JPH07508884A - 指示薬として使用するための改善された特異活性を有するアルカリホスファターゼ酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 攪示薬として使用するための改善された特異活性を有するアルカリホスファター ゼ酵素 発明の詳細な説明 発明の分野 本発明は、生物学的特性を改善するための酵素の改良に関する。特に、本発明は 、結合アッセイの標識として使用するためのアルカリホスファターゼを産生ずる ための遺伝子工学処理された大腸菌の使用に関し、該酵素は高められた特異活性 および高い熱安定性を有する。

発明の背景 アルカリホスファターゼは、種々の診断用の結合アッセイにおいて容易に検出可 能な標識酵素として使用される。例えば、分析の型に応じて、問題の被分析物に 結合する抗原、抗体または他の特異的結合物に結合することができる不均一酵素 結合アッセイにおいてしばしば使用される。結合が生じた後、新たに生じた結合 複合体は、反応混合物から分離され、その複合体に関与するアルカリホスファタ ーゼの有無または量を観察することにより検出することができる。アルカリホス ファターゼは、酵素基質を添加して得られる酵素／基質反応の程度を観察するこ とにより検出される。

標識として使用するための特定の酵素の選択基準としては、高い特異活性（すな わち、高速触媒作用、即ち高速酵素反応）；高温での安定性（通常は５０〜６０ ℃より高い溶融温度）；特異的結合物に結合した後の酵素の安定性；酵素検出反 応に使用するための容易に定量できる酵素基質の利用可能性；反応物質増幅法の 利用可能性；およびその測定法での適正な性能（例えば、低いバックグランド値 ）が挙げられる。温度安定性は、酵素を適用する多くの産業にとっては、大きな 関心事である。蛋白質はその温度安定性が様々であり、種々の酵素の溶融温度（ Ｔｍ）の範囲は、４０℃以下〜１００℃以上までとなりうる。

子牛の腸のアルカリホスファターゼは、高い特異的活性および約５５℃の溶融温 度を示す酵素標識として使用されるこが多い。該酵素およびその抱合体は、結合 アッセイに使用するのに都合が良く、検出反応の物質を増幅するためのい（っが の方法もある。しかし、子牛の腸のアルカリホスファターゼを標識として使用す ることには、まだいくつかの欠点がある。これらの欠点としては、酵素製剤の純 度が不十分なものがあること、および共有的に結合した炭水化物が存在し、これ が、測定結果をめる際のバックグランド値を高くしていると考えられることが挙 げられる。さらに、子牛の腸のアルカリホスファターゼは、結合アッセイで使用 するための特異的結合物に結合した後の温度安定性が悪い。これらの欠点のため 、結合アッセイ、特に高められた温度に達する測定法により適した特異的活性お よび温度安定性を有する新しい形状のアルカリホスファターゼの探索および開発 に関して多くの研究が行われている。

哺乳類の酵素の欠点を克服するために選択される一つの方法は、哺乳類のアルカ リホスファターゼと対比して温度安定性が極めて高い大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ア ルカリホスファターゼを使用するものである。大腸菌のアルカリホスファターゼ は、Ｔｍが約９５℃である。また、単位細胞当たりに多数のコピーの対応する遺 伝子が存在するならば、アルカリホスファターゼは、大腸菌から高められた量で 発現することができる。さらに、その酵素は数段階で精製して均一にすることが できる。しかし、大腸菌由来のアルカリホスファターゼは、子牛の腸のアルカリ ホスファターゼよりも特異的活性が低い。大腸菌アルカリホスファターゼの触媒 反応速度（ｋ、、、）は、かなりバラツキがあるが、最大で６０ｓｅｃ−’であ る。これに対して、子牛の腸のアルカリホスファターゼの場合は、ｋ２、が約２ ，０００ｓｅｃ−’である。このように天然の大腸菌アルカリホスファターゼは 、触媒速度が子牛の腸のアルカリホスファターゼより低いので、大腸菌アルカリ ホスファターゼのより好ましい温度安定特性は保持したまま、その触媒活性を改 善できれば有利であろう。

蛋白質工学分野の最近の進歩、例えば、部位特異的突然変異誘発、コンピュータ ー支援分子設計、遺伝子発現技術および結晶または核磁気共鳴構造の利用性など により、酵素の特異的活性の改善を目的とする計画の実行が可能になってきた。

酵素の改善可能な特性は、一般的な二つの組に分けることができる。

それは、（１）基質特異性、触媒反応速度（ｋ、、、　’Ｉ　、ミカエリス定数 （Ｋｍ）など、酵素活性部位の局所的特性に依存する特性、ならびに（２）温度 安定性、蛋白質分解に対する耐性および活性部位のアロステリック制御など、蛋 白質構造の全体的性質に依存する特性である。酵素の活性部位は、典型的には約 １０個のアミノ酸残基から成る。一般に、活性部位で生じる反応は、活性部位の アミノ酸により決定される。従って、活性部位を構成するアミノ酸残基を変える ことにより、酵素の触媒効果を変えることができる。

アルカリホスファターゼの特性を改善するための初期の試みは、主に、酵素の化 学的改質に基づいていた。例えば、酵素を、光酸化に付するか、モノ−およびジ クロロアセチル−β−グリセロホスフェート：２Ｉ　３−ブタンジオン；フェニ ルグリオキサールおよび他の化合物による処理にかけた。典型的には、これらの 処理により、酵素の触媒活性が低下または消失し、それにより、酵素の機能に関 する情報が得られた（Ｃｏｌｅｍｔｎ　ｔｎｄＧｅｌｌｉｎｇ＋、　Ａｄｗ、　 Ｅｎ＋７ｍｏ１．、　Ｖｏｌｕｍｅ　５５．　ｐｓｇｅ　３５１　（１９８３） 　）。

酵素をテトラニトロメタンで処理しくチロンル残基にニトロ化する）た後、ニト ロ化残基をアミノチロシル残基に還元すると、酵素のホスホヒドロラーゼ活性が 、未修飾の蛋白質の活性の１３０％に上昇し、ホスホトランスフェラーゼ活性は 、通常の値の３５０％であったＣＣｈｒｉｓｔｅｎら、Ｂｉｏｃｂｅｍｉ＋ｌＢ 、Ｖｏｌｕ＋ｅ　ＩＯ，ｐ＋ｇ＋　１３７７　（１９７１）　）。そのような実 験により、アルカリホスファターゼの酵素特性の一部は、酵素の化学的修飾によ り改善できることが示された。しかし、化学的修飾法は、酵素のどのアミノ酸を 修飾するかに関する選択性が低く、従って、広範囲のアミノ酸残基が影響を受け るという点で制限がある。

さらに、蛋白質の活性部位または結合部位の変化は、単一のアミノ酸の変化（す なわち、点変異）よりもさらに広範囲に及ぶ。例えば、遺伝子発現を抑制する蛋 白質（リプレッサー）は、いくつかの酸性残基を変えることにより、活性化物質 に変換することができる（ｌＪ＋　＊＋＋ｄ　Ｐｌ■ｈｎｅ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｖ ｏｌｕｍｅ　４ｇ、　ｐｉｅ８４７−８５３　（１９８７＋）。トリプトファン シンテターゼのα−サブユニットに関する研究で示されるように、はとんどの突 然変異により、Ｔｍが低下する（Ｙｕｌｓｎｌら、　Ｎ５ｌａ＋ｔ、　Ｖｏｌｕ ｍｅ　２Ｇ？、ｐＩｇｅＩ２７４−２７５　（１９７７））　、それにもかかわ らず、ＢＩｃｉｌ１ｍ＋　＋ｌｅｇ＋ｏｌｈｅ＋ＩＩｏｐｈｉ１ｗ＋の中性プロ テアーゼに関する研究で示されるように、酵素配列の２．３のアミノ酸を置き換 えると、酵素のＴｍをかなり上昇させることができる（　１ｓｓｎｔｋｓら、　 Ｎ５ｌａ＋ｔ。

Ｖｏｌｕｍｅ　３２４．　ｐｉｅｓ　６９５−６９７　（１９８６１〕。

組換えＤＮＡ技術の進歩により、アルカリホスファターゼの生成を司る遺伝子（ ｐｈｏＡ遺伝子）を改変して、特定のアミノ酸残基を修飾または変えること（部 位特異的突然変異誘発）が可能になった。大腸菌では、ｐｈｏＡ遺伝子は、リン 酸塩の結合、運搬および代謝の調節に関与する少なくとも１８個の遺伝子の不連 続ｆａｍｉｌｙの一部である。大腸菌ｐｈｏＡ遺伝子のヌクレオチドおよびアミ ノ酸配列は、当業者には周知である（Ｃｈ＊ａ（、Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ■ｅ　４ ４．　ｐｌｉｅｌ　１２１−１２５　（１９８６））。

遺伝子工学により、アルカリホスファターゼ酵素の活性部位のセリン１０２の突 然変異の結果、特異的活性が１，０００分の−に低下したので、このアミノ酸残 基がアルカリホスファターゼ活性に対して重要であることが示された（１．　Ｅ 、Ｂｗｌｌｅ＋−Ｒｔｎ＋ｏｈｏｌｌら、＾ｂ＋ｌ＋ｔｅｌ＋　ｏｆ　１９８９ 　Ａｌｈｌｉｎｅ　Ｐｂｏ＋ｐｈｒｌ＊＋Ｃ’Ｈａｐｏｋｉ■、Ｓｉｎ　Ｄｉｅ ｇｏ、　Ｃ人、（＋９８９１３　。あるいは、セリンをシスティンで置き換え、 水酸基は保持されたままにすると、活性がわずかに低下するだけである（Ｇｂｏ ｔｈら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌｕｍｅ２３１、ｐｓｇｅ　１４５　（１９ １１６））。酵素活性部位のすぐ近くの残基であるアルギニン１６６の役割も突 然変異誘発により研究され、その結果、触媒効率が天然酵素と比較して約５０分 の−に低下した（Ｂｕ１１＋＋−１１＋ｎｔｏｈｏｌｌら、Ｐｒｏｃ、Ｎｔｌｌ 、Ａｃｔｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、ＶｏｌｕＩＩｅ　８５．　ｐａｇｅ　４２７６ 　ｆ１９ｇ８）及びＣｈｔｉｄ＊＋ｏｇｌｏｏら、Ｂｉｏｅｈｅｍｉ＋ｌＢ、　 Ｖｏｌｏｍ＋　２７．　ｐＨ＋　［１３３８（１９Ｂ８１　）　ｏアルカリホス ファターゼのアミノ末端から１０〜４０個のアミノ酸残基を蛋白質分解脱離する と、温度安定性は低下するが、酵素の特異的活性はそのままか、わずかに低下す るだけであることが示された［Ｃｈｌｅｂ。

ｖｔｋｉら、１．　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ、Ｖｏｌｕａｅ　２６４．　ｐａｔｅ　 ４５２３　（１９８９］］。

ｐｈｏＡ遺伝子のアミノ酸に変化を及ぼさない突然変異も、いくつかの野生型の 大腸菌の単離物から証明されている（ＤｕＢｏｓｅら、Ｐｒｏｃ、Ｈｅ１１．　 Ａｃｔｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｖｏｌｕｍｅ　８５．　ｐｔｇｅ　７０３６　（＋ ９８８）〕。より最近、大腸菌アルカリホスファターゼの活性部位のアスパラギ ン酸１°Ｉの機能が、そのアミノ酸をアラニンで置き換える部位特異的突然変異 誘発により研究された（Ｃｂ＊ｉｄｔ＋。

ｇｌｏｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅ「ｉｎｇ、Ｖｏｌｕｉｅ　３（２ ）、９ｓｇｅｔ　１２７−Ｈ２（１９８９＋）。その突然変異酵素は、野生型酵 素より約３倍高い活性を示したが、温度安定性ではかなりの低下を示した。

発明の要旨 本発明は、野生型酵素と対比して高められた触媒活性を有するアルカリホスファ ターゼ酵素の産生を調節する合成遺伝子の構築に関する。本新規酵素の酵素活性 は、野生型酵素と対比して３６倍も増加した。本新規酵素の温度安定性は、野生 型酵素と対比すると低いが、その酵素を結合測定法で使用するのに適する程度の 温度安定性は保持されている。すなわち、本新規酵素は、通常の測定条件下では 熱により不活性化されない。新規酵素、その酵素を産生ずるのに使用される新規 ＤＮＡ配列、設計されたＤＮＡ配列を含む新規プラスミド、そのプラスミドを含 む新規宿主および新規酵素を指示薬の形で使用する測定法を記載する。

例えば、大腸菌で産生される合成アルカリホスファターゼ酵素を記載するが、そ の新規酵素は、野生型大腸菌アルカリホスファターゼと対比して少な（とも１個 のアミノ酸突然変異を有し、特異的活性は、野生型大腸菌アルカリホスファター ゼと対比して増加している。典型的には、アミノ酸突然変異は、酵素の活性部位 の約２０；内で生じる。アミノ酸変化の例としては、ＴｈｒＩｏｏの箇所にＶａ 　Ｉ、Ｔｈ　ｒ”’の箇所にＩｌｅ、Ｌｙｓ１２８の箇所にＡｒｇ、Ｖａ１９９ の箇所にＡｌａＳＡｌａ”’の箇所にＡｓ　＋）、　Ａ　Ｉ　ａ＋０３の箇所に Ｃｙｓ、Ｔｈｒ’°７の箇所にＶａｌ、Ａｓｐ’°１の箇所にＳｅｔ、およびＡ 　ｓ　ｐ　＋　５３の箇所にＧｌｙが入って置き換わるものが挙げられる。、ア ミノ酸が２個変化したものには、Ｖ　ａ　ｌ　９９の箇所にＡｌａが入り、Ｌｙ ８′ｎの箇所にＡｒｇが入るか、または、Ｖ　ａ　Ｉ　３７’の箇所にＡｌａが 入り　３　ｅ　「４１５の箇所にＧｌｙが入るアミノ酸突然変異がある。

本発明は、ベクターに挿入するのに適する新規ＤＮＡ配列を含む。その配列は、 アルカリホスファターゼ酵素をコードする一連のコドンを含み、該アルカリホス ファターゼは、野生型大腸菌アルカリホスファターゼと対比して少なくとも１個 のアミノ酸突然変異を有し、また、野生型大腸菌アルカリホスファターゼと対比 して高められた特異的活性を有する。該ＤＮＡ配列を含むプラスミドおよび該プ ラスミドを含む宿主細胞も記載する。単細胞宿主を使用し、典型的には、大腸菌 、Ｂ＊ｃｉｌｌｓｓ。

５ｌｒｅｐｌｏｓ７ｃｅｓ、　＠乳類の細胞、酵母および他の真菌類などの細菌 株および真菌株から選択される。その選択は本発明では重要でないが、全ての宿 主が必ずしも等しく効果的であるわけではない。

さらに、本発明は、該合成アルカリホスファターゼ酵素の結合測定法における酵 素標識としての用途を含む。テスト試料中の被分析物の有無または量を測定する のに有用な指示薬は、新規酵素に特異的結合物を直接または間接的に結合するこ とにより作ることができる。その結果得られる指示薬は、サンドイッチアッセイ 、競合アッセイならびに直接および間接測定法など（これらに限定されない）の 測定法で使用するのに適する。

発明の詳細な説明 本発明は、高められた特異的活性を有し、天然酵素の好ましい温度安定特性は保 持されたままの新規アルカリホスファターゼ酵素を提供する。遺伝子的に改良し た酵素は、子牛の腸のアルカリホスファターゼよりも熱安定性が良好であり、７ ５℃（ｐ　Ｈ７，５）での最小半減期は５分である。さらに、測定条件に応じて 、新規酵素の酵素活性は、天然酵素の１．５〜３６倍に高められた。特異的活性 の増加が最も大きく認められるのは、新規酵素の酵素活性を低濃度のトリス（０ ，０５Ｍ）またはジェタノールアミン（０，０５Ｍ）の存在下で測定するときで ある。高められた特異的活性は、分子設計、遺伝子工学および部位特異的突然変 異誘発の組み合わせにより達成された。

典型的には、アルカリホスファターゼにおいて突然変異の標的となる部位を酵素 の結晶構造に基づいて予め決定した（Ｓｏｖ畠ｄ＋ｋｉら、Ｉ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏ ｌ、、Ｖｏｌｕｍｔ　１８６．　ｐｓｕｓ４１７−４３３　（１９１１５））。

標的部位としであるアミノ酸を選択する基準は、そのアミノ酸が酵素分子の活性 部位、特に触媒残基５ｅｒＩ０２に近いことであった。

酵素の一定の部位で所期のアミノ酸変化を得るために、そのアミノ酸をコードす る適切なコドン配列をｐｈｏＡ遺伝子に挿入した。ランダムなアミノ酸変化も、 コドン配列ＮＮＮ　（Ｎは４個のヌクレオチドのいずれかである。）をＤＮＡ配 列に挿入することにより行った。構築された一つの突然変異体は、偶然、２個の 点変異、すなわち２個のアミノ酸変化を有していた。これは、遺伝子合成に使用 した合成オリゴヌクレオチドの化学的修飾の結果であると考えられる。

新規プラスミドの構築 適切に突然変異が行われたＤＮＡ分子の最初の組を得て、それから二つの蛋白質 設計計画を使用して突然変異体酵素を産生じた。まず、修飾された種々のＤＮＡ 配列を単一の遺伝子に導入し、得られたクローンから、高い特異的活性を有する 突然変異体酵素を産生ずるものを選択した。次に、突然変異体ＤＮＡ分子を第二 回めの突然変異誘発のための基礎遺伝子として使用した。

最初の計画は、アルカリホスファターゼをコードする完全合成遺伝子の設計およ び構築を含む。合成ｐｈｏＡ遺伝子は、本出願人による係属中の米国特許出願Ｎ ｏ、１３１，９７３（１９８？年１２月１１日出願）およびＭｓｎｄｅｃｋｉ　 ＋ａｄ　Ｒｏｌｌｉｎｇ、ＧｔＩｌｅ。

Ｖ＋＋１ｍｍｅ　６ｇ、　ｐ＊ｔｅ＋　１０１１０７　（１９８８）　（これら は参考文献として本明細書に添付する。）に記載されたＦｏｋ　Ｉ法を使用して 合成した。２１個の合成オリゴヌクレオチド（図１（ａ）〜（ｅ））を設計し、 このために作成したプラスミドベクター（ｐ　Ｗ　Ｎ５００）で個々にクローン 化した。各合成オリゴヌクレオチドは、次・いで、Ｆｏｋｒ制隈エンドヌクレア ーゼを使用してベクターから切り取った。得られたＤＮＡ断片は、ベクターから 切断した後、各フラグメントの突出末端がそれぞれ異なる配列を有して、２１個 の全フラグメントを一つの反応で連結して約１６００塩基対の合成ｐｈｏＡ遺伝 子を産生ずるように設計した。

合成遺伝子は、翻訳（遺伝子の塩基配列がポリペプチド鎖のアミノ酸配列に翻訳 される機構）開始のためのｐｈｏＡリポソーム結合部位および転写終結部位配列 （遺伝子に相補的なｍＲＮＡ鎖の合成が終結する部位）を含んでいた。本合成遺 伝子は、合成プラスミドベクターｐＷＭ５１８（構成は実施例１１に記載する） でクローン化した。そのベクターは、クローン化、発現および突然変異誘発など の操作を容易にするための限られた数の制限部位を有するように設計した。合成 ｐｈｏＡ遺伝子を有するプラスミド（ｐＭＡ　１００）からのアルカリホスファ ターゼ発現レベルは、５５０ｎｍでの光学密度が１．５に成長した１１の細胞か らの蛋白質が１０ｍｇ近くとなった。染色体アルカリホスファターゼ遺伝子が欠 失した大腸菌株を形質転換および続く培養に使用して本発明の新規酵素を産生じ た。そのような株としては、Ｉｎｏｕ７ｅら、１．　Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ、、Ｖｏ ｌｕｍｅ　＋１０゜ｐ＊ｇ＋＋　７５−８７　（１９７７１（参考文献として本 明細書に添付する。）に記載されたＭＺ１３ｂ　（Ｆ−１ａｃＸ７４．　Δ（ｂ ｒｎＱ”。

ｐｈｏＡ−、ｐｈｏＢ−、ｐｒｏｃ−：）、ｔｓｘＲ，ｔｒｐ、、、ｓｔｒ”、 Ｆ８０Ｄ　（ｐｒｏＣ’、ｐｒＯＢ’）ｔｐｗ３＋　Ｆ２Ｏ）大腸菌がある。

生物学的測定法を使用して、得られた突然変異体の大腸菌微生物をスクリーニン グし、どのクローンが高められた特異的活性を有するアルカリホスファターゼを 産生ずるかを測定した。

クローンの増殖は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール（ＢＣＩＰ）の基 質を含む培地で行った。高い特異的活性を有するアルカリホスファターゼを産生 ずるコロニーは、コロニーの周囲が酵素と基質との反応により青色を呈すること により検出した。

宿主細胞によるアルカリホスファターゼ発現レベルが高いと、指示薬プレート上 のコロニーのカラースクリーニングには不都合である（発現レベルの増加が小さ い場合は、青色が深くなる色変化が観察しにくい。）。従って、突然変異体酵素 を天然様の酵素から区別しやすくするために、天然の１ａｃＺリポソ一ム結合部 位を、天然リポソーム結合部位と類似しているが、翻訳開始効率の劣る配列で置 き換えることによりプラスミドのアルカリホスファターゼ発現レベルを下げた。

その結果得られるプラスミドをｐＭＡｌｏｌと命名した。このｐｈｏＡ遺伝子は 、ＡＴＧ開始コドンの上流にある５個のランダムなヌクレオチド群を含む。その 結果、酵素の発現はかなり低下し、高い特異的活性を有する突然変異体酵素のみ がＢＣＩＰ基質において暗青色を示す。クローンライブラリーは、異なるレベル のアルカリホスファターゼ活性を示す約１，０００個のクローンを含むように作 製した。アルカリホスファターゼ活性を呈色で選別するに適するクローン（ｐＭ Ａ　１０１）を選択して、さらに突然変異誘発の研究を行った。

部位特異的突然変異誘発 Ｌｎｄｅｃｋｉら、？ｏｅ、Ｎ５１１．　＾ｅｇｄ、Ｓｅｉ、、Ｖｏｌｕｍｅ　 ８３．　ｐｉｅｓ？＋７７−７１８１　（１９８６）　（参考文献として本明細 書に添付する。）に開示されているように、オリゴヌクレオチド特異的二重鎖切 断修復法（すなわち、架橋突然変異誘発）を使用して合成プラスミドベクターを 構築した。しかし、この特定の方法を使用することは、本発明には重要でない。

その方法は、コンピテント大腸菌細胞を変性線状プラスミドおよび、適切な突然 変異をコードし、プラスミド切断点付近のプラスミドＤＮＡ配列に類似する二つ の「アーム」を有する合成オリゴヌクレオチド配列とともに共形質転換すること により突然変異を導入することを含む。

突然変異誘発には一重鎖オリゴヌクレオチド配列のみを使用するので、変性配列 をプラスミドＤＮＡに導入するのに特に有利である。

その方法では、アルカリホスファターゼ遺伝子の部分配列における突然変異をコ ードする合成オリゴヌクレオチド部分配列をプラスミドベクターのｐｈｏＡ遺伝 子に入れてクローン化し、ｐｈｏＡ遺伝子を置き換えるというよりむしろ修飾を 行った。

合成オリゴヌクレオチド部分配列は、典型的には２０個のアミノ酸の鎖に対応す るように規定した、またはランダムなコドン配列を標的部位に運ぶように設計し た。部分配列を導入するために、ｐｈｏＡ遺伝子を含む大腸菌プラスミドは、突 然変異誘発の標的である部位の隣で切断する（すなわち、プラスミドを１個所の み切断する制限エンドヌクレアーゼで切断した。そのような部位が、ｐｈｏＡ遺 伝子内に２５個ある。）か、または、プラスミドを２種の酵素で切断して突然変 異誘発を行うべき部位と重複する制限断片を遊離した。宿主細胞は、その細胞を 切断プラスミド、合成オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡリガーゼにより結合する ことにより形質転換した。１回の形質転換で２００個のコロニーが得られた。

色選別に引き続き、ＤＮＡ塩基配列決定および精製蛋白質の分析を行って、高め られた特異的活性を有するアルカリホスファターゼを発現する遺伝子を有する１ ０個の大腸菌突然変異体株が得られた。これらの突然変異体は、Ｔｈ　ｒ”’　 ＞Ｖａ　１（すなわち、１００位のトレオニンがバリンで置き換えれた。）；Ｔ ｈｒ”’　＞Ｉ　Ｉｅ；Ｌｙｓ３２８＞Ａｒｇ；Ｖａ１９９＞Ａｌａ　；Ａｓｐ ”’　＞Ｓｅ　ｒ　；Ａｌａ”’　＞Ａｓｐ　；Ａｌａ”３＞Ｃｙｓ；Ｔｈｒ” ’　＞Ｖａｌであり、二重突然変異体は、ＬＹｓ３２’＞ＡｒｇおよびＶａ１９ ９＞Ａｌａであり、偶然の二重突然変異体は、Ｖａｔ”’＞ＡｌａおよびＳｅｔ ”’＞Ｇｌｙであった。

この種の遺伝子突然変異体を含むプラスミドクローニングベヒクルを調製する別 の方法、例えば、Ｐｏ１ｉｔｋｙ　ら、Ｐ＋ｏ、ｃ、　Ｎｔｌｌ、＾ｃｓＬ　Ｓ ｅｉ、　０３人、　Ｌｏｌａｍｅ　７３（ｉｌｌ、　ｐ＊ｔｔｓ　３９０Ｇ−３ ９０４（１９７６）　、米国特許Ｎｏ、４，３７５，５１４および米国特許Ｎｏ 、４゜７０４．３６２　（これらは、参考文献として本明細書に添付する。）に 記載の方法も使用することができる。

アルカリホスファターゼ突然変異体の分析特異的活性および温度安定性の分析を 、精製度の高い蛋白質物質に対して行った。簡単に述べると、精製法は、スフェ ロプラストの生成によるペリプラズム蛋白質の終結、硫安沈澱およびクロマトフ オーカシングクロマトグラフィーを含む。特異的活性およびミカエリス定数の測 定は、酵素基質（例えば、リン酸ｐ−ニトロフェニル）が変換されて発色性物質 を生成する速度をモニターすることにより行った。温度安定性は、異なる温度で の酵素失活を追跡することにより測定した。

得られた新規酵素およびその特性を表１に示す。全ての大腸菌突然変異体は、天 然酵素（ｐＭＡｌｏｏとして表される）よりも特異的活性が高いアルカリホスフ ァターゼ酵素を発現した。

突然変異体酵素の各々は、温度安定性が天然酵素より小さかったが、哺乳類の酵 素である子牛の腸のアルカリホスファターゼよりはかなり良好であった。

表　１ 構築された突然変異体 プラスミド　突然変異　特異的活性　Ｋｍ　温度安定性（Ｉモル／ａｔ／分　（ ＊Ｍ）　（半減期）ｐＭＡｌｏｏ　野生型　６０　３０　６分　（９５℃）ｐｉ ｔ＾１１０　Ｙ＊ｌ”’　＞Ａｌｔ　９０　２３　７分　（８０℃）Ｓ！ｔ”’ 　＞Ｇ１７ ｐＭＡｌｌｌ　７１，１＋００　＞Ｖ＊ｌ　１２３　２Ｇ　２１分　（８５℃） ｐＭＡＩＩ２　Ｔｈｅ”’　Ｎｌｅ　１２３　２Ｏ１０分　（８５℃）ｐＨＡｌ １７　ＬＩ！””　＞Ａｒｔ　２２０　９４　１０分　（８５℃）ｐＭＡＩＩ４ 　Ｖ＊１９９）＾１１２Ｇ５　２２　１５分　（８０℃）３分　（８５℃） ９ＭＡｌ１５　＾＋ｐ１０’　＞Ｓ＋＋　２９０　５６　１４分　（８０℃）２ 分　（８５℃） ｐｖ＾１１６　ＬＨ”８）＾Ｂ　１９０　７４　５分　（７５℃）Ｙ＋１９９） Ａｌｔ　＜１分　（８５℃）ｐＨＡｌ１７　＾Ｉｓ’°３〉＾＋ｐ　１３３　１ ４４　２２分　（８５℃）ｐＭＡＩｌ＆　Ａ１１１０’　＞ＣＦｌ　１０５　７ ５　２９分　〔８５℃）１１１４Ａｌ１９　Ｔｈｒ１０７）Ｖ！１　２４０　１ ０２　７分　（８５℃）子牛の腸のフルカリネスフ１ターゼ　１８００　１０　 ９分　（６５℃）アルカリホスファターゼ標識を使用する結合測定法アルカリホ スファターゼを結合測定法で標識として使用することに関してさらに記載する前 に、多数の用語の定義を行う。

本発明の新規標識が有利に使用される種々の測定法も記載する。

「特異的結合物質」は、特異的結合対、すなわち、一方の分子が化学的または物 理的手段によりもう一方の分子に特異的に結合する二つの異なる分子の一つの物 質を意味する。抗原−抗体の特異的結合対の他にも特異的結合対があり、例えば 、それらに限定されないが、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、（例え ば、ＤＮＡハイブリッド形成反応における）相補的ヌクレオチド配列、相補的ペ プチド配列、エフェクターとレセプター分子、酵素補因子と酵素、酵素阻害剤と 酵素、ペプチド配列とその配列または蛋白質全体に対して特異的な抗体、ポリマ ー酸とポリマー塩基、色素と蛋白質バインダー、ペプチドと特異的蛋白質バイン ダー（例えば、リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボヌクレアーゼ　Ｓ− 蛋白質）などが挙げられる。さらに、特異的結合対は、もとの特異的結合物質の 類似体である物質、例えば、被分析物−類似体を含めることができる。

特異的結合物質が免疫反応物質の場合は、例えば、抗体、抗原、ハプテンまたは それらの複合体が挙げられ、抗体を使用する場合は、モノクローナル抗体、ポリ クローナル抗体、組換え蛋白質、２種以上の抗体混合物、抗体フラグメントまた はそれらの混合物、ならびに抗体と他の特異的結合物質との混合物が挙げられる 。そのような抗体の作製およびそれらを特異的結合物質として使用するための適 合性の詳細は当業者には周知である。

「被分析物」は、測定法で検出または測定すべき化合物または組成物を意味する 。被分析物は、被分析物に特異的な天然の結合物質が存在するか、被分析物に特 異的な結合物質を作製することができる物質であればどんなものでもよい。被分 析物としては、それらに限定されないが、毒素、有機化合物、蛋白質、ペプチド 、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与さ れるものおよび不法目的で投与されるものを含む）、および上記物質の代謝物ま たは上記物質に対する抗体が挙げられる。「被分析物」はまた、免疫定量法で重 要な抗原性物質、ハブテン、抗体およびそれらの組み合わせも含む。本発明の試 薬および方法はまた、問題の食品および環境上の被分析物を測定する目的で設計 することもできる。

「指示薬」は、標識が接合した特異的結合物質を意味する。

指示薬は、テスト試料中の被分析物の量に関する検出可能な信号を発生する。一 般に、指示薬は、固相物質に固定化した後、検出または測定されるが、遊離また は未結合の指示薬も検出または測定して測定結果をめることができる。指示薬の 特異的結合物は、上述したどんな特異的結合対の物質でもよい。本発明において 、指示薬の標識成分は、高められた特異的活性を有する合成アルカリホスファタ ーゼである。酵素標識は、酵素基質を検出可能な物質に変換するために使用され る。その物質は、目で見て、または装置により検出することができる。また、検 出可能な信号の増幅は、酵素を１種以上の基質または他の酵素と反応させて検出 可能な反応物質を作ることにより行うことができる。

「捕獲結合物」は、被分析物または指示薬に直接または間接的に結合可能で、典 型的には、共有、非共有、吸着または非特異的機構により固相に結合しているか 、または結合可能であり、或いは析出可能である特異的結合物を意味し、その結 果、捕獲結合物はテスト試料または他の測定試薬から分離可能である。

「捕獲試薬」は、直接または間接的に固相物質に接合していて、捕獲結合物およ びそれに結合した被分析物または指示薬を未結合の被分析物および測定試薬から 分離することができる捕獲結合物を意味する。典型的には、捕獲結合物の固相へ の接合は事実上不可逆的であり、共有機構を含むことができる。しかし、本発明 の捕獲試薬は、不溶固相物質に結合した捕獲結合物に限定されない。凝集測定法 では、捕獲試薬に、牛血清アルブミンなどの可溶担体物質に結合した捕獲結合物 を含めることができる。

「固相物質」は、当業者には周知の、特異的結合物を固定化するために使用され る、適するクロマトグラフ用物質、吸湿性物質、多孔性物質もしくは毛管物質、 または他の常用の固体物質を意味する。本発明では、固相物質に、１個以上の分 析試薬を含む１個以上の層を有する流動測定法装置で使用するためのガラス繊維 、セルロースまたはナイロンパッド；浸漬計量測定法用の浸漬片：クロマトグラ フィ−（例えば、紙またはガラス繊維）もしくは薄層クロマトグラフィー例えば 、ニトロセルロース）用の試験片（１個または全部の試薬が固相物質の１個の片 の分離した各ゾーンに含まれる。）；または当業者に周知の吸収物質を含めるこ とができる。また、固相物質に、ポリアクリルアミドビーズ、ポリスチレンビー ズまたはチューブ、磁気ビーズ、マイクロタイタープレートまたはガラスもしく はプラスチック試験管も含めることができるが、それらに限定されない。

天然、合成または合成により修飾された天然の物質も固相物質として使用するこ とができ、例えば、ポリサッカライド、例えば紙などのセルロース物質ならびに ジアゾベンジルオキシメチルセルロース、ニトロセルロース、２−アミノフェニ ルチオエーテルセルロースおよびセルロース酢酸エステルなどのセルロース誘導 体；シリカ；シリコン粒子；不活化アルミナなどの無機物質、または塩化ビニル 、プロピレンとの塩化ビニルポリマーおよび酢酸ビニルとの塩化ビニルポリマー などのポリマーとの多孔性ポリマーマトリックスに均一に分散した他の無機細粒 物質、天然（例えば、木綿）および合成（例えば、ナイロン）の布；シリカゲル 、アガロース、デキストランおよびゼラチンなどの多孔性ゲル：ポリアクリレー トなどのポリマー性フィルム；蛋白質結合膜などが挙げられる。固相物質は、適 度の強度を有するべきであり、あるいは、強度を支持体により付与してもよく、 検出可能な信号の発生を妨げるべきではない。

所望により、捕獲試薬の捕獲結合物は、粒子、例えば微粒子に固定することがで きる。これらの微粒子は、固相物質として役立ち、カラムに保持され、可溶試薬 とテスト試料との混合物に懸濁し、または他の固相ベース物質によって保持・固 定化することができる。「保持・固定化」は、固相ベース物質と会合した微粒子 がその物質内で他の位置に実質的に移動することができないことを意味する。微 粒子は、当業者であれば、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリプロピレン 、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネートまた は同様の物質から成る物質を含む適当な型の粒状物質から選択することができる 。微粒子の大きさは重要ではないが、固相ベース物質を使用する場合は、平均直 径が面相ベース物質の孔の平均サイズより小さいのが好ましい。

本発明はまた、最初は固相物質に接合していない捕獲結合物質を含む捕獲試薬も 含む。測定成分間で複合体の生成が生じると、固相を分離機構として使用するこ とができる。例えば、反応混合物を固相物質と接触させ、新たに生成した反応複 合体を固相物質により保持させることができる。別の方法を用いてこの分離を行 うこともできる。例えば、本出願人による係属中の米国特許出願Ｎｏ、１５０． ２７８　（１９８８年１月２９日出願）（参考文献として本明細書に添付する。

）に開示されているように、それ自体が捕獲結合物に結合する固相を使用する方 法；捕獲結合物に対して特異的である結合物を固相に固定する方法；または固相 に、捕獲結合物に結合している帯電した物質を引きつけて結合する反対電荷の帯 電物質などの物質を固定する方法がある。

「特異的補助結合物」は、捕獲結合物の特異的結合物および検出可能な結合複合 体の一部となる指示薬の他に使用される、特異的結合物を意味する。一つの測定 法で１種以上の特異的補助結合物を使用することができる。例えば、特異的補助 結合物は、指示薬がその特異的補助結合物を結合することができ、後者が被分析 物を結合することができる測定法で使用することができる。

「テスト試料」は、典型的には、問題の被分析物を含むと推測される、天然また は人工的に作った液体のテスト媒体を意味する。テスト試料は、一般には生物学 的液体またはその希釈物である。被分析物を測定することができる生物学的液体 としては、血清、全血、血漿、尿、唾液、羊水、脳を髄液などが挙げられる。ま た、変形して液体テスト媒体となるようにした固体物質（例えば、髪、組織など ）もテスト試料として挙げることができる。

当業者であれば理解されるように、結合物、補助結合物または固相物質の選択は 本発明には重要ではない。それらの物質は、所定の被分析物またはテスト試料に 対する測定結果を最適にするように選択する。

本発明の新規酵素は、競合結合測定法などの均一な結合測定法、およびサンドイ ッチおよび競合結合測定法などの不均一な結合測定法において有利に使用される 。不均一な結合測定法は、結合反応物が結合する固相物質の使用を含む。テスト 試料中の被分析物の有無または量を示す標識を検出する前に、反応混合物から固 相を分離することにより、固定化された反応成分から過剰の試料および測定試薬 を取り除く。

固相サンドイッチアッセイにおいて、捕獲試薬は、典型的には、固相物質に結合 した捕獲結合物を含む。例えば、特異的結合物は、テスト試料中の抗原−被分析 物に結合する固定化抗体にすることができ、あるいは、テスト試料中の抗体−被 分析物に結合する固定化抗原にすることができる。捕獲試薬は、被分析物を含む 可能性のあるテスト試料および標識化したもう一つの特異的結合物（例えば、標 識化した抗−被分析物抗体）を含む指示薬に接触させる。それらの試薬は同時に 混合するか、逐次（個々に、または組み合わせて）添加する。結合反応の結果、 捕獲試薬／被分析物／措示薬複合体が生成する。その分析法はまた、得られた複 合体を過剰の試薬およびテスト試料から分離する工程を含むことができる。固相 物質に保持された複合体は、固相の指示薬を調べることにより検出される。被分 析物が試料中に存在する場合は、標識物が固相物質上に存在する。固相と会合す る標識物の量は、試料中の被分析物の量に正相関する。

本発明の測定法は、サンドイッチ測定法のいずれか（前方向、逆方向および同時 法など）を使用して行うことができる。典型的には、前方向の測定法は、テスト 試料を捕獲試薬に接触させた後、インキュベートシ、指示薬を添加するものであ る。逆方向の測定法は、を旨示薬をテスト試料に添加した後、インキュベートし て、捕獲試薬を添加するものである。同時測定法は、捕獲試薬と指示薬とを同時 に接触させるので、ただ１回のインキュベーション工程を含む。

さらに、本発明の新規酵素は、捕獲試薬／被分析物／被分析物−特異的結合物／ 指示薬の複合体を生成する間接サンドイツチ測定法で使用することができる。こ の場合、追加の被分析物−特異的結合物が特異的補助結合物である。

競合測定法も本発明の新規酵素を使用して行うことができる。

固相競合側定法では、捕獲試薬が、典型的には、やはり捕獲結合物を含む。この 捕獲結合物は面相物質に固定されており、テスト試料および指示薬の両方に接触 させる。しかし、指示薬は、標識が、結合している被分析物または被分析物類似 物から生成させることができる。結合反応が生じ、その結果、（１）固定化捕獲 試薬／被分析物複合体および（２）固定化捕獲試薬／指示薬複合体の複合体が生 成する。あるいは、固定化された特異的結合物が、被分析物または指示薬に対す る結合をテスト試料被分析物と競合する被分析物類似物であってもよい。競合測 定法では、固相と会合する標識物の量が試料中の被分析物の量と逆相関する。す なわち、陽性のテスト試料は、信号の減少を生じる。

これらの結合法では、テスト試料中の被分析物の有無または量が、通常は、固相 と会合した標識物の有無または量を検出することによりめられるが、遊離または 未結合の指示薬を検出することもできる。競合測定法では、テスト試料中に存在 する被分析物が多いほど、固相上に存在する標識の量が少ない。サンドイッチ測 定法では、テスト試料中に存在する被分析物が多いほど、固相上に存在する標識 の量が多い。

下記実施例で特定的に記載するように、いくつかの新規組換え酵素を種々の免疫 グロブリンと化学的に結合させることにより、酵素免疫測定法（ＥＴＡ）で使用 するための抱合体を形成した。例えば、プラスミドｐＭＡ１１０、ｐＭＡｌｌｌ 、９ＭＡ１１２、ｐＭＡ１１３およびｐＭＡ１１５により発現される突然変異体 酵素を、ヘテロニ官能性カップリング試薬により、抗−α−フ二トプロテインモ ノクローナル抗体（抗−ＡＦＴ抗体）に結合した。これらの抗体／酵素抱合体は 、後に指示薬としてＥＴＡで使用した。例えば、ＡＦＰ標準曲線を、突然変異体 プラスミドｐＭＡ１１３由来の新規アルカリホスファターゼ酵素と結合した抗− ＡＦＴ抗体を使用する測定法で作った。

ｐＭＡ　１１３酵素／抗体指示薬により標準曲線が得られた。

これは、同様の測定条件下で哺乳類酵素／抗体指示薬により得られるものに相当 した。ヘテロニ官能性カップリング試薬の使用は、その分野では周知であり、特 定のへテロニ官能性カップリング試薬が、本発明の新規を指示薬に必須ではない 。

新規アルカリホスファターゼ酵素はまた、癌抗原１２５および抗癌胎児性抗原抗 体、癌抗原１９−９Ｆａｂ断片およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗体などのい くつかの他の蛋白質に化学的に結合させた。これらは全て、検出可能な物質を生 じ、それにより反応成分の有無または量を指示する酵素基質の添加によりアルカ リホスファターゼの有無を検出する自動化ＥＩＡでうまく使用されている。多く のアルカリホスファターゼ基質は、アルカリホスファターゼ標識を使用する結合 測定法での使用に利用できる。通常使用される基質は、ｐ−ニトロフェニルリン 酸エステル（ｐＮＰＰ）　、５−クロロ−４−ブロモ−３−インドリルリン酸エ ステル（ｘ　ｐ）およびメチルウンベリフェリルリン酸エステル（ＭＵＰ）であ る。ＭＵＰおよびｐＮＰＰ基質は、免疫測定法で使用されることが多い。結合測 定法の別の態様として、指示薬は、酵素基質で標識した特異的結合物を含むこと ができ、アルカリホスファターゼ酵素を添加して検出可能な信号を生じる。

次に、本発明を下記実施例により説明するが、本発明は、以下の実施例により隔 室されるものではない。

実施例１ 突然変異体および合成野生型ｐｈｏＡ遺伝子の作製ａ、オリゴヌクレオチド合成 本発明に必須ではないが、アルカリホスファターゼ遺伝子の突然変異誘発および その遺伝子の発現を可能にするために合成ｐｈｏＡ遺伝子を構築した。合成遺伝 子の構造は、Ｃｈｔａｌら１Ｇｅｆｉｅ　４４．　１２１−１２５　（ＩＨ６１ （参考文献として本明細書に添付する。）に開示されている野生型大腸菌アルカ リホスファターゼ遺伝子の配列に基づいた。この遺伝子は、大腸菌のコドンを優 先し、約５０〜１００塩基対の間隔でそれぞれ異なる制限部位を有するように設 計した。ｐｈｏＡ遺伝子を構築するために、ＭＩｄｅｅｋｉら、　Ｇｅ＋＋ｅ、 　６８．　１０１−１０７　（１９８ｇ）　（参考文献として本明細書に添付す る。）に開示されている、Ｆｏｋｌ法の遺伝子合成を使用した。ｐｈｏＡ遺伝子 配列は、長さが各々７３塩基対の２１個のオリゴヌクレオチド部分配列に分割し た。Ｆｏｋ　Ｉアームに対応するさらに３０個の塩基を各部分配列に付加し、切 断部位の各々の側で切断したプラスミドＤＮＡにオーバーラツプさせてアニーリ ングした。

オリゴヌクレオチドを、５°−ジメトキシトリチルヌクレオシド　β−シアノエ チルホスホラミディテスを使用して＾Ｈｌｉｔｄ　Ｂｉｏ＋ｙ＋ｌ＋ｓ　３８０ Ｂ　Ｂｎｌｈｅ＋ｉｘｅ＋　（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓＨ１ｅｍ＋、Ｆｏｉｌ ｅ＋Ｃ１ｔｙ、ＣＡ　）により合成した。オリゴヌクレオチドの精製は、１０％ ポリアクリルアミドゲル（１０％ポリアクリルアミド、７．０Ｍの尿素、および ＩＸＴＢＥ　（８９ｍＭのトリス−ホウ酸塩、８９ｍＭのホウ酸、２．０ｍＭの エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））　）上でゲル電気泳動を使用して行つな 。ＤＮＡをＵＶシャドウィングにより可視化し、１０３塩基対部分配列に対応す るバンドをゲルから切り取った。オリゴヌクレオチドを、切り取ったゲルの部分 から、１　ｍ　ｌのマキサム溶離緩衝液（０，５Ｍの酢酸アンモニウムおよび１ ｍＭのＥＤＴＡ）により３７℃で１６時間溶離した。残留ポリアクリルアミドを 除去するために、溶離したオリゴヌクレオチドをフィルター（０゜２μＭの　Ｃ ｅ＋＋ｌ＋＊ｘフィルター；　５ｃｈｌｃｉｃｂｓ＋　＆　５ｃｂａｅｌｌ、ｌ ｅｅ、。

Ｋ＊ｅｎｅ、　ＮＨ）に通した。精製したオリゴヌクレオチドを５倍体積のエタ ノールにより析出させ、水（５０ｕｌ）に再懸濁して、ベックマンＤＵ−７分光 光度計（Ｂｅｃｋｉｘｎ　ｌｎ＋ｌ＋ａｍｔａｔ＋、　Ｐｓｌ。

＾１１ｏ、　ＣＡ）により定量した。合成オリゴヌクレオチドの配列を図１（ａ ）〜（Ｃ）に示す。

ｂ、ＤＮＡのクローニング プラスミドベクターでの合成オリゴヌクレオチドのクローニングは、上述した架 橋突然変異誘発により行った。クローニングのために選択したプラスミドは、上 述したｐＷＭ５００およびｐＷＭ５０１であった。

クローニングベクターをＳｍａ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼで切断した。切断し たプラスミド（約５０　ｎ　ｇ）を３０μＩの変性緩衝液（１０ｍＭのＫＣＩ、 ５ｍＭのトリス−ＭＣＩ　ｐＨ８，０，５ｍＭのＭｇＳＯ４および０．５ｍＭの ジチオトレイトール）中でオリゴヌクレオチド部分配列（２０ピコモル）と混合 した。試料を沸騰水浴中、１００℃で３分間加熱し、５分かけて室温に冷却した 。次いで、試料を、Ｖｉｚｉｒｓら、　Ｇｅｅｅ。

Ｖｏｌｕｍｅ　＋９．　ｐｓＨｓ　２５９−２６８　（１９８２）　（参考文献 として本明細書に添付する。）に記載の冷却したコンピテントＪＭ８３宿主細胞 （１００μｌ：ａｒａ、Δ（Ｉａｃ−ｐｒｏＡＢ）、５ｔｒＡ、ｔｈｉ、Ｆ８０ ｄ、］ａｃＺΔＭ１５）と混合した。７Ｍ８３細胞は、Ｍｗａｄｅｌら、１．　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、Ｙｏ１ｗｍ！５コ、ｐｉｅｓ　ｌ５９−１６２　＋１９ ７０１　（参考文献として本明細書に添付する。）に開示されたＣ　ａ　Ｃｌ　 ｚ法により作成した。混合物を氷上で５分間冷却し、次いで３７℃で３分間、熱 ショックを与えた。約２ｍｌのルリア流体培養基（ＬＢ）（１＊にっき、バクト ートリブトン１０ｇ１バクトー酵母抽出物５ｇおよびＮａＣ１１０ｇを含む。ｐ Ｈ７，５）を形質転換混合物に添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベート した。次いで、形質転換された細胞をＳｏ＋ｙｔｌｌ　ＧＬＣ−２Ｂ卓上遠心分 離機（４，ＯＯＯｒｐｍ、５分間）で遠心分離することにより濃縮した。細胞を ＬＢ培地（１００μｍ）に再懸濁し、アンピシリン耐性を有するコロニー、すな わちプラスミドを含む細菌細胞を選択するために５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリル−Ｄ−ガラクトシド（１，６ｍｇ）およびアンピシリン（ＬＢ培地／ アンピシリン；　１００μｍ。

２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地上でプレート培養した。プレートは３７℃で１ ５時間インキュベートし、β−ガラクトシダーゼ発色分析により形質転換体に着 目した。

クローニングした２１個のオリゴヌクレオチドの各々に対して４個の細胞コロニ ーを選択した。各単一コロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ 培地（Ｑ、５ｍ１）１．ニー接種した。培養物を、５時間一定に攪拌しながら、 ３７℃で増殖させた。次いで、２１個の個々の細胞培１（すなわち、各オリゴヌ クレオチド配列に対応して１個ずつ）をプールし、アンピシリンを含む１１のＬ Ｂ培地に添加して、６００　ｎ　ｍでの光学密度が０．６５になるまで２．５時 間増殖させた。プールした部分配列を４個ずつ培養したのは、オリゴヌクレオチ ド部分配列の合成中に生じた可能性がある別の突然変異を含むサブクローンを避 ける目的である。培養物は、Ｆｒｅｉｋｔｌ　ら、　ＤＮＡ。

Ｖｏｌａａｅ　５．　ｐＢｅ＋　５３９−５４４　（１９８６）　（参考文献と して本明細書に添付する。）に開示されたように、クロラムフェニコールととも に増殖させ、３７℃で１６時間インキュベートした。

ｃ、ＤＮＡ断片挿入物の構築 形質転換された細胞を遠心分離（１０，ｏｏｏｘｇ、５分。

４℃）により取り出した。細胞を溶解し、プラスミドＤＮＡを、Ｂｉ＋ｎｂｏｉ ｍら、Ｎｗｃｌｓｉｃ　Ａｃｉ＋ｌ＋　Ｒｅ＋ｅｔ＋ｅｂ、ＶｏｌＩｍｅ　７． 　ｐａｔ　１５Ｎ（１９７９１（参考文献として本明細書に添付する。）に開示 されたように塩化セシウム密度勾配により精製した。

プールした４個の試料の精製プラスミドＤＮＡをＦｏｋ　Ｉで消化してＤＮＡ断 片挿入物を得た。約２５０μｇのプールした部分配列プラスミドＤＮＡを、５０ ０μｌの緩衝液（２０ｍＭ（７）ＫＣＩ、１０ｍＭ（７）トリ７−ＭＣｌ　ｐＨ ７，５およ？ｔ。

ｍＭ（ＤＭ　ｇ　ＣＩ　２）中、３７℃で２．５時間、２００単位のＦｏｋ　Ｉ で消化した。消化したものを６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、 ７３塩基対のオリゴヌクレオチド部分配列に対応する断片を取り出した。断片の 溶離は、実質的に、上記実施例１のａ、で記載したオリゴヌクレオチド精製に使 用した方法に従って行った。

精製したＦｏｋ　Ｉ断片は、水（１５μｌ）に再懸濁した。４個の試料の各々の アリコート（０，５μｌ）を０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、得ら れたＤＮＡの大体の濃度をめた。推定した定量値に基づいて、プールした４、５ μｇのＦｏｋ　Ｉ断片を各試料から得た。

ｄ、大腸菌突然変異株 発現力の高い、機能性アルカリホスファターゼ蛋白質を得るために、前記の２１ 個の断片挿入物を合成プラスミドのｐＷＭ５１８と連結した。この発現系では、 合成ｐｈｏＡ遺伝子が、ラクトースプロモータおよび天然ｐｈｏＡ遺伝子のリポ ソーム結合部位の制御下にあった。５０ｎＨの各断片を使用して、１５０ｎｇの Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ切断ベクターと連結した。

突然変異誘発のないｐｈｏＡ遺伝子（ｐＭＡｌｏｏと命名）を得るために、等し いアリコートの４個のプラスミド試料を合わせた。ｐＭＡｌｏｏの制限地図を図 ２に示し、ユニークな制限部位を有する合成の野生型大腸菌アルカリホスファタ ーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図３（ａ）〜（ｂ）に示す。

オリゴヌクレオチド部分配列とベクターとの連結は、連結混合物（１０μｌ　： 　６０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）；　５ｍＭのＭｇ　Ｃｌ　ｘ　；　０．　４ ｍＭのアデノシン三リン酸；および１０ｍＭのジチオトレイトール）中で行った 。酵素リガーゼ（Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ）を添加する前に、試料を４２℃で１５ 分間インキュベートした後、４℃で１．５時間放置した。リガーゼを添加した後 、試料を０℃で１６時間インキュベートした。連結反応は、５％アクリルアミド ゲル（１１５０ビス−アクリルアミド）上で分析することにより終了を確認した 。連結物質の移動により、ｐＷＭ５１８のｐｈｏＡ遺伝子の全長に対応する３゜ ５キロ塩基の断片および部分的に連結した断片と連結していない断片とのはしご であることが示された。次いで、連結混合物を５Ｏ３−１宿主細胞（Ｆ−、ｒｅ ｃＡｌ、ｇｙｒＡ９６．ｔｈｉ、ｈｓｄＲ１７，（ｒｈ−ｍｋ’）＋　５ｕｐＥ ４４．ｒｅｌ　Ａｌ、Ｉ−：　Ｓｌ＋５ｌＢｅｎｚ、　Ｓｔｎ　Ｄｉｅｇｏ、　 ＣＡ）で形質転換した。

形質転換法は、Ｈ＊ｎ＊ｈ＠ｎ、Ｉ、　Ｍｏ１．　［１ｉｏ１．、　Ｖｏｌ■ｅ 　１６６、　ｐｕＣ雲５５７−５８０　（１９８３１（参考文献として本明細書 に添付する。）に記載の方法に従って行った。５Ｃ３−１細胞（１００μｌ）を 溶かして、予め冷却したポリプロピレンチューブ（１５ｍｌ；Ｆｉｌｅｏｎ　２ ０５９．　Ｆｉ＋ｈｅ＋　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｐｉ口＋ｂｗＢｈ、　ＦＡ 　）に分注した。β−メルカプトエタノール（１，４Ｍ、１．７μｍ）を細胞に 添加し、０℃で１０分間、静かにかきまぜた。ｌｎＨのプラスミドＤＮＡを細胞 に添加したとき、最高の形質転換効率が得られた。すなわち、複製プラスミドを 含む宿主細胞が最大数であった。表２に示す混合物の種々の希釈物について調べ た。

試料を氷上で３０分間インキュベートし、４５℃の水浴で４５秒間熱し、氷上で ２分間インキュベートした。ＳＯＣ培地（０，９ｍ１）を添加し、試料をインキ ュベートした（２２５ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間）。（ＳＯＣ培地 は、１１につき、バクトートリブトン２０ｇ１バクトー酵母抽出物５ｇ、１０ｍ ＭのＮａＣ１および２．５ｍＭのＫＣＩを、２Ｍの濾過−滅菌Ｍｇ溶液（１ｍｌ ／１００ｍ１のＳＯＣ；　ＬＭのＭｇＳＯ４を有するＩＭのＭｇＣ＋、］および ２Ｍの濾過−滅菌グルコース溶液（１ｍ　ｌ　／　１００　ｍ　ｌの５ＯＣ）と 混合して含む。）インキュベージコン後、細胞を、１１０００ｒｐで１０分間遠 心分離することにより濃縮した。得られたペレットを５ＯＣ（２００μｌ）に再 懸濁し、アンピシリン（５０μｇ／　ｍ　Ｉ　）を含むＬＢ培地上にブレーティ ングした。

合成アルカリホスファターゼの産生がＢＣＴＰの使用により青色を呈することに より確認されたコロニーを、各プレートに添加した水〔１００μＩ　：　２０ｍ ｇ／ｍ　Ｊ）に懸濁した。形質転換効率を表２に示す。５Ｃ３−１細胞は、通常 コントロールとして使用されるｐＵｃ９プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（Ｂｅｌｂｅｓ ｄｔ　Ｒｅ５ｕ＋ｅｈ　Ｌｔｂｏ＋ｔｌｏｒｉｅ＋、　Ｇ＋１ｌｂｅ＋ｓｂｅ＋ ｇ、　ＭＤ）でも形質転換を行って、形質転換効率の対比定量測定を行った。５ Ｏ３−１宿主細胞の全形質転換効率は、約２Ｘ１０’コロニー／μｇ　ｐＵＣ９ ＤＮＡであった。Ｓｌ＋５ｌＢｅｎｚが記載する効率は、１×１０９コロニー／ μｇ　ＤＮＡより大きい。

６個の形質転換体（６個の青色コロニー）しか、機能性合成ｐｈｏＡ遺伝子の存 在を示さなかったので、天然配列を分析するために、形質転換プロトコルを繰り 返してより多くのクローンを得た。全部で１６個のコロニーを、形質転換した５ ＣＳ−１細胞から拾い上げ、プラスミドＤＮＡを、Ｂｉｒ＋＋ｂｏｉｍら、　Ｎ １ｃｌｌｉｔ　Ａｃ１ｄ＋　Ｒｅ＋、７．　１５Ｎ　（１９７９１（参考文献と して本明細書に添付する。）に開示されたｍ１ｎｉｐｒｅｐ法により単離した。

各試料のアリコートをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ［で消化し、分子量マーカー （ＤＮＡ／Ｈｉｎｄｍ断片、ＦＸ１７４ＲＦＤＮＡ／Ｈａｅｌｌ［断片および１ キロ塩基のＤＮＡのはしご；Ｂｃｌｈｅ＋ｄｚ　Ｒ＋＋ｃ１＋ｃｈ　Ｌ＋ｂｏ＋ ｔｌｏ＋ｉｅ＋、　Ｇ５１ｌｈｅ＋＋ｂｗＢ、　ＭＤ）とともに０．８％アガロ ースゲル上で電気泳動にかけた。消化した１６個の試料は全て、大きさが全長の アルカリホスファターゼ遺伝子に対応する１　４キロ塩基の挿入断片を含むと思 われた。

４個のクローンを１６個の試料から選び、プラスミドＤＮＡを、　Ｒｇｄｌｏｌ ｌら、Ｐｔｏｃ、Ｎａ１１．　＾ｃｏｄ、Ｓｔｉ、、Ｖｏｌｌｓ　５７．　ｐＨ ｔ＋１５１４−１５２１　＋１９６７１　（参考文献として本明細書に添付する 。）に開示されたＣｓＣｌ勾配により、個々に単離・精製した。試料の塩基配列 決定を、５ｒｎＨ＋ら、　Ｐｔｏｃ、　Ｎｔｌｌ、ＡｃＩｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖ 。

ｌｉｍｅ　７４．　ｐｅｅｌ　５４６３−５４６７　（１９７７）に開示された 多重復配列プライマーを使用するサンガージデオキシ法により行った。４個の試 料は全て、同じ突然変異を含み、１１９１のＣがＴに、１２２０のＴがＣに、１ ３３３のＡがＧになっていた。最初の突然変異はアミノ酸に変化を及ぼさないが 、残りの変化は、Ｖａｌ”’＞ＡｌａおよびＳｅｔ”’＞Ｇｌｙの突然変異にな った。得られたクローンをｐＭＡｌｌｏと命名した。

ｅ０合成の野生型大腸菌株の調製 野生型ｐｈｏＡ遺伝子（ｐ　Ｍ　Ａ　１００　）を、その後のＤＮＡ修飾により 高められた特異的活性を有するアルカリホスファターゼをコードするためのベー スとして使用した。さらに、合成野生型微生物由来のアルカリホスファターゼは 、突然変異体酵素の評価および市販の大腸菌アルカリホスファターゼとの対比に おいて有用であった。合成の野生型ｐｈｏＡ遺伝子を得るために、９ＭＡ１１０ プラスミドの既存の遺伝的突然変異を修復する必要があった。実質的に実施例１ ａに記載のプロトコルに従って作った合成オリゴヌクレオチドを使用して、突然 変異配列を野生型配列で置き換えた。突然変異の位置の故に、２４６塩基対に対 応するＢｇｌＩｒ／５ｐｈｌ断片は置き換える必要があった。

９ＭＡ１１０プラスミド（約１０μｇ）を１×培地塩緩衝液（１００μＩ　；　 １００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５および１０ｍＭ のＭ　ｇ　Ｃｌ　ｘ　）中、３７℃で１６時間、ＢｇｌＩＩ（７５単位）で消化 した。消化完了を調べるために、アリコートを０．８％アガロースゲル上で電気 泳動にかけた。塩濃度を１５０ｍＭＮａＣ１に増加し、ＤＮＡをさらに、３７℃ で１６時間、５ｐｈｌ（６０単位）で消化した。

得られた３、２キロ塩基のプラスミド断片を５％ポリアクリルアミドゲル（１１ ５０ビス−アクリルアミド）上で精製し、ＤＮＡを実質的に上記１ａで記載した 方法に従って抽出した。

取り出した突然変異体Ｂｇｌｎ／５ｐｈｌ断片を、天然配列のＢｇｌＩ［／５ｐ ｈｌ断片に対応する３個の相補的合成オリゴヌクレオチド（各々の長さは約８０ 塩基）で置き換えた（合計２４７塩基対）。約４ピコモルの各合成オリゴヌクレ オチドを、Ｒｉｃｈ＋＋ｄｔｏｎら、ＰＩＯＣ，Ｎ１１ｌ　＾ｅｘｄ、Ｓｃｉ、 、２．　８１５　（１９７１１（参考文献として本明細書に添付する。）に開示 されているように、Ｔ４　ＤＮＡキナーゼ（３゜０単位；　Ｂｃｌｌ＋ｃ＋ｄｒ 　Ｒｅ＋ｅ＋＋Ｃｈ　Ｌ＊ｂ。

＋＋ｉｏ＋ｉ＋＋、　Ｇ暑ｉ１ｈ＋＋＋ｂｅＢ、　ＭＤ）を使用して、１×連結 緩衝液（１５μＩ　；　６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，５ｍＭのＭｇ Ｃ１ｚ　、０．４ｍＭのＡＴＰ）中、３７℃で３０分間、キナーゼ処理した。相 補的オリゴヌクレオチドを７０℃で５分間インキュベートし、１．５時間、４℃ にゆっくり冷却することによりアニーリングした。次いで、アニーリングされた オリゴヌクレオチドを、精製した３、２キロ塩基の合成プラスミドに連結した。

連結、形質転換およびインキュベーション法は、実質的に上記で記載した方法に 従って行ったが、得られる合成プラスミドは、ＭＺ１３ｂ宿主細胞でクローン化 した。

約２００個の青色のコロニーおよび１２０個の白色コロニーが得られた。４個の 青色コロニーを選択し、ｍ１ｎｉｐｒｅｐＤＮＡを実質的に上記で記載した方法 に従って調製した。置換した、または修復したオリゴヌクレオチド部分配列に対 応する領域は、実質的に上記で記載した方法に従って、サンガーのジデオキシ法 により塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定がなされたクローンは全て、野 生型ｐｈｏＡ配列を含んでいた。

天然および突然変異体のアルカリホスファターゼから得られたコロニーの色の強 度を対比すると、突然変異体コロニーの方が、天然コロニーより濃い青色であっ た。

実施例２ 突然変異体をスクリーニングするための天然ｐｈｏＡの改善された発現 高められた特異的活性を存するアルカリホスファターゼ突然変異体を高感度で色 選別するのは、天然アルカリホスファターゼが示す色が強烈であるために困難で あった。突然変異体を天然アルカリホスファターゼと区別するためには、天然ｐ ｈｏＡの発現を低下させる必要があった（すなわち、青色の薄い天然コロニーを 得る必要があった）。アルカリホスファターゼの発現レベルは、ｐｈｏＡの５ｈ ｉｎｓ−Ｄ＋ｌ（＊＋ｎｏ配列（Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ａ）を変性配列で置き換え、 ＢＣＩＰ基質を用いて青色の薄いコロニーを選び低下させた。

天然リポソーム結合部位を除去するために、Ｉ）ＭＡｌｏｏ（１５μｇ、実施例 １ｅ）を１×培地塩緩衝液中、３７℃で１６時間、７５単位のＢ　ａ　ｍ　ＨＩ により消化した。塩の濃度を１５０ｍＭのＮａＣｌに増加させ、ＤＮＡをサラニ 、３７℃で１６時間、７５単位の５ａｌｌで消化した。リポソーム結合部位は、 実施例１に記載したように、架橋突然変異誘発により、適当な位置に変性配列を 有するオリゴヌクレオチドを付与することによって置き換えた。種々のレベルの アルカリホスファターゼ活性を示す約１，０００個のクローンが生じた。

非常に淡い青色から中位の青色の３個のコロニーを単離し、実質的に実施例１に 記載の手順に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。各試料で生じた突然変異のリ ポソーム結合部位の構造を決定するために、実質的に実施例１に記載の手順に従 って、サンガージデオキシ配列決定法を再び使用した。配列結果は、配列決定さ れた形質転換体が、１）リポソーム結合部位の全欠失、または２）ＡＴＧＧＣも しくはＣＡＡＴＡの配列を含むリポソーム結合部位のいずれかを有す゛ることを 示した。ＡＴＧＧＣリポソーム結合部位に対応する試料は、最も淡い青色を呈し 、ソーム結合部位を有する天然ｐｈｏＡを含むこのｐＭＡ１０１合成プラスミド ベクターを使用して行なった。

実施例３ 天然アルカリホスファターゼの突然変異誘発アルカリホスファターゼの特異的活 性を高めるために、酵素の突然変異誘発を、酵素の活性領域または触媒残基３　 ｅｒ＋ｏｚから約１０人〜約２０人内の範囲に対して行った。突然変異誘発の標 的としたアミノ酸は、ｖａ１９９、Ｔ　ｈ　ｒ　”’　、Ａ　ｓ　ｐ１０’　％ Ａ　Ｉ　ａ”’　、Ｔｈ　ｒ”’およびＬ　ｙｓ３２８であった。アミノ酸Ｖａ １９９、Ｔｈｒ”０、Ａｓｐ”’　、Ａｌａ”’およびＴ　ｈ　ｒ　”’は、触 媒残基５ｅｒＩ０２に近いので、突然変異誘発として特に重要である。また　Ｌ 　７３３２ｇは、正の電荷を有し、酵素の活性部位のすぐ近くにあるので重要で ある。

Ｖａ１９９、Ｔ　ｈ　ｒ　”’およびＡｓｐｌｏｌのアミノ酸の突然変異誘発は 、ｐＭＡｌｏｌの３ｎａＢＩ制限部位およびＬ　ｙｓ３２８に対するＣ１ａｌ制 限部位での架橋突然変異誘発により行った。Ａｌ　ａ１０３およびＴ）、ｒ１０ ７に対しては、９ＭＡ１０１プラスミドを５ｎａＢｒおよびＥｃｏＲＶで消化し た後に架橋突然変異誘発を行った。合成オリゴヌクレオチドは、実施例１に記載 したように、各合成オリゴヌクレオチドが突然変異を受けるべきアミノ酸に対し て変性配列を含むように作った。

突然変異を受ける各残基に対して可能な全アミノ酸置換を含むクローンライブラ リーを得るために、架橋突然変異誘発の標準方法のスケールを５倍に増加させた 。ｐＭＡ１０１ベクター（２５０μｇ、実施例２）を５ｎａＢＩ　（９９，１０ ０および１０１での突然変異用）　、Ｃ１ａ　ｒ　（３２Ｂでの突然変異用）ま たは５ｎａＢ＋およびＥ　ｃ　ｏＲＶ　（１０３および１０７での突然変異用） のいずれかで完全に消化した。消化したベクターおよび合成オリゴヌクレオチド の一つ（１００ピコモル）を混合し、１００℃で３分間加熱した。試料を５分間 冷却し、コンピテントＪＭ８３細胞（５００μｍ）に添加した。形質転換混合物 を氷上で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で３分間、熱した。ＬＢ培地 （２，０ｍ１）を各試料に添加し、その試料を３７℃で６０分間インキュベート した。細胞を遠心分離によりペレット化し、ＬＢ培地（１００μｌ）に再懸濁し 、ＬＢプレート（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１．０μｇ　／　ｍ　 ｌのＢＣＩＰを含む）上に拡げた。プレートを３７℃で１６時間インキュベート した。リポソーム結合部位の突然変異によりｐｈｏＡの発現が低下しているので 、プレートをさらに室温で６時間インキュベートした。バックグランドと比較し て濃い暗青色のコロニーを、高められた特異的活性を有するｐｈｏＡ突然変異体 として記録した。

青色のコロニーを選択し、実質的に実施例１に記載した方法に従って、サンガー のジデオキシ塩基配列決定のために、ｍ１ｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製した。突然 変異結果を表３に示す。また、天然アルカリホスファターゼと比較して、突然変 異体の特異的活性に関する正確なデータを得るためには、各試料から精製蛋白質 を得る必要があった。

表３ 突然変異誘発の結果 突然変異を受けたアミノ酸　コロニーの数　：ｌＦ：／ｐＭＡＩＩ４　２６０　 暗青色　ＧＣＡ、ＧＣＴＶａ　Ｉ”＞Ａ　ｌ　ａ　３８０　淡青色３６８０　白 色 ｐＭＡｌｌｌと１１２　２３　暗青色　ＧＴＡ／ＡＴＣＴｈ　ｒ”’　＞Ｖａ　 ｌ　３１６　淡青色Ｔｈｒ’°’＞Ｉｌｅ　７６　白色 ｐＭＡＩＩ５　１３０　暗青色　ＴＣＡ、ＴＣＣＡｓｐ”’　＞Ｓｅｔ　２６０ 　淡青色４２１１Ｇ　白色 ｐＭＡ１１６　２７０　暗青色　ＧＣＴＬｙｓ３２”　＞Ｓｅｔ　４９０　淡青 色Ｖａｌ”　＞　Ａｌａ　１３４０　白色ｐＭＡ１１７と１１８　２３　暗青色 　ＧＡＴ：ＴＧＴＡｌａ１０’　＞Ａｓｐ　＋４１　淡青色Ａ　ｌ　ａ”’　＞ Ｃｙ　ｓ　ＩＩＩＱ　白色ｐＭＡＩＩ９　１５　暗青色　ＧＴＧ Ｔｈ　ｒ”’　＞Ｖａ　ｌ　Ｂ？　淡青色１６６　白色 表３は、特異的活性の高いアルカリホスファターゼ酵素突然変異体が得られたア ミノ酸突然変異の形質転換効率を表す。濃青色のコロニーは、高められた特異的 活性を有するアルカリホスファターゼ突然変異体を表し、淡青色のコロニーは、 天然のアルカリホスファターゼに匹敵する特異的活性を有する突然変異体であり 、白色のコロニーは、特異的活性が低下した突然変異体であった。ｐＭＡ１１３ 　（Ｌｙｓ””　＞Ａｒｇ）は高い特異的活性を育するので、これ以後の突然変 異誘発に使用した。

例えば、ｐＭＡ１１６は、９ＭＡ１１３プラスミドのＶａ１９９をさらにＡｌａ に変化させて得られた。各アミノ酸置換に対して得られるコドンは、サンガーの ジデオキシ塩基配列決定法により確認した。

実施例４ アルカリホスファターゼの精製 天然および突然変異体のアルカリホスファターゼ酵素の酵素活性を測定するため には、充分な量の酵素を得なければならない。各試料に対して、２１振とうフラ スコ醗酵を行った。最初の培養は、２０ｍＭのグルコースを含むＬＢ培地／アン ピシリン（４０ｍｌ）で単一コロニーを一夜培養した。グルコースの添加により 、アルカリホスファターゼの微生物発現が抑制された。これは、本発明の発現系 では、ｌａｃプロモーターにより制御される（ＩｌｔｇｓｓＩｉｋ　Ｂ、　Ｔｈ ｅ　ＬＩｃｌｏ＋ｅ　Ｏｐｅ＋ｏｎ、Ｃｏ１ｄ　５ｐａｉＩｌ（ＨＩｒｂｏｒＬ ｓｂｏ＋＊ｌｏＢ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ＋ｉＢ　Ｈｔ＋ｂｏ＋、ＮＹ、１８９−２１ ９゜１９７０）。培養は、フラスコ（２５０ｍｌ）中で一夜、激しく振とうしな がら３７℃で増殖させた。培養物を１０分間遠心分離しく４，０００ｘｇ）、上 清を捨てて、ペレットをＬＢ培地／アンピシリン（４０ｍｌ）に再懸濁した。２ １のＬＢ培地／アンピシリンを含む６１フラスコに一夜培養したものを接種し、 ３７℃で約６時間、激しく振とうしながらインキュベートした。

アルカリホスファターゼの精製は、下記方法に従って行った。

６００ｎｍでの光学密度が１．３〜１．４に達すると、形質転換した細胞を遠心 分離（４８００ｒｐｍ、２０分、４℃）により取り出した。アルカリホスファタ ーゼを抽出するために、Ｅｗ１ｎ＋、ら、　ＩｏａｒｎＩｌ　ｏｆ　Ｉｎ１ｅｃ ｌｉｏＩｌｔ　Ｄｉ＋ｅ＊ｓ■、ＶＯＩＩ１１！　１３３゜ｐ＊ｇｅ＋　５９７ −Ｓ＋０２　（１９７６）　（参考文献として本明細書に添付する。）に開示さ れたように、２１の培養ブロスから得た細胞を０．１５Ｍの冷トリス−ＨＣｌ緩 衝液（ｐＨ６，６）（８０ｍｌ；０．９％のＮａＣｌおよび６ｍｇ／ｍｌのポリ ミキシンＢ）に懸濁した。３７℃の水浴中で７〜１０分間インキュベートした後 、細胞を遠心分離（８，０００Ｘｇ、５分、４℃）により除去した。

ポリミキシンＢ抽出物を、４℃で固体の硫酸アンモニウムをゆっくり添加して８ ５％飽和にし、次いで、４℃で２４時間、ゆっ（り攪拌した。得られた沈澱を遠 心分離（８，ＯＯＯＸｇ。

５分、４℃）により取り出して、０．０２Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８， Ｏ；　１ｍＭのＭｇＣ１，を含む）に再懸濁した。試料の透析を、４℃で、８〜 １２１の０．０２Ｍ）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，Ｏ；　１ｍＭのＭｇＣ１， を含む）に対して行った。次いで、試料を、限外濾過細胞（八ｍ１ｃｏｎ、　Ｍ ｏ＋１ｓ１８０５Ｇ、Ｏ■マｅｒｒ、　Ｍ＾）を使用して５〜１０倍に濃縮した 。

アルカリホスファターゼの等電点クロマトグラフィーを、１ｌｌｏｎｏ　Ｐ　） ＩＲ５１５カラムおよびＰｏ１７ｂｍｌｌｔ＋　７４および９６　Ｃ８ｉＨｍｓ ＣＣ８１Ｈ春Ｉ　Ｃａｍｐｓロア、Ｈ，Ｌｏｌｃ、　ＭＯ）を使用して、高速淡 白液体りＯマドグラフィー系（Ｐｈ＊＋ｍ＊ｃｉ３　Ｐｉ＋ｃｔｌｔｖｔ７．　 Ｎｌ　）で行った。カラムを０．０２５Ｍ（７）ビス−トリス−ＣＨ，Ｃ００Ｈ （ｐＨ６，９；　１ｍＭのＭｇＣ＋２を含む）と平衡にした。蛋白質を、Ｐｏ１ ７ｂｕｌｌｃ＋　−ＣＨ）　ＣＯＯＨ溶液（ｐＨ５，５；６％（Ｖ／Ｖ）のＰｏ １７ｂｗｌｆｔ＋　９６．６％（Ｖ／Ｖ）のＰ＋１７ｂ＠１ｌｅｒ７４および１ ｍＭのＭｇＣｌ□を含む）によりカラムから溶離した。これらの条件は、ｐＨ勾 配が６．５〜５．５で直線となり、活性蛋白質は、６．３〜６．１のｐＨで溶離 した。Ｐｏ１ｙｂｓｔ＋ｅ＋を、２０ｍＭのトリス（＋）Ｈ８，Ｏ；　１ｍＭの ＭｇＣ１，を含む）中で平衡になりでいるセファデックスＧ−７５上でゲル濾過 クロマトグラフィーにかけることにより、試料から除去した。

得られた酵素試料は次いで、＾５ｉｃｏｎ　Ｃｅ＋＋Ｉ＋１ｅｏ１１−３０　ミ クロ濃縮器を使用して３〜６倍に濃縮した。

実施例５ 精製したアルカリホスファターゼの分析精製した蛋白質の解析には、Ｌ＋ｅｓｍ ｌｉ、υ、に、、　Ｎ５１ｗ＋ｅ、　ＶＯＩＩＩ！２７７、　ｐａｔｅ　６８０ 　（１９７０１（参考文献として本明細書に添付する。）に開示されたドデシル 硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動がある。電気泳動により、単一 の主要バンドが示された。これは、染色された全蛋白質の９８％以上であり、分 子量４６，０００ダルトンに対応し、アルカリホスファターゼのモノマーの予想 される大きさである。遺伝子工学により得た各アルカリホスファターゼのこれら の条件下での電気泳動移動度は、市販の大腸菌アルカリホスファターゼ（Ｓｉ１ ｓｔ　）のそれと同一であった。

得られた突然変異体酵素の動力学定数（Ｖ　二、、およびに、）を、酵素基質ｐ 　Ｎ　Ｐ　Ｐ　（Ｓｉｇｎｓ　）および４−メチルウムベリフェリルリン酸（４ −Ｍ　Ｕ　Ｐ　；　Ｂｏｅｈ＋ｉＢｔ＋　ｌｌｓｎｎｈｅｉｍ、１ｎｄｉ＋ｎｔ ｐ。

ｌｉｄ、　ＩＮ　）を使用して、ＩＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，０；１ ｍＭのＭｇＣｌ、を含む）中、２５℃で測定した。

ｐＮＰＰ基質のｐ−ニトロフェノールへの変換を、ヒユーレット−ハラカード９ １５３Ａ紫外光度計を使用して４１０ｎｍでの吸収の変化（ｅ＝１．６２Ｘ１０ ’　Ｍ−’ｃｍ−’）を追跡して監視した。４−ＭＵＰ基質からのメチルウムベ リフエロンの脱離は、蛍光光度計（励起波長＝３４０　ｎ　ｍ　；発光波長＝４ ６５ｎｍ；　ｅ＝５．９Ｘ１０９Ｍ−’ａｍ−’）ｌ：より監視した。初期速度 を最初の５〜１０％の反応（ｒ＞０．９９７）からグラフによりめた。ｋｏ、お よびに７の値は、８個のデータのＬｉｎｅｖｅ＊ｔｅ＋−Ｂａ「翫プロットから 得た。

酵素の各々に対して得られた結果を表４にまとめる。突然変異体酵素は全て、天 然アルカリホスファターゼよりも高い特異的活性を育していた（基質としてｐＮ ＰＰまたはＭＵＰのいずれを使用しても）。ｐＮＰＰを用いて行った測定では、 酵素の特異的活性の増加が、１．６〜３，９倍の範囲であった。Ｋ１値は、突然 変異体プラスミドｐＭＡ１１３によって得られた酵素に対して最も劇的に増加し 、他の全ては相対的に不変か、わずかに改善された。すなわち、突然変異体は、 Ｋ−については有益な変化はないものの、高められた特異的活性の故に有用であ る。

表４ 突然変異体酵素の動力学定数 アルカリ本スフ７ターゼＶｍｓｘＫｍＶａｎＫｍ（Ｉｓｏｌ　ｍＨ−’　５ｉｎ −’）　ｆｓＭｌ　（ｕｏｌ　ｍＨ−’　５ｉｎ−’）　（１１１０ｐＭＡ　１ ００　５６　３０．１　１０６　９．３野生型 ｐＭＡ　１１Ｇ　９Ｇ　２３　１４２　１４．４ｐＭＡ　Ｉｌｌ　１２３　１９ ．８　１９０　ｔｏ、１ＴｈｅｌＯ’　＞Ｖｔｌ ｐＭＡ　１１２　１３３　２０．２　２２９　１０．２ＴＩ＋＋”’＞ｌ１ｅ ｐｉｔ八１へ３　２２０　９４．４　２１７　４７．７酵素の熱安定性を、下記 の方法に従って測定した。各アルカリホスファターゼの不可逆的熱不活化の時間 的経過を、酵素の溶液（２０μｇ／ｍｌ、０．０２Ｍのトリス−ＨＣｌ中で調製 、加熱温度でｐＨ７，５，１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）を一定温度の加熱ブロッ ク中でインキュベートシ、定期的に試料を取り出して２５℃で定量することによ り測定した。不可逆的熱不活化の一次速度定数および半減期を、半対数座標の回 帰直線によりめると、少なくとも０．９７の相関計数が全ての場合に得られた。

いくつかのアルカリホスファターゼの不可逆的熱不活化（８５℃、ｐＨ７，５） の時間的経過の例を表５に示す。

表　５ 不可逆的熱不活化の時間的経過 （分）　ｐ　Ｍ　Ａ　１００　ｐ　Ｍ　Ａ　Ｉｌｌ　ｐ　Ｍ　Ａ　１１２各突然 変異体酵素に対する同様の研究結果を表６にまとめる。

突然変異体酵素は全て、天然アルカリホスファターゼよりも速い速度で不可逆的 熱不活化を受けた。しかし、突然変異体酵素の熱安定性は、子牛の腸のアルカリ ホスファターゼの熱安定性（同様の測定条件下、７０℃でさえ、半減期は６分） よりも優れていた。

表６ 突然変異体酵素の熱安定性 ｐＭＡ　ＩＩＩ　８５　０．０３１　２２．６Ｔｈ　ｒ”’　＞Ｖａ　１ 実施例６ アルカリホスファターゼの動力学定数に対するｐＨの影響動力学定数（ＩＩおよ びＶ、、、）に対するｐＨの影響を、突然変異体ｐＭＡＩＬ５　（Ａｓｐ”’　 ＞５ｅｔ）および子牛の腸のアルカリホスファターゼ（ＢｏｅｌｕｉｎＢ＋　Ｍ ｌｎｅｈｃｉｍ、ｌ＋ｄｉＩｔｐ。

ｌｉｄ、ＩＮ　）の両方に対して測定した。測定は、基質として４−ＭＵＰを使 用して、２５℃で行った。メチルウムベリフエロンの基質からの脱離を、ヒユー レット−パラカード９１５３Ａ紫外光度計を使用して３６０ｎｍでの吸収の増加 （吸光計数は、メチルウムベリフェＯンを使用して実験により測定し、表７に示 す。）を追跡して監視した。５０ｍＭのトリス（ｐＨ８〜９．５）または５０ｍ Ｍのジェタノールアミン（ＳｉＨｔ＋　）（ｐＨ９〜１１）およびＮ　ａ　Ｃｌ 　（ＳｉＨｉｇ　）を含むイオン強度の低い緩衝液（１＝２００）を使用した。

初期速度を、最初の５〜１０％の反応（ｒｈｏ、９９５）からグラフによりめた 。

ｖｌｌ、およびに、の値は、６〜７個のデータのＬｉｅ＊ｖｅｓｙｅｒ−Ｌｏ＋ にプロットから得た。■１１．のに、１への変換は、子牛の腸のアルカリホスフ ァターゼおよび９ＭＡ１１５アルカリホスフアターゼに対して各々１５０，００ ０ダルトンおよび９４．０００ダルトンの分子量の値を使用し、また両方の酵素 の二量体につき２個の活性部位を使用して行った。結果を表７に示す。

表７ 基質として４−ＭＵＰを使用したアルカリホスファターゼの動力学定数に対する ｐＨの影響 （Ｍ−１ｃｍ−’）　ＬμＭ）　（＊Ｍ／分）　（秒−１）（μＭ）　（＃Ｍ／ 分）　（秒＝１）８、Ｑｌ、ＱＱｘｌＱ’　３．１　１１．４　３Ｇ　１．９　 ４１１．４　３０３ｇ、５　１．４ｘｌＯ’　６．７　２６．５　６９　１１２ 　５１１．７　３６７９．０＋、６２ｘｌＯ’　５０，３　６６．２　１？３　 ４３．９　９１．９　５７４ＬＳＩＪ５ｘｌＧ’　４１０　１７６　４５Ｓｌｉ １　１４１１　８７５１０、ＯＬ、６７ｘｌＯ’　１６６０　２６２　６８４　 ３４８　１８１　１１３０１０．５１．６８ＸｌＯ’　３５２０　２８４　７４ １　４７６２　Ｇ３２　３９５０１１ＪＩＪ９ｘｌｔｌ’３６３１１２３９６２ コＩＨＯ１１１１１６６９８０調べたｐＨ範囲のほぼ全体にわたって、両方の酵 素のに７およびｋ　、、、の値は、ｐＨとともに増加して（する。突然変異体の 大腸菌アルカリホスファターゼと子牛の腸の”アルカ１ノホスフアターゼとの間 のｋｌ、、の相違は、ｐＨ１０，０で最小である。

このｐＨでは、子牛の腸の酵素は、突然変異体の大腸菌酵素より１．６５倍速い に過ぎぬ。ｐＨ１０，０でに１値力（たとえ増加していても、新規酵素は測定法 の標識として使用するの１こ適している。同様の実験をこれらの酵素および天然 大腸菌アルカリホスファターゼ（ｐＭＡ　１００）に対して、基質としてｐＮＰ Ｐを使用して行った。ｐＮＰＰ基質のｐ−ニトロフェノールへの変換を、ヒユー レット−バラカード９１５３Ａ紫外光度計を使用して４１０ｎｍでの吸収の変化 （ｅ＝１．６２ｘｌＯ’Ｍ−’ａｍ−’）を追跡して監視した。これらの酵素の に２．、に対するｐＨの影響を表８に示す。新規酵素ｐＭＡ　１１５のに３．。

は、野生型アルカリホスファターゼよりもｐＨ１０，０でｔｔ　ｔｚ３６倍高か った。

表　８ 基質としてｐＮＰＰを使用するアルカ１」ホスファターゼのｋ　、、、に対する ｐｉ（の影響 アルカリホスファターゼのｋ　、ａｔ ｐＨｐＭＡｌｏｏ　ｐＭＡ１１５　子牛の腸８、０　８　３５　３４５ Ｂ、５　１０　７８　４８０ ９．０　１２　１５４　７６０ ９．５　１３　２５５　１００４ １０．０　３０　１０６８　２１１３ １０．５　３３　９４７　４６７５ １１．０　２８　９２７　７１７５ ｐＮＰＰに対して認められたこの傾向（よ、４−ＭＵＰでも同様であった。すな わち、ｐ）１Ｂから１０までｋｔ、、ｌｉ増加し、ｐＭＡ１１５と子牛の腸のア ルカリホスファターゼとのに２．１の相違はｐＨ１０で最小になる（２倍の相違 ）。天然大腸菌（ｐＭＡ　１００）と子牛の腸のアルカ１ノホスファターゼとの に、１．の相違はｐＨ範囲全般にわたって大きく、たとえｐＨ１０．０であって も、ｋｏ、１の相違は７０倍である。データにより、９ＭＡ１１５は野生型の大 腸菌アルカリホスファターゼよりも明らかに優れていることが示される。なぜな らば、子牛の腸のアルカリホスファターゼとの比較で、ｐＨ１０，０におけるｋ 　ｃ、、の相違が７０倍から僅か２倍に減少するからである。

実施例７ α−フェトプロティンのサンドイッチＥＴＡにおける突然変異体アルカリホスフ ァターゼの使用 酵素で標識した抗−ＡＦＰ抗体を、まず突然変異体酵素（実施例３に記載したよ うに調製した、ｐＭＡ１１３由来のアルカリホスファターゼ）およびモノクロー ナル抗−ＡＦＰ抗体を下記のように別々に処理して調製した。５０倍モル過剰の ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ ）／Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をアルカリホスファターゼの０． １Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２；１ｍＭのＭｇＣ１，を含み、最終ＤＭＦ濃度 は５％）における０、６ｍｇ／ｍ＋溶液に添加した。反応を２５℃で３時間行い 、その後、ＳＭＣＣ処理した酵素をＯ，１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２；　１ ．ＯｍＭのＭｇＣ＋２を含む）に対して、４℃で１８時間透析した。

０．１Ｍリン酸塩緩衝１＆（ｐＨ７，２；　１．ＯｍＭのＭｇＣｌ２を含む）に おける５、３ｍｇ／ｍｌの抗−ＡＦＰ抗体溶液を、２５℃で１時間、５００倍モ ル過剰の２−イミノチオランにより処理した。次いで、チオール化試料を０．１ Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２；　１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）に対して、４℃ で１８時間透析した。

ＳＭＣＣ処理した酵素をそのチオール化抗−ＡＦＰ抗体に２＝１（各々）モル比 で添加し、全蛋白質濃度を１ｍｇ／ｍ＋トシた。４℃で４時間後、Ｎ−エチルマ レイミド（最終濃度：０．３ｍＭ）を４℃で３０分間添加し、次いで２−メルカ プトエタノール（最終濃度：１．ＯｍＭ）をやはり４℃で３０分間添加すること により反応を停止した。次いで、その溶液を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ ｐＨ８，Ｏ；　１．ＯｍＭのＭｇＣ１，を含む）に対して、４℃で１８時間透析 した。

酵素／抗体指示薬の性能を、Ａｂｂｏｌｌ　Ｉｌｌ！　（登録商標）−＾ｒＰア ッセイ手順および試薬（本出願人）を使用して評価した。大腸菌突然変異体アル カリホスファターゼ指示薬に対する基質は、１．２ｍＭの４−ＭＵＰ／１．５Ｍ のトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，Ｏ；　１．ＯｍＭのＭｇＣｌ２を含む）を含 んでいた。

酵素／抗体ｍ水薬は、アッセイキットの指示薬希釈緩衝液により１．３μｇ　／ 　ｍ　ｌの最終濃度に希釈し、次いで、濾過した（０．２μＭの膜）。指示薬を 使用して、図４に示す標準曲線を得た。また、図４には、子牛の腸のアルカリホ スファターゼで標識した抗−ＡＦＰ抗体指示薬を使用して得た標準曲線も示す。

二つの曲線間の相関により、突然変異体酵素／抗体指示薬東 は、約０．８μｇ　／　ｍ　Ｉで使用される哺乳類酵素／抗体指示騎と比較して 、１．３μｇ　／　ｍ　］の低い濃度でアッセイに使用することができることが 示された。

実施例８ 癌抗原に対するサンドイッチＥＩＡにおける突然変異体アルカリホスファターゼ の使用 抗−癌抗原抗体断片を、下記の方法に従って突然変異体アルカリホスファターゼ で標識した。９ＭＡ１１５　（０，６ｍｇ／ｍｌ；０．１Ｍリン酸塩緩衝液；ｐ Ｈ７，２；１．ＯｍＭのＭｇｃＩ２を含む）を、静かに回転しながら３０分間、 ４５０倍モル過剰の２−イミノチオランで処理した。チオール化試料を、平衡に したセファデックスＧ−２５カラム（ＩＸ４５ｃｍ）で脱塩し、０．１Ｍのリン 酸塩緩衝液（ｐＨ７，０；　１．０ｍＭのＭｇＣ＋２および０．１ｍＭのＺｎＣ ｌ、を含む）で溶離した。

抗体断片を５０倍モル過剰のスクシンイミジル　４−（Ｎ−マレイミドメチル− １−トリカブラミド）シクロヘキサンカルボキシレート（３０原子リンカ−）と 反応させ、静かに回転しながら２５℃で３０分間、ＤＭＦ　（最終ＤＭＦ濃度： １５％）中で調製した。次いで、この試料を、平衡にしたセファデックスＧ−２ ５カラム（ＩＸ４５ｃｍ）で脱塩し、０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，Ｏ； 　Ｏ，ＬＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含む）で溶離した。

チオール化した突然変異体アルカリホスファターゼを、それぞれ１．５：１のモ ル比で活性化抗体断片と混合した。反応混合物を２〜８℃で１５時間静かに回転 させ、Ｎ−エチルマレイミド（最終濃度：０．１ｍＭ）を添加することにより反 応を停止した。２５℃で１時間後、試料をトリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ；ｐ Ｈ８，０；１．ＯｍＭのＭｇＣｌ２を含む）に対して４℃で１８時間透析した。

得られた酵素／抗体断片指示薬を、実賀的に実施例７に記載の方法に従って、指 示薬希釈緩衝液で３．７μｇ　／　ｍ　＋の最終濃度に希釈して、濾過した。指 示薬を、実質的に実施例７に記載のアッセイ方法に従ってサンドイッチアッセイ に使用して癌抗原を検出し、図５に示す標準曲線を得た。図５は、同様に調製し た子牛の腸のアルカリホスファターゼ／抗体断片指示薬を１．６４μｇ　／　ｍ 　ｌのアッセイ濃度で使用した標準曲線も示す。

指示薬濃度の相違を考慮すると、突然変異酵素／抗体指示薬の性能は、哺乳類酵 素／抗体断片指示薬に匹敵するものである。

測定結果から、標識として突然変異体酵素を使用する指示薬は、ＥＴＡで良好に 使用することができることが示された。

実施例９ 突然変異体アルカリホスファターゼ／結合物指示薬の安定性酵素で標識した抗Ａ ＦＰ抗体を実質的に実施例７に記載の方法に従って調製したが、以下の２点を例 外とする。（１）ｐＭＡ１１０由来の突然変異体アルカリホスファターゼの０． ６ｍｇ　／　ｍ　ｌ溶液（０，１Ｍリン酸塩緩衝液中）を２５℃で２時間、ＤＭ Ｆに溶解した（最終ＤＭＦ濃度：１５％）５０倍モル過剰の３０原子リンカ−で 処理し、（２）活性化酵素およびチオール化抗体（実質的に実施例７に記載の方 法に従って調製）を４℃で８時間、１：１モル比で反応させた。得られた指示薬 を、指示薬希釈剤（実施例６に記載のもの）で１５μｇ　／　ｍ　Ｉに希釈し、 ４５℃の熱を加えた。

指示薬の熱による不活化の時間的経過を追跡するために、試料を６０日間、熱か ら遠ざけ、実施例６記載の手順により指示薬の性能を硼測定した。測定結果を図 ６に表し、子牛の腸のアルカリホスファターゼ／抗−ＡＦＰ抗体指示薬の熱によ る不活化の時間的経過を併記する。大腸菌突然変異体アルカリホスファターゼを 含む指示薬の信号は、４５℃で６０日後の低下が最初に比べ３０％未満であった が、哺乳類酵素／抗体指示薬の信号は、４５℃で、たった２０日後に最初に比ベ ロ０％以上低下した。大腸菌突然変異体酵素／抗体指示薬の熱安定性は、哺乳類 酵素指示薬よりはるかに優れていた。

実施例１０ 突然変異体アルカリホスファターゼおよび特異的結合物の部位特異的抱合 この実施例は、高い特異的活性を示し、モノマー１個あたり１個の表面システィ ン残基を含む突然変異体大腸菌アルカリホスファターゼの調製に関するものであ る。反応性システィン残基の存在は、ヘテロニ官能性試薬による突然変異体酵素 の特異的結合物への部位特異的共有結合を可能にした。この連結方法により、実 施例７および８に記載した２−イ・ミノチオランによる非特異的化学修飾による 酵素へのチオールの導入は必要でなくなった。得られた特異的結合物／酵素抱合 体は、高められた安定性を有し、ＥＩＡでの非特異的結合の発生が低い。

実質的に実施例３に記載の方法に従って酵素を調製し、システィン残基を、実質 的に実施例３に記載の方法に従って、酵素の活性部位またはモノマー界面を妨害 しない位置で酵素分子に挿入した。次いで、修飾した酵素を、実質的に実施例７ および８に記載の方法に従って、ｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステルまたはスクシンイミジル４−（マレイミドメチル−１− トリカルバミド　シクロヘキサンカルボキシレート）などのへテロ三官能性架橋 試薬により特異的結合物に抱合した。

実施例１１ ユニークな制限部位を有する合成大腸菌プラスミドの構築８、総論 合成大腸菌を設計・構築して、これが機能性クローニングベクターであることを 示した。遺伝子合成のＦｏｋ　Ｉ法（ＭＩ＋＋ｄｅｃｋｉ　■ｄ　ｌ１ｏｌｌｉ Ｂ、　Ｇｅｎｅ、６１１．　１１１１；　１９ｇｇ　）を使用して、３０個のオ リゴヌクレオチドからそのプラスミドを組み立てた。そのプラスミドは、β−ラ クタマーゼ遺伝子、複製起点、］ａｃＺ遺伝子断片および多クローニング部位の 合成モジュールを含んでおり、ｐＵＣ−型プラスミドの後にパターン化する。相 違としては、ｐＵＣプラスミドに存在する制限部位のほぼ５０％が除去され、プ ラスミドの大きさが２０５０塩基対に減少し、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＩ ａｃＺ断片の両方の下流に転写終結因子が導入されることがある。これらの変化 は、クローニング、突然変異誘発、発現および制限酵素分析などの多くの方法を 可能にする。

ｂ、プラスミドの設計 大腸菌の合成プラスミドの全体の設計は、クローニング／発現ベクターに必要ま たは望ましい特徴に基づいた。一つの要件は、ベクターから得られる制限酵素に よる断片の操作および精製を可能にするために、低分子量であることであった。

別の好ましい特徴は、できるだけ多くの制限部位を除き、重要な位置にユニーク な制限部位を導入することであった。過去の経験がら、多くの種々の制限部位を 有するベクターでクローニングを行うと、続＜　ＤＮＡ断片のサブクローニング は明らかに不便を伴うことがわかっている。

合成プラスミドを、３個の別々のカセットに分けた。第一は、ｐ　ＴＪ　Ｃ９（ Ｖｉｔｉ＋鳳　＊ｎｄ　Ｍｔ＋＋ｉｎ１．　Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌｕｍｅ　１９． 　ｐｓ（ｅｓ　２５９−２６８　（１９８２１）の複製起点を、合成プラスミド におけるｏｒｉ領域を構成するＤＮＡ配列として選択した。その配列は、ＲＮＡ ［およびＲＮＡＩＩ複製プライマー領域、ならびにそれらのそれぞれのプロモー タを含む（Ｐｏｌｉｓｋｙ、　ＭＩｘｉｍｉ＋ｉＢ　Ｇｔｏｅ　Ｅｔｐ＋ｓ＋＋ ｉｏｎ、Ｗ、Ｓ、＋ｅ＋ｎ１ｋｏｌ１編、Ｂｉｔｌｅ＋ｖｏ＋ｌｂ＋、ＢＯｔｔ ｏｎ、１９Ｈ）。

第二は、ｐＵＣプラスミドのβ−ラクタマーゼ遺伝子を選択マーカーとして選択 した。その遺伝子は、ｐＵＣ９に見られる天然Ｐ３プロモーターＣＢ＋ｏ＋ｉｏ ｔら、１．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＠、、　Ｖｏｌｕｍｅ２５？、ｐ＊ｇｅ＋　９ ２０５−９２１０　（１９８２））および強力な７ｙ−ジｆｄ遺伝子ｖｍ転写終 結因子［Ｂｅｃｋら、　Ｎ１ｃｌｔｉｃ　Ａｅｉｄｔ　Ｒｅ＋、、　Ｖｅｌｗｓ ｅ５、ｐｒｉｅｓ　４４９４−４５１Ｏｆ＋９７１１））を含んでいた。ｏｒｉ 領域とは反対に、β−ラクタマーゼのヌクレオチド配列は変化しており、いくつ かの制限部位が除去された。はとんどの場合（Ｉｌｅ８２＞Ｖａ　ＩおよびＶａ ｌ１８２＞Ａｌａを除く）、アミノ酸配列は同じままであった。ｂｌａ遺伝子の 天然の制限部位の約６０％が除去された。

第三に、ｐｕｃのａ−相補１ａｃＺ遺伝子断片も、ｏｒｔ領域およびアンピシリ ン耐性遺伝子を有することの他に、クローニングマーカーとして使え、および異 種融合蛋白を発現することにより好ましかった。ｐＵＣ９由来の１ａｃＺ配列は 変化しており、β−ラクタマーゼ遺伝子における変化と同様に制限部位の数が減 少した。Ｓｍａｒ部位は、他の所望部位の挿入のためのユニークな制限部位とし て保持した。

Ｃ１遺伝子構築 ｐＷＭ５１０を構築するため、全部で２５個のオリゴヌクレオチドを遺伝子合成 のＦｏｋ　Ｉ法を使用して合成し、それらのオリゴヌクレオチドをｐＷＭ５００ 系のプラスミド（Ｍｓｎｄｅｃｋｉ＋ｍｄ　Ｂｏｌｌｉｎｇ、Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ ａｍｅ　６Ｂ、ｐｅｅｌ　１０１−１ｆｌ？　（１９ｇ８１　）　で前述のよう にクローン化した。そのプラスミドを精製し、配列を確かめた後、ＦｏｋＴで切 断することにより個々の断片を取り出した。２５個の断片（大きさは４０塩基対 〜８２塩基対）は全て、相補的な４個のユニークな塩基対が突き出ており、それ らをアニーリングして連結すると、完全に閉じた環状ベクターが得られた。断片 を連結して５Ｏ３−１コンピテント細胞（Ｆ−、ｒｅｃＡＴ、ｅｎｄＡＩ、ｇｙ ｒＡ９６．ｔｈｉ。

ｈｓｄＲ１７，（ｒｈ−、ｍｉ’）、５ｕｐＥ４４．ｒｅｌＡＩ″〕に形質転換 した。形質転換細胞を、アンピシリンを含むＬＢプレート上にブレーティングし た。うまく形質転換された細胞は生き残り、機能性複製起点およびβ−ラクタマ ーゼ遺伝子を含むそのままのプラスミドを有する場合のみ、コロニーを形成する 。

連結は、２５個の全Ｆｏｋ　Ｔ断片をシラットガン連結することにより行った。

連結混合物１０ｍｇにつき約３８個の形質転換体が得られた。５Ｃ３−１細胞の 全体の形質転換効率は、５×１０７細胞／　ｍ　ｇ超らせんｐ　Ｂ　Ｒ３２２（ Ｂｏｌｉｗ＊＋ら、　Ｇｅｌ１ｅ。

ＶｏｌＩｌ＋ｕ　２．　ｐ＊ｇｅ＋　９５−１１３　（１９７７１）より大きか った。

全部で３個のコロニーをプレートから拾い上げた。３個のクローンのうち、２個 は正しいＡｖａｌｌ制限パターンを有していた。うち１個のクローンを拾い上げ 、プラスミドＤＮＡを配列決定のためのＣｓＣ１勾配上で単離した。多重配列決 定プライマーを使用して二重鎖ＤＮＡ配列の確認をした。全部で１６５９塩基対 のうち、個々のＦｏｋ　Ｉクローンにも組み立てたプラスミドにも配列誤りはな かった。ｏｒｉ領域および機能性β−ラクタマーゼ遺伝子を含むこの合成プラス ミドをｐＷＭ５１０と命名した。

プラスミド設計の第二段階では、合成１ａｃＺカセツト（Ｙｓｎｉｓｈ−ｐｃ＋ ＋ｏｆｆｉ　ら、　Ｇｅｎｅ、　’ｌｏｔ口ｔ　３３．　ｐａｇｅｓ　１１１３ −１１９　（１９８５）に記載のもの〕を、図２に示すＦｏｋ　Ｉ断片を使用し て、ｐＷＭ５１０のＥｃｏＲｒ部位にクローン化した。このカセットは、ｌａｃ プロモータ、βガラクトシダーゼのアミノ末端６０アミノ酸をコードする］ａｃ Ｚ遺伝子断片、ｔｒｐＡ転写終結因子（ＣｈｒｉＮｉｔら、Ｐｒｏｃ、Ｎｓ口、 Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｖｅｌｗｓｅ　７ｇ＋ｐ畠ｕ＋　４１８０−４１８ ４　ｆｌＨＩｌ）および架橋突然変異誘発により多重クローニング部位を導入す るためのＳｍａ　１部位を含んでいた。

クローニングによりプラスミドｐＷＭ５１１が得られた。ＩａｃＺカセットはＥ ｃｏＲＩで切断したｐＷＭ５１０の二方向のいずれかに連結することができるが 、βラクタマーゼｍＲＮＡまたはＲＮＡＩＩと同じ方向で１ａｃＺ転写単位を発 現するクローンのみを回収した（テストした２０個のクローンから回収）。

ｐＷＭ５１１のＩａｃＺ遺伝子断片の方向は、従って、Ｉ）ＵＣ型プラスミド七 同じである。また、βラクタマーゼ遺伝子に位置する１個だけのＦｏｋ１部位も 除去し、合成遺伝子を遺伝子合成のＦｏｋ　Ｉ法のクローニングベクターとして 使えるようにした。この特定の方法は、Ｆｏｋｌによりプラスミドから小さい遺 伝子断片を切り取るという原理に基づくので、プラスミドの他の場所にＦｏｋ１ 部位があると、小さいＦｏｋＩ断片の精製が著しく困難となる。Ｆｏｋ１部位の 除去は、変性オリゴヌクレオチドを使用する架橋突然変異によって行い、Ｔｒｐ −Ｍｅｔアミノ酸配列配列えた。続く配列決定により、その配列がＴｒｐ−Ｌｅ ｕアミノ酸配列配列わっていることが示された。

Ｔｒｐ−Ｍｅｔ配列は１０６０〜１０６４の残基のＤＮＡ領域に対応する（図７ ）。突然変異に使用したオリゴヌクレオチドの配列は次の通りであった。

ＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＮＮＮＧＡＡＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧ 工ＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣｐＷＭ５１１プラスミドをＦｏｋ　Ｉで直線化し、架 橋突然変異誘発法を使用して配列を変異させた。この保存的なアミノ酸突然変異 では、アンピシリン耐性の変化は認められなかった。

Ｆｏｋ　Ｔ部位のないプラスミドの構成をｐＷＭ５１５と命名した。

ＥｃｏＲＩ領域の削除は、ｐＷＭ５１５をＥ　ｃ　ｏ　ＲＴ　／　Ｓ　ｍａｌで 切り取り、必要な塩基変更を含む合成二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入すること により行った。その合成プラスミドの構築物をｐＷＭ５２０と命名した。架橋突 然変異誘発を使用してファージＭ　１３　ｍ　ｐ　１８　（Ｙ＊Ｉｌｉ＋ｈ−Ｐ ｅ＋＋ｏｎ　ら、Ｇｅｌ１ｔ、　’Ｉｏｌ暑ｍｅ３３、ｐｔｔｅ＋　１０３−１ １９　（１９８５）　）の多重クローニング部位を用い、１ａｃＺ遺伝子内のＳ ｍａ　１部位にクローニングした。これは、ｐＵｃ１８に対して確立された標準 的クローニング手順を適用させるために行った。多重クローニング部位ｍｐ１８ を含む構築物を、ｐＷＭ５１８と命名した。ｐＷＭ５１８の多重クローニング部 位は次の通りである。

ｄ、プラスミドの解析 合成プラスミドの解析は、これが最初の全合成像をなすので重要であった。それ は、そのプロトタイプであるｐＵＣ−型のプラスミドとはかなり異なる。この合 成プラスミドは、ｐＵｃ−型のプラスミドと比較すると、３個の欠失（全長は６ ３６塩基）および７０個の点変異を含んでいた。ｐＵＣプラスミドに存在した制 限部位のほぼ５０％が除去され、“そのことは、ＤＮＡの制限酵素による分析ま たは精製に有利である。特に、ｐＷＭ５１９プラスミドには、６塩基対の非変性 配列を認識する制限酵素の部位が７つしかなく、うち３つは操作上の便宜から人 為的に導入されたものである。ｐＵＣプラスミドにはそのような部位が２４個あ るが、多重クローニング部位は含まれない。

かかる部位の少なさは、クローニング用に特異的な６塩基対を有する制限酵素を 自由に使用でき、また、合成りＮＡによる制限断片の置換または架橋突然変異誘 発によるクローン化された遺伝子の突然変異誘発を容易にする。プラスミドｐＷ Ｍ５２０は、７５個の制限酵素の切断部位を持っていない。その合成プラスミド は、β−ラクタマーゼ遺伝子のＰ１プロモーターが欠けている。該プラスミドは 、最短複製起点、２個の新しく導入された転写終結因子および最短設計１ａｃプ ロモーターを含む。

そのプラスミドは、少なくとも１２０世代（プレート上で４継代）にわたって安 定して増殖できることが示された。すなわち、復製起点（図７の１３４９〜１９ ９３）を含む構築断片は、安定した複製を完全に維持することができる。プラス ミドの複製数は、アガロースゲル上のプラスミドＤＮＡバンドの密度を走査して ラージＤＮＡ標本からのＤＮＡの収量を測定し、β−ラクタマーゼのレベルを測 定することにより評価した（ＩａｏｅＩら　、　１．　Ｃ１１ｎｉｃ、　Ｍｉｃ ＋ｏｂｉｏ１．、　Ｖｏｌｕｍｅ　１５．　ｐＢｅ＋　、６７７−６８３（１９ ８２））。複製数は、ｐＵＣ９より３〜４倍少なく、ｐＢＲ３２２の複製数と同 等であった。この知見は、最近決定された、ｐＢＲ３２２と対比してのｐＵＣ型 プラプラスミド製起点の配列の変化と一致しくｐＢＲ３２２の２９９０のＧがｐ ＵＣプラスミドの対応する領域ではＡに変化した。ＭｉｌｌｅＩｌら、　Ｆｏｃ ｗ＋。

ＢＲＬ−Ｇｉｂｃｏ　Ｖｏｌａｗｔ　ＩＱ、　ｐｔ（ｔ　５６　（１９ＲＲ）　 ］　、ｐ　ＵＣプラスミドに高い複製数が付与されるのはこのためであると考え られる。

合成プラスミドの配列を図７に示す。図７では、転写終結因子、−３５および一 １０プロモーター領域およびｆＭｅｔをコードするＡＴＧＩ−リブレットに下線 を付けた。横向きの矢印は、転写開始部位を示す。縦の矢印は、ＲＮａｓｅＨ切 断部位を示す。アポストロフィは分割点を示し、Ｆｏｋｒ断片の配列を与える。

合成オリゴヌクレオチドの配列は、アーム１十分割点の間の配列＋４個の３″末 端残基の重複部分子アーム２であった。

Ｆｏｋ　Ｉ断片およびオリゴヌクレオチドは、上記で示したように配列に番号を 付した。断片１の配列は、２個の不連続配列から成る。三角印は、ＩａｃＺカセ ットを規定する。

ｐＷＭ５１０の構築に使用したオリゴヌクレオチドは、全て５゛−ジメトキシト リチルヌクレオシド　β−シアノエチルホスホラミディテスｌｔ使用して、Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ＋ｙ＋１ｔｓｓ　３８０ＡＳｙｎｌ）ｈｅｓｉ＋ｅ＋により 合成した。合成は、平均孔径が１０００人である０、２μモルスケールの制御孔 ガラス固体支持体上で行った。オリゴヌクレオチドは、ゲル電気泳動により精製 した。

合成オリゴヌクレオチドのクローニングは、架橋突然変異誘発手順により行った 。Ｆｏｋ　ｒ法の遺伝子合成に使用した４個のクローニングベクター（ｐＷＭ５ ００．ｐＷＭ５０１、ｐＷＭ５０２およびｐＷＭ５０７）の全てをＳｍａ　ｒで 切断した。

約５０ｎＨの線状化ベクターを、３０μｍの変性緩衝液（１０ｍ　Ｍ　（Ｄ　Ｋ 　ＣＩ　、５　、　０　ｍ　Ｍ　（Ｄ　トリス−ＭＣＩ　ｐＨ８，０゜５．０ｍ ＭのＭｇＳＯ４，０，５ｍＭのジチオトレイトール）中で２０ピコモルのオリゴ ヌクレオチドと混合し、混合物を沸騰水浴中で３０分間、１００℃に加熱した。

その試料を５分間で室温に冷却し、冷却した２００ｍ１のコンピテントＪＭ８３ 細胞（ａｒａ、Ｄ　（Ｉａｃ−ｐｒｏＡＢ）、５ｔｒＡ、ｔｈｉ。

Ｆ２Ｏ１ａｃｚＤＭ１５）に移した。コンピテント細胞は、ＣａＣ１，法により 調製した。ＤＮＡ／細胞混合物を氷上で５分間冷却した後、３７℃で３分間、熱 衝撃を加えた。約２μｌのＬＢ培地を形質転換混合物に添加し、細胞を３７℃で １時間インキュベートした後、細胞をブレーティングした。

合成プラスミド用のＦｏｋｌ断片を含むプラスミド構築物を次のように消化した 。約２００ｎＨの各プラスミドを９０単位のＦ　ｏ　ｋ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎ！ ｌ＆ｎｄ　ＢｉｏＬ＊ｂ３　Ｂｅｙｅ＋１７．　ＭＡ）で切断した。

反応は、３７℃で２．５時間、ｌｘｌ’□ｋｌ緩衝液（２０ｍＭのＫＣＩ、１０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，１０ｍＭのＭｇＣ＋、および１０ｍＭの２ −メルカプトエタノール）を含む５００μｍ容積中で行った。この挿入物含有Ｆ ｏｋ　Ｉ断片は、次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。

連結工程では、全部で２５個のＦｏｋ　Ｉ断片（各１００　ｎ　ｇ）を単一反応 で一緒に連結した（上記参照）。使用したクローニングベクターの型は次の通り であった。ｐＷＭ５００：２〜１４および２６〜２９の断片；ｐＷＭ５０１：１ ５〜１ｓ、２４および２５の断片、ｐＷＭ５０２　：１９〜２３　；およびｐＷ Ｍ５０７：断片３０゜ 実施例１２ Ａｓ　ｐ”’　＞Ｇ　Ｉ　ｙ突然変異体の構築および特性Ａｓ　ｐ”’　＞Ｇ　 Ｉ　ｙ突然変異体の構築は、まず、プラスミドｐＭＡ　１０１をＳｐｅ　Ｉおよ びＰｖｕＩ［制限酵素で切断して、アミノ酸残基１５３の天然型コドンを有する ＤＮＡ断片を脱離し、該プラスミドに突然変異を導入して行った。次いで、切断 されたＤＮＡを、所望の突然変異に対応する位置にランダムなりＮＡ配列を有す るオリゴヌクレオチドとともに、実施例１（ｂ）で記載したように架橋突然変異 誘発に使用した。ヌクレオチドの配列は次の通りであった。

Ａ６Ａ　緘口＝ １０旧にコ（爪ηン＾ｑズ工 得られたコロニーは、色素産生基質の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル −リン酸を使用して、次のように、高いｋｔ、を持つものを選別した。

１、大腸菌細胞を、上述したＡｓｐ”’＞Ｇｌｙ突然変異を含むプラスミドによ り形質転換した後、アンピシリンを含むＬＢ寒天平板上においたフィルター（Ｍ ｉｌｌｉｐｏ＋ｃ　Ｎｏ、　１（ＡＴＦ　０８２２５　）上にブレーティングし 、平板をカバーして細胞を３７℃でインキュベートした。

２、工程１）のブレーティングフィルターを新しいフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏ ＋ｅ　Ｎｏ、　Ｈ＾丁Ｆ　０８２２５　）上に置き、２冊の重い本の間において 押さえることにより、そのレプリカを作つた。最初のフィルターおよびレプリカ フィルター上の細胞を別々のＬＢ寒天平板に置き、平板をカバーして、３７℃で ２〜３時間インキュベートした。

３、工程２）のプレートを、カバーしないで９０℃で１時間４５分インキュベー トした後、室温に冷却した。

４、工程３）でインキュベートした平板のもとのフィルターおよびレプリカフィ ルターを寒天から注意深くはがし、予め４０ｍ１の５０　ｍ　Ｍ　）リス（ｐ　 Ｈ１０，０）で湿らしであるワットマン吸取紙上において、室温で５分間インキ ュベートした。

５、工程４）のもとのフィルターおよびレプリカフィルターを注意深く吸い取り 、予め４０ｍ１の５０ｍＭトリス、０．２ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリル−リン酸（ｐＨ１０，０）で湿らしであるもう一枚の吸取紙上 において、室温で５分間インキュベートした。

６、工程５）のもとのフィルターおよびレプリカフィルターを乾いたワットマン の吸取紙に注意深く移し、最初のフィルター上の最も濃い青色の＝１０ニーをレ プリカフィルター上の対応するコロニーに適合させた。

７、工程６）のもとのフィルターのコロニーを取り出し、アンピンリンを存する ４、０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で一夜培養した。

８、ＬＢ寒天平板を４つの部分に分け、工程７）の増殖した培養から得た試料を 寒天平板上で画線培養して、３７℃で一夜インキユベートした。

スクリーニング工程により、もとのフィルターおよびレプリカフィルター上に、 野生型と比較してはっきりした非常に濃い青色を示すクローンを同定した。その クローンｐＤＧ２０１を、ＤＮＡ配列決定により解析した。その結果、コドン１ ５３に対して、ＧＡＣ（野生型の配列）の代わりに配列ＧＧＣとなっていた。こ のコドンは、突然変異体では、１５３位のグリシン残基に対応する。次いで、プ ラスミドｐＤＧ２０１の突然変異体遺伝子を大腸菌で発現し、突然変異体アルカ リホスファターゼを実施例４に記載したように精製した。精製した突然変異体蛋 白は、実施例５に記載したように、ｋｔｈｌｓそのｐＨ依存性およびに、を測定 して解析した。ＩＭＦリス（ｐＨ８，２）中での突然変異体のｋ　ｃ、、は２２ ９秒−１であり、Ｋ、は１１．８μＭであった。この結果、Ａｓｐ”’＞Ｇｌｙ 突然変異体は、調べた全ｐＨ範囲にわたって、Ａｓｐ”’＞Ｓｅｔ突然変異体と ほぼ同等の触媒活性を有し、従って、本明細書に記載したようなアッセイでのリ ポータ−酵素としての用途など、いくつかの応用に対して優れた候補であること が示された。

当業者であれば理解されるように、本発明の概念は、該酵素をコードするＤＮＡ を、野生型酵素の温度安定性を保持しながら高められた特異的活性を有する酵素 を産生ずるか、野生型酵素の特異的活性を保持しながら高められた温度安定性を 有する酵素を産生ずるように修飾した他の酵素にも等しく適用できる。

本発明はまた、格別の実験努力を要することなく、大腸菌以外の宿主（それらに 限定されないが、ＢＩｃｉｌｌ■、　Ｓｌ＋！ｐｌｏｌ！ｃｅｓ。

哺乳類細胞ならびに酵母および他の真菌類など）の使用にも適用できるが、全て の宿主が等しく効果的であるとは限らない。

明らかなように、本明細書に記載した本発明は、本発明の精神および範囲を逸脱 しないならば、多くの改変が可能であり、従って、制限は、添付の請求の範囲に 示すものによってのみ行われる。

図面の簡単な説明 図１（ａ）〜（Ｃ）は、アルカリホスファターゼ遺伝子を構築するために使用す る合成オリゴヌクレオチドを示す。

図２は、プラスミドｐＭＡ１００の制限地図を示す。

図３（ａ）〜（ｂ）は、合成した、野生型の大腸菌アルカリホスファターゼのヌ クレオチドおよびアミノ酸配列を示す。

図４は、本発明の新規ｍ水薬を使用する、α−フェトプロティンを検出するため の結合アッセイの結果を示す。

図５は、本発明の新規攬水薬を使用する、癌抗原を検出するための結合アッセイ の結果を示す。

図６は、子牛の腸のアルカリホスファターゼおよび大腸菌突然変異体アルカリホ スファターゼの不可逆的な熱不活化の時間的経過を示す。

図７は、合成プラスミドｐＷＭ５２０のヌクレオチド配列を示す。

塩基コードおよびアミノ酸を表すために、以下の記号および略号を使用する。

塩基コード： アミノ酸の３文字の略号： Ａｒｇ　アルギニン　Ｌｙｓ　リジン Ａｓｎ　アスパラギン　Ｍｅｔ　メチオニンＡｓｐ　アスパラギン酸　Ｐｈｅ　 フェニルアラニンＣｙｓ　システィン　Ｐｒｏ　プロリンＧｌｎ　グルタミン　 Ｓｅｒ　セリン Ｇｌｕ　グルタミン酸　Ｔｈｒ　トレオニンＧｌｙ　グリシン　Ｔｒｐ　）リブ トファンＨ４ｓ　ヒスチジン　Ｔｙｒ　チロシンｌｉｅ　イソロイシン　Ｖａｌ 　パリンＡＦＰ（ｎｇ／而） ｆｌＧ、　４ ＤＡＹＳ　ＡＴ　４５°Ｃ ＦＩＧ、　６ トＮ ｑ） トＮ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９　 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ　１／４２　６８０７−４Ｂ Ｇ０ＩＮ　３３１５３５　７０５５−２Ｊ３３１５４３　５４５　Ｓ　７０５５ −２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　９／１６ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　トマジツクーアラン、スザン・ジエイアメリカ合衆国、イリノ イ・６００３０、ブレイスレイク、ノース・ストーンブリッジ・レーン・３２４ ０５ Ｉ

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．大腸菌によって産生されるアルカリホスファターゼであって、該アルカリホ スファターゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと対比して少なくとも１ 個のアミノ酸変異を有し、該アルカリホスファターゼが野生型の大腸菌アルカリ ホスファターゼと対比して高められた特異的活性を有する合成酵素。
2. ２．アミノ酸変異が酸素の活性部位の約２０Å内で生じることを特徴とする請求 項１に記載の合成酸素。
3. ３．アミノ酸変異が該活性部位の約１０Å内で生じることを特徴とする請求項２ に記載の合成酵素。
4. ４．アミノ酸変異が該活性部位内で生じることを特徴とする請求項１に記載の合 成酵素。
5. ５．アミノ酸変異がＴｈｒ１００の代わりにＶａｌ、Ｔｈｒ１００の代わりにＩ ｌｅ、Ｌｙｓ３２８の代わりにＡｒｇ、Ｖａｌ９９の代わりにＡｌａ、Ａｌａ１ ０３の代わりにＡｓｐ、Ａｌａ１０３の代わりにＣｙｓ、Ｔｈｒ１０７の代わり にＶａｌ、Ａｓｐ１０１の代わりにＳｅｒおよびＡｓｐ１５３の代わりにＧｌｙ から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の合成酵素。
6. ６．アミノ酸変異がＶａｌ９９の代わりにＡＩａおよびＬｙｓ３２８の代わりに Ａｒｇを含むことを特徴とする請求項１に記載の合成酵素。
7. ７．アミノ酸変異がＶａｌ３７７の代わりにＡｌａおよびＳｅｒ４１５の代わり にＧｌｙを含むことを特徴とする請求項１に記載の合成酵素。
8. ８．単細胞宿主での発現のためのアルカリホスファターゼ酵素をコードするヌク レオチド配列を含み、該アルカリホスファターゼが野生型の大腸菌アルカリホス ファターゼと対比して少なくとも１個のアミノ酸変異を有し、該アルカリホスフ ァターゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと対比して高められた特異的 活性を有する、設計されたＤＮＡ配列。
9. ９．アミノ酸変異が酵素の活性部位の約２０Å内で生じることを特徴とする請求 項８に記載の配列。
10. １０．アミノ酸変異が該活性部位の約１０入内で生じることを特徴とする請求項 ９に記載の配列。
11. １１．アミノ酸変異が該活性部位内で生じることを特徴とする請求項８に記載の 配列。
12. １２．アミノ酸変異がＴｈｒ１００の代わりにＶａｌ、Ｔｈｒ１００の代わりに Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３２８の代わりにＡｒｇ、Ｖａｌ９９の代わりにＡｌａ、Ａｌａ １０３の代わりにＡｓｐ、Ａｌａ１０３の代わりにＣｙｓ、Ｔｈｒ１０７の代わ りにＶａｌ、Ａｓｐ１０１の代わりにＳｅｒおよびＡｓｐ１５３の代わりにＧｌ ｙから成る群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の配列。
13. １３．アミノ酸変異がＶａｌ９９の代わりにＡｌａおよびＬｙｓ３２８の代わり にＡｒｇを含むことを特徴とする請求項８に記載の配列。
14. １４．アミノ酸変異がＶａｌ３７７の代わりにＡｌａおよびＳｅｒ４１５の代わ りにＧｌｙを含むことを特徴とする請求項８に記載の配列。
15. １５．単細胞宿主が大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，哺 乳類細胞、酵母および他の真菌類から成る群から選択されることを特徴とする請 求項８に記載の配列。
16. １６．単細胞宿主での発現のためのアルカリホスファターゼ酵素をコードする設 計されたＤＮＡ配列を含み、該アルカリホスファターゼが野生型の大腸菌アルカ リホスファターゼと対比して少なくとも１個のアミノ酸変異を有し、該アルカリ ホスファターゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと対比して高められた 特異的活性を有するプラスミド。
17. １７．アミノ酸変異が酵素の活性部位の約２０Å内で生じることを特徴とする請 求項１６に記載のプラスミド。
18. １８．アミノ酸変異が該活性部位の約１０Å内で生じることを特徴とする請求項 １７に記載のプラスミド。
19. １９．アミノ酸変異が該活性部位内で生じることを特徴とする請求項１６に記載 のプラスミド。
20. ２０．アミノ酸変異がＴｈｒ１００の代わりにＶａｌ、Ｔｈｒ１００の代わりに Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３２８の代わりにＡｒｇ、Ｖａｌ９９の代わりにＡｌａ、Ａｌａ １０３の代わりにＡｓｐ、Ａｌａ１０３の代わりにＣｙｓ、Ｔｈｒ１０７の代わ りにＶａｌ、Ａｓｐ１０１の代わりにＳｅｒおよびＡｓｐ１５３の代わりにＧｌ ｙから成る群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載のプラスミド。
21. ２１．アミノ酸変異がＶａｌ９９の代わりにＡｌａおよびＬｙｓ３２８の代わり にＡｒｇを含むことを特徴とする請求項１６に記載のプラスミド。
22. ２２．アミノ酸変異がＶａｌ３７７の代わりにＡｌａおよびＳｅｒ４１３の代わ りにＧｌｙを含むことを特徴とする請求項１６に記載のプラスミド。
23. ２３．単細胞宿主が大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，哺 乳類細胞、酵母および他の真菌類から成る群から選択されることを特徴とする請 求項１６に記載のプラスミド。
24. ２４．プラスミドを含み、単細胞宿主での発現のためのアルカリホスファターゼ 酸素をコードする設計されたＤＮＡ配列で形質転換され、該アルカリホスファタ ーゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと対比して少なくとも１個のアミ ノ酸変異を有し、該アルカリホスファターゼが野生型の大腸菌アルカリホスファ ターゼと対比して高められた特異的活性を有する単細胞宿主。
25. ２５．アミノ酸変異が酵素の活性部位の約２０Å内で生じることを特徴とする請 求項２４に記載の宿主。
26. ２６．アミノ酸変異が該活性部位の約１０Å内で生じることを特徴とする請求項 ２５に記載の宿主。
27. ２７．アミノ酸変異が該活性部位内で生じることを特徴とする請求項２４に記載 の宿主。
28. ２８．アミノ酸変異がＴｈｒ１００の代わりにＶａｌ、Ｔｈｒ１００の代わりに Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３２８の代わりにＡｒｇ、Ｖａｌ９９の代わりにＡｌａ、Ａｌａ １０３の代わりにＡｓｐ、Ａｌａ１０３の代わりにＣｙｓ、Ｔｈｒ１０７の代わ りにＶａｌ、Ａｓｐ１０１の代わりにＳｅｒおよびＡｓｐ１５３の代わりにＧｌ ｙから成る群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の宿主。
29. ２９．アミノ酸変異がＶａｌ９９の代わりにＡｌａおよびＬｙｓ３２８の代わり にＡｒｇを含むことを特徴とする請求項２４に記載の宿主。
30. ３０．アミノ酸変異がＶａｌ３７７の代わりにＡｌａおよびＳｅｒ４１５の代わ りにＧｌｙを含むことを特徴とする請求項２４に記載の宿主。
31. ３１．単細胞宿主が大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，哺 乳類細胞、酵母および他の真菌類から成る群から選択されることを特徴とする請 求項２４に記載の宿主。
32. ３２．下記工程： ａ．テスト試料を指示薬および捕獲結合物と逐次または同時に接触させ、該指示 薬が特異的結合物に直接または間接的に結合したアルカリホスファターゼ酵素を 含む工程において、該アルカリホスファターゼが野生型の大腸菌アルカリホスフ ァターゼと対比して少なくとも１個のアミノ酸変異を有し、該アルカリホスファ ターゼが野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと対比して高められた特異的活 性を有する工程；ｂ．該指示薬を被分析物、該捕獲試薬および補助の特異的結合 物から成る群から選択される物質に結合させ、その結果、指示薬複合体を形成す る工程； ｃ．該指示薬複合体または遊離の指示薬を酵素基質と反応させて検出可能な信号 を作り、テスト試料中の被分析物の有無または量を測定する工程 を含む、テスト試料中の被分析物の有無または量を測定する方法。
33. ３３．特異的結合物がビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補 的核酸配列、エフェクターおよびレセプター分子、酵素補因子および酵素、酸素 阻害剤および酵素、ならびに免疫反応物からなる特異的結合対の群から選択され ることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
34. ３４．免疫反応物が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、組 換え抗体、組換え蛋白、ハプテン、抗原およびそれらの混合物または複合体から 成る群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. ３５．特異的結合物が、サンドイッチアッセイでの被分析物、競合アッセイでの 捕獲結合物および間接的アッセイでの補助の特異的結合物から成る群から選択さ れる物質に対して特異的であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
36. ３６．捕獲結合物が固相に結合しているか、結合可能であることを特徴とする請 求項３２に記載の方法。
37. ３７．固相がミクロ粒子、磁気粒子、ポリスチレンビーズ、ミクロタイターブレ ート、ニトロセルロース、ポリスチレンチューブ、ガラスチューブおよび多孔性 、吸湿性、吸収性または毛細管物質から成る群から選択されることを特徴とする 請求項３６に記載の方法。
38. ３８．アミノ酸変異が酸素の活性部位の約２０Å内で生じることを特徴とする請 求項３２に記載の方法。
39. ３９．アミノ酸変異が該活性部位の約１０Å内で生じることを特徴とする請求項 ３８に記載の方法。
40. ４０．アミノ酸変異が該活性部位内で生じることを特徴とする請求項３２に記載 の方法。
41. ４１．アミノ酸変異がＴｈｒ１００の代わりにＶａｌ、Ｔｈｒ１００の代わりに Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３２８の代わりにＡｒｇ、Ｖａｌ９９の代わりにＡｌａ、Ａｌａ １０３の代わりにＡｓｐ、Ａｌａ１０３の代わりにＣｙｓ、Ｔｈｒ１０７の代わ りにＶａｌ、Ａｓｐ１０１の代わりにＳｅｒおよびＡｓｐ１５３の代わりにＧｌ ｙから成る群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
42. ４２．アミノ酸変異がＶａｌ９９の代わりにＡｌａおよびＬｙｓ３２８の代わり にＡｒｇを含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
43. ４３．アミノ酸変異がＶａｌ３７７の代わりにＡｌａおよびＳｅｒ４１５の代わ りにＧｌｙを含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
44. ４４．ａ．野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと対比して少なくとも１個の アミノ酸変異を有し、野生型の大腸菌アルカリホスファターゼと対比して高めら れた特異的活性を有するアルカリホスファターゼ酵素；および ｂ．該酵素に直接または間接的に結合した特異的結合物を含む、テスト試料中の 被分析物の有無または量を測定するのに有用な指示薬。
45. ４５．特異的結合物がビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補 的核酸配列、エフェクターおよびレセプター分子、酵素補因子および酵素、酵素 阻害剤および酵素、ならびに免疫反応物からなる特異的結合対の群から選択され ることを特徴とする請求項４４に記載の指示薬。
46. ４６．免疫反応物が、モノクローナル抗体・ポリクローナル抗体、抗体断片、組 換え抗体、組換え蛋白、ハプテン、抗原およびそれらの混合物または複合体から 成る群から選択されることを特徴とする請求項４５に記載の指示薬。
47. ４７．特異的結合物が、サンドイッチアッセイでの被分析物、競合アッセイでの 捕獲結合物および間接的アッセイでの補助の特異的結合物から成る群から選択さ れる物質に対して特異的であることを特徴とする請求項４４に記載の指示薬。
48. ４８．アミノ酸変異が酵素の活性部位の約２０Å内で生じることを特徴とする請 求項４４に記載の指示薬。
49. ４９．アミノ酸変異が該活性部位の約１０Å内で生じることを特徴とする請求項 ４８に記載の指示薬。
50. ５０．アミノ酸変異が該活性部位内で生じることを特徴とする請求項４４に記載 の指示薬。
51. ５１．アミノ酸変異がＴｈｒ１００の代わりにＶａｌ、Ｔｈｒ１００の代わりに Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３２８の代わりにＡｒｇ、Ｖａｌ９９の代わりにＡｌａ、Ａｌａ １０３の代わりにＡｓｐ、Ａｌａ１０３の代わりにＣｙｓ、Ｔｈｒ１０７の代わ りにＶａｌ、Ａｓｐ１０１の代わりにＳｅｒおよびＡｓｐ１５３の代わりにＧｌ ｙから成る群から選択されることを特徴とする請求項４４に記載の指示薬。
52. ５２．アミノ酸変異がＶａｌ９９の代わりにＡｌａおよびＬｙｓ３２８の代わり にＡｒｇを含むことを特徴とする請求項４４に記載の指示薬。
53. ５３．アミノ酸変異がＶａｌ３７７の代わりにＡｌａおよびＳｅｒ４１５の代わ りにＧｌｙを含むことを特徴とする請求項４４に記載の指示薬。
54. ５４．アミノ酸が少なくとも１個のシステイン残基を含み、その結果、該アミノ 酸が架橋剤により特異的結合物に共有的に結合することを特徴とする請求項４４ に記載の指示薬。
55. ５５．該架橋剤がヘテロニ官能性架橋剤であることを特徴とする請求項５４に記 載の指示薬。
56. ５６．架橋剤が、ｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステルおよびスクシンイミジル４−（マレイミドメチル−１−トリカルバミド 　シクロヘキサン　カルボキシレートから成る群から選択されることを特徴とす る請求項５４に記載の指示薬。