JPH09159670A - 試料中のリガンド検出法およびそのための試薬 - Google Patents
試料中のリガンド検出法およびそのための試薬Info
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- JPH09159670A JPH09159670A JP7320894A JP32089495A JPH09159670A JP H09159670 A JPH09159670 A JP H09159670A JP 7320894 A JP7320894 A JP 7320894A JP 32089495 A JP32089495 A JP 32089495A JP H09159670 A JPH09159670 A JP H09159670A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高純度で、安定性が高く、しかも仔牛小腸由
来酵素程度の比活性を有するアルカリフォスファターゼ
を得、これを利用する生体試料中のリガンド検出方法、
そのための試薬、試料中のリガンドを定量する方法、試
料中の核酸配列決定法を提供すること。 【解決手段】 下記理化学的性質を有するアルカリフォ
スファターゼを利用する生体試料中のリガンド検出方
法、そのための試薬、試料中のリガンドを定量する方
法、試料中の核酸配列決定法を提供すること。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
来酵素程度の比活性を有するアルカリフォスファターゼ
を得、これを利用する生体試料中のリガンド検出方法、
そのための試薬、試料中のリガンドを定量する方法、試
料中の核酸配列決定法を提供すること。 【解決手段】 下記理化学的性質を有するアルカリフォ
スファターゼを利用する生体試料中のリガンド検出方
法、そのための試薬、試料中のリガンドを定量する方
法、試料中の核酸配列決定法を提供すること。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は高純度であって、安
定性がよい新規なアルカリフォスファターゼを標識とす
る試料中のリガンドを検出する方法およびその試薬に関
する。
定性がよい新規なアルカリフォスファターゼを標識とす
る試料中のリガンドを検出する方法およびその試薬に関
する。
【０００２】
【従来の技術】生体物質の検出法としては多くの方法が
知られており、様々な成分が混在する中で、ある特定の
微量の成分を特異的に測定する場合には、生化学的親和
性を利用した分析法が用いられている。例えばグルコー
スや尿酸等、体液中に１０-2ｍｏｌｅ／ｌオーダー以上
の濃度で存在する成分に対しては、該成分を基質とする
酵素反応を利用する検出法が多く使用され、酵素の基質
とならないより高分子量の成分や、より低濃度の成分を
測定しようとする場合には、各成分の親和性、例えば抗
原−抗体、ホルモン−レセプター、核酸−核酸等、より
親和性の高いものを利用することが一般的である。これ
らの親和性を利用する検出法では、一方の親和性成分を
標識して検出することが多くの場合、必要である。その
一つの方法として、標識として放射性物質（ＲＩ）を用
いる方法が、検出感度の面で優れており、従来から使用
されてきた。しかし、特殊な放射性物質を取り扱う施設
や測定装置を必要とすることから、近年は、酵素でもっ
て一方の親和性成分を標識し、親和性により結合した標
識もしくは結合しなかった標識の酵素活性を測定するこ
とにより、他方の親和性成分を定量する方法が用いられ
ている。標識酵素の検出に用いる基質を、比色用基質か
ら蛍光法用基質、更には発光用基質と変えることにより
飛躍的に検出感度の向上が図られている。標識用酵素が
備える条件として、一般的に高純度、安定性が高い、タ
ーンオーバーが高い、標識しやすい官能基を持つ、基質
に対するＫｍ値が低い、バックグラウンドが低い、検出
に適した基質がある等が挙げられる。用いられている酵
素の種類としてはアルカリフォスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース６
−リン酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ラ
クタマーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム等が挙げら
れるが、この中でアルカリフォスファターゼがもつ大き
な利点は、バックグラウンドが他の酵素より低いことお
よび検出に適した基質があることなどである。
知られており、様々な成分が混在する中で、ある特定の
微量の成分を特異的に測定する場合には、生化学的親和
性を利用した分析法が用いられている。例えばグルコー
スや尿酸等、体液中に１０-2ｍｏｌｅ／ｌオーダー以上
の濃度で存在する成分に対しては、該成分を基質とする
酵素反応を利用する検出法が多く使用され、酵素の基質
とならないより高分子量の成分や、より低濃度の成分を
測定しようとする場合には、各成分の親和性、例えば抗
原−抗体、ホルモン−レセプター、核酸−核酸等、より
親和性の高いものを利用することが一般的である。これ
らの親和性を利用する検出法では、一方の親和性成分を
標識して検出することが多くの場合、必要である。その
一つの方法として、標識として放射性物質（ＲＩ）を用
いる方法が、検出感度の面で優れており、従来から使用
されてきた。しかし、特殊な放射性物質を取り扱う施設
や測定装置を必要とすることから、近年は、酵素でもっ
て一方の親和性成分を標識し、親和性により結合した標
識もしくは結合しなかった標識の酵素活性を測定するこ
とにより、他方の親和性成分を定量する方法が用いられ
ている。標識酵素の検出に用いる基質を、比色用基質か
ら蛍光法用基質、更には発光用基質と変えることにより
飛躍的に検出感度の向上が図られている。標識用酵素が
備える条件として、一般的に高純度、安定性が高い、タ
ーンオーバーが高い、標識しやすい官能基を持つ、基質
に対するＫｍ値が低い、バックグラウンドが低い、検出
に適した基質がある等が挙げられる。用いられている酵
素の種類としてはアルカリフォスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース６
−リン酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ラ
クタマーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム等が挙げら
れるが、この中でアルカリフォスファターゼがもつ大き
な利点は、バックグラウンドが他の酵素より低いことお
よび検出に適した基質があることなどである。
【０００３】上記性質を鑑みて最も汎用されているのは
仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼである。仔牛小
腸由来のアルカリフォスファターゼは、比活性３，００
０Ｕ／ｍｇ以上を有すこと、糖鎖を有しているため、過
ヨウ素酸法で標識できることより、他起源の酵素より優
れているとされている。しかし、その一方で、安定性に
乏しいこと、および有している糖鎖のためにバックグラ
ウンドが生じることも知られている（Besman,M.,Colema
n,J.E.,J.Biol.Chem.,260,1190(1985)、特開昭60-18058
4号公報）。
仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼである。仔牛小
腸由来のアルカリフォスファターゼは、比活性３，００
０Ｕ／ｍｇ以上を有すこと、糖鎖を有しているため、過
ヨウ素酸法で標識できることより、他起源の酵素より優
れているとされている。しかし、その一方で、安定性に
乏しいこと、および有している糖鎖のためにバックグラ
ウンドが生じることも知られている（Besman,M.,Colema
n,J.E.,J.Biol.Chem.,260,1190(1985)、特開昭60-18058
4号公報）。
【０００４】また、大腸菌由来アルカリフォスファター
ゼは安定性が良く、純度の高い標品を容易に入手できる
が、比活性６０Ｕ／ｍｇと低く、標識用酵素に適さず、
分子生物学における脱リン酸化用酵素として使用されて
いるに過ぎない（Reid,R.W.,Wilson,I.B. in "The Enzy
mes", 3rd Ed.373(1971)）。これらの酵素を改善するた
め、部位特異的変異により大腸菌アルカリフォスファタ
ーゼのアミノ酸を置換し、比活性を向上させる試みがあ
る（特開平4-349881号公報）。しかし、ここで得られた
変異アルカリフォスファターゼは、比活性において３．
９倍の上昇が得られたのみであり、仔牛小腸由来のもの
に匹敵しない。
ゼは安定性が良く、純度の高い標品を容易に入手できる
が、比活性６０Ｕ／ｍｇと低く、標識用酵素に適さず、
分子生物学における脱リン酸化用酵素として使用されて
いるに過ぎない（Reid,R.W.,Wilson,I.B. in "The Enzy
mes", 3rd Ed.373(1971)）。これらの酵素を改善するた
め、部位特異的変異により大腸菌アルカリフォスファタ
ーゼのアミノ酸を置換し、比活性を向上させる試みがあ
る（特開平4-349881号公報）。しかし、ここで得られた
変異アルカリフォスファターゼは、比活性において３．
９倍の上昇が得られたのみであり、仔牛小腸由来のもの
に匹敵しない。
【０００５】自然界から高い比活性を有するアルカリフ
ォスファターゼを獲得しようとする試みもあり、好アル
カリ性バチルス・エスピー（Bacillus sp.）由来の酵素
（M,Nomoto et al.,Agric.Biol.Chem.,52(7),1643(198
8)）やバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheni
formis）由来の酵素に関する報告（Hulett,F.M.,J.Gen.
Microbiol.,132,2387(1986)）がある。しかしながら、
前者は比活性１６５０Ｕ／ｍｇであって、仔牛小腸由来
酵素の比活性に匹敵するとはいい難い。また後者は比活
性２１１５．９Ｕ／ｍｇながら、その酵素活性測定は５
５℃においてであり、実用的な３７℃ではその７割以下
であると予想されるデータが示されている（Hulett,F.
M. et al.,Biochemistry,10(8),1364(1971)）。
ォスファターゼを獲得しようとする試みもあり、好アル
カリ性バチルス・エスピー（Bacillus sp.）由来の酵素
（M,Nomoto et al.,Agric.Biol.Chem.,52(7),1643(198
8)）やバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheni
formis）由来の酵素に関する報告（Hulett,F.M.,J.Gen.
Microbiol.,132,2387(1986)）がある。しかしながら、
前者は比活性１６５０Ｕ／ｍｇであって、仔牛小腸由来
酵素の比活性に匹敵するとはいい難い。また後者は比活
性２１１５．９Ｕ／ｍｇながら、その酵素活性測定は５
５℃においてであり、実用的な３７℃ではその７割以下
であると予想されるデータが示されている（Hulett,F.
M. et al.,Biochemistry,10(8),1364(1971)）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前記酵素より高純度、
安定性が高く、しかも仔牛小腸由来酵素程度の比活性を
有するアルカリフォスファターゼを微生物から得ること
が求められていた。本発明の目的はかかるアルカリフォ
スファターゼを使用する試料中のリガンドを検出する方
法、生体試料中のリガンドの検出方法、そのための試
薬、試料中のリガンドを定量する方法、試料中の核酸配
列決定法を提供することである。
安定性が高く、しかも仔牛小腸由来酵素程度の比活性を
有するアルカリフォスファターゼを微生物から得ること
が求められていた。本発明の目的はかかるアルカリフォ
スファターゼを使用する試料中のリガンドを検出する方
法、生体試料中のリガンドの検出方法、そのための試
薬、試料中のリガンドを定量する方法、試料中の核酸配
列決定法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは検出感度が
高く、安定性に優れ、かつバックグラウンドが低いバイ
ンディングアッセイ方法およびそれを使用する試薬を安
価に作製するために、鋭意研究を重ねた結果、安定性が
良く、比活性が高く、かつバックグラウンドの原因と考
えられる糖鎖を持たないアルカリフォスファターゼを見
いだし、本発明を完成するに至った。
高く、安定性に優れ、かつバックグラウンドが低いバイ
ンディングアッセイ方法およびそれを使用する試薬を安
価に作製するために、鋭意研究を重ねた結果、安定性が
良く、比活性が高く、かつバックグラウンドの原因と考
えられる糖鎖を持たないアルカリフォスファターゼを見
いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は標識として、下記理化
学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用するこ
とを特徴とする試料中のリガンドを検出する方法であ
る。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
学的性質を有するアルカリホスファターゼを使用するこ
とを特徴とする試料中のリガンドを検出する方法であ
る。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
【０００９】また、本発明は(i) 下記理化学的性質を有
するアルカリホスファターゼで直接的または間接的に標
識されたリガンドに対する特異的結合物質または(ii)リ
ガンドに対する特異的結合物質および下記理化学的性質
を有するアルカリホスファーゼで標識されたリガンド、
および(iii) アルカリホスファターゼ測定試薬を含有す
る生体試料中のリガンド検出試薬である。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
するアルカリホスファターゼで直接的または間接的に標
識されたリガンドに対する特異的結合物質または(ii)リ
ガンドに対する特異的結合物質および下記理化学的性質
を有するアルカリホスファーゼで標識されたリガンド、
および(iii) アルカリホスファターゼ測定試薬を含有す
る生体試料中のリガンド検出試薬である。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
【００１０】さらに、本発明は(i) アビジン化合物また
はビオチン化合物を結合し、リガンドに対して特異的な
親和性を有する物質および(ii)ビオチン化合物またはア
ビジン化合物を結合する下記理化学的性質を有するアル
カリホスファターゼおよび(iii) アルカリホスファター
ゼを測定する物質を含有する生体試料中のリガンド検出
試薬である。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
はビオチン化合物を結合し、リガンドに対して特異的な
親和性を有する物質および(ii)ビオチン化合物またはア
ビジン化合物を結合する下記理化学的性質を有するアル
カリホスファターゼおよび(iii) アルカリホスファター
ゼを測定する物質を含有する生体試料中のリガンド検出
試薬である。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
【００１１】本発明は標識として、下記理化学的性質を
有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴と
する試料中のリガンドを定量する方法である。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴と
する試料中のリガンドを定量する方法である。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
【００１２】本発明は標識として、下記理化学的性質を
有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴と
する試料中の核酸配列決定法である。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
有するアルカリホスファターゼを使用することを特徴と
する試料中の核酸配列決定法である。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。（但し、残存活性が８０％以上の
場合を安定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ)
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の試料中のリガンドを検出
する具体な方法は、試料中のリガンドとリガンドに対し
て特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用
し、該反応により結合した物質に結合するアルカリホス
ファターゼ活性を測定するか、あるいは結合しなかった
アルカリホスファターゼ活性を測定する方法である。
する具体な方法は、試料中のリガンドとリガンドに対し
て特異的な親和性を有する物質との親和性反応を利用
し、該反応により結合した物質に結合するアルカリホス
ファターゼ活性を測定するか、あるいは結合しなかった
アルカリホスファターゼ活性を測定する方法である。
【００１４】本発明において、試料中のリガンドとして
は、抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプターまたは
核酸などが例示される。リガンドとリガンドに対して特
異的な親和性を有する物質との親和性反応としては、抗
原抗体反応、ホルモン−ホルモンレセプター反応、核酸
ハイブリダイゼーション反応などがある。
は、抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプターまたは
核酸などが例示される。リガンドとリガンドに対して特
異的な親和性を有する物質との親和性反応としては、抗
原抗体反応、ホルモン−ホルモンレセプター反応、核酸
ハイブリダイゼーション反応などがある。
【００１５】本発明に使用するアルカリフォスファター
ゼは、上記理化学的性質を有するアルカリフォスファタ
ーゼであれば、いずれの起源のものを用いても良い。好
適なものとしては、バチルス（Bacillus）属のアルカリ
フォスファターゼなどがある。例えば、バチルス・バデ
ィウス（Bacillus badius）ＴＥ３４９２、バチルス・
バディウスＴＥ３４９３のアルカリフォスファターゼや
バチルス・バディウスＴＥ３４９７のアルカリフォスフ
ァターゼが例示される。
ゼは、上記理化学的性質を有するアルカリフォスファタ
ーゼであれば、いずれの起源のものを用いても良い。好
適なものとしては、バチルス（Bacillus）属のアルカリ
フォスファターゼなどがある。例えば、バチルス・バデ
ィウス（Bacillus badius）ＴＥ３４９２、バチルス・
バディウスＴＥ３４９３のアルカリフォスファターゼや
バチルス・バディウスＴＥ３４９７のアルカリフォスフ
ァターゼが例示される。
【００１６】バチルス・バディウスＴＥ３４９２のアル
カリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りで
ある。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリ
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に
作用する。 ３．Ｋｍ値：０．３４ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：６０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定
義する）〕 １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法）６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
カリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りで
ある。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリ
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に
作用する。 ３．Ｋｍ値：０．３４ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：６０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定
義する）〕 １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法）６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
【００１７】バチルス・バディウスＴＥ３４９３のアル
カリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りで
ある。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリ
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に
作用する。 ３．Ｋｍ値：０．２６ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：６０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定
義する）〕 １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法）６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
カリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りで
ある。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリ
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−６−リン酸に
作用する。 ３．Ｋｍ値：０．２６ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：６０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定
義する）〕 １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法）６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
【００１８】バチルス・バディウスＴＥ３４９７のアル
カリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りで
ある。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリ
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−１−リン酸、
グルコース−６−リン酸に作用する ３．Ｋｍ値：０．２８ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：７０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定
義する）〕 １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法）６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
カリフォスファターゼの理化学的性質は、以下の通りで
ある。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸、ＮＡＤＰ、ＤＬ−α−グリ
セロリン酸、β−グリセロリン酸、フェニルリン酸、フ
ォスフォエタノールアミン、グルコース−１−リン酸、
グルコース−６−リン酸に作用する ３．Ｋｍ値：０．２８ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ４．至適ｐＨ：ｐＨ９．５〜１０ ５．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ６．至適温度：６０℃以上 ７．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ８．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ９．糖鎖を有さない。 １０．熱安定性：７０℃以下〔ｐＨ７．５、３０分間、
（但し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定
義する）〕 １１．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲル
ろ過法）６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
【００１９】これらのアルカリホスファターゼを製造す
る方法としては、バチルス属に属し、上記理化学的性質
を有するアルカリホスファターゼ生成能を有する菌株、
例えば、バチルス・バディウス（Bacillus badius）Ｔ
Ｅ３４９２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８３）、バチルス・
バディウスＴＥ３４９３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８
４）、バチルス・バディウスＴＥ３４９７（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１２０）を培地にて培養し、培養物より該アル
カリホスファターゼを採取する方法がある。アルカリホ
スファターゼ生産菌の培養にあたって使用する培地とし
ては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、
その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成
培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、
例えばグルコース、グリセロール等が使用される。窒素
源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス
等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸ア
ンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機
物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸
マグネシウム等が使用される。またアルカリホスファタ
ーゼの生産誘導として、リン酸濃度を低くしておくこと
が望ましい。
る方法としては、バチルス属に属し、上記理化学的性質
を有するアルカリホスファターゼ生成能を有する菌株、
例えば、バチルス・バディウス（Bacillus badius）Ｔ
Ｅ３４９２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８３）、バチルス・
バディウスＴＥ３４９３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８
４）、バチルス・バディウスＴＥ３４９７（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１２０）を培地にて培養し、培養物より該アル
カリホスファターゼを採取する方法がある。アルカリホ
スファターゼ生産菌の培養にあたって使用する培地とし
ては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、
その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成
培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、
例えばグルコース、グリセロール等が使用される。窒素
源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス
等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸ア
ンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機
物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸
マグネシウム等が使用される。またアルカリホスファタ
ーゼの生産誘導として、リン酸濃度を低くしておくこと
が望ましい。
【００２０】培地は通常、振盪培養、あるいは通気攪拌
培養で行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５
〜３７℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜
１０に制御するのがよい。これら以外の条件下でも使用
する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜
７日で生育し、菌体内および菌体外にアルカリホスファ
ターゼが生産蓄積される。
培養で行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５
〜３７℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜
１０に制御するのがよい。これら以外の条件下でも使用
する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜
７日で生育し、菌体内および菌体外にアルカリホスファ
ターゼが生産蓄積される。
【００２１】本発明の酵素の精製法は一般に使用される
精製法を用いればよい。例えば、菌体除去後の培地を、
硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カ
ルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレン
イミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミ
ノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−
セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精
製することができる。また、これらの方法で得られた粗
酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレードライや凍結
乾燥により粉末化できる。
精製法を用いればよい。例えば、菌体除去後の培地を、
硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カ
ルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレン
イミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミ
ノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−
セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精
製することができる。また、これらの方法で得られた粗
酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレードライや凍結
乾燥により粉末化できる。
【００２２】次に本発明のアルカリホスファターゼの活
性測定法を示す。まず下記反応混液をキュベットに調製
し、３７℃で約５分予備加温する。 ３．００ｍｌ ０．１ｍｌ ＣｏＣｌ2 および０．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 を含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝
液、ｐＨ９．８ ０．０５ｍｌ ０．６７ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸
溶液 次に、酵素溶液０．０５ｍｌを加え、緩やかに混和後、
水を対照に３７℃で制御された分光光度計で４０５ｎｍ
の吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分か
ら１分間当たりの吸光度変化を求める。盲検は反応混液
に酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．０５ｍＭ Ｃｏ
Ｃｌ2 および１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ トリ
ス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）を加え、上記同様に操作を
行って１分間当たりの吸光度を求めた。上記条件で１分
間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生成する
酵素量を１単位（Ｕ）とする。
性測定法を示す。まず下記反応混液をキュベットに調製
し、３７℃で約５分予備加温する。 ３．００ｍｌ ０．１ｍｌ ＣｏＣｌ2 および０．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 を含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝
液、ｐＨ９．８ ０．０５ｍｌ ０．６７ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸
溶液 次に、酵素溶液０．０５ｍｌを加え、緩やかに混和後、
水を対照に３７℃で制御された分光光度計で４０５ｎｍ
の吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分か
ら１分間当たりの吸光度変化を求める。盲検は反応混液
に酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．０５ｍＭ Ｃｏ
Ｃｌ2 および１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ トリ
ス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５）を加え、上記同様に操作を
行って１分間当たりの吸光度を求めた。上記条件で１分
間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生成する
酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００２３】本発明において、アルカリホスファターゼ
で標識される物質としては、例えば、抗原としてはタン
パク質、核酸などの高分子物質などが挙げられる。最
近、良く用いられている抗原のエピトープ部位をデサイ
ンしたペプチドも使用することができる。また抗体とし
ては通常、使用されるもの、例えばヤギ、ウサギ、モル
モットなどに免疫して得られるポリクローナル抗体、マ
ウス腹水等のハイブリドーマから得られるモノクローナ
ル抗体、更にこれらの抗体をプロテアーゼ処理して得ら
れる抗原結合活性フラグメント（Ｆａｂ’）などを使用
することができる。遺伝子組変え技術で得られるＦｖ抗
体、一本鎖Ｆｖ抗体等抗原結合活性を有するタンパク質
を使用することも可能である。
で標識される物質としては、例えば、抗原としてはタン
パク質、核酸などの高分子物質などが挙げられる。最
近、良く用いられている抗原のエピトープ部位をデサイ
ンしたペプチドも使用することができる。また抗体とし
ては通常、使用されるもの、例えばヤギ、ウサギ、モル
モットなどに免疫して得られるポリクローナル抗体、マ
ウス腹水等のハイブリドーマから得られるモノクローナ
ル抗体、更にこれらの抗体をプロテアーゼ処理して得ら
れる抗原結合活性フラグメント（Ｆａｂ’）などを使用
することができる。遺伝子組変え技術で得られるＦｖ抗
体、一本鎖Ｆｖ抗体等抗原結合活性を有するタンパク質
を使用することも可能である。
【００２４】本発明において、アルカリホスファターゼ
は、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を
有する物質のいずれか一方に結合されていることが好ま
しい。
は、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を
有する物質のいずれか一方に結合されていることが好ま
しい。
【００２５】アルカリフォスファターゼを上記抗原や抗
体などに標識する際に使用する方法としては、グルタル
アルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリ
ジン−ジスルフィド法などを用いることができるが、好
ましいのはマレイミド法のように抗原、抗体や酵素の活
性を低下させない方法である。
体などに標識する際に使用する方法としては、グルタル
アルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリ
ジン−ジスルフィド法などを用いることができるが、好
ましいのはマレイミド法のように抗原、抗体や酵素の活
性を低下させない方法である。
【００２６】抗体や抗原１分子に導入される標識用酵素
としては、通常、１分子以上、好ましくは２分子以上結
合した酵素標識体を使用することが望ましい。
としては、通常、１分子以上、好ましくは２分子以上結
合した酵素標識体を使用することが望ましい。
【００２７】本発明の具体例な例としては、試料中のリ
ガンド、例えば抗原または抗体とアルカリホスファター
ゼを結合した該リガンドに特異的な親和性を有する物
質、例えば抗体または抗原を反応させ、反応生成物と未
反応生成物を分離した後、反応生成物に結合したアルカ
リホスファターゼ活性または未反応生成物のアルカリホ
スファターゼ活性を測定する。
ガンド、例えば抗原または抗体とアルカリホスファター
ゼを結合した該リガンドに特異的な親和性を有する物
質、例えば抗体または抗原を反応させ、反応生成物と未
反応生成物を分離した後、反応生成物に結合したアルカ
リホスファターゼ活性または未反応生成物のアルカリホ
スファターゼ活性を測定する。
【００２８】標識物質としてアリカリホスファターゼを
用いる免疫学的測定法は、抗体、抗原のいずれを測定す
る場合にも、競合法、もしくは非競合法のヘテロジニア
ス法に使用することができる。いずれの方法においても
一次抗体のみならず、二次抗体を用いる方法において
も、それらにアルカリホスファターゼを標識することが
できる。また二次抗体の代わりに、プロテインＡ、プロ
テインＧのようなＦｃレセプターにアルカリホスファタ
ーゼを標識して使用できる。
用いる免疫学的測定法は、抗体、抗原のいずれを測定す
る場合にも、競合法、もしくは非競合法のヘテロジニア
ス法に使用することができる。いずれの方法においても
一次抗体のみならず、二次抗体を用いる方法において
も、それらにアルカリホスファターゼを標識することが
できる。また二次抗体の代わりに、プロテインＡ、プロ
テインＧのようなＦｃレセプターにアルカリホスファタ
ーゼを標識して使用できる。
【００２９】また、本発明の方法の別な具体例として
は、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を
有する物質を固相に結合しているリガンドの検出法があ
る。固相としては、従来既知のものを使用すれば良く、
例えばポリスチレンビーズなどが挙げられる。
は、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を
有する物質を固相に結合しているリガンドの検出法があ
る。固相としては、従来既知のものを使用すれば良く、
例えばポリスチレンビーズなどが挙げられる。
【００３０】また、他の具体的な例としては、アビジン
化合物またはビオチン化合物がリガンドに対して特異的
な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原に結合
し、アルカリホスファターゼがビオチン化合物またはア
ビジン化合物に結合して、リガンド、例えば抗原または
抗体とリガンドに対して特異的な親和性を有する物質、
例えば抗体または抗原との親和性反応と同時に、または
その後にアビジン化合物−ビオチン化合物結合反応を行
い、該反応により結合したアルカリホスファターゼ活性
または残存するアルカリホスファターゼ活性を測定する
試料中のリガンドの検出法がある。ここにアビジン化合
物とはビオチン化合物と強く結合する糖タンパク質であ
り、例えばアビジン、ストレプトアビジンなどが挙げら
れる。また、ビオチン化合物とはビタミンＢ複合体の１
つであり、例えばビオチンなどが挙げられる。
化合物またはビオチン化合物がリガンドに対して特異的
な親和性を有する物質、例えば抗体または抗原に結合
し、アルカリホスファターゼがビオチン化合物またはア
ビジン化合物に結合して、リガンド、例えば抗原または
抗体とリガンドに対して特異的な親和性を有する物質、
例えば抗体または抗原との親和性反応と同時に、または
その後にアビジン化合物−ビオチン化合物結合反応を行
い、該反応により結合したアルカリホスファターゼ活性
または残存するアルカリホスファターゼ活性を測定する
試料中のリガンドの検出法がある。ここにアビジン化合
物とはビオチン化合物と強く結合する糖タンパク質であ
り、例えばアビジン、ストレプトアビジンなどが挙げら
れる。また、ビオチン化合物とはビタミンＢ複合体の１
つであり、例えばビオチンなどが挙げられる。
【００３１】アビジン化合物とビオチン化合物、就中ア
ビジンとビオチンの結合定数は、１０15Ｍ-1レベルで非
常に高いこと、アビジン化合物、就中アビジンは４つの
ビオチン結合部位を持つこと、ビオチン化合物を導入す
ることは、例えば抗体などの活性の損失が少ないことに
よりアビジン化合物−ビオチン化合物系は大きなメリッ
トを有している。
ビジンとビオチンの結合定数は、１０15Ｍ-1レベルで非
常に高いこと、アビジン化合物、就中アビジンは４つの
ビオチン結合部位を持つこと、ビオチン化合物を導入す
ることは、例えば抗体などの活性の損失が少ないことに
よりアビジン化合物−ビオチン化合物系は大きなメリッ
トを有している。
【００３２】例えば固相サンドウイッチ免疫測定法にお
いて、固相に固定化した抗体と試料を反応させ、さらに
ビオチン化合物を結合した抗体と反応させた後、反応生
成物中のビオチン化合物または未反応生成物中のビオチ
ン化合物をアルカリホスファターゼで標識したアビジン
化合物により検出する。アビジンおよび類縁物質のスト
レプトアビジンは分子量５万程度のタンパク質であり、
これらはアルカリホスファターゼとグルタルアルデヒド
法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリジン−ジス
ルフィド法などを用いて結合することができる。
いて、固相に固定化した抗体と試料を反応させ、さらに
ビオチン化合物を結合した抗体と反応させた後、反応生
成物中のビオチン化合物または未反応生成物中のビオチ
ン化合物をアルカリホスファターゼで標識したアビジン
化合物により検出する。アビジンおよび類縁物質のスト
レプトアビジンは分子量５万程度のタンパク質であり、
これらはアルカリホスファターゼとグルタルアルデヒド
法、マレイミド法、カルボジイミド法、ピリジン−ジス
ルフィド法などを用いて結合することができる。
【００３３】一方、ビオチン化合物に代えてアビジン化
合物を結合する抗体を使用した場合、抗原抗体反応の
後、アビジン化合物とアルカリホスファターゼで標識し
たビオチン化合物により検出する。アルカリホスファタ
ーゼをビオチン化する試薬は市販されており、例えばビ
オチン−Ｎ−ハイドロキシ−コハク酸イミドエステル、
ビオチン−Ｎ−ハイドロキシ−スルホコハク酸イミドエ
ステル、ビオチノイル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ハ
イドロキシ−コハク酸イミドエステルなどを挙げること
ができる。
合物を結合する抗体を使用した場合、抗原抗体反応の
後、アビジン化合物とアルカリホスファターゼで標識し
たビオチン化合物により検出する。アルカリホスファタ
ーゼをビオチン化する試薬は市販されており、例えばビ
オチン−Ｎ−ハイドロキシ−コハク酸イミドエステル、
ビオチン−Ｎ−ハイドロキシ−スルホコハク酸イミドエ
ステル、ビオチノイル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ハ
イドロキシ−コハク酸イミドエステルなどを挙げること
ができる。
【００３４】本発明の試料中のリガンド検出試薬とは、
前記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標
識されたリガンドに対する特異的結合物質または前記理
化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識され
たリガンドおよびアルカリホスファターゼ測定試薬を含
有する。アルカリホスファターゼ測定試薬としては、発
色基質、蛍光基質、発光基質などが例示される。
前記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標
識されたリガンドに対する特異的結合物質または前記理
化学的性質を有するアルカリホスファターゼで標識され
たリガンドおよびアルカリホスファターゼ測定試薬を含
有する。アルカリホスファターゼ測定試薬としては、発
色基質、蛍光基質、発光基質などが例示される。
【００３５】発色基質としては、ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸、１−ナフトールフタレインモノリン酸（特公平５
−１３９５８号公報）、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルリン酸およびそれとニトロブルーテトラゾリ
ウムとの組み合わせなどが挙げられる。また、蛍光基質
としては、４−メチルウンベリフェリルリン酸、フェナ
レノン−６−リン酸とその類縁化合物、ベンズフェナレ
ン−６−リン酸とその類縁化合物（特開昭６２−１９０
１９１号公報）などが挙げられる。さらに、発光基質と
しては、ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤ等の１，２−ジオキセタン
化合物またはそれらの誘導体およびこれらの化合物とエ
ンハンサー、例えば界面活性剤、蛍光性物質またはタン
パク質などの混合物などが挙げられる。
ン酸、１−ナフトールフタレインモノリン酸（特公平５
−１３９５８号公報）、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルリン酸およびそれとニトロブルーテトラゾリ
ウムとの組み合わせなどが挙げられる。また、蛍光基質
としては、４−メチルウンベリフェリルリン酸、フェナ
レノン−６−リン酸とその類縁化合物、ベンズフェナレ
ン−６−リン酸とその類縁化合物（特開昭６２−１９０
１９１号公報）などが挙げられる。さらに、発光基質と
しては、ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤ等の１，２−ジオキセタン
化合物またはそれらの誘導体およびこれらの化合物とエ
ンハンサー、例えば界面活性剤、蛍光性物質またはタン
パク質などの混合物などが挙げられる。
【００３６】本発明のこれら基質の濃度は、０．０１〜
２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは〜５０ｍｍｏｌ／ｌで
ある。本発明の酵素反応は、通常、ｐＨ７〜１１で行う
が、至適ｐＨを考慮すると、ｐＨ８〜１１で酵素反応す
ることが望ましい。使用する緩衝液としては、トリス塩
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ジエタノールアミン塩酸緩衝
液、トリエタノールアミン塩酸緩衝液、重炭酸緩衝液、
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩酸緩衝液、バルビタール
緩衝液、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ
−２−メチルプロパノール塩酸緩衝液、アミノアルコー
ル系緩衝液などを例示することができる。これらの緩衝
液の濃度は、５〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２０
〜５０ｍｍｏｌ／ｌである。
２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは〜５０ｍｍｏｌ／ｌで
ある。本発明の酵素反応は、通常、ｐＨ７〜１１で行う
が、至適ｐＨを考慮すると、ｐＨ８〜１１で酵素反応す
ることが望ましい。使用する緩衝液としては、トリス塩
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ジエタノールアミン塩酸緩衝
液、トリエタノールアミン塩酸緩衝液、重炭酸緩衝液、
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩酸緩衝液、バルビタール
緩衝液、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ
−２−メチルプロパノール塩酸緩衝液、アミノアルコー
ル系緩衝液などを例示することができる。これらの緩衝
液の濃度は、５〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２０
〜５０ｍｍｏｌ／ｌである。
【００３７】反応生成物に結合する酵素または未反応生
成物に結合する酵素の活性は、アルカリホスファタゼ活
性をレート法で測定することより実施できるが、上記基
質と酵素結合体を一定時間反応させ、反応停止後に該生
成物を検出することによっても行うことができる。停止
剤として使用できるものとしては、アルカリ溶液、酵素
阻害剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、無機リン酸等が使用
できる。また反応停止後、強アルカリ条件にすることに
より、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ジオキセタン化合物
等の基質では、感度を更に上げることができる（特開平
２−２７３１９９号公報）。
成物に結合する酵素の活性は、アルカリホスファタゼ活
性をレート法で測定することより実施できるが、上記基
質と酵素結合体を一定時間反応させ、反応停止後に該生
成物を検出することによっても行うことができる。停止
剤として使用できるものとしては、アルカリ溶液、酵素
阻害剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、無機リン酸等が使用
できる。また反応停止後、強アルカリ条件にすることに
より、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ジオキセタン化合物
等の基質では、感度を更に上げることができる（特開平
２−２７３１９９号公報）。
【００３８】本発明に使用する緩衝液中にはアルカリフ
ォスファターゼの不活性化を防ぐために金属塩を添加す
ることが望ましい。使用できる金属塩としてはマグネシ
ウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、マンガン塩、カルシウム
塩が挙げられるが、好ましくはマグネシウム塩とコバル
ト塩である。好ましいマグネシウム塩の添加濃度は０．
０５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌであり、酢酸マグ
ネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、
硫酸マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸マグネシウ
ム等のマグネシウム錯化合物を使用することができる。
好ましいコバルト塩の添加濃度は０．０２〜５ｍｍｏｌ
／ｌであり、酢酸コバルト、塩化コバルト、クエン酸コ
バルト、硫酸コバルト、エチレンジアミン四酢酸コバル
ト等のコバルト錯化合物を使用することができる。マグ
ネシウム塩とコバルト塩を併用することが望ましいが必
須ではない。
ォスファターゼの不活性化を防ぐために金属塩を添加す
ることが望ましい。使用できる金属塩としてはマグネシ
ウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、マンガン塩、カルシウム
塩が挙げられるが、好ましくはマグネシウム塩とコバル
ト塩である。好ましいマグネシウム塩の添加濃度は０．
０５ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌであり、酢酸マグ
ネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、
硫酸マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸マグネシウ
ム等のマグネシウム錯化合物を使用することができる。
好ましいコバルト塩の添加濃度は０．０２〜５ｍｍｏｌ
／ｌであり、酢酸コバルト、塩化コバルト、クエン酸コ
バルト、硫酸コバルト、エチレンジアミン四酢酸コバル
ト等のコバルト錯化合物を使用することができる。マグ
ネシウム塩とコバルト塩を併用することが望ましいが必
須ではない。
【００３９】本発明の実施に有用な界面活性剤は、アル
カリフォスファターゼ活性を大きく阻害しない任意のも
のを使用することができる。一般に有用な界面活性剤は
非イオン性界面活性剤であるが、両性界面活性剤および
イオン性界面活性剤も使用できる。また本発明には水と
混和しうる有機溶媒の併用も可能である。その例として
メタノール、エタノール、プロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニト
リル、ヘキサメチレンホスホアミドなどである。
カリフォスファターゼ活性を大きく阻害しない任意のも
のを使用することができる。一般に有用な界面活性剤は
非イオン性界面活性剤であるが、両性界面活性剤および
イオン性界面活性剤も使用できる。また本発明には水と
混和しうる有機溶媒の併用も可能である。その例として
メタノール、エタノール、プロパノール、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニト
リル、ヘキサメチレンホスホアミドなどである。
【００４０】さらに、本発明の試薬には酵素反応を円滑
に行わせるため、あるいはその構成成分の活性を維持す
るため、他の化合物を添加してもよい。このような化合
物として、例えば安定化剤、賦形剤が挙げられる。また
バックグラウンドや非特異反応の低減にアルカリフォス
ファターゼの不活化型酵素を添加することは有効であ
る。
に行わせるため、あるいはその構成成分の活性を維持す
るため、他の化合物を添加してもよい。このような化合
物として、例えば安定化剤、賦形剤が挙げられる。また
バックグラウンドや非特異反応の低減にアルカリフォス
ファターゼの不活化型酵素を添加することは有効であ
る。
【００４１】本発明は上記固相サンドウイッチ免疫測定
法のみならず、ホルモン−レセプター親和性を利用した
ホルモンやそのレセプターの測定、核酸−核酸親和性、
例えばＤＮＡ−ＤＮＡ反応またはＤＮＡ−ＲＮＡ反応な
どを利用した測定などにも用いることができる。
法のみならず、ホルモン−レセプター親和性を利用した
ホルモンやそのレセプターの測定、核酸−核酸親和性、
例えばＤＮＡ−ＤＮＡ反応またはＤＮＡ−ＲＮＡ反応な
どを利用した測定などにも用いることができる。
【００４２】本発明の核酸を検出する具体的な例として
は、捕捉オリゴヌクレオチドを固定した部材に核酸（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ）を含む試料を作用させ、次いでアル
カリホスファターゼを標識した検出オリゴヌクレオチド
を作用させて、捕捉オリゴヌクレオチドに結合した核酸
と標識した検出オリゴヌクレオチドとの核酸ハイブリダ
イゼーションを行い、未反応の検出オリゴヌクレオチド
を分離した後、核酸ハイブリダイゼーションされた結合
体のアルカリホスファターゼ活性を測定することによ
り、試料中の核酸を検出する方法がある。
は、捕捉オリゴヌクレオチドを固定した部材に核酸（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ）を含む試料を作用させ、次いでアル
カリホスファターゼを標識した検出オリゴヌクレオチド
を作用させて、捕捉オリゴヌクレオチドに結合した核酸
と標識した検出オリゴヌクレオチドとの核酸ハイブリダ
イゼーションを行い、未反応の検出オリゴヌクレオチド
を分離した後、核酸ハイブリダイゼーションされた結合
体のアルカリホスファターゼ活性を測定することによ
り、試料中の核酸を検出する方法がある。
【００４３】試料中の核酸としては、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａなど、１本鎖または２本鎖核酸が例示される。試料と
しては、血清、尿、リンパ液などの体液、各種組織など
の材料が例示される。
Ａなど、１本鎖または２本鎖核酸が例示される。試料と
しては、血清、尿、リンパ液などの体液、各種組織など
の材料が例示される。
【００４４】本発明のアルカリホスファターゼとＤＮＡ
またはＲＮＡとの複合体の作製は、例えば M.Renz and
C.Kurz,Nucleic Acids Res.,12(8),3435(1984)に記載の
方法を用いることができる。例えば、アルカリフォスフ
ァターゼとポリエチレンイミンを架橋して、コンジュゲ
ートを作製した後、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレ
オチドをグルタルアルデヒドにより架橋させ、標識核酸
を得る。またオリゴヌクレオチドを合成する場合、その
５’末端や任意の鎖にスペーサーアームを介して、直
接、アミノ基やチオール基を導入する試薬が市販されて
おり、これらの試薬とアルカリホスファターゼをグルタ
ルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、コ
ハク酸イミドエステル法、ピリジン−ジスルフィド法に
より結合して、オリゴヌクレオチドにアルカリホスファ
ターゼを導入することもできる。
またはＲＮＡとの複合体の作製は、例えば M.Renz and
C.Kurz,Nucleic Acids Res.,12(8),3435(1984)に記載の
方法を用いることができる。例えば、アルカリフォスフ
ァターゼとポリエチレンイミンを架橋して、コンジュゲ
ートを作製した後、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレ
オチドをグルタルアルデヒドにより架橋させ、標識核酸
を得る。またオリゴヌクレオチドを合成する場合、その
５’末端や任意の鎖にスペーサーアームを介して、直
接、アミノ基やチオール基を導入する試薬が市販されて
おり、これらの試薬とアルカリホスファターゼをグルタ
ルアルデヒド法、マレイミド法、カルボジイミド法、コ
ハク酸イミドエステル法、ピリジン−ジスルフィド法に
より結合して、オリゴヌクレオチドにアルカリホスファ
ターゼを導入することもできる。
【００４５】試料としてはＤＮＡが例示され、ＤＮＡを
鋳型として伸長反応を行う際、ビオチン化プライマーも
しくはビオチン化ターミネーター等を利用して、ビオチ
ンをＤＮＡ断片に取り込ませる。次に電気泳動により断
片を展開した後、アビジン化アルカリホスファターゼも
しくはアビジン、続いてビオチン化アルカリホスファタ
ーゼと反応させて、上記断片を検出する。
鋳型として伸長反応を行う際、ビオチン化プライマーも
しくはビオチン化ターミネーター等を利用して、ビオチ
ンをＤＮＡ断片に取り込ませる。次に電気泳動により断
片を展開した後、アビジン化アルカリホスファターゼも
しくはアビジン、続いてビオチン化アルカリホスファタ
ーゼと反応させて、上記断片を検出する。
【００４６】更には、本発明は試料中の核酸を取り出し
て、核酸ハイブリダイゼーションを行う方法に代えて、
細胞中で核酸ハイブリダイゼーションを行うin situ ハ
イブリダイゼーションにも使用可能である。
て、核酸ハイブリダイゼーションを行う方法に代えて、
細胞中で核酸ハイブリダイゼーションを行うin situ ハ
イブリダイゼーションにも使用可能である。
【００４７】本発明の他の具体例としては、標識とし
て、上記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼ
を使用することを特徴とする試料中の核酸配列決定法が
ある。配列決定にはジデオキシターミネーション法、マ
キサム−ギルバート法など公知の手法を選択することが
できる。例えば、ジデオキシターミネーション法を用い
る場合、以下の方法が例示される。まず配列を決定すべ
き核酸（一本鎖もしくはアルカリ変性した２本鎖）にビ
オチン化プライマーをハイブリダイズさせ、さらに１種
のジデオキシリボヌクレオチド（例えばｄｄＡＴＰ）を
４種のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）および
核酸合成酵素（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ酵素、Ｔ７ポリメ
ラーゼ等）とともに加え、伸長反応と停止反応を同時に
行わせる。他の３種のジデオキシリボヌクレオチド（ｄ
ｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴｐ）についても同
様に反応をおこなわせ、得られる４種の反応液をそれぞ
れシークエンスゲル上の電気泳動に付した後、アビジン
化アルカリフォスファターゼもしくはアビジン、続いて
ビオチン化アルカリホスファターゼを反応させ、発色基
質等を用いて種々の伸長断片を検出、各レーンを比較対
照することにより核酸配列を決定する。上記アルカリホ
スファターゼ標識核酸を用いる核酸配列決定用試薬とし
ては、該酵素を直接的または間接的に結合するＤＮＡま
たはＲＮＡとアルカリホスファターゼ測定試薬を包含す
る。
て、上記理化学的性質を有するアルカリホスファターゼ
を使用することを特徴とする試料中の核酸配列決定法が
ある。配列決定にはジデオキシターミネーション法、マ
キサム−ギルバート法など公知の手法を選択することが
できる。例えば、ジデオキシターミネーション法を用い
る場合、以下の方法が例示される。まず配列を決定すべ
き核酸（一本鎖もしくはアルカリ変性した２本鎖）にビ
オチン化プライマーをハイブリダイズさせ、さらに１種
のジデオキシリボヌクレオチド（例えばｄｄＡＴＰ）を
４種のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）および
核酸合成酵素（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ酵素、Ｔ７ポリメ
ラーゼ等）とともに加え、伸長反応と停止反応を同時に
行わせる。他の３種のジデオキシリボヌクレオチド（ｄ
ｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴｐ）についても同
様に反応をおこなわせ、得られる４種の反応液をそれぞ
れシークエンスゲル上の電気泳動に付した後、アビジン
化アルカリフォスファターゼもしくはアビジン、続いて
ビオチン化アルカリホスファターゼを反応させ、発色基
質等を用いて種々の伸長断片を検出、各レーンを比較対
照することにより核酸配列を決定する。上記アルカリホ
スファターゼ標識核酸を用いる核酸配列決定用試薬とし
ては、該酵素を直接的または間接的に結合するＤＮＡま
たはＲＮＡとアルカリホスファターゼ測定試薬を包含す
る。
【００４８】
【本発明の効果】本発明で特定されるアルカリホスファ
ターゼを使用するバインディングアッセイ用試薬、それ
による試料中のリガンド検出法は、高感度であって、長
期保存性に優れる。しかも目的物質の検出にあたり、バ
ックグラウンドの少ない良好な結果を与えることができ
る。
ターゼを使用するバインディングアッセイ用試薬、それ
による試料中のリガンド検出法は、高感度であって、長
期保存性に優れる。しかも目的物質の検出にあたり、バ
ックグラウンドの少ない良好な結果を与えることができ
る。
【００４９】
【実施例】以下、参考例、実施例を挙げて、本発明を具
体的に説明する。参考例１ ３．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、０．１
％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００
２％リン酸一カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含む
培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１
２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌とし
て、バチルス・バディウムＴＥ３４９７（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５１２０）を一白金耳植菌し、３０℃で２０時間培
養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレ
ーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌに移し、３０
０ｒｐｍ，通気量２１／分、３０℃で２０時間培養し
た。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を
得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマ
トグラフィー、フェニルセファロールクロマトグラフィ
ー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比
活性２，３００Ｕ／ｍｇにまで精製した。
体的に説明する。参考例１ ３．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、０．１
％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、０．００
２％リン酸一カリウム、０．３％塩化ナトリウムを含む
培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１
２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌とし
て、バチルス・バディウムＴＥ３４９７（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５１２０）を一白金耳植菌し、３０℃で２０時間培
養し、種培養液とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレ
ーブを行い、放冷後、種培養液１００ｍｌに移し、３０
０ｒｐｍ，通気量２１／分、３０℃で２０時間培養し
た。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を
得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロースクロマ
トグラフィー、フェニルセファロールクロマトグラフィ
ー、セファデックスＧ−２００によるゲルろ過により比
活性２，３００Ｕ／ｍｇにまで精製した。
【００５０】得られたアルカリホスファターゼは下記特
性を有していた。 １．下記の反応を触媒した。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性
性を有していた。 １．下記の反応を触媒した。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性
【００５１】
【表１】
【００５２】３．Ｋｍ値 ｐ−ニトロフェノールに対するＫｍ値は０．２８ｍＭで
あった。 ４．至適ｐＨ ０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。至適ｐＨは９．５
〜１０であった。 ５．安定ｐＨ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ
３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１０）で２６℃、１６時間保存して、その残存活
性を測定した。安定ｐＨはｐＨ６〜１１であった。 ６．至適温度 各温度における酵素活性を測定した。至適温度は６０℃
以上であった。 ７．熱安定性 本発明の酵素を１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および０．１ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ2 を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を
測定した。７０℃まで安定であった（但し、８０％以上
の残存活性がある場合を安定であると定義する）。 ８．活性化および安定化剤 Ｍｇ2+およびＣｏ2+が必須であった。 ９．分子量 １４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １０．糖含量 糖は検出されなかった。
あった。 ４．至適ｐＨ ０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。至適ｐＨは９．５
〜１０であった。 ５．安定ｐＨ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ
３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１０）で２６℃、１６時間保存して、その残存活
性を測定した。安定ｐＨはｐＨ６〜１１であった。 ６．至適温度 各温度における酵素活性を測定した。至適温度は６０℃
以上であった。 ７．熱安定性 本発明の酵素を１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および０．１ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ2 を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）中で３０分間保温した後、残存する酵素活性を
測定した。７０℃まで安定であった（但し、８０％以上
の残存活性がある場合を安定であると定義する）。 ８．活性化および安定化剤 Ｍｇ2+およびＣｏ2+が必須であった。 ９．分子量 １４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ過法） ６５，０００〜６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １０．糖含量 糖は検出されなかった。
【００５３】実施例１ （１）アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＣＲＰ
ＩｇＧの作製 参考例１のアルカリフォスファターゼ５ｍｇを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 お
よび０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む）２．５ｍｌに２５
％グルタルアルデヒド溶液３５μｌを加え、２５℃で５
０分間インキュベートした。次に、２．５ｍｇのヤギ抗
ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所製）を
含む０．５ｍｌ ５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を
加え、２５℃で更に７５分間インキュベートした。次に
２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．７を１５０μｌ添加
後、４℃で３０分間撹拌し、１５０ｍｇのＮａＢＨ4 を
含む水溶液を１５０μｌ添加後、４℃で１５時間インキ
ュベートした。得られた混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ
２００（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグ
ラフィー（溶出液として０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 、０．１％ Ｎａ
Ｎ3 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を
使用）で精製し、第一ピークを酵素標識抗体として取得
した。
ＩｇＧの作製 参考例１のアルカリフォスファターゼ５ｍｇを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 お
よび０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 を含む）２．５ｍｌに２５
％グルタルアルデヒド溶液３５μｌを加え、２５℃で５
０分間インキュベートした。次に、２．５ｍｇのヤギ抗
ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所製）を
含む０．５ｍｌ ５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を
加え、２５℃で更に７５分間インキュベートした。次に
２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．７を１５０μｌ添加
後、４℃で３０分間撹拌し、１５０ｍｇのＮａＢＨ4 を
含む水溶液を１５０μｌ添加後、４℃で１５時間インキ
ュベートした。得られた混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ
２００（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグ
ラフィー（溶出液として０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 、０．１％ Ｎａ
Ｎ3 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を
使用）で精製し、第一ピークを酵素標識抗体として取得
した。
【００５４】（２）ヒトＣＲＰの検量線 ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（日本バイオテスト研究所
製）を被覆したポリスチレンビーズ１個にヒトＣＲＰ
０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０℃で１時
間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３回洗浄
後、アルカリフォスファターゼ活性当たり１Ｕ／ｍｌに
希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１時間イ
ンキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１１ｍＭ
ｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含
む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加え、
３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２ｍ
ｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度
を測定し、検量線を作成した（図１）。
製）を被覆したポリスチレンビーズ１個にヒトＣＲＰ
０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０℃で１時
間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３回洗浄
後、アルカリフォスファターゼ活性当たり１Ｕ／ｍｌに
希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１時間イ
ンキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１１ｍＭ
ｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含
む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加え、
３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ ２ｍ
ｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度
を測定し、検量線を作成した（図１）。
【００５５】比較例１ 仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）５
ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２．５
ｍｌに２５％グルタルアルデヒド溶液１５０μｌを加
え、実施例１と同様に操作を行い、酵素標識抗体を取得
した。上記酵素標識抗体を用い、実施例１と同様にヒト
ＣＲＰについての検量線を作製した（図１）。特異発色
（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度
（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本
発明のアルカリフォスファターゼ１２．５に対して、Ｃ
ＩＡＰは５．１３であり、本発明のアルカリフォスファ
ターゼの方が非特異吸着が小さかった。
ｍｇを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２．５
ｍｌに２５％グルタルアルデヒド溶液１５０μｌを加
え、実施例１と同様に操作を行い、酵素標識抗体を取得
した。上記酵素標識抗体を用い、実施例１と同様にヒト
ＣＲＰについての検量線を作製した（図１）。特異発色
（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度
（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本
発明のアルカリフォスファターゼ１２．５に対して、Ｃ
ＩＡＰは５．１３であり、本発明のアルカリフォスファ
ターゼの方が非特異吸着が小さかった。
【００５６】実施例２ （１）アルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトＣＲ
Ｐ Ｆａｂ’の作製 ヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆ（ａｂ’）2 （バインディング
サイト社）５ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ
６．０ １ｍｌに０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミ
ン、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ６．０ １００ｍｌを加え、３７℃、９０分間イン
キュベートした。該混合液を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、０．５ｍ
ｌに濃縮した。一方、本発明のアルカリフォスファター
ゼ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールアミン緩
衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ
ＣｏＣｌ2 を含む）５００μｌに０．１ｍｇ Ｎ−サク
シニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレートを含むジメチルホルムアミ
ド１０μｌを加え、３０℃で３０分間インキュベートし
た。得られた液は１ｍＭＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ Ｃｏ
Ｃｌ2 を含む０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．０
で脱塩後、０．５ｍｌに濃縮した。調製したヒツジ抗ヒ
トＣＲＰ Ｆａｂ’にマレイミド化アルカリフォスファ
ターゼを加え、４℃、２０時間インキュベートした。次
に１０ｍＭ ２−メルカプトエチルアミン ５０μｌを
加え、２５℃で２０分間インキュベートした。得られた
混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピ
ークを酵素標識抗体として取得した。
Ｐ Ｆａｂ’の作製 ヒツジ抗ヒトＣＲＰ Ｆ（ａｂ’）2 （バインディング
サイト社）５ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ
６．０ １ｍｌに０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミ
ン、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ６．０ １００ｍｌを加え、３７℃、９０分間イン
キュベートした。該混合液を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、０．５ｍ
ｌに濃縮した。一方、本発明のアルカリフォスファター
ゼ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールアミン緩
衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ
ＣｏＣｌ2 を含む）５００μｌに０．１ｍｇ Ｎ−サク
シニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレートを含むジメチルホルムアミ
ド１０μｌを加え、３０℃で３０分間インキュベートし
た。得られた液は１ｍＭＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ Ｃｏ
Ｃｌ2 を含む０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．０
で脱塩後、０．５ｍｌに濃縮した。調製したヒツジ抗ヒ
トＣＲＰ Ｆａｂ’にマレイミド化アルカリフォスファ
ターゼを加え、４℃、２０時間インキュベートした。次
に１０ｍＭ ２−メルカプトエチルアミン ５０μｌを
加え、２５℃で２０分間インキュベートした。得られた
混合物はＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピ
ークを酵素標識抗体として取得した。
【００５７】（２）ヒトＣＲＰの検量線 ヤギ抗ヒトＣＲＰＩｇＧ分画（株式会社日本バイオテス
ト研究所製）を被覆したポリスチレンビーズ１個に、ヒ
トＣＲＰ０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０
℃で１時間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３
回洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性当たり１Ｕ／
ｍｌに希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１
時間インキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１
１ｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ2
を含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加
え、３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ２
ｍｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光
度を測定し、検量線を作成した（図２）。
ト研究所製）を被覆したポリスチレンビーズ１個に、ヒ
トＣＲＰ０〜１０００ｎｇ／ｍｌ １ｍｌを加え、３０
℃で１時間インキュベートした。次に固相をＰＢＳで３
回洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性当たり１Ｕ／
ｍｌに希釈した酵素標識抗体１ｍｌを加え、３０℃で１
時間インキュベートした。更にＰＢＳで３回洗浄後、１
１ｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ2
を含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８を加
え、３７℃で３０分間反応させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ２
ｍｌを加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光
度を測定し、検量線を作成した（図２）。
【００５８】比較例２ ＣＩＡＰ２．５ｍｇを含む３０ｍＭ トリエタノールア
ミン緩衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１
ｍＭ ＺｎＣｌ2 、３Ｍ ＮａＣｌを含む）５００μｌ
について実施例２と同様の操作を行い、酵素標識抗体を
取得した。上記酵素標識抗体を用い、実施例１同様ヒト
ＣＲＰについての検量線を作成した（図２）。特異発色
（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度
（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本
発明のアルカリフォスファターゼ５５．２に対して、Ｃ
ＩＡＰは３４．８であり、本発明のアルカリフォスファ
ターゼの方が非特異吸着が小さかった。
ミン緩衝液、ｐＨ７．６（１ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１
ｍＭ ＺｎＣｌ2 、３Ｍ ＮａＣｌを含む）５００μｌ
について実施例２と同様の操作を行い、酵素標識抗体を
取得した。上記酵素標識抗体を用い、実施例１同様ヒト
ＣＲＰについての検量線を作成した（図２）。特異発色
（１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）とブランクの吸光度
（０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＲＰ）の比（Ｓ／Ｎ比）は、本
発明のアルカリフォスファターゼ５５．２に対して、Ｃ
ＩＡＰは３４．８であり、本発明のアルカリフォスファ
ターゼの方が非特異吸着が小さかった。
【００５９】実施例３ （１）ストレプトアビジン標識アルカリフォスファター
ゼの作製 ストレプトアビジン４ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ７．５ ６００μｌに０．１ｍｇ Ｓ−アセチ
ルメルカプトスクシニックアンハイドライドを含むジメ
チルホルムアミド１０μｌを添加し、３０℃で３０分間
インキュベートした。次に０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．０ ２０μｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．０ １２０μｌ、１Ｍ塩酸ハイドロキシルアミン１
２０μｌを添加し、３０℃で５分間インキュベートし、
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、６００μ
ｌに濃縮した。実施例２で作製したマレイミド化アルカ
リフォスファターゼ溶液１００μｌに作製したメルカプ
トスクシニル化ストレプトアビジン１００μｌを加え、
４℃、２０時間インキュベート後、得られた混合物をＳ
ｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピークを酵素
標識ストレプトアビジンとした。
ゼの作製 ストレプトアビジン４ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ７．５ ６００μｌに０．１ｍｇ Ｓ−アセチ
ルメルカプトスクシニックアンハイドライドを含むジメ
チルホルムアミド１０μｌを添加し、３０℃で３０分間
インキュベートした。次に０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ
７．０ ２０μｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．０ １２０μｌ、１Ｍ塩酸ハイドロキシルアミン１
２０μｌを添加し、３０℃で５分間インキュベートし、
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で脱塩後、６００μ
ｌに濃縮した。実施例２で作製したマレイミド化アルカ
リフォスファターゼ溶液１００μｌに作製したメルカプ
トスクシニル化ストレプトアビジン１００μｌを加え、
４℃、２０時間インキュベート後、得られた混合物をＳ
ｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００で精製し、第一ピークを酵素
標識ストレプトアビジンとした。
【００６０】比較例３ ＣＩＡＰについて実施例３と同様な方法で酵素標識スト
レプトアビジンを作製した。常法に従い、イモビロン
（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇアプラ
イし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング後、本
発明の酵素標識ストレプトアビジン及びＣＩＡＰ標識ス
トレプトアビジン０．３Ｕ／ｍｌと３０℃で１時間イン
キュベートした。次に発光基質ＰＰＤを含む１Ｍ ジエ
タノールアミン緩衝液，ｐＨ９．８（５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 を含む）と反応させ、Ｘ線フィルムに感光させて検出
した。本発明の酵素標識体およびＣＩＡＰ標識体共に
０．５ｎｇのビオチニル化ストレプトアビジンを検出す
ることができた。次に本発明の酵素標識ストレプトアビ
ジンおよびＣＩＡＰ標識ストレプトアビジンを１ｍＭ
ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．５で４０℃に７日間保存して、アルカリフォスファ
ターゼ活性を比較した。結果を図３に示すが、本発明の
酵素標識ストレプトアビジンの方が安定であった（図
３）。
レプトアビジンを作製した。常法に従い、イモビロン
（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇアプラ
イし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング後、本
発明の酵素標識ストレプトアビジン及びＣＩＡＰ標識ス
トレプトアビジン０．３Ｕ／ｍｌと３０℃で１時間イン
キュベートした。次に発光基質ＰＰＤを含む１Ｍ ジエ
タノールアミン緩衝液，ｐＨ９．８（５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 を含む）と反応させ、Ｘ線フィルムに感光させて検出
した。本発明の酵素標識体およびＣＩＡＰ標識体共に
０．５ｎｇのビオチニル化ストレプトアビジンを検出す
ることができた。次に本発明の酵素標識ストレプトアビ
ジンおよびＣＩＡＰ標識ストレプトアビジンを１ｍＭ
ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ
７．５で４０℃に７日間保存して、アルカリフォスファ
ターゼ活性を比較した。結果を図３に示すが、本発明の
酵素標識ストレプトアビジンの方が安定であった（図
３）。
【００６１】実施例４ （１）ビオチニル化アルカリフォスファターゼの作製 本発明のアルカリフォスファターゼ６ｍｇを含む３０ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５（１ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ２を含む）６００μ
ｌに０．１２８ｍｇ Ｄ−ビオチニン−ε−アミノカプ
リン酸−Ｎ−ハイドロキシスクシイミドエステルを含む
ジメチルホルムアミド２０μｌを加え、２５℃で３時間
撹拌した後、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 、０．１％ＮａＮ3 を含
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に対して透析した。
Ｍトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５（１ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ２を含む）６００μ
ｌに０．１２８ｍｇ Ｄ−ビオチニン−ε−アミノカプ
リン酸−Ｎ−ハイドロキシスクシイミドエステルを含む
ジメチルホルムアミド２０μｌを加え、２５℃で３時間
撹拌した後、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、０．１ｍＭ ＣｏＣｌ2 、０．１％ＮａＮ3 を含
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に対して透析した。
【００６２】比較例４ ＣＩＡＰについて実施例４と同様の方法でビオチニル化
アルカリフォスファタを作製した。常法に従い、イモビ
ロン（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇア
プライし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング
後、１μｇ／ｍｌの本発明のビオチニル化アルカリフォ
スファターゼ及びビオチニル化ＣＩＡＰ０．３Ｕ／ｍｌ
と３０℃で１時間インキュベートした。次に発光基質Ｐ
ＰＤを含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．
８（５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む）と反応させ、Ｘ線フィ
ルムに感光させて検出した。本発明の酵素標識体および
ＣＩＡＰ標識体共に５０ｐｇのビオチニル化ストレプト
アビジンを検出することができた。次に本発明のビオチ
ニル化アルカリフォスファターゼおよびビオチニル化Ｃ
ＩＡＰを１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で熱アルカリフォスファターゼ
活性の熱安定性を比較した。結果を図４に示すが、本発
明のビオチニル化アルカリフォスファターゼの方が安定
であった。
アルカリフォスファタを作製した。常法に従い、イモビ
ロン（ミリポア社）にビオチニルＢＳＡを０〜５ｎｇア
プライし、１％カゼインを含むＰＢＳでブロッキング
後、１μｇ／ｍｌの本発明のビオチニル化アルカリフォ
スファターゼ及びビオチニル化ＣＩＡＰ０．３Ｕ／ｍｌ
と３０℃で１時間インキュベートした。次に発光基質Ｐ
ＰＤを含む１Ｍ ジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．
８（５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む）と反応させ、Ｘ線フィ
ルムに感光させて検出した。本発明の酵素標識体および
ＣＩＡＰ標識体共に５０ｐｇのビオチニル化ストレプト
アビジンを検出することができた。次に本発明のビオチ
ニル化アルカリフォスファターゼおよびビオチニル化Ｃ
ＩＡＰを１ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で熱アルカリフォスファターゼ
活性の熱安定性を比較した。結果を図４に示すが、本発
明のビオチニル化アルカリフォスファターゼの方が安定
であった。
【００６３】実施例５ （１）アルカリフォスファターゼ標識プローブ Ｕｎｉ−ＬｉｎｋTMＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ（クロ
ーンテック社製）を５’端に組み込んだ下記配列のオリ
ゴヌクレオチドを通常の方法で合成し、精製した。 ５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧ
ＣＧＣＧＴＡＡＴ−３’ 上記プローブ１０ｎｍｏｌｅを含む０．１Ｍ ＮａＨＣ
Ｏ3 １０μｌにジスクシミジルスベリン酸溶液（１０ｍ
ｇ／ｍｌ−ＤＭＳＯ）５０μｌ加え、攪拌後、２５℃１
５分間反応させ、セファデックスＧ−２５カラムでゲル
ろ過し、最初のオリゴヌクレオチドを含むピークを分取
した。該ピークを１００μｌに濃縮し、本発明のアルカ
リフォスファターゼ１．５ｍｇを含む０．１Ｍ ＮａＨ
ＣＯ3 ４０μｌを加え、２５℃で一晩反応した。該混合
物に約５００μｌの１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０を加えた後、Ｍｏ
ｎｏＱ（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグ
ラフィー（溶出液Ａ：１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む２
０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、溶出液Ｂ：１．
０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で精製した。
ーンテック社製）を５’端に組み込んだ下記配列のオリ
ゴヌクレオチドを通常の方法で合成し、精製した。 ５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧ
ＣＧＣＧＴＡＡＴ−３’ 上記プローブ１０ｎｍｏｌｅを含む０．１Ｍ ＮａＨＣ
Ｏ3 １０μｌにジスクシミジルスベリン酸溶液（１０ｍ
ｇ／ｍｌ−ＤＭＳＯ）５０μｌ加え、攪拌後、２５℃１
５分間反応させ、セファデックスＧ−２５カラムでゲル
ろ過し、最初のオリゴヌクレオチドを含むピークを分取
した。該ピークを１００μｌに濃縮し、本発明のアルカ
リフォスファターゼ１．５ｍｇを含む０．１Ｍ ＮａＨ
ＣＯ3 ４０μｌを加え、２５℃で一晩反応した。該混合
物に約５００μｌの１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０を加えた後、Ｍｏ
ｎｏＱ（ファルマシア製）を用いる高速液体クロマトグ
ラフィー（溶出液Ａ：１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む２
０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、溶出液Ｂ：１．
０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で精製した。
【００６４】比較例５ ＣＩＡＰについて実施例５の方法で、ＣＩＡＰ標識プロ
ーブを作製した。本発明の酵素標識プローブおよびＣＩ
ＡＰ標識プローブを１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＰＢＳで
７０℃で２時間処理して、アルカリフォスファターゼ活
性を比較した。結果は図５に示すように、本発明の酵素
標識プローブの方が安定であった。
ーブを作製した。本発明の酵素標識プローブおよびＣＩ
ＡＰ標識プローブを１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＰＢＳで
７０℃で２時間処理して、アルカリフォスファターゼ活
性を比較した。結果は図５に示すように、本発明の酵素
標識プローブの方が安定であった。
【図１】本発明の酵素標識およびＣＩＡＰ標識ヤギ抗ヒ
トＣＲＰＩｇＧを用いたヒトＣＲＰの検量線の比較を示
す。
トＣＲＰＩｇＧを用いたヒトＣＲＰの検量線の比較を示
す。
【図２】本発明の酵素標識およびＣＩＡＰ標識ヒツジ抗
ヒトＣＲＰＦａｂ’を用いたヒトＣＲＰの検量線の比較
を示す。
ヒトＣＲＰＦａｂ’を用いたヒトＣＲＰの検量線の比較
を示す。
【図３】ストレプトアビジンによる本発明の酵素標識体
とＣＩＡＰ標識体の保存安定性の比較を示す。
とＣＩＡＰ標識体の保存安定性の比較を示す。
【図４】ビオチンによる本発明の酵素標識体とＣＩＡＰ
標識体の熱安定性の比較を示す。
標識体の熱安定性の比較を示す。
【図５】本発明の酵素およびＣＩＡＰ標識プローブの熱
安定性を示す。
安定性を示す。
Claims (20)
- 【請求項１】 標識として、下記理化学的性質を有する
アルカリホスファターゼを使用することを特徴とする試
料中のリガンドを検出する方法。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定（但し、残存活性が８０％以上の場合を安
定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ） - 【請求項２】 試料中のリガンドを検出する方法が、試
料中のリガンドとリガンドに対して特異的な親和性を有
する物質との親和性反応を利用するものであり、該反応
により結合した物質に結合するアルカリホスファターゼ
活性を測定するか、あるいは結合しなかったアルカリホ
スファターゼ活性を測定する方法である請求項１記載の
試料中のリガンドの検出法。 - 【請求項３】 リガンドとリガンドに対して特異的な親
和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
り、アルカリホスファターゼがリガンドに対して特異的
な親和性を有する物質に直接的または間接的に結合する
請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。 - 【請求項４】 リガンドとリガンドに対して特異的な親
和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
り、アルカリホスファターゼがリガンドに直接的または
間接的に結合する請求項１記載の試料中のリガンドの検
出法。 - 【請求項５】 アビジン化合物またはビオチン化合物が
結合したリガンドに対して特異的な親和性を有する物質
と、アルカリホスファターゼとビオチン化合物またはア
ビジン化合物との結合とを、リガンドとリガンドに対し
て特異的な親和性を有する物質との親和性反応と同時
に、またはその後にアビジン化合物−ビオチン化合物結
合反応に付し、該反応により結合したアルカリホスファ
ターゼ活性または残存するアルカリホスファターゼ活性
を測定する請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。 - 【請求項６】 リガンドが抗原、抗体、ホルモン、ホル
モンレセプターまたは核酸である請求項１記載の試料中
のリガンドの検出法。 - 【請求項７】 リガンドとリガンドに対して特異的な親
和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
り、該親和反応が抗原抗体反応である請求項１記載の試
料中のリガンドの検出法。 - 【請求項８】 リガンドとリガンドに対して特異的な親
和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
り、該親和反応がホルモン−ホルモンレセプター反応で
ある請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。 - 【請求項９】 リガンドとリガンドに対して特異的な親
和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
り、該親和反応が核酸ハイブリダイゼーション反応であ
る請求項１記載の試料中のリガンドの検出法。 - 【請求項１０】 リガンドとリガンドに対して特異的な
親和性を有する物質との親和性反応を利用するものであ
り、リガンドまたはリガンドに対して特異的な親和性を
有する物質のいずれか一方が固相に結合している請求項
１記載の試料中のリガンドの検出法。 - 【請求項１１】 下記理化学的性質を有するアルカリホ
スファターゼで標識されたリガンドに対する特異的結合
物質または下記理化学的性質を有するアルカリホスファ
ターゼで標識されたリガンドおよびアルカリホスファタ
ーゼ測定試薬を含有する生体試料中のリガンド検出試
薬。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定（但し、残存活性が８０％以上の場合を安
定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ） - 【請求項１２】 (i) アビジン化合物またはビオチン化
合物を結合するリガンドに対して特異的な親和性を有す
る物質および(ii)ビオチン化合物またはアビジン化合物
を結合する下記理化学的性質を有するアルカリホスファ
ターゼおよび(iii) アルカリホスファターゼを測定する
物質を含有する生体試料中のリガンド検出試薬。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定（但し、残存活性が８０％以上の場合を安
定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ） - 【請求項１３】 アルカリホスファターゼ測定試薬が
１，２−ジオキセタン化合物またはこの誘導体、フェナ
レノン−６−リン酸、ベンズフェナレン−６−リン酸、
４−メチルウンベリフェリルリン酸、ｐ−ニトロフェニ
ルリン酸、１−ナフトールフタレインリン酸、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルリン酸またはこれらの
化合物の誘導体である請求項１１または１２記載の生体
試料中のリガンド検出試薬。 - 【請求項１４】 リガンドが抗原、抗体、ホルモン、ホ
ルモンレセプターまたは核酸である請求項１１または１
２記載の試料中のリガンド検出試薬。 - 【請求項１５】 リガンドとリガンドに対して特異的な
親和性を有する物質とが親和性反応性であって、親和性
反応が抗原抗体反応である請求項１１または１２記載の
試料中のリガンド検出試薬。 - 【請求項１６】 リガンドとリガンドに対して特異的な
親和性を有する物質との親和性反応性であって、親和性
反応がホルモン−ホルモンレセプター反応である請求項
１１または１２記載の試料中のリガンド検出試薬。 - 【請求項１７】 リガンドとリガンドに対して特異的な
親和性を有する物質との親和性反応性であって、親和性
反応が核酸ハイブリダイゼーション反応である請求項１
１または１２記載の試料中のリガンド検出試薬。 - 【請求項１８】 リガンドまたはリガンドに対して特異
的な親和性を有する物質のいずれか一方が固相に結合し
ている請求項１１または１２記載の試料中のリガンドの
検出試薬。 - 【請求項１９】 標識として、下記理化学的性質を有す
るアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする
試料中のリガンドを定量する方法。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+ ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定（但し、残存活性が８０％以上の場合を安
定であると定義する） ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ） - 【請求項２０】 標識として、下記理化学的性質を有す
るアルカリホスファターゼを使用することを特徴とする
試料中の核酸配列決定法。 １．次の反応を触媒する。オルソリン酸モノエステル
＋ Ｈ2 Ｏ → アルコール ＋ オルソリン酸 ２．活性化および安定化剤：Ｍｇ2+およびＣｏ2+（但
し、残存活性が８０％以上の場合を安定であると定義す
る） ３．熱安定性：ｐＨ７．５、６０℃処理で、少なくとも
３０分間安定である。 ４．比活性：少なくとも２，３００Ｕ／ｍｇ ５．糖鎖を有さない。 ６．分子量：１４０，０００〜１５０，０００（ゲルろ
過法）６５，０００〜 ６７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32089495A JP3658820B2 (ja) | 1995-12-08 | 1995-12-08 | 試料中のリガンド検出法およびそのための試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32089495A JP3658820B2 (ja) | 1995-12-08 | 1995-12-08 | 試料中のリガンド検出法およびそのための試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09159670A true JPH09159670A (ja) | 1997-06-20 |
| JP3658820B2 JP3658820B2 (ja) | 2005-06-08 |
Family
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| JP (1) | JP3658820B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013011519A (ja) * | 2011-06-29 | 2013-01-17 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | 安定化された高アルカリ性試薬及び測定方法 |
-
1995
- 1995-12-08 JP JP32089495A patent/JP3658820B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013011519A (ja) * | 2011-06-29 | 2013-01-17 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | 安定化された高アルカリ性試薬及び測定方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3658820B2 (ja) | 2005-06-08 |
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