JPH08501446A

JPH08501446A - 生物学的化合物の検出及び／または測定用結合体

Info

Publication number: JPH08501446A
Application number: JP6507616A
Authority: JP
Inventors: ジョゼルマクレ; ベルナールランティエール; イザベルアレクサーンドル; フィリップモリス; ナタリーザマテオ
Original assignee: ラムダテクエス．アー．
Priority date: 1992-09-22
Filing date: 1993-09-21
Publication date: 1996-02-20
Also published as: EP0662154B1; CA2145092A1; WO1994006933A1; EP0662154A1; BE1006179A3; AU4937093A; DE69319127D1

Abstract

(57)【要約】生物学的化合物を検出し、及び／または測定するための新規結合体がキナーゼまたはデヒドロゲナーゼからなり、そのサルファグループか好ましくは予め還元されており、好ましくはルシフェラーゼによる生物発光システムに使用可能な中間化合物を生成可能である。前記酵素は、カプリング剤によってあらかじめ活性化されたリガンドに結合し、前記生物学的化合物に特異的に結合する。本発明はまた、前記結合体の製造プロセス、前記結合体の検出及び／または測定プロセスへの利用、およびそれを含む診断キットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的化合物の検出及び／または測定用結合体発明の主題本発明は、生物学的化合物の検出及び／または測定（assay）をするための新規の結合体に関する。本発明は、前記結合体の製法、検出及び／または測定方法における前記結合体の利用、及び前記結合体を含む診断キットにも関する。発明の技術的背景及び公知技術生物学及び医学の分野における診断試験を目的とする測定方法の多くは、原則として抗原の抗体による特殊な認識及び、ここ数年来は核酸塩基（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のペアリング（pairing）に基づく。これらの方法は、関連する相互作用に応じて、また分析リガンド（抗原／抗体またはヌクレオチド配列）を固定するための手段に応じて種々の形式を取った。放射性同位体で標識された分子を分析する技術は正確かつ極めて感度が高い。放射性同位体を利用する以上、この分析方法の欠点が特殊な部屋の設置、廃棄物の貯蔵、健康及び安全、さらには関連の法的規制に伴なう問題にあることは明らかである。常温プローブ技術は、共有結合するプローブと酵素とから成る酵素結合体の利用に基づく。これらの結合体は酵素の基質を着色生成物に変換し、これを分光分析法で測定することによって検出することができる。これはペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼとの結合の場合である。この分析は多量に存在するリガンドの検出を可能にするが、少量しか存在しない抗原、例えばホルモンを検出する免疫化学分析の場合や、検知すべき量が極めて少ない、ＤＮＡプローブを使用する遺伝子ハイブリダイゼーションの場合には感度が低く過ぎることが判明している。化学発光法は励起される化学分子からの発光に基づく。この励起は、化学反応または他の分子からのエネルギー転移によって発生させることができる。第１の場合、反応は一般に酵素の触媒作用下に行われる。広く採用されているシステムは、ルミノールまたは過酸化水素の存在におけるペルオキシダーゼ、またはアダマンティル１,２−ジオキシエタンフェニルホスフェートの存在におけるアルカリホスファターゼである（L. Kricka， Chim．Chem., ３７，１４７２−１４８１，１９９１）。これらの分析システムは感度にすぐれているが、信号が極めて短いから量化することが極めて困難である。１つの解決法として、励起されると特に長い、従って、検出可能な励起時間を有する蛍光を発生させるランタニド、ユウロピウムの使用が考えられる。この方法は検出限界値がＤＮＡ０．３ｐｇでアデノウイルスの検出に利用されている（Syvanen 等、Nuc． Acids Res．１４，１０１７，１９８６）。２つの分子：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）との間のエネルギー転移を利用することもできる。第１の分子（ＦＩＴＣ）はプローブと結合し、第２の分子はサンプルＤＮＡと結合している。プローブがサンプルと結合した状態になると２つの分子が互いにエネルギーを転移できる：即ち、固有波長のＴＲＩＴＣの励起がペアリングが起こった場合にその近傍に存在するＦＩＴＣに転移し、ＦＩＴＣが特徴的な蛍光を発する。この方法は感度にすぐれているが、日常的に利用するには最適化すべきパラメータが数多く残っている（Davins 等、Analyt．Letters ２０，１８９７,１９８７）。 Boehringer Mannheim から市販されている新規の化学発光分析システムはジゴキシゲニンで標識され、ジゴキシゲニンに対する標識抗体によって検出されるＤＮＡプローブの検出に基づく（Holtke H，及び Kessler C．Nucleic Acid sResearch, １８（１９）,５８４３−５１,１９９０）。この分子はアルカリホスファターゼと結合する抗体によって認識され、アルカリホスファターゼは基質と反応して検出可能な光子を発射させる。この方法は充分感度が高いが有毒分子を伴ない、実施し難いという欠点がある。生物発光の原理は、基質の存在下においてルシフェラーゼの酵素作用によって起こる自然発光である。ルシフェラーゼには２つの種類がある：即ち、ＡＴＰをその基質として利用するルシフェラーゼと、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの酸化をエネルギー源として利用するルシフェラーゼである。後者の場合、ルシフェラーゼはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼと結合する。これらの酵素は微量（１０^-12モル）の基質を測定することを可能にする。ＡＴＰルシフェラーゼはＮＡＤ（Ｐ）Ｈルシフェラーゼの量子効率より１０倍も大きい量子効率を有し、１０倍も低い基質検出限界値を可能にする。分析条件次第では、信号が極めて長時間にわたって安定する。アガロースビーズ、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピルジルチオ）プロピオネート（ＳＤＰＤ）及びグルタルアルデヒド（ＵＳ．４，６０４，３６４）のようなカプリング剤を利用する種々の方法がこれらの酵素を抗体、抗原または核酸プローブのようなリガンドと直接結合させる目的で提案されている。特許出願ＥＰ２５４１７２号は、カプリング剤として同種二管能性（homobifu nctional）試薬（ビス−マレイミドポリアルキレングリコール）を使用する抗体／酵素（例えはβ−ガラクトシダーゼ）結合体を開示している。特許出願ＥＰ１３７５１５号は、生物発光試験における免疫グロブリンＧ／酵素（エクオリン）結合体の利用を開示している。これらの文献に開示されている２つの結合体は、２つの逐次活性化、即ち、先ず抗体をカプリング剤で活性化し、次いで酵素をカプリング剤で活性化するステップによって得られる。この二重活性化によって２つの活性化された成分を互いに反応させて結合体を生成させることができる。ただし、このような診断方法は特定の生物学的化合物の検出及び／または測定に充分な高さの感度を望めないルシフェラーゼの直接利用に基づく。リガンドと結合させたキナーゼまたはデヒドロゲナーゼの利用に基づく他の方法も提案されている。特許出願ＥＰ３０４９３４号は、Avrameas等が報告している手順（Bull．of Soc．Chim．Biol （１９６８）５０，ｐ.１１６９）に従ってグルタルアルデヒドを利用して抗体、ヌクレオチド配列、アビジンまたはストレプトアビジンのようなリガンドと公知の態様で結合させた特定キナーゼに属する酵素から成る結合体を開示している。ただし、標識としてのキナーゼやデヒドロゲナーゼの利用は、これらの酵素を種々のリガンドと結合させるのに使用されるカプリング剤によって不活性化されるため制約される。特許出願ＥＰ４３１８８２号は、例えはヌクレオチド配列を付着させることのできるあらかじめ活性化されたチオール基を含有する酵素（例えば細菌性ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）のようなタンパク質から成る試薬を開示している。しかし、この文献は、生物発光を伴なう検出及び／または測定方法に利用できるようにするため、このあらかじめ活性化された結合体をキナーゼまたはデヒドロゲナーゼに付着させることは記述していない。ビオチニル化プローブを検出するために抗原または抗体、ヌクレオチドプローブまたはアビジンと共有結合させたグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを使用することは、特許出願ＥＰ１６１１３８号及びＥＰ３６２０４２号から公知である。この複合体はSepharose４Ｂに共有結合させたグルコース−６− ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ルシフェラーゼまたはＦＭＮ−オキシドレダクターゼによって生成するＮＡＤＨの検出を可能にする。しかし、この方法によって達成される感度は、病原性または非病原性有機体から特定のヌクレオチド配列を最適条件下で検出するには（明らかに酵素の結合に伴なう上記不活性化現象を一因として）余りに低い。発明の目的本発明の目的は、生物学的化合物と特異な態様で結合できるリガンドと、そのリガンドと結合しても酵素作用を失わないキナーゼまたはデヒドロゲナーゼとから成り、生物学的化合物の検出及び／または測定に利用できる新規の結合体及びこの結合体の新規の製法を提供することにある。本発明の他の目的は、比活性、高い代謝回転率、及び周囲温度で高い安定性を有する酵素分を含み、コストが低く、精製が容易であり、実質的に非可逆的に反応する結合体を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のゲノム中に存在する相補配列とペアリングする性質を有し、本発明の結合体のリガンドとして利用するか、または本発明の結合体のリガンドを認識する分子に付着させることができる新規の核酸配列を提供することにある。本発明の最後の目的は、本発明の結合体を含み、公知の診断キットと同等またはそれ以上の感度で生物学的化合物の検出及び／または測定を行う診断キットを提供することにある。発明の特徴的要素本発明は生物学的化合物の検出及び／または測定を目的とし、キナーゼまたはデヒドロゲナーゼから成り、好ましくはサルファグループをあらかじめ還元させてあり、生物発光システム、好ましくはルシフェラーゼが利用できる中間化合物を生成させることのできる活性結合体に関する：前記キナーゼまたはデヒドロゲナーゼがリガンドと直接結合し、該リガンドはカプリング剤によってあらかじめ活性化され、前記生物学的化合物と直接または間接的に（即ち、抗体／抗体、抗体／抗原、ストレプトアビジン／ビオチン、などのタイプの認識を可能にするリガンドカスケードによって）特異な態様で結合できる。本発明では結合体の前記キナーゼまたはデヒドロゲナーゼをあらかじめ活性化せず、リガンドと直接結合させ、リガンド自体をカプリング剤によってあらかじめ活性化する。生物学的化合物とは原核生物、真核生物、マイコプラズマ、ウイルスのような病原性または非病原性微生物、または植物または動物などの細胞系；前記微生物の成分または前記微生物から生成する成分、特に、遺伝子増幅（ＰＣＲまたはＬＣＲ）によってあらかじめ適当に増幅した抗原、抗体、ヌクレオチド配列、脂質または糖類など及び／またはそれらの混合物を意味し；固形支持体またはゲルに付着させるか、溶液中に存在させるのが好ましい。キナーゼは、ピルビン酸キナーゼであることが好ましい。カプリング剤は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボキシレート、またはそのスルホ誘導体のような異種二管能性（hetero bifunctional）カプリング剤であることが好ましい。本発明の一実施例では、リガンドが抗原、ホルモンレセプター、抗体、ヌクレオチド配列、及びビオチニル化ヌクレオチド配列と結合可能なアビジンまたはストレプトアビジンのような化合物、及び／またはそれらの混合物から成るグループから選択される。本発明は、ＨＰＶ６ｂ，ＨＰＶ１１，ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８及びＨＰＶ３３のようなヒト乳頭腫の原因となる種々のウイルスの検出及び／または測定を可能にする新規のヌクレオチド配列、これらの配列の断片、１本鎖ＤＮＡの断片、またはＲＮＡの断片にも関する。本発明は特に下記に関する： −２５個のヌクレオチドから成るＤＮＡ配列：即ちのすべてまたは一部。 −その相補配列：即ちのすべてまたは一部。 −上記配列に対応するＲＮＡ配列のすべて、または一部。これらは上記５種類のＨＰＶの同時検出を可能にする。これらの配列はＨＰＶ６ｂＥ１遺伝子のヌクレオチド２０４７−２０７１と対応する領域とハイブリダイズして位置９及び１５に２つのミスペアリング（ｍｉｓｐａｒｉｎｇ）を有する二重鎖を形成し、ＨＰＶ１１Ｅ１遺伝子のヌクレオチド２０４７−２０７１に対応する領域とハイブリダイズして位置８及び９に２つのミスペアリングを有する二重鎖を形成し、ＨＰＶ１６Ｅ１遺伝子のヌクレオチド２０７６−２１００に対応する領域とハイブリダイズして位置１５に１つのミスペアリングを有する二重鎖を形成し、ＨＰＶ１８Ｅ１遺伝子のヌクレオチド２１５７−２１７１に対応する領域とハイブリダイズして位置６に１つのミスペアリングを有する二重鎖を形成し、ＨＰＶ３３Ｅ１遺伝子のヌクレオチド２０７０−２０９４に対応する領域とハイブリダイズして位置５，８及び１５に３つのミスペアリングを有する二重鎖を形成する。 −２５個のヌクレオチドが２つのＤＮＡ配列：即ち、のすべてまたは一部。 −上記配列の相補配列：即ち、のすべてまたは一部。これらはＨＰＶ６ｂ及びＨＰＶ１１の同時検出を可能にする。配列３,３ａ,５及び５ａは、ＨＰＶ６ｂ及びＨＰＶ１１のＥ２遺伝子のヌクレオチド２７３６−２７６０に対応する両ウイルスに共通の領域とハイブリダイズして二重鎖を形成する。配列４，４ａ，６及び６ａは、ＨＰＶ６ｂ及びＨＰＶ１１のＥ２遺伝子のヌクレオチド３３５５−３３７９に対応する両ウイルスに共通の領域とハイブリダイズして二重鎖を形成する。 −２１個のヌクレオチドから成るＤＮＡ配列：即ち、のすべてまたは一部。 −その相補配列：即ち、のすべてまたは一部。これらはＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８及びＨＰＶ３３の同時検出を可能にする。これらの配列は、ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子のヌクレオチド６７８０−６８００に対応する領域とハイブリダイズして位置１５にミスペアリングを有する二重鎖を形成し、ＨＰＶ１８Ｌ１遺伝子のヌクレオチド６７５９−６７７９に対応する領域とハイブリダイズして位置３にミスペアリングを有する二重鎖を形成し、ＨＰＶ３３Ｌ１遺伝子のヌクレオチド６７３４−６７５４に対応する領域とハイブリダイズして位置１５にミスペアリングを有する二重鎖を形成する。 −２５個のヌクレオチドから成るＤＮＡ配列：即ちのすべてまたは一部。 −その相補配列：即ちのすべてまたは一部。これらはＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の同時検出を可能にする。これらの配列は、ＨＰＶ１６Ｅ１遺伝子のヌクレオチド９３１− ９８５と対応する領域とハイブリダイズして二重鎖を形成し、ＨＰＶ１８Ｅ１遺伝子のヌクレオチド１００７−１０３１に対応する領域とハイブリダイズして１つのミスペアリングを有する二重鎖を形成する。 −上記配列と対応するＲＮＡ配列：即ち、のすべてまたは一部。これらの配列は、種々のヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のゲノムに存在するが、ヒトのゲノムには存在しない相補配列とペアリングする性質を有する。こうして形成されるハイブリッドは、断片に付着させた同位体または非同位体標識の利用、常温プローブ技術の利用、特にＰＣＲまたはＬＣＲを使用した遺伝子増幅の利用、及び／または生物発光の利用によりｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、フィルターやプラスチック上でのハイブリダイゼーション、“サンドイッチ”ハイブリダイゼーション、固形支持体上または溶液中でのハイブリダイゼーション、ドットブロット、ノーザンブロットまたはサザンブロットハイブリダイゼーションのような種々の公知方法で検出することができる。以上に述べた配列は生殖路（genital tract）に現われることの多いＨＰＶ（タイプ６ｂ，１１，１６，１８及び３３）の同定を可能にする。ある種のＨＰＶ（タイプ１６，１８及び３３）は悪性腫瘍、この場合には女性の子宮頸の癌、の出現と関連することが多く、他のタイプ（６ｂ及び１１）は良性の病変を特徴とする。従って、予後を、即ち、妥当な治療法を確立するには１種類または２種類以上のＨＰＶの存在とその種類を判定することが極めて重要である。ヒト乳頭腫の原因であるウイルスを検出及び／または測定するには、適当にビオチニル化された上記ヌクレオチド配列の全部または一部が本発明の結合体のリガンドに含まれているか、または本発明の結合体と結合できることが好ましい。本発明は、本発明の結合体の製法にも係わり、この製法においては、好ましくは異種二管能性であるカプリング剤を溶液中でリガンドと反応させ、この活性化リガンドを、あらかじめ単数または複数のスルフィドブリッジを還元させてあるキナーゼまたはデヒドロゲナーゼと結合させる。本発明の結合体のキナーゼまたはデヒドロゲナーゼは、キナーゼまたはテヒドロゲナーゼに対して親和力を有するBlue Seph−arose のようなゲルを含有するアフィニティーカラムにその活性部位を固定し、あらかじめカプリング剤で活性化したリガンドと結合させ、次いでカラムを洗浄し、例えばイオン強度を増大させて洗浄液の組成を変化させることによってカラムから結合体を溶出させるのが好都合である。本発明は、生物学的化合物の検出及び／または測定を目的とする本発明の結合体の利用にも係わり；特にハイブリダイゼーションによるヌクレオチド配列の検出及び／または測定に係わる；これらのヌクレオチド配列は、in situ ハイブリダイゼーション、フィルター、プラスチック、固形支持体上でのハイブリダイゼーション、溶液中、“サンドイッチ”中での、またはゲル上でのハイブリダイゼーション、ドットブロット、ノーザンブロットまたはサザンブロットハイブリダイゼーション、断片に付着させた同位体または非同位体標識の利用、常温プローブ技術の利用、特にＰＣＲまたはＬＣＲによる遺伝子増幅の利用、及び／またはこれらの併用によって検出することが好ましい。最後に、本発明は本発明の結合体を含み、生物学的化合物を検出及び／または分析するキット、及びin situ ハイブリダイゼーション、フィルター、プラスチック、固形支持体上でのハイブリダイゼーション、溶液中または“サンドイッチ”中での、またはゲル上でのハイブリダイゼーション、ドットブロット、ノーザンブロットまたはサザンブロットハイブリダイゼーション、断片に付着させた同位体または非同位体標識の利用、常温プローブ技術の利用、特にＰＣＲまたはＬＣＲによる遺伝子増幅の利用、及び／またはこれらの併用によるヌクレオチド配列の検出及び／または測定を目的とする試薬にも係わる。図面の簡単な説明図１は、オリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション測定における本発明の結合体の利用を説明する図である。図２ないし４は、図１に示した測定の実施態様を示す。図５及び６は、本発明の結合体を利用して行われるＨＰＶウイルスのＤＮＡの直接及び間接定量化をそれぞれ示す。図７は、ピルビン酸キナーゼの活性及び酵素１分子当りのアーム数に対するＳＰＤＰ濃度の影響を示す。図８は、本発明の結合体を利用し、かつ生物発光に基づいて行われるヒトＩｇＧの定量化を示す。図９は、本発明の結合体を利用して得られるターゲットＨＩＶ配列の濃度曲線を示す。好ましい実施例の説明本発明ては、基質分析の高い精度を考慮して指示剤としてＮＡＤＨルシフェラーゼではなくＡＴＰルシフェラーゼを使用する。感度をさらに高め、長時間にわたって大きい信号を得るため、実験条件下で定量のＡＴＰを生成させることのできるキナーゼてヌクレオチド配列、抗体、抗原、アビジンまたはストレプトアビジンを標識する。次いでこのＡＴＰをルシフェラーゼによって分解し、発光量を検出することによってルシフェラーゼの活性を定量化する。キナーゼの選択ＥＬＩＳＡに使用するのと同種の種々の基準に従って指標酵素を選択しなければならない（Avrameas， Scand. J. Immunol.,８,７−２２,１９７８）、即ち； −高い比活性及び代謝回転率； −周囲温度における比較的すぐれた安定性； −できるだけ小さくなければならない結合後の活性損；最後に、 −酵素は高純度の形態で利用できねばならない；高純度の酵素が市販されているか、または酵素の調製が比較的簡単でなければならない。 −さらに、酵素はその基質の安定性に従って選択しなければならない。 Kayne によれば（Kayne F.S., the Enzyme，edBoyer part．Ａ．８,１９７３, Academic Press， pp.３５３−３８２）、ピルビン酸キナーゼは極めて純粋な形態で市販されているが、ラビット筋肉から極めて簡単に大量に精製することもできる。また、反応の標準自由エネルギー変化が−７.５ｋｃａｌ／ｍｏｌであるから、キナーゼの触媒作用下に進行する反応は事実上非可逆的にピルビン酸塩及びＡＴＰの形成に寄与する（Muirhead,M., Biochemical Society Tr ansactions, １５（５），９９６−９９９，１９８７）。ホスホエノールピルビン酸塩＋ＡＤＰ→ピルビン酸塩＋ＡＴＰ５ｍｇ／ｍｌの酵素溶液は、周囲温度において少なくとも４８時間にわたってその活性を保持する。市販の溶液（５０％グリセロール含有）は、４℃において少なくとも６カ月にわたって安定である。このほかに、ピルビン酸キナーゼには市販されていること、熱安定性が高いこと、反応がＡＴＰ形成の方向に変位することなどの長所もある。さらにまた、遺伝子操作によって特異な性質を有する新規のキナーゼを生成させることができる。即ち、配列の一部を開裂することによって熱安定性にすぐれたピルビン酸キナーゼを生成させることができる。このような熱安定ピルビン酸キナーゼは、高温でハイブリダイゼーション反応に使用することができる（Walk er等、Journal of Molecular Biology （１９９２）２２８，ｐ．２６５− ２７６）。同様に、アセテートキナーゼのようなキナーゼを使用することができる。ピルビン酸キナーゼの結合公知のカプリング剤（グルタルアルデヒド、ＳＰＤＰ即ちＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、過ヨウ素酸塩など）を使用すると、活性損が極めて大きく、それが９５％を超えるような結合体が形成される。このことはカプリング剤に対するキナーゼ及びデヒドロゲナーゼの感度を裏書きするものであり、公知のカプリング剤を使用しても診断試験用に充分な活性を有する結合体は得られないということである。対照実験において、発明者等は非活性化天然キナーゼをＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）で活性化されたリガンドと共有結合させることができるという予想外の所見を得た。この予想外の所見を説明するとすれば、おそらくはキナーゼが遊離−ＳＨ基を有し、これが活性化されたプローブと結合している２−ピリジルジスルフィドグループと共にジスルフィドブリッジを形成することができるのであろう。このアプローチを利用して得られる結合体は完全に活性である。発明者等は、低濃度のジチオトレイトールを利用してキナーゼ中の１つまたは２つ以上の天然ジスルフィドブリッジをあらかじめ還元することにより、結合からの収量を増やすことができるとの所見をも得た。溶液中での結合に最適な条件を抗体について以下に説明する。発明者等は、抗体を５倍のモル濃度のＳＰＤＰで活性化すると、抗体１分子に１ないし２ＳＰＤＰアームが付着するとの所見を得た。この濃度のＳＰＤＰは当量（モル比において）の活性化された抗体とキナーゼとを結合させる場合に最大量の活性結合体を生成させる。収量を高め、キナーゼと結合した抗体の非結合抗体からの分離を容易にし、多量の結合体の調製を可能にする（固相）カラムでの結合方法は、Blue Sepharose （Pharmacia, Uppsala,Sweden）を含有するカラムに、弱い非共有結合によってキナーゼをその活性部位において結合し、次いで、あらかじめＳＰＤＰで活性化された抗体を充分な時間（通常は１６時間）にわたりカラムを通して閉回路中を循環させるというものである。従って、活性化された抗体はBlue Sepharose に固定されたキナーゼと結合体を形成する充分な可能性を持つ。反応後、カラムを洗浄し、反応しなかった抗体を除去し、洗浄液のイオン強度を高めることによって結合体を溶出させる。この方法を抗体及びアビジンとの関連において詳しく後述する。活性結合体を利用できるから、いわゆるＥＬＩＳＡ法のような免疫試験またはヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに基づく診断試験に利用することができる。キナーゼを抗体と結合させる方法の原理をその他のタンパク質、さらにはオリゴヌクレオチドにまで広げることができた。即ち、アビジン及びストレプトアビジンをＳＰＤＰで活性化し、余剰の試薬を除去したのち、ピルビン酸キナーゼと接触させることができた。こうして溶液中に形成された結合体を、キナーゼを保持し、極めて有効であることが立証されているBlue Sepharoseカラムで精製した。オリゴヌクレオチドプローブをキナーゼと結合するにはＤＮＡプローブの３′ 及び／または５′末端位置をアミンで置換すればよく、このアミンは生成または添加されるヌクレオチドを合成する過程で組込めばよい。この末端アミンをＳＭＣＣによって活性化し、次いで余剰試薬を除去したのち、結合のためピルビン酸キナーゼと接触させる。次いで結合体を分子ふるいクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーで容易に精製できる。免疫酵素分析（ＥＬＩＳＡ）種々のＥＬＩＳＡ試験に使用できる抗体／キナーゼ結合体を形成するにはキナーゼを抗体と結合すればよい。直接的な結合体測定には多凹皿（multiwell dish）、試験管などのような支持体を利用し、これに抗原を固定する。抗体／キナーゼ結合体を漸減的に添加する。洗浄後、ルシフェリンの存在においてルシフェラーゼによって分解されて発光するＡＴＰを生成させながら、結合したキナーゼの活性をその基質の存在において測定する。発光量は、生物光度計を使用するか、ポラロイドフィルムのような感光フィルムを使用するか、さもなければＸ線に感光するネガティブペーパーを使用して測定することができる。この試験によって抗体の力価を測定することができる。ピルビン酸キナーゼ分析の条件下においては、酵素が数日間にわたって活性を維持できるように酵素量及びルシフェラーゼ量に対して基質を多めに設定する。通常のＥＬＩＳＡ試験では３日間にわたって発光量を追跡する。この直接試験では、いわゆる競合法を利用して抗原を定量化することができる。この場合、測定皿または支持体に抗体を固定する。次いで定量分析すべき抗原を、キナーゼに結合している一定量の抗原の存在において培養する。この２つの抗原が皿に固定されている抗体に対して競合する；定量分析すべき抗原の量が多ければ多いほど抗体と結合可能な抗原／キナーゼは少なくなる。キナーゼの活性によって検出されるのは後者である。次いで検量線に基づいて抗原の量を求める。いわゆるサンドイッチ法を利用すれは、抗原をもっと容易に定量分析できる。皿などのような固形支持体に抗体を固定する。次いで定量分析すべき抗原を希釈度を次第に高めながら添加し、洗浄後、キナーゼで標識した一定量の第２抗体を添加し、キナーゼの活性を測定する。この方法の変形として、標識されていない第２抗体を使用し、キナーゼで標識した抗抗体を添加する（ダブルサンドイッチ）。サンドイッチ法によって抗体も定量化でき、この場合、抗原を支持体に固定する。濃度を高くしながら抗体を添加し、洗浄後、キナーゼで標識した抗抗体を培養し、キナーゼの活性を測定する。ここでも標識されていない抗抗体を使用し、次いでキナーゼと結合した第２の抗抗体を使用したダブルサンドイッチ測定を行うことができる。オリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション分析キナーゼと結合可能なプローブとしてアビジン（またはストレプトアビジン）、抗体またはヌクレオチドを使用できるから、ヌクレオチド配列を認識する試験を開発することができる。この技術は細菌、カビ、イースト、ウイルス、癌細胞または特異な核酸配列を有する生物学的有機体を検出する診断試験などのような広い分野に応用できる。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの原理は周知であり、従ってここでは簡単に説明する。この原理は、相補ヌクレオチド鎖によってヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を認識し、適当な温度、ｐＨ及び塩条件において両者をペアリングさせて二重鎖を形成するというものである。この認識はアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（またはウラル（Ｕ））との間、及びグアニン（ｇ）とシトシン（Ｃ）との間に水素結合を形成することによって可能になる。もし検出すべきＤＮＡ（ＲＮＡ）が判明していれば、科学的、酵素的または生物学的方法を利用することにより、被検出ＤＮＡ（またはＲＮＡ）と特異的にハイブリタイズする相補配列を構成することができる。このハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションが特異的に起こり、それによって偽陽性（false positives）を避けることができるようにきびしい条件下で行うことが好ましい。生物発光試験を実施するためにキナーゼ結合体を利用する利点は、極めて高い感度と数日にも及ぶ検出時間である。最も簡単な方法では、試験に供するヌクレオチド配列をビオチンで標識する。この標識化は種々の方法で行うことができる：即ち、−合成においてビオチニル化オリゴヌクレオチドを使用するか、配列をＮＨＳ−ビオチン、ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはビオチンを含みかつヌクレオチド配列と結合可能な試薬と反応させることによって化学的に、 −または、特定ヌクレオチド配列の末端にビオチニル化ヌクレオチドを組込む末端転移酵素を使用して酵素的に行う。ビオチンは、光学ビオチン（photobioti n）と呼ばれる光学活性化化合物を使用して核酸中に組込むことができる。ビオチニル化配列は、酵素と結合しているアビジンまたはストレプトアビジンによって、またはキナーゼで標識され、ビオチニル化配列に向けられる抗体との反応後のアビジンまたはストレプトアビジンによって認識することができる。検出すべき配列とのハイブリダイゼーション後、ビオチンと結合するアビジン／キナーゼ結合体を使用する。次いで、ルシフェラーゼの存在において発光するＡＴＰの生成によってキナーゼの活性を測定する。溶液中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡの検出は、洗浄または競合反応を行うための固定化ステップが必要であるから比較的複雑である。配列は、“ドットブロット”試験と呼ばれる試験またはゲル電気泳動による分離を伴う試験においてニトロセルロースまたはナイロンフィルターに直接固定することができる（サザンブロット及びノーザンブロット）。測定すべきＤＮＡＩ（またはＲＮＡ）が極めて微量である場合、それ自体が支持体３（フィルター、ゲル、プラスチック、ガラス、ビーズ等）に固定されている相補配列２によってこのＤＮＡＩを固定することができる。固定プローブに対してハイブリダイズされたＤＮＡＩ（またはＲＮＡ）は他のビオチニル化配列４及びアビジン／キナーゼ結合体５または抗体／キナーゼ抗プローブを使用することによって測定することができる。固定化されたキャプター２と呼ばれるものと、ビオチニル化されたディテクター４と呼ばれるものとの２つのヌクレオチド配列（２及び４）を使用するこの方法は、サンドイッチ法とも呼ばれる。手順としては、キャプター及びディテクターと呼ばれる２つの配列を、検出すべきＤＮＡ（またはＲＮＡ）に同時に添加するか、または試験の条件及び所期の結果：即ち、高い感度、作用速度または操作のし易さに応じて逐次的に添加すればよい（図１）。アビジンとビオチンとの間の認識だけでなく、抗原（またはハプテン）と抗体との間の認識をも利用することによって、これらの方法をさらに複雑化することができる（図２，３及び４）。例えば、ビオチニル化核酸配列４を使用し、（キナーゼと結合しているかまたは結合していない）アビジン６と反応させ、アビジン自体かキナーゼと結合している抗アビジン抗体７によって認識されるようにすることも可能である（図２及び３）。キナーゼと結合しているかまたは結合していないかのいずれかであり、かつプローブと結合しているビオチンに向けられる抗体８との直接反応（図４）を行うことも可能である。ビオチン以外の分子、例えば、特異抗体によって認識されるフルオレセインまたはジゴキシゲニンをプローブの標識として使用することも可能である。この方法にはいくつかの変形があり、キナーゼと結合した第２抗体を使用したり、ビオチンと結合した抗体を使用し、アビジン／キナーゼ結合体をこれと反応させるのも変形例である。どのような組合わせを使用するにしても、本発明の少なくとも１つのアビジン／キナーゼ結合体５または抗体／キナーゼ結合体７を反応のステップの１つにおいて使用する。これらの特異的なアビジン／ビオチンまたは抗体／抗原認識は、固形支持体への固定にも利用できる。これを利用すれば、固定に先立って溶液中でハイブリダイゼーション反応を進行させることができる。溶液中でのハイブリダイゼーションの利点は立体因子及び拡散因子が反応を遅らせる固形支持体上でのハイブリダイゼーションよりもはるかに反応速度が大きいことにある。特に好ましい方法として、被測定ＤＮＡをそのＤＮＡの一部と相補関係にある２つのヌクレオチド配列とハイブリダイズする。この２つの配列をそれそれ異なる分子、例えば一方はビオチンで、他方はキナーゼで標識する。ハイブリダイゼーション後、混合物をアビジンが固定されている支持体と接触させ、その結果、ビオチニル化配列が結合し、その一部がハイブリッドのうちのルシフェラーゼ及び適当な基質の存在において、測定可能な第２キナーゼ配列を含む部分を形成する。固定はポリＧまたはポリＴ（ポリＵ）配列をそれそれ認識するポリＣまたはポリＡのような相補プライマー配列を使用することによって行うことができる。ビオチンを含むプローブ、または測定すべき第２の特異的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、溶液中でのハイハイブリダイゼーションの過程で、支持体と結合している相補配列と結合するポリＡ（またはポリＴまたはポリＧ）を含むことができる。２つの配列は、ビオチン、または例えばジニトロフェノールまたはフルオレセインのような抗原（またはハプテン）をも含むことができる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリッドはアビジンを含む支持体に固定し、抗原またはハプテン（この場合には抗ジニトロフェノールまたは抗ジゴキシゲニン）にむけられ、かつキナーゼで標識された抗体によって検出することができる。もし抗体がキナーゼで標識されていなければ、キナーゼで標識した第２抗体を使用することができる。支持体に結合され、抗原またはハプテン（この場合にはジニトロフェノール）を認識してそれに結合する抗体を利用することによっても固定を行うことができる。アビジン／キナーゼをハイブリットのビオチニル化配列と反応させることによりハイブリッドを検出する。上述したその他のビオチン／アビジン検出方法を利用することもできるが、いずれの場合にも少なくとも１つの結合体／キナーゼを使用する。ＤＮＡの二重鎖を認識する抗体にキナーゼを結合させることも可能である。以上に述べたハイブリッド検出に際しては、少なくとも１つのステップにおいてビオチンとアビジンとの間、または抗体とその抗原またはハプテンとの間に存在する認識に依存した。特にピルビン酸キナーゼの場合、この反応ルートを省くことができる（この酵素は４５℃で少なくとも２時間にわたって安定であり、これは特にオリゴヌクレオチドで達成されるハイブリダイゼーション状態を表わすとの所見が得られた）。この所見に基づき、オリゴヌクレオチド配列と直接結合したキナーゼから成る結合体を調製し、これをハイブリダイゼーションに使用し；キナーゼの活性をその基質及びルシフェラーゼの存在において測定する。この技術は、ＰＣＲによって配列を増幅したのち、溶液中または固定細胞中でも利用することができる。この場合、熱安定ピルビン酸キナーゼを使用する方法が特に好ましい。例免疫試験Ｉ−抗ＩｇＧ／キナーゼ結合体の検出多凹プレートにマウスＩｇＧを固定する。次いて凹みにウシのアルブミンを充填し、４時間放置する。４時間後、凹みを Tween溶液で３回洗浄する。好ましければ、凹みを乾かしてもよい。アルブミンの存在において結合抗体を２時間にわたって２０℃に保温する。洗浄後、基質、即ち、ホスホエノールピルビン酸塩、ＡＤＰ、ルシフェリン及びルシフェアーゼを含有する混合溶液を添加することによってキナーゼの活性を測定する。なお、ルシフェリン及びルシフェラーゼは、キナーゼがＡＤＰとホスホエノールピルビン酸塩とから生成させるＡＴＰを検出するための物質である。これに続く５分間にわたり生物光度計によって発光量を測定し、測定結果を１分間にわたるプラトー値または積分値の形で表現する。例えば３，０００または２０，０００ＡＳＡの高感度ポラロィドフィルムで５分間露光したのち、４５秒間現像することもできる。この試験ではＩｇＧ／キナーゼを順次希釈し、２，５６０倍の希釈、即ち、２.６×１０^-13モルの抗体濃度まで検出が可能であった。 II−抗原と考えられるＩｇＧの測定（サンドイッチ法）ラビットの抗ヒトＩｇＧ抗体を多凹プレートに固定したことを除けば前記と同じ実験を行なった。希釈度を漸次高めながらプレートをヒトＩｇＧと共に培養したのち、洗浄し、キナーゼと結合させたマウスの抗ヒトＩｇＧ抗体をすべての凹みに添加した。プレート写真によってキナーゼを測定することでヒトＩｇＧの試験ては８，３１０^-14モルの濃度を検出することができた。 III −抗β−ＨＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、humanchorionic goradot ropin）抗体の力価測定（女性被検者から得た）陰性血清を利用して９８，０００ｍＵＩ／ｍｌの抗β −ＨＣＧ陽性血清の２０×及び１００×の２種類の希釈溶液を調製する。トラッピングモノクローン抗体（抗β−ＨＣＧ）であらかじめコーティングした２×３配列マイクロウエル中で６０分間にわたり湿った雰囲気下でこの２つの希釈溶液を３７℃に保温する。マイクロウエルを３回洗浄したのち、透析し、１００×、１，０００×、及び１０，０００×に希釈した市販のラビット抗ＨＣＧポリクローンＩｇＧを培養する。洗浄はリン酸塩緩衝液で３回実施する。最後に、ピルビン酸キナーゼと結合しているヒツジの抗ラビットＩｇＧ抗体から成る結合体に関してマイクロウエルの列ごとに濃度曲線を作成した。３回の洗浄後、生物光度計用のプレートリーダーを利用して活性を測定する。ラビットの抗ＨＣＧ抗体を１００×に希釈し、結合体の希釈度を５０×にすると、含有率９８,０００ｍＵＩ／ｍｌのＨＣＧ血清の２０×希釈溶液ては３０ＲＬＵの活性が観察され、１００×希釈溶液では７ＲＬＵ（試験値とブランク値との差）の活性が観察される。従って、血清中におけるβ−ＨＣＧの濃度４，９００ｍＵＩ／ｍｌはＳ／Ｎ比（signal／noiseratio）７で測定することができ、濃度９８０ｍＵＩ／ｍｌはＳ／Ｎ比２で測定することができる。この値は事実上測定の限界である考えられる。血清は含有率が２，０００ｍＵＩ／ｍｌ以上なら陽性であると考えられ、この値は臨床生物学ラボラトリーに規定されている条件と一致する。条件を最適化すれば、この測定の性能をさらに高めることができるであろう。 IV−抗ヒストン抗体の測定陽性患者の血清中の抗ヒストン抗体の測定を８００ないし１０２，４００倍の希釈度を得るため対照血清を使用して血清を倍加希釈することによって実施した。多凹皿をあらかじめヒストンプロテインでコーティングした。洗浄後、キナーゼで標識したラビットの抗ヒトＩｇＧ抗体と同様に、ヒトの抗ヒストン血清をこれらの凹みて培養した。この抗ヒストン血清は２５，６００倍希釈までの希釈に正比例する信号を発し、一方ペルオキシダーゼで標識した結合体を使用し、メーカー（Biolal, Belgium）の規定条件に従って吸光度測定法によって読取られ、基質としてＡＢＴＳ（アジノベンゾチアゾリンスルホネート）を使用した同じ試験では検出可能な希釈度は１，６００倍まであった。遺伝試験Ｉ．ＨＰＶ１８ウィルスのＤＮＡの直接測定Ａ．プラスチック皿に対するＤＮＡの共有結合表面にアミノ化されたグループが現われるように改良された多凹プラスチック皿にＨＰＶ１８ウイルスのＤＮＡを共有結合させた。この結合は１−エチル−３ −（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びメチルイミダゾールから成るカプリング剤を介してＤＮＡの５′末端リン酸塩とプラスチックに移植されたアミノ官能基との間で行われる。プレートを５時間にわたって５０℃に保温し、次いて０．２５％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ溶液で５０℃において洗浄する。この結合条件を推奨しているのは Covalink 皿を市販しているメーカー（ＮＵＮＣ， Glbco ＢＲＬ）である。Ｂ．ビオチニル化オリゴの使用によるＤＮＡ検出ＨＰＶ１８−３３及び１６のウイルスＤＮＡの特異配列を認識する特異性を備えた２１塩基対からなるオリゴヌクレオチドを選択した。この配列は：である。この配列は、ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子のヌクレオチド６７８０−６８００に対応する領域とハイブリダイズして位置１５に１個のミスペアリング、位置３に１個のミスペアリングを有する二重鎖を形成し、ＨＰＶ１８Ｌ１遺伝子のヌクレオチド６７５９−６７７９に対応する領域とハイブリダイズして二重鎖を形成し、ＨＰＶ３３Ｌ１遺伝子のヌクレオチド６７３４−６７５４に対応する領域とハイブリタイズして位置１５に１個のミスペアリング、位置３に１個のミスペアリングを有する二重鎖を形成する。このオリゴヌクレオチドのビオチン標識は末端トランスフェラーゼを利用して行われる。末端トランスフェラーゼは、ある種のビオチニル化ｄＵＴＰ及ひある種の（非ビオチニル化）ｄＣＴＰを３′末端に結合させる。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡが固定されている凹みでビオチニル化オリゴを含有するハイブリダイゼーション溶液中で行われ、１６時間にわたって５０℃に保温される。洗浄後、０．０１ｍｇ／ｍｌの速度でアビジン／キナーゼ結合体を添加し、洗浄後、上記の例で述べたようにキナーゼの基質及びルシフェラーゼの存在においてキナーゼの活性を測定する。このような条件下に検出されるＨＰＶ１８ウイルスＤＮＡの量は１００ｎｇ／凹みの溶液に相当し、極めて高い。 II−２つのオリゴヌクレオチドの使用によるＨＰＶ１８ウイルスのＤＮＡの間接測定（サンドイッチ法）Ａ．５８６塩基対（ｂｐ）のゲノム粘性及び相互作用の問題及び完全なＨＰＶゲノム（＋／−８，０００塩基対）の操作に伴なう困難を回避するため、このゲノムの一部、即ち、６，１９３番目の塩基から６，７７９番目の塩基までの５８６塩基対の鎖をＰＣＲによって増幅する。Ｂ．トラッピングオリゴの共有結合２１塩基対を有するトラッピングオリゴヌクレオチトはＨＰＶ１８ゲノムに対して特異性を有し、上記断片の３′末端から始まる最初の２１個の塩基と相補関係にある。である。ウイルスＨＰＶ１８のＤＮＡの場合と同様にＮＵＮＣ皿にトラッピングオリゴを共有結合する。５ｎｇ／凹みのオリゴヌクレオチドを使用し、５時間にわたって５０℃に保温し、共有結合によって約１．２ｎｇを結合する。Ｃ．ＨＰＶ１８断片のハイブリダイゼーションハイブリダイゼーションに際しては、トラッピングオリゴヌクレオチドを含有する凹みを先ず洗浄する。次に、水で希釈し、変性させたＨＰＶ１８ゲノム断片を含有するハイブリダイゼーション溶液を該断片の濃度を漸次低下させながら２００マイクロリットル／凹みの速度で添加する。２時間にわたり５０℃でハイブリダイゼーションを進行させる。Ｄ．ビオチニル化オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション２１塩基対を有するディテクターとしてのオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ１６ ,１８及び３３ゲノムに対して特異性を有し（第Ｂ項−ＨＰＶ１８ウィルスの間接測定を参照）、第Ａ項で選択された５８６塩基対から成る配列断片の３′末端から始まる最終２１個の塩基と相補関係にある。その配列は：である。凹みを洗浄したのち、ハイブリダイゼーションにビオチニル化オリゴヌクレオチドを添加することを除いて上述の方法と同じ方法でハイブリダイゼーションを行う。このハイブリダイゼーションは１時間にわたり５０℃で行う。Ｅ．生物発光を利用する測定ハイブリダイゼーションが完了したのち、プレートを洗浄し、０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度でアビジン／キナーゼ結合体を添加し、洗浄後、上記例と同様に基質及びルシフェラーゼの存在においてキナーゼの活性を測定する。 III．ＨＰＶウィルスのＤＮＡの間接測定（ＤＮＡ鎖の存在において長いプローブの二重認識とキナーゼ標識抗体による検出を利用するサンドイッチ法）Ａ．５８６塩基対を有するゲノム粘性や相互作用の問題及び完全なＨＰＶゲノムの操作に伴なう困難を避けるため、ゲノムの一部、即ち、６，１９３番目の塩基から６，７７９番目の塩基に至る５８６塩基対から成る鎖をＰＣＲによって増幅する。Ｂ．トラッピングプローブの共有結合ＰＣＲで調製した５′−リン酸化トラッピングプローブを既に述べたように凹みに共有結合させる。Ｃ．サンドイッチハイブリダイゼーションＰＣＲによってビオチニル化検出プローブを調製した。ｄＴＴＰに対して１／２の割合で存在するビオチニル化ｄＵＴＰによってビオチンが組込まれる。トラッピングプローブが固定されている凹みでハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション溶液は、５８６塩基対を有するＨＰＶターゲットＤＮＡと、ＰＣＲによって調製されたビオチニル化プローブとから成る。ハイブリダイゼーションは２時間にわたり７０℃で行う。Ｄ．測定洗浄及び飽和後、アビジンを、次いで抗アビジン抗体を、さらには抗アビジン抗体に向けられたキナーゼ標識抗体を凹みで培養する。洗浄及び平衡化後、上記例と同様に基質及びルシフェラーゼの存在においてキナーゼの活性を測定し、ルミノスキャンで発光量を測定するか、またはポラロイド写真を撮る。Ｅ．結果 Lumac 生物光度計を使用した光量測定値は５００ｐｇのＨＰＶターゲットＤＮＡでは１０，０００ＲＬＵ（relative light unit）、５０ｐｇのＨＰＶターゲットＤＮＡでは２，５００ＲＬＵであった。 IV．ＨＰＶウィルスのＤＮＡの間接測定（ＤＮＡ鎖の存在においてストレプトアビジン／キナーゼ結合体を利用して測定するサンドイッチ法）プラスチック凹みに結合させたトラッピングプローブ及びビオチン標識ディテクタープローブの調製は、上記例III の場合と全く同じである。ハイブリダイゼーションも同じ条件下で行う。ハイブリダイゼーション後、凹みを洗浄及び飽和させたのち、１，０００×に希釈されたストレプトアビジン／キナーゼ結合体と共に培養する。凹みを４回洗浄してから、上記例の場合と同様にキナーゼ基質及びルシフェラーゼの存在において培養する。このような条件下で５００ｐｇないし５ｐｇのＨＰＶターゲットＤＮＡについて濃度曲線を求めた。ＲＬＵ値は非特異性ＤＮＡの存在において得られる対照値よりも大きかった。Ｖ．ＨＩＶウイルスのＤＮＡの間接測定（ＤＮＡ鎖の存在においてストレプトアビジン／キナーゼ結合体を利用して測定するサンドイッチ法）Ａ．ＰＣＲによって生成させたターゲットＡＩＤＳウィルス（ＨＩＶＩ）のＲＮＡ鎖のセグメントをＤＮＡに転写し、ＰＣＲによって増幅した。この断片は１，２１４番目の塩基と１，６８７番目の塩基との間に位置する４７３個の塩基から成る。Ｂ．ハイブリダイゼーショントラッピングプローブとディテクタープローブの調製、ハイブリダイゼーション、及び測定をVIIIの場合と同様に行う。Ｃ．結果ＨＩＶターゲットＤＮＡ断片について１，０００ないし１ｐｇの範囲にわたって濃度曲線を求めた。この濃度曲線上のどの点においてもＲＬＵ測定値は非特異性ＤＮＡを使用して得られた対照よりもはるかに大きかった（結果を図９に示す）。 VI．サイトメガロウイルスＤＮＡの間接測定ＣＭＶウイルスのＲＮＡ鎖セグメントをＤＮＡに転写し、次いでＰＣＲによって増幅した。４３４個の塩基から成るこの断片は２，２２３番目の塩基と２，６５７番目の塩基との間に位置する。例 VIIIの場合と同じ実験プロトコールを実施し、ＣＭＶターゲットＤＮＡについて１，０００ないし１０ｐｇの範囲にわたって濃度曲線を求めた。 VII.バクチリウムクラミジアトラコマティスＤＮＡの間接測定クラミジアトラコマティスＤＮＡのセグメントをＰＣＲによって増幅した。４１５個の塩基から成るこの断片は５，３３９番目の塩基の下流に位置し、ターゲットＤＮＡを表わす。例 VIIIの場合と同じ実験プロトコールを実施し、クラミジアトラコマティスについて２，０００ないし２０ｐｇの範囲にわたる濃度曲線を求めた。 VIII.ポラロイドプレート読取りによる生物発光ＥＬＩＳＡ新しい結合体を合成し、９６個の凹みを有するプレートをラビットの抗ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＧ及びマウスＩｇＧでコーティングする。ａ／第１の作業として結合体の力価を測定するため飽和曲線を作成する；ｂ／ELISA測定そのものは使用される指標酵素の量がやや異なる２つの方法に従って実施する。第１の場合、即ち、直接測定では、ピルビン酸キナーゼ反応によって生成するＡＴＰを生物発光を利用して連続的に測定する。この方法によれば、2.6×10^-13モル／試験のヒトＩｇＧを検出することができる（図５）。第２の場合、即ち、間接測定では、生成したATPを６０分間蓄積してから生物発光を利用して測定する。この場合には、8.32×10^-14モル／試験が検出される（図６）。ただし、感度は期待したほど改善されなかった。 IX．結合アーム数、ピルビン酸キナーゼの活性、及び基Ｐによる保護効果に対するＳＰＤＰ濃度の影響１００ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄中に１０ｍｇ／ｍｌのＰＫを溶かしたｐＨ７の１００ｍｌアリコートをエタノール中の濃度を漸進的に高めなからＳＰＤＰ２００ｍｌで活性化する。３０分間の反応後、SephadexＧ２５によって余剰ＳＰＤＰを除去し、ＰＫをその残留活性及び酵素１分子ごとの結合アーム数に関して分析する。実験は濃度１ｍＭの基質（ＡＤＰ、ホスホエノールピルビン酸塩及びＭｇＣｌ₂ ）の存在において行われる。グラフから明らかなように、酵素との結合アーム数が比較的少なければ（５個以下）、基質の存在において実験するか基質の不在下で実験するかに関係なく、残留活性に変化は見られない。酵素１個に対する＋／ −４結合アームに相当する１０ＳＰＤＰを超えると、基質の存在において実験することで残留活性がやや高くなる（図７）。標準的な方法に従ってマイクロウエル皿（microwell dish）をマウス（ブランク）及びヒト（試験）から得られた免疫グロブリン（ＩｇＧ）でコーティングする。ピルビン酸キナーゼに結合させた抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＧから成る結合体を培養したのち、マイクロウエルを洗浄し、抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＧと結合しているキナーゼの活性を発光によって測定する。後者の結合体は抗原、即ち、ヒトＩｇＧを含有している凹みの中に固定される（図８）。Ｘ．ＨＩＶウイルスのＲＮＡから生成するＤＮＡ断の測定ＨＩＶウイルスに対して特異なＤＮＡプローブをそれそれの５′末端によって Covalink （ＮＵＮＣ）マイクロウエル皿と共有結合させ、ＡＩＤＳウイルス（ＨＩＶＩ）のＲＮＡの一部に相当する４７５塩基対断片のＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）増幅から得られたＤＮＡ断片の存在において培養した。溶液は２０５塩基対を有するビオチニル化ディテクタープローブをも含有し、このディテクタープローブはまたＨＩＶＩウイルスのＤＮＡ配列と相補関係にある。７０℃でハイブリダイズし、洗浄したのち、ストレプトアビジン／キナーゼ結合体をハイブリッドと共に培養し、凹み内に存在するキナーゼ／ストレプトアビジン結合体を測定するためキナーゼ及びルシフェラーゼの基質を添加する。図９は、これらの試薬の培養で観察されたＲＬＵ（Relative Light Unit）の１時間ごとの増大を表わす勾配を示す。マウスのゲノムから得られた５７１塩基対を有するターゲットＤＮＡを使用して対照値を得た。試験を３回実施し、その平均値を取り、標準偏差（＋／−ｓ）を図に示した。図から明らかなように、この試験によってＩｐｇのＤＮＡを有効に検出するこができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/535 8310−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者モリスフィリップベルギー国ナミュールベー5000、シュマンドゥラカラコレ２ (72)発明者ザマテオナタリーベルギー国ベルビエールベー4800、リュピエールフリュッシェ１

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的化合物の検出及び／または測定を目的とする活性化結合体であって、好ましくはサルファグループをあらかじめ還元させてあり、生物発光システム、好ましくはルシフェラーゼが利用できる中間化合物を生成可能なキナーゼまたはデヒドロゲナーゼを含み、その酵素が、カップリング剤によってあらかじめ活性化され、前記生物学的化合物と直接的または間接的に特異的に結合可能なリガンドに結合していることを特徴とする前記活性化結合体。２．キナーゼがピルビン酸キナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の結合体。３．カプリング剤が異種二管能性であることを特徴とする請求項１及び２のいずれかに記載の結合体。４．カプリング剤がＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボキシレート、及びそのスルホ誘導体のいずれかであることを特徴とする請求項３に記載の結合体。５．リガンドを、抗原、ホルモンレセプター、抗体、ヌクレオチド配列及びビオチニル化ヌクレオチド配列と結合可能な化合物、及び／またはそれらの混合物から成るグループから選択したことを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の結合体。６．リガンドが必要ならば修飾してもよいアビジンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする請求項５に記載の結合体。７．ヌクレオチド配列が下記ヌクレオチド配列から成るグループから選択されたヌクレオチド配列の全部及び一部のいずれかであることを特徴とする請求項５及び６のいずれかに記載の結合体：８．請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載の結合体の製法において、好ましくは異種二管能性であるカプリング剤を溶液中でリガンドと反応させ、この活性化されたリガンドをキナーゼまたはデヒドロゲナーゼと結合させ、必要ならそのスルフィドブリッジの１または２個以上をあらかじめ還元させてあることを特徴とする前記製法。９．請求項８に記載の結合体の製法において、結合体のキナーゼまたはデヒドロゲナーゼをキナーゼまたはデヒドロゲナーゼに対して親和力を有するゲル、好ましくはBlue Sephar−ose を含有するカラムに活性部位において固定し、カプリング剤によってあらかじめ活性化してあるリガンドと結合させ、カラムを洗浄し、洗浄液の組成を変えることによって、好ましくはイオン強度を高めることによって、カラムから結合体を溶出させることを特徴とする前記製法。１０．生物学的化合物の検出及び／または測定を目的とする請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載の結合体の利用。１１．ハイブリダイゼーションによるヌクレオチド配列の検出及び／または測定を目的とする請求項１０に記載の利用。１２．in situ ハイブリダイゼーション、フィルター上での、プラスチック上での、固形支持体上での、溶液中での、サンドイッチ上での、またはゲル上でのハイブリダイゼーション、ドットブロット、ノーザンブロットまたはサザンブロットハイブリダイゼーション、断片に付着させた同位体または非同位体標識の利用、常温プローブ技術の利用、または遺伝子増幅、特にＰＣＲまたはＬＣＲによる遺伝子増幅の利用、及び／またはこれらを複合化した手段の利用から成るグループから選択した方法によって、あらかじめ検出されたヌクレオチド配列の検出及び／または測定を目的とする請求項１１に記載の利用。１３．請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載の結合体を含むことを特徴とする生物学的化合物を検出及び／または測定するためのキット。１４．請求項１３に記載の診断キットであって、in situ ハイブリダイゼーション、フィルター上での、固形支持体上での、溶液中での、サンドイッチ中での、またはゲル上でのハイブリダイゼーション、ドットブロット、ノーザンブロットまたはサザンブロットハイブリダイゼーション、断片に付着させた同位体または非同位体標識の利用、常温プローブ技術の利用、または遺伝子増幅、特にＰＣＲまたはＬＣＲによる遺伝子増幅の利用、及び／またはこれらを複合化した手段の利用から成るグループから選択した方法によってヌクレオチド配列を検出及び／または測定するための試薬をも含むことを特徴とする前記診断キット。