JPS60226900A - 核酸−タンパク質複合体 - Google Patents

核酸−タンパク質複合体

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JPS60226900A
JPS60226900A JP60046684A JP4668485A JPS60226900A JP S60226900 A JPS60226900 A JP S60226900A JP 60046684 A JP60046684 A JP 60046684A JP 4668485 A JP4668485 A JP 4668485A JP S60226900 A JPS60226900 A JP S60226900A
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JP60046684A
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ナニブフシヤン・ダツタグプタ
ウイリアム・ノウルズ
ビンセント・マーチエシ
ドナルド・エム・クロザーズ
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MOREKIYURAA DAIAGUNOSUTEITSUKUSU Inc
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MOREKIYURAA DAIAGUNOSUTEITSUKU
MOREKIYURAA DAIAGUNOSUTEITSUKUSU Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、タンパク質を標識付けされた核酸と共有結合
することによるタンパク質の標識付けおよび診断を目的
とする免疫検定におけるこれらの標識付けされた物質の
使用に関する。
免疫学的試薬、例えば、抗体は、抗原として知られてい
る異質物質の導入に応答して体により生産されるタンパ
ク質分子である。特異的抗体は特異的抗原へ結合して、
抗原−抗体複合体を生成する。抗体はその相補的抗原に
のみを結合するので、抗体を使用して種々の生物学的試
料中の特異的抗原の存在を検出することができる。ある
種の病気の状態の検出および診断のこのような免疫学的
方法は、生物医学に大変革を起こした。抗体は血液、尿
、および他の体液の中の少量の特別の分子（例えば、タ
ンパク質、ホルモン、薬物）の存在を測定するために現
在普通に使用されている。
抗原とその対応する抗体との間の特異的相互作用を検出
するために通常使用される１つの方法は、インシュリン
の検出についてＹａ　ｌ　ｏｗおよびＢｅｒｓｏｎによ
り発見された放射線免疫検出応性（ＲＩＡ）である。〔
アール・ニス・ヤロウおよびニス拳エイ・バーソン（Ｒ
，Ｓ、ＹａｌＯＷおよびＳ、Ａ、Ｂｅｒｓｏｎ）；　Ｊ
、−ＣＩｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、１９６０：　３９：　１
１５７−１１７５）、ＲＩＡは検定される抗原がまず放
射性同位元素で標識付けされ１次いで放射性同位元素を
計数する標準の手段により定量されるという事実に頼る
。各種類の放射性標識付けは、制限、例えば、検出の感
度、同位オ素の半減期、オペレー・ターへの危険および
廃棄物処理の問題を有する。放射性同位元素を計数する
ために必要な費用もかなりの額になる。したがって。
放射能に頼らないで免疫標識付けを達成することが高度
に望ましい。
いく種類かの非放射性免疫検定法が実際に存在するが、
その感度の水準はＲＩＡにより到達しうるちのに匹敵し
ていない。
検定の１つのタイプ、例えば、抗原を化学的に蛍光性化
合物で処理し、これにより蛍光標識付は抗体の位置を特
別の蛍光顕微鏡で同定できるようにすることによって実
施される。蛍光標識付は抗体の使用は多くの用途をもつ
広く用いられている手順であるが、この技術もある制限
をもち、なかでも現存する方法により標識付けされ元抗
体は少量の抗原性物質を検出するために十分な感度をも
たないという制限をもつ、感度を増加するために、ポリ
リジンが発蛍光団を結合するために使用されてきている
が、ポリリジンは多くのタイプの化合物に非特異的に結
合するので、高いバックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕ
ｎｄ）の問題が生ずる。
標識試薬の他のタイプは、タンパク質−バクテリオファ
ージ複合体、安定な遊離基、電子密な（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｎ　ｄｅｎｓｅ）化合物、発光性化合物および酵素を包
含す、る、これらの標識試薬のすべては、ある種の欠点
を有する。ある種の試薬、例えば、酵素は貯蔵が困難で
ある。ある種の標識試薬は、マルチタイプのコピー（ｍ
ｕｌｔｉｔｙｐｅ　ｃｏｐｙ）が存在しないかぎり、十
分に感受性ではない。標識のマルチタイプのコピーが反
応成分に直接結合する場合、蛍光性標識の場合における
ように、抗体は抗原へ結合する能力を失うことがあり、
すなわち、特異性に劣るようになることがある。［エイ
・エイチ・ダプリュ・エム・シュールスおよびビーφケ
ー拳パンφウイーメン（Ａ、Ｈ，Ｗ、Ｍ、５ｃｈｕｕｒ
ｓ＆　Ｂ、に、Ｖａｎ　Ｗｅｅｍｅｎ）、ｃｌｉｎ、ｃ
ｈｉｍ、Ａｃｔａ　８１．、（１９７７）１−４０；７
’イ・ｚス譬スミスら（ｎ、ｓ　。
Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）、Ａｎｎ　ｃ　１ｉ　、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、１８　（１９８１）２５３−２７４参照
］、シたがって、免疫学的試薬を直接標識付けして、こ
のような特異性の低下を回避することが高度に望ましい
。
欧州特許出願第８４　１０７　６２４．３号は核酸を標
識付けする光化学的方法を開示している。この発明は、
好ましくは交雑検定において検出の目的に用いられ、免
疫学的検定において使用することができる。標識付けは
光反応性フロクマリンまたはフエナントリジウム化合物
を使用して核酸を標識に結合する。この標識は慣用法に
より検定することができる。こうして、最終生成物は、
（ａ）核酸成分、（ｂ）核酸成分へ結合したフロクマリ
ンまたはフエナントリジウム化合物および（ｃ）（ｂ）
へ化学的に結合した標識からなる標識付は核酸プローブ
からなる。ＤＮＡへの結合には、アミノメチルトリオキ
サレン、アミノメチルアンゲリシンおよびアミノアルキ
ルエチジウムもしくはメチジラムアジド類が好ましい結
合試薬である。核酸成分は一本鎖もしくな二本鎖ＤＮＡ
もしくはＲＮＡまたはそれらの断片であることができる
。標識は既知の方法で検定できるいかなるもの１例えば
、ハプテン例えばビオチン、酵素例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリ性ホスフ了ターゼ、セイヨウワサビの
ペルオキシダーゼ、パパインまたはフィコビリタンパク
質であることもできる。
したがって、本発明の目的は非放射性である高度に便利
なかつ感受性の免疫検定を提供することである。
本発明の他の目的は、多数の標識、すなわち、２０／タ
ンパク質以上の標識で免疫学的試薬を標識付けし、高度
の感受性の、例えば、放射線免疫検定と同程度に感受性
の免疫検定を与える手段を提供することである。
本発明の他の目的は、免疫学的反応の妨害が存在しない
ような方法で免疫学的試薬を標識付けすることである。
これらの目的および他の目的および利点は、本発明に従
い実現される０本発明によれば、核酸の１端へ共有結合
したタンパク質が提供される。核酸は標識の相体である
。ポリヌクレオチド類は共有結合的に修飾（ｃｏｖａｌ
ｅｎｔ　ｌｙ　ｎｏｄｉｆｙ）されて多数の蛍光性分子
および免疫原分子を支持することができるので、それら
は多数標識（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）の
ためのマトリックスとしてはたらく、核酸分子は、例え
ば、蛍光性分子またはハプテンで高度に標識される０次
いで、標識付けされた核酸は、タンパク質、例えば、タ
ンパク質Ａに共有結合される。
共有結合されたタンパク質−核酸は、多数の標識を、核
酸上に、有利には共有結合の前にかつ結合された物質を
免疫検定に使用する前に、支持することができる。
標識は、いかなる既知のタイプであることもでき、例え
ば、発蛍光団、抗原、ハプテン、酵素、放射性同位元素
、コファクターまたは炭水化物であることができる。
使用において、結合された物質のタンパク質部分は、あ
る他の試薬、例えば、他のタンパク質、核酸の特異的ヌ
クレオチド配列、例えば、リプレッサータンパク質また
はハプテンに対して特異性であり、後者は抗ハプテン抗
体と二次反応により検出可能である。この特異性により
、実際に、標識はタンパク質が特異的に結合する部位へ
［取り付けられる（ａｔｔａｃｈｅｄ）」ようになる。
本発明は、また、標識の存在により決定されるような、
抗原についての検定を実施する方法に拡張され、ここで
抗原は、試料中に含有される場合、抗体と複合化される
０次いで、抗原−抗体複合体は、抗体と標識付けされた
タンパク質との間の結合により、標識付けされたタンパ
ク質へ結合される。この免疫検定は、タンパク質の１端
へ共有結合された核酸が検定により検出されるべき標識
を支持するということにおいて、先行免疫検定より改良
されている。
本発明は、また、放射線免疫検定手順に拡張され、ここ
で試料中に存在しうる抗原は前記抗原に対して特異性の
抗体と複合化され、この複合体は、前述のように、共有
結合されたタンパク質−核酸へ結合され、その後核酸部
分は放射能的に標識付けされ、そして標識は検定される
。
本発明の詳述するにあたって、タンパク質成分は、それ
が部位特異性であるかぎり、多数の種類のものであるこ
とができる。特に適当な物質は、イムノグロブリン類、
タンパク質Ａなどを包含する。タンパク質Ａは、スタフ
ィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ａｕｒ見且」）から分離される４０．０００ダル
トンの一本鎖ポリペプチドである。Ｓ、ａｕｒｅｕｓの
ある株において、それは細胞壁のペプチドグリカン部分
へ共有結合されている。タンパクｍＡはいく種類かのＩ
ｇＧ部類の抗体へＦｃ−結合区域により結合する。この
場合において、抗体は試験試料中の検出すべき抗体に対
して特異性である。
タンパク質Ａは熱および変性剤に対して非常に安定であ
り、そして変性状態に引き続いて復元することができる
。［ジエイーダブリュφゴーディング（Ｊ　、Ｗ、Ｇｏ
ｄｉｎｇ）：　ｒ免疫学的試薬におけるスタフィロコッ
カス・タンパクＷＡの使用Ｊ　（Ｕｓｅ　ｏｆ　５ｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ａｓ　
ａｎ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅａｇｅｎｔ）
。
Ｊ、１ｍｍ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０　２４１−２５３　
（１９７８）参照］。タンパク質ＡのＩｇＧへの結合は
、ＩｇＧ分子の抗原部位へ影響を及ぼさない。
あるいは、タンパク賀部分はＩｇＧのような抗体である
ことができ、こうして試験試料中のある抗原に対して特
異性であろう。抗原は可溶性であり、細胞表面または粒
状物質へ固有にあるいは化学的に結合されうる。　・般
に、すべての抗原はＮＡＰＡ試薬の使用により検出され
うる。
未知の試料中で検出されうる診断の抗原は、リンパ球遺
伝標識、腫瘍特異性抗原、腫瘍細胞、膜受容体、微生物
抗原、血液型および組織適合性の型を代表する抗原、お
よび血清、尿などの中の抗原を包含し、それらは種々の
病気の状態において上昇したりあるいは低下する。
抗体は特定の抗原に対する特異性を有する。抗体はモノ
クロナルまたはポリクロナルのいずれかであることがで
き、そして１種または２種以北のタイプ、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍなどであることができる。抗原は生体内である数の種
により、あるいは生体外で細胞培養または組み換えＤＮ
Ａ技術により生産されることができる。
核酸は一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−
ＲＮＡ雑種、オリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオ
キシリボヌクレオチドであることができる。
タンパク質は核酸へ種々の方法で共有結合させることが
できる。１つの手順において、核酸の１端を、例えば、
末端トランスフェラーゼで修飾して、すでに存在しない
場合、リボヌクレオチド末端を確立する。リボヌクレオ
チド末端は過ヨウ素酸塩で酸化してアルデヒド基を形成
し、このアルデヒド基はシップ塩基の反応をタンパク質
の７ミノ基と行い、次いで水素化により安定なアミノメ
チル結合をタンパク質と核酸との間に形成する。
標識は、タンパク質への結合の前後に、そして検定の非
常に後の段階においてさえ、核酸部分へ適用することが
できる。標識は核酸上に存在するため、タンパク質との
反応を妨害せず、１つのタンパク質部分につき多数の標
識、例えば、２０〜１００以上の標識が存在することさ
えできる。ある種のタンパク質が直接標識付けされる場
合、６程度に少ない標識は反応を妨害するために十分で
あることが、以前に示された。
標識は欧州特許出願＄８４　１０７　６２４３号中に詳
述されているようにして核酸へ取り付けることができる
０代表的な標識は、蛍光団類、例えば、フルオレ１イン
、テキサス・シー２ド（ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ）、ローダ
ミンまたはフィコエリスリ７（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒ
ｉｎｅ）；二次標識付は抗体のための標的としてはたら
くことができるハプテンまたは抗原；標識付けされたア
ビジンまたは抗ビオチンにより検出することができるビ
オチン；慣用法で検定される酵素、例えば、セイヨウワ
サビのペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ；
発光検定のためのコツアクア−、例えば、ＦＡＤまたは
β−ガラクトシダーゼ；エネルギー伝達またはクエンチ
ング（ｑｕｅｎｔｉｎｇ）を行う蛍光修飾試薬：放射性
同位元素：または炭水化物を包含する。
前述のように、タンパク質部分は、例えば、ＩｇＧのよ
うな抗体のＦｃ部分に対して１部位特異性であるべきで
ある。
ＮＡＰＡ複合体の標識が発蛍光団である場合、Ｉ　ｇＧ
−ＮＡＰＡ複合体と反応する抗原の存在は直接の蛍光免
疫検定により決定することができる。標識がハプテンで
ある場合、二次増幅（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ）が必要であり、ここでそのハプテン
に対して特異性であるＩｇＧ分子を使用する。標識が酵
素である場合、結合した曹素の量を既知の方法でその基
質の酵素触媒反応により決定できる酵素の検定を使用す
ることができる。標識が放射性同位元素である場合、放
射線免疫検定を慣用法で実施する。
・次ＮＡＰＡ複合体の標識に対して特異性であるＩｇＧ
との二次増幅の場合において、異る標識を支持する第２
標識付けＮＡＰＡ複合体の添加により読み出しくｒｅａ
ｄ−ｏｕｔ）を達成することができる。
共有結合したタンパク賀−核酸は免疫検定において慣用
法で使用することができ、標識は最初に存在するか、あ
るいは最終の検定より前のいかなる段階においても添加
することができる。
本発明を添付図面を参照しながらさらに説明する。
図面、とくに第１図を参照すると、末端リポース残基（
ＮＡｒ）を含有する核酸を、核酸を結合する配位子へ光
化学的方法（ｈν）により結合する。ＮＡｒがＤＮＡで
ある場合、ＮＡｒはＴｄＴ−ＡＴＰ　（末端デオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼーアデノシントリホス
フエート）から調製する。ＮＡｒがＲＮＡである場合、
それはそのまま使用する。共有結合の付加物（ｃｏｖａ
ｌｅｎｔ　ａｄｄｕｃｔ）、（Ｎａｒ）配位子、が生成
する。光化学的方法は１例えば、欧州特許出願第８４　
１０７　６２４．３号中に記載される光反応性エチジウ
ムアジドまたはプソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）誘導体
を使用する。アミノメチルプソラレン例えば、アミノメ
チルートリオキサレｙ　（ｔ　ｒ　ｉ　ｏｘｓａ　ｌ　
ｅｎ）　（ＡＭＴ）またはアミンメチルジメチルーアン
ゲリシン（ＡＭＡ）を使用する場合、フルオレセインイ
ンチオシアネー）（ＦＩＴＣ）による二次標識付けが可
催である。付加物、例えば、（ＮＡｒ）配位子−標識、
が生成し、これを過ヨウ素酸塩（ＮａＩＯ，）で酸化す
ることによりアルデヒド基ＨＯ ／ （ＮＡ）　■ ＼ 配位子−標識 を形成する。この複合体（１）はタンパク質Ａと反応し
、そして（２）においてＮａＢＩ（＊で還元されて、Ｎ
Ａ’ＦＡ複合体 ＣＨ２−タンパク質Ａ ／ （Ｎ　Ａ）　（３） ＼ 配位子−標識 タンパク質Ａの代わりに、複合体（１）がＩｇＧと反応
し、そして（２）において還元されると、ＮＡ−ＩｇＧ ＣＨ２ＮＨＩｇＧ ／ （ＮＡ）（３） ＼ 配位子−標識 が生成する。
フルオレセインの代わりに、他の標識、例えば、ハブテ
ン、酵素、コファクター、抗原、放射性同位元素、炭水
化物および他の発蛍光団を同様に使用することができる
。
より詳しく第２図を参照すると、いくつかの物理的にあ
るいは化学的に検出可能な標識を支持する核酸の端へタ
ンパク質Ａを共有結合させる。直接蛍光測定を望む場合
、標識（木）は発蛍光団であることができる。免疫検定
に基づく酵素の調製のために、標識は酵素または酵素の
基質であることができる。酵素、セイヨウワサビのペル
オキシダーゼの結合に関すると、この酵素の約ｌθ〜１
００のコピーを結合させることができる。放射性測定を
望む場合、核酸を適当な放射性同位元素で標識する。核
酸は−・水銀または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−
ＲＮＡ雑種、オリゴリボヌクレオチドまたはデオキシリ
ボヌクレオチドであることができる。
標識付けされたタンパク質Ａ付加物（ＮＡＰＡ）はＩｇ
ＧまたはＩｇＧ−抗原複合体と反応するであろう。次い
で、この複合体を慣用法で検定することができる さらに増幅を望むとき、ハプテンまたは適当な抗原を標
識として使用する０次いで、前記複合体を標識に対して
特異性の抗体と反応させ、追加量のＮＡＰＡ　（試薬■
）と自由に結合する抗体のＦｃ断片を残す０次いで、こ
れを前のように検定することができる。
次の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実
施例において、特記しないかぎり、すべての部は重量に
よる。
一丈蔦１」− ＤＮＡ　にゝい　リポース−る ＱＸ１７４１Ｆ（７）ＨａｅｌＩＩ消化物または実施例
３の生成物をカリウムココジレート緩衝液（ｐＨ７，２
，２００ミリモル）に対して透析し、そして濃度を１０
−４モルに塩基対において調節する。このＤＮＡ溶液（
１００ＩＬ１）に、５ＩＬｌの２ミリモルのジチオスレ
イトール、１４Ｃ標識ＡＴＰと混合したＩＩＬｌのｌθ
ミリモルのＡＴＰおよび１０．１のｌθミリモルの塩化
コバルトを添加する。この混合物を３７℃において５分
間インキュベーションし、次いで水中で１０分間冷却す
る。１５単位の末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを添加し、そしてこの混合物を１５℃において
６０分間インキュベーションする。
反応後、酵素をフェノール抽出により除去し、そして未
反応のヌクレオトド類を透析またはセファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０）カラムの通過により除去す
る。収率を吸収対ＣＰＭ比から計算する。均一な反応を
仮定すると、収率はＤＮＡの３゛末端につき約ｌθ〜２
０ＡＴＰである。ＣＲＮＡ−ＤＮＡ１ｍ１ａ＊たｔ＊二
木ｔａＲＮＡについて、ＴｄＴの反応のこの工程はそれ
以上の反応について不必要である。） タンパク　の　化　び Ｈ ０／／ タンパクＪｌｊ　Ａ寸たはＩｑＧ 実施例１の生成物のリボース末端の酸化を、過ヨウ素酸
ナトリウムで室温において０．１モルの酢酸ナトリウム
Ｉａ＃液ｐＨ５および０．１容量の１モルの過ヨウ素酸
ナトリウムを使用して実施する。得られる溶液を１モル
のＮａＣ１，０，００５モルの酢酸ナトリウムＰＨ９に
対して透析して過剰の過ヨウ素酸塩を除去する０次いで
、タンパクｆｉＡまたはＩｇＧを添加し、そしてこの溶
液をＮａ−ホウ水素化物により還元する。
この反応は０〜５０℃において１モルまでのイオン強度
のＮａＣｌ中で実施することができる。
実施例３ 実施例１に記載するように処理したＱＸ　１７４ＲＦ二
本ｆｆ１ＤＮＡの）（ａｅｍ制限酵素消化物または実施
例２の生成物を、トリス（Ｔｒｉｓ）−ＥＤＴＡ緩衝液
（ＴＥ）（１０ミリモルのトリスヒドロキメチルアミノ
メタン、１ミリモルのＥＤＴＡ；ＨＣｌ１？ｐＨ７，１
に調節されたもの）中に溶解するか、あるいはそれに対
して透析する。Ｗ度を塩基対において１．５Ｘ１０−’
モル／ｌに調節する。ＴＥ中に溶解した４°−アミノメ
チルトリオキサレン（ＡＭＴ）を添加して、配位子対塩
基対の比を０．１にする。この混合物を窒素ガスで１５
秒間フラッシュし、そして３６０ｎｍの輻射線で６０分
間照射する。これによりトリオキサレン残基はＤＮＡへ
共有結合する０反応後、この混合物に酢酸ナトリウムを
添加してイオン強度を上昇させた後、この混合物をエタ
ノールで沈殿させる。この沈殿は、また、上澄み液中に
未反応のトリオキサレンを残す、トリチウム化（ｔｒｉ
ｔｉａｔｅｄ））リオキサレンを使用することにより、
結合の相対量を推定することができる。（精確に同一・
の条件を二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡ雑種につい
て使用することができる）。
−ｙ」ｌ１久− 実施例２および３の生成物は、ＡＭＴおよび／またはタ
ンパク質からの遊離第−ＮＨ２残基を有する。それらを
ビオチンおよび／またはフルオレセインまたはローダミ
ンと反応させる。フルオレセインインチオシアネート（
Ｆ　Ｉ　ＴＣ）溶液を、５ｇの固体を２ｍｌのエタノー
ル中に溶解することにより調製する。実施例２および３
の生成物を、０．１モルの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８〜９）に対して透析するか、あるいはその中に溶解
させる０次いで、それらをＦＩＴＣのエタノール溶液と
等しい重量濃度で１５＝１の容量比で混合する。反応を
１時間進行させる。生成物をセファデックスＧ５０カラ
ムで精製する。排除された分画は生成物を含有する。ビ
オチンによる標識付けは、欧州特許出願第８４　１０７
　６　２４．３号中に記載されるように、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミノビオチンを使用することにより実施す
る。
一！蔦Ｕ ポリアリルアミノウリジンホスフェート（アリルアミノ
ウリジントリホスフェートを慣用法により酵素重合させ
ることにより製造した）を、実施例５におけるように、
フルオレセイン、ローダミンまたはビオチンと反応させ
、次いで実施例２におけるようにタンパク質と反応させ
る。
反応の順序を変更させることができ、例えば、ＤＮＡを
まずＡＭＴと反応させ、次いでリポース残基をＴｄＴに
より付加させ、すべてのＡＭＴアミン残基を標識と反応
させ、次いでタンパク質とのレドックス反応を介する結
合を実施することができる。
ＣＥＡは糖タンパク質であり、そして血清ＣＥＡの定最
は卵巣、乳房および結腸の癌をもつ患者において予後の
診断および潜在的診断の値を有することが示された。
血清の試料（０，１−１ｍ１）を支持物質（例えば、ニ
トロセルロース）中でインキュベーションして、ＣＥＡ
をこのような支持物質へ結合させる。この結合は非特異
性であることができ、例えば、タンパク質のプラスチッ
クへの吸着であることができ、あるいは特異性であるこ
とができ、ＣＥＡに対して特異性の抗体またはＦａｂ断
片を使用する支持体へのＣＥＡの固定化であることがで
き、前記の抗体または断片はこの支持体上に前もって固
定化されている。
次いで、固定化されたＣＥＡをポリクロナル抗体（その
抗原の特異性およびタンパク質Ａの結合特性について選
択され、そして抗原への最大の特異的結合を与えるよう
に滴定されている）とともの室温において３０分間イン
キュベーションする。０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）−２０（ＰＢＳ−ＴＶ）を含有するリン酸塩緩衝塩
溶液（２０ミリモルのリン酸ナトリウム、１３０ミリモ
ルのＮａＣ１）中で３回洗浄することにより、結合しな
いタンパク質を除去する。
フルオレセイン標識ＤＮＡ−タンパクｊｊＡ複合体を、
前記抗体−抗原複合体とともに３０分間室温においてイ
ンキュベーションし、そしてＰＢＳ−Ｔｗで３回洗浄し
て、結合しないＮＡＰＡ複合体を除去する。
次いで、標識を蛍光顕微鏡検査により検定する。
フィニルのハイバーク勾配（Ｆｉｃｏｌｌ　ｈｙｐａｑ
ｕｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用して、全血（１ｍｌ）
からリンパ球を分離する。リンパ球を１組（ｂａｔｔｅ
ｒｙ）の抗血清中でインキュベーションする。前記の抗
血清は特定の組織適合性（ＨＬＡ）のサブ−タイプ（ｓ
ｕｂ−ｔｙｐｅ）について特異性である。結合しない抗
血清を分画遠心により除去し、そして細胞をＰＢＳで３
回洗浄する。洗浄したリンパ球を蛍光標識タンパクＷＡ
−ＤＮＡ複合体とともにインキュベーションする。結合
しない蛍光標識タンパク！Ａ−ＤＮＡ複合体を分画遠心
により除去する０次いで、リンパ球を蛍光顕微鏡検査に
より分析する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、タンパク質ＡまたはＩｇＧを核酸へ本発明の
１実施態様に従い結合する方法の概略フローシートであ
る。 第２図は、ある検定において第１図の結合された生成物
を使用する方法の概略フローシートである。 特許出願人　モレキュラー・ダイアグノスティンＦＩＧ
＋ 第１頁の続き ■発明者　ビンセント・マーチェ　ア シ　ド ＠発　明　者　ドナルド・エム・クロ　アザーズ　レ メリ力合衆国コネチカット州０６４３７セイチエムズヘ
ツ・プロスペクトアベニュー　１７９ メリ力合衆国コネチカット州０６４７２ノースフォード
・サイドライブ（番地なし）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ｌ、核酸の１端に共有結合されたタンパク質。 ２、核酸が−・末鎖または二本鎖であり、そして前記核
    酸がデオキシリポ核酸またはリポ核酸またはオリゴデオ
    キシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドま
    たはそれらの雑種であることを特徴とする特許請求の範
    囲第１項記載の結合タンパク質。 ３、核酸がＨｇ、ＳＲまたはＮｌ２の官能基を有するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１または２項記載の結
    合タンパク質。 ４、タンパク質が、 ａ）他のタンパク質、 ｂ）核酸の特異的ヌルレオチド配列、 Ｃ）ハプテン、または ｄ）配位子、 に対する親和性を有することを特徴とする特許請求の範
    囲第１〜３項のいずれかに記載の結合タンパク質。 ５、核酸が少なくとも１つの物理的または化学的に検出
    可能な標識を支持することを特徴とする特許請求の範囲
    第１〜４項のいずれかに記載の結合タンパク質。 ６、標識が発蛍光団、染料、抗原、配位子、酵素、酵素
    の基質、コファクター、放射性同位元素、炭水化物また
    はそれらの組み合わせであることができることを特徴と
    する特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の結合
    タンパク質。 ７、特異的に結合性の化合物を標識付けされた核酸の１
    端に結合させることを特徴とする分析物（ａｎａｌｙｔ
    ｅ）を特異的に結合性の化合物と複合化させることから
    なる分析物の決定方法。 ８、特異的に結合性の化合物が、 ａ）他のタンパク質、 ｂ）核酸の特異的ヌルレオチド配列、 Ｃ）ハプテン、または ｄ）配位子、 に対する親和性を有するタンパク質であることを特徴と
    する特許請求の範囲第７項記載の分析物の定量方法。 ９、核酸を化学的処理または酵素的処理に付してタンパ
    ク質を結合することのできる官能基を１端に導入するこ
    とをことを特徴とする核酸の１端に共有結合されている
    タンパク質の調製方法。 ｉｏ、核酸はｌ端にリボース部分を支持し、前記リポー
    ス部分を酸化して側鎖のアルデヒド基を形成し、前記ア
    ルデヒド基はシッフ塩基を介してタンパク質を結合する
    ことができ、そして必要に応じて、前記アルデヒド基を
    還元することをことを特徴とする核酸の１端に共有結合
    されているタンパク質の調製方法。 １１、核酸を少なくとも１つの物理的または化学的に検
    出可能な標識で標識付けすることを特徴とする特許請求
    の範囲第９または１０項のいずれかに記載の核酸の１端
    に共有結合されているタンパク質の調製方法。
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