JP2597698B2 - オリゴヌクレオチド‐ポリアミド コンジュゲート - Google Patents

オリゴヌクレオチド‐ポリアミド コンジュゲート

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジ
ュゲート、その製造方法、および該コンジュゲートの使
用、特に診断および治療薬としての使用に関する。
合成オリゴヌクレオチドは、分子生物学の分野におい
て、特にDNMまたはRNA配列の検出のためのハイブリダイ
ゼーション プローブとして広く応用されることが見い
出された。通常、オリゴヌクレオチドはその５′末端に
放射ラベルを有しており、ハイブリダイゼーションの検
出が可能である。細胞毒性や突然変異誘発性などの放射
ラベルされた物質に通常伴われる問題は別にすると、放
射ラベルされたプローブの検出にはオートラジオグラフ
ィー暴露が必要であり、数日を要することも多い。さら
に、放射ラベルが短い半減期を有していることもあり、
これにより、その保存性および後の使用が制限される。
蛍光あるいは酵素リポーターグループなどの非−放射
活性プローブまたはリポーターグループでオリゴヌクレ
オチドをラベルすると、高い安全性、定めのない貯蔵寿
命および検出の容易性を含む、放射ラベルされたプロー
ブを凌ぐかなりの利点が得られる。
１またはそれ以上のヌクレオチド塩基を用いて（米国
特許No.4,669,876および豪州特許出願公開No.1648/8
5）、または直接リポーターグループをオリゴヌクレオ
チドの３′もしくは５′末端に結合させることによって
（欧州特許出願公開No.84101392.3および85102130.
3）、オリゴヌクレオチドを非−放射活性リポーターグ
ループでラベルすることが提案されていた。このような
以前の提案は複雑な合成反応を包含することが多く、オ
リゴヌクレオチドの相補性標的配列へのハイブリダイゼ
ーションを遮断することもある。
従って、相補性の標的配列に効率的にハイブリダイズ
し、放射活性ラベルに頼ることなく好都合に検出するこ
とができ、そしてさらに、比較的簡単かつ都合良く製造
することができるオリゴヌクレオチドが求められてい
る。
本発明によれば、式:X−Ｌ−Ｙ［式中、Ｘはポリアミ
ドであり、Ｙはオリゴヌクレオチドであり、そしてＬは
ポリアミドＸのアミノ末端およびオリゴヌクレオチドＹ
の３′ホスフェート基と共有結合を形成するリンカーで
ある］で示されるオリゴヌクレオチド−ポリアミド コ
ンジュゲートが提供される。
ポリアミドは、アミドまたはいわゆるペプチド結合に
よって結合したリジン、バリン、グリシン、セリン、ト
レオニン、チロシン、メチオニン、プロリンなどの天然
のアミノ酸［Biochemistry、第２版、Albelt L.Lehning
er、72−77頁］から得ることができる。別法によれば、
ポリアミドは合成アミノ酸（即ち、天然にはタンパク質
中に見い出されないアミノ酸）から、または天然および
合成アミノ酸の組合せによって得ることができる。本明
細書中で用いる「合成アミノ酸」なる用語は、一般式:H
2NCHRCOOH［式中、Ｒはアルキルまたはシクロアルキル
などのあらゆる有機部分であり、これらは、不飽和もし
くは部分的に飽和していてもよく、そして／または１も
しくはそれ以上の異項原子またはそのような異項原子を
含む基（アミド基など）で遮断されていてもよく、そし
て／またはハロゲン、シアノ、アミノもしくは置換もし
くは非置換フェニルもしくはベンジルで置換されていて
もよい］で示されるα，ω−アミノカルボン酸を指す。
このポリアミドは任意の数のアミノ酸単位を含んでい
てよいが、それがオリゴヌクレオチドとその標的配列の
ハイブリダイゼーションを妨害しないものであるという
条件のもとにあるのは勿論のことである。例示のために
挙げると、ポリアミドは１〜100のアミノ酸単位を含ん
でいよう。
このポリアミドは天然のα−アミノ酸を含有するペプ
チドを形成することもある。このペプチドの配列は、オ
リゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲートのあら
ゆる望ましい適用に好都合なように設計することができ
る。このペプチドは、後記で説明するようにリポーター
グループで誘導体化することができる１またはそれ以上
のリジン残基を含有していてもよい。さらに、このポリ
アミドは抗原性であって、従って抗体の結合によって検
出可能であってもよく、これは例えば抗体結合の検出を
可能にするための適当なリポーターグループを含んでい
てもよい。
合成アミノ酸を、例えば、リポーターグループを有す
るリジンなどのアミノ酸の間のスペーサーとして用い
て、リポーターグループの立体障害もしくは失活を回避
するか、またはオリゴヌクレオチドから大きなリポータ
ーグループを遠ざけてもよい。有用なアミノ酸スペーサ
ーの例は６−アミノヘキサン酸（Aha）である。
本発明で用いることができる合成アミノ酸には次式で
示される化合物が含まれる： ［式中、ROはｐ−ニトロフェニルオキシ、ペンタフルオ
ロフェニルオキシおよびＮ′−ヒドロキシスクシンイミ
ジルなどの脱離基であるか、またはＲが水素であり； R2はフルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）または
tert−ブトキシカルボニル（Boc）などのアミノ保護基
であり； ｎおよびn1は０〜30であってよく； Ｗは である（ここで、n2およびn3は０〜100であってよ
い）］。
ポリアミド合成に有用なアミノ酸単位は、 である。
ポリアミドを得るために用いることができる合成アミ
ノ酸が、いかなる意味においても上に具体的に例示した
化合物に限定されるものではないことを理解すべきであ
る。
ポリアミドＸを、１またはそれ以上のリポーターグル
ープ（検出マーカーとも呼ばれる）、例えばビオチン、
蛍光団、化学ルミネッセンス部分、酵素またはフェリチ
ンなどのコロイド化合物またはコロイド状の銀もしくは
金でラベルすることができる。
蛍光団リポーターグループは以下に挙げるものから選
択してよい：フルオレセイン−５−イソチオシアネー
ト、ジアシル（イソブチリル、アセチルまたはピバロイ
ルなど）フルオレセイン−５および／または６−カルボ
ン酸ペンタフルオロフェニル エステル、６−（ジアシ
ル−５および／または６−カルボキサミド−フルオレセ
イン）アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェニル エス
テル、テキサス・レッド（Texas Red;Molecular Probe
s,Inc.の商標）、テトラメチルローダミン−５（および
６）イソチオシアネート、エオシン−イソチオシアネー
ト、エリトロシン−５−イソチオシアネート、４−クロ
ロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−1,3−ジアゾー
ル、４−フルオロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−1,
3−ジアゾール、３−（７−ニトロベンズ−２−オキサ
−1,3−ジアゾール−４−イル）メチルアミノプロピオ
ニトリル、６−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−1,3
−ジアゾール−４−イル）アミノヘキサン酸、スクシン
イミジル 12−（Ｎ−メチル−Ｎ−（７−ニトロベンズ
−２−オキサ−1,3−ジアゾール−４−イル）アミノド
デカノエート、７−ジエチルアミノ−３−（４′−イソ
チオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン（CP）、
７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸、７−ジメチルアミ
ノクマリン−４−酢酸、スクシンイミジル ７−ジメチ
ルアミノクマリン−４−アセテート、７−メトキシクマ
リン−４−酢酸、４−アセトアミド−４′−イソチオシ
アナトスチルベン−2,2′−ジスルホン酸（SITS）、９
−クロロアクリジン、スクシンイミジル ３−（９−カ
ルバゾール）プロピオネート、スクシンイミジル１−ピ
レンブチレート、スクシンイミジル−１−ピレンノナノ
エート、ｐ−ニトロフェニル １−ピレンブチレート、
９−アセトラセンプロピオン酸、スクシンイミジル ア
ントラセン−９−プロピオネート、２−アセトラセンス
ルホニルクロリド、または特定の方法で処理したときに
蛍光を発する蛍光団前駆体。
酵素系のリポーターグループは、β−ガラクトシダー
ゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、アルカ
リホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、ルシフェラーゼ
および炭酸脱水酵素から選択してよい。通常、酵素は１
またはそれ以上の基質として反応して、色の変化、ルミ
ネッセンスまたは沈澱の生成などの検出可能なシグナル
を与えるであろう。
リポーターグループは、当分野で自体既知の常法に従
ってポリアミドに結合させることができる。例えば、１
級アミン基などのポリアミド上の求核基を蛍光または酵
素リポーターグループと反応させて、それらの間に共有
結合を形成させることができる。別の方法によれば、当
分野で自体既知の２官能性のカップリング試薬［例え
ば、Pierce Cemical Companyのカタログ（1987）に記載
されている試薬］を用いてリポーターグループをポリア
ミドに結合させることができる。
ビオチニル化されたオリゴヌクレオチドは常法によっ
て製造することができる。例えば、誘導体化されていな
いビオチンをBOP結合法［Castro,B.et al.,Synthesis,
（1976）,pp.751−752］を用いてオリゴヌクレオチドに
導入することができる。別法では、ビオチンをＮ−ヒド
ロキシスクシンイミジル活性エステルとして導入するこ
とができる。ビオチンはリポーターグループに結合され
たアピジンを用いて検出することができる。例えば、ス
トレプトアビジン−アルカリホスファターゼ コンジュ
ゲートを用いてビオチンに結合させてよい。アルカリホ
スファターゼは適当な基質と反応して、視覚的に検出す
ることが可能な不溶性の染料沈澱を生成することができ
る。
免疫学的な反応によってポリアミドを検出するのが望
ましいときには、当分野で周知の方法［例えば、Godin
g,J.W.,（1986）,Monoclon al Antibodies:Principles
and Practice,第２版,Academic Press］に従い、オリゴ
ヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲート、ポリアミ
ド単独、または担体分子、例えばKLH［キーホール・サ
サガイ・ヘモシナニン（key hole limpet haemocynani
n）］に結合したポリアミドを用いる免疫化によって、
適当な宿主動物中にポリアミドに対する抗体を生成させ
てよい。
オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNA標的中の相補ヌ
クレオチド配列へのハイブリダイゼーションが可能なデ
オキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれ
らの組合せ物からなっていてよい。一般に、オリゴヌク
レオチドを構成するヌクレオチドの数は、標的配列への
ハイブリダイゼーションを可能にする十分なヌクレオチ
ドが存在している限り重要ではない。通常、オリゴヌク
レオチドは６を越えるヌクレオチドを含有しているであ
ろう。このオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーシ
ョンに影響を及ぼすことなくインビボでの半減期を長く
するために適切に修飾されていてもよい。例えば、Arga
wal et al.［Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,pp.7079−708
3（1988）］またはSteinおよびCohen［Cancer.Res.48,p
p.2659−2688（1988）］の方法に従い、リン骨格上の１
または２個の非−架橋酸素をイオウまたはアミンに代え
ることによって、オリゴヌクレオチドを修飾することが
できる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドはオ
リゴヌクレオチドなる用語の範囲内である。また、「オ
リゴヌクレオチド」なる用語には１個のヌクレオチドが
含まれていてよい。
リンカーＬは、２官能性分子Ｒ′−Ｌ′−Ｒ″［式
中、Ｒ′およびＲ″は同一であるか、または異なってお
り、−NH2、−CO2H、−OH、OR（ここで、Ｒはヒドロキ
シ保護基である）、−CO2R（ここで、Ｒは２−ヒドロキ
シピリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニト
ロフェニル、ペンタフルオロフェニル（Pfp）、Meであ
る）または他の活性エステル、アシルイミダゾール、マ
レイミド、トリフルオロアセテート、ジケトン、イミド
エステル、スルホネートエステル、イミン、−CHO、1,2
−シクロヘキサンジオン、グリオキサール、スルホニル
ハライド、α−ハロゲン化ケトン、アジドなどの官能基
を表し、そしてＬはアルキルまたは置換アルキル基であ
る］から導かれる部分を意味する。アルキル鎖Ｌは、ハ
ロゲン（Ｉ、Br、Cl、Ｆ）、ヒドロキシ、シアノ、フェ
ニル、アミノ、カルボキシ、アルキル、アルコキシなど
の通常の置換基で置換することができる。さらに、リン
カーＬのアルキレン鎖は、１またはそれ以上の２価の
基、例えば−Ｏ−、−Ｓ−、−NH−、−CH＝CH−、−Ｃ
＝Ｃ−、フェニル、−SO2などで遮断することができ
る。しかし、官能基Ｒ′は適当な条件のもとでポリアミ
ドのアミノ末端と共有結合を形成しうるものでなければ
ならず、また、官能基Ｒ″は適当な条件のもとでヌクレ
オチドと共有結合を形成しうるものでなければならな
い。連結基Ｒ′−Ｌ−Ｒ″および特定のコンジュゲーシ
ョンの化学の選択は、得られるプローブ分子の完全性に
必須である他の巨大分子結合、即ちペプチド、グリコシ
ドおよびホスホジエステル結合を保存するという要求を
満たすものでなければならないのは明らかである。
このリンカーをα，ωヒドロキシカルボン酸誘導体か
ら導いてもよい。
また、リンカーＬは結合であってもよいし、また、ブ
チロラクトンなどのラクトンであってもよい。
さらに、本発明はオリゴヌクレオチドの３′−末端を
ポリアミドのアミノ末端に連結することからなるオリゴ
ヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲートの製造方法
を提供するものである。
即ち、本方法の１態様によれば、予め調製しておいた
オリゴヌクレオチド部分または予め調製しておいたポリ
アミド部分のどちらかに連結基を結合させ、次いで残り
の部分を連結基に結合させることによって、コンジュゲ
ートを製造することができる。
別の方法によれば、適当な連結基前駆体を、予め調製
しておいたオリゴヌクレオチド部分および予め調製して
おいたポリアミド部分に結合させてもよい。次いで、２
つの前駆体を反応させると、連結基が得られる。
別の態様によれば、本方法は、予め調製しておいたポ
リアミドに連結基を結合させ、次にこの連結基にヌクレ
オチド塩基を結合させ、次いで１またはそれ以上の別の
ヌクレオチド塩基を順次付加してオリゴヌクレオチドを
得ることからなる。
さらに別の態様では、本方法は、予め調製しておいた
オリゴヌクレオチドに連結基を結合させ、次にこの連結
基にアミノ酸を結合させ、次いで１またはそれ以上のア
ミノ酸を順次付加してポリアミドを得ることからなる。
ポリアミド部分は、固体の支持マトリックス、例えば
調節された（コントロールされた）多孔ガラス（CPG）
などに結合させることもできる。
本発明の特に好ましい態様によれば、以下に挙げる工
程からなるオリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュ
ゲートの製造方法が提供される： （ａ）第１のアミノ酸またはアミノ酸ユニット（アミド
結合によって互いに結合している）のＣ−末端を、支持
マトリックスと反応させてそれらを結合させ； （ｂ）次に、この支持マトリックスを、周知の固相ペプ
チド合成法に従い、１またはそれ以上のアミノ酸と順次
反応させてポリアミドを得； （ｃ）この支持マトリックス−ポリアミドを、リンカー
の第１の反応性基と反応させてポリアミドのアミノ末端
とリンカーを結合させ； （ｄ）工程（ｃ）の生成物を、第１のヌクレオチドと反
応させてリンカーの第２の反応性基とヌクレオチドの
３′ホスフェートを結合させ； （ｅ）次いで、この支持マトリックスを、周知の固相オ
リゴヌクレオチド合成法に従い、１またはそれ以上のヌ
クレオチドと順次反応させてオリゴヌクレオチドを得；
そして （ｆ）所望により、オリゴヌクレオチド−ポリアミド
コンジュゲートを支持マトリックスから切断し、ポリア
ミドまたはオリゴヌクレオチドの反応性基に結合したあ
らゆる保護基を除去し、そして得られたコンジュゲート
を精製する。
リンカーＬが結合できるときには、工程（ｃ）を省略
する。
ポリアミドは、例えば、固相Fmoc法［Atherton,R.and
Shepard,R.C.,（1985）,J.Chem.Soc.Commun,pp−165−
166］または固相Boc法［Barany,G.and Merrifield,R.
B.,（1980），“Solid−Phase Peptide Synt hesis";
“The Peptides",第２巻,E.Gross ＆ J.Meienhofer編,A
cademic Press,New York,pp.1−284中］を用いて合成す
ることができる。これらの方法においては、アミノ酸を
当分野で自体既知の通常の保護基［例えば、Green,（19
81），“Protective Groups in Organic Synthesis",Jo
hn Wiley ＆ Sons,Inc.;Atherton and Sheppard,（198
5）,J.Chem.Soc.Commun,pp.195−166;Barany and Merri
field,上記］で保護して反応性部分を保護する。
オリゴヌクレオチドは、固相ホスホトリエステル法
［Sproat and Gait,（1984），“Oligonucleotide Synt
hesis,A Practical Approach",pp.83−116,IRL Press,O
xford］、固相Ｈ−ホスホネート法［Froehler et al.,
（1986）,Nucleic Acids Research,14,pp.5399−540
7］、または固相ホスホルアミダイト法［Beaucage and
Caruthers,（1981）,Tetrahedron Lett.,22,pp.1859−1
862］によって合成することができる。これらの方法の
それぞれにおいて、ヒドロキシまたはアミノ基などの反
応性基は、文献記載［Green,（1981），“Protective G
roups in Organic Synthesis",John Wiley ＆ Sons,In
c.;Beaucage,S.L.and Caruthers,M.H.,（1981）,Tetrah
edron Lett.,22,pp.1859−1862;Sproat,S.and Gait,M.
J.,（1984），“Oligonucleotide Synthesis,A Practic
al Approach",pp.83−116,IRL Press,Oxford］のように
して、通常のヒドロキシおよびアミノ保護基によって保
護することができる。
オリゴヌクレオチドポリアミド コンジュゲートの合
成が終わったら、当分野で自体既知の方法に従って脱保
護を行ってよい。
本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュ
ゲートは、完全に保護され、支持マトリックスに結合し
ているか、支持マトリックスから除去され保護された形
態であるか、または完全に脱保護された形態であってよ
い。これらの状態のそれぞれが「オリゴヌクレオチド−
ポリアミド コンジュゲート」なる用語の範囲内にあ
る。
支持マトリックスは、例えば、調節された多孔ガラス
［アミノプロピル調節多孔ガラス（AP−CPG）など］ま
たはポリスチレン樹脂などから選択してよい。ポリアミ
ドと結合した支持マトリックスは固体の支持体を構成
し、その上でオリゴヌクレオチド合成が行われる。
本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュ
ゲートの好ましい合成法は、大きなパッチのポリアミド
（そのＣ−末端で支持マトリックスに結合している）を
前もって製造することができ、そして必要なときにその
一部を所望のオリゴヌクレオチドを組立てるために用い
ることができ、好都合である。さらに、段階的な合成に
よって、予め調製しておいたオリゴヌクレオチドを予め
調製しておいたポリアミドに結合させることによって得
られる収率よりも高い、優れたオリゴヌクレオチド−ポ
リアミド コンジュゲートの収率が得られることにな
る。
ポリアミドは通常の市販のペプチド合成機［例えば、
Applied Bio system Inc.から入手可能］で合成してよ
く、次いでオリゴヌクレオチドの合成のための通常の市
販のオリゴヌクレオチド合成機［例えば、Applied Bios
ystems Inc.から供給されている合成機］に移してよ
い。
１またはそれ以上のリポーターグループを、多くの異
なる段階でポリアミドに導入することができる。このリ
ポーターグループはポリアミドの合成前（段階Ｉ）にア
ミノ酸中に存在することができ；ポリアミドの合成後
（段階I a）に；リンカーの付加後（段階II）に；支持
マトリックス上でのオリゴヌクレオチドの合成後（段階
II）に；または、脱保護および支持マトリックスからの
オリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲートの精
製後（段階IV）に導入することができる。選択される方
法は選択されるリポーターグループおよび合成方法に依
存するであろう。
リポーターグループがペプチドおよびオリゴヌクレオ
チド合成の両方の条件に安定であるときには、これを誘
導体化されたアミノ酸としてポリアミド合成の始めから
導入することができる（段階I a）。DNA合成の条件には
安定であるがペプチド合成の条件には安定ではないとき
には、これをポリアミドの合成後に導入することができ
る（段階ＩまたはII）。リポーターグループがペプチド
またはオリゴヌクレオチド鎖の組立のどちらにも安定で
はないが脱保護方法に安定であるときには、完全に保護
されたポリアミド−オリゴヌクレオチド コンジュゲー
トのオリゴヌクレオチド鎖の組立の後に導入することが
できる（段階III）。これらの方法は、ポリアミド−オ
リゴヌクレオチド コンジュゲートが固体の支持体上に
あるままでラベルが導入され、従って過剰のリポーター
グループを用いることができ、反応後に過剰量を簡単に
洗い落とすことができるので好都合である。ラベルがコ
ンジュゲートの合成に用いるどの条件にも安定ではない
ときには、精製された完全に脱保護されたポリアミド−
オリゴヌクレオチド コンジュゲートとの液相反応にお
いて導入することができる（段階IV）。
蛍光団は、Ｉ〜IVのいずれかの段階でオリゴヌクレオ
チド−ポリアミド コンジュゲートに導入することがで
きる。これはビオチンの場合も同様である。
酵素、およびコロイド状化合物（コロイド状金、コロ
イド銀あるいはフェリチンなど）は段階IVで導入するこ
とができる。
オリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲートの
ポリアミド部分は、得られる検出シグナルを増大させ、
従って検出を容易にする複数のリポーターグループを含
んでいてもよい。
コンジュゲートのポリアミド部分はリポーターグルー
プを結合するための媒体として機能するだけでなく、ポ
リアミドを特定の細胞型、細胞位置に向けさせるための
アドレス・マーカーとしても作用するか、またはオリゴ
ヌクレオチドの細胞膜の通過を増強することもある。ペ
プチド配列のアドレス・ラベル活性はよく調べられてい
る［Verner and Schatz,（1988）,Science 241,pp.1307
−1313;およびGoldfarb et al.,（1986）,Nature 322,p
p.641−644］。例えば、細胞表面受容体によって認識さ
れるペプチド配列を選択することによって、該ペプチド
配列にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを特定の
細胞型中に運搬することができ、ここでこれらは生物学
的作用を発揮することができる（例えば、アンチセンス
オリゴヌクレオチドの場合にはウイルス性または細胞
性RNAの転写をブロックする）。
本発明の別の態様においては、ウイルス性、細菌性、
またはその他の疾病の治療方法であって、そのような治
療を必要としている患者に本発明のオリゴヌクレオチド
−ポリアミド コンジュゲートの治療学的有効量を投与
することを特徴とし、さらに、このコンジュゲートのオ
リゴヌクレオチド部分が特定のウイルス性、細菌性また
は他のポリヌクレオチドの相補性であるアンチセンス
オリゴヌクレオチドであって特定のポリヌクレオチドの
転写または翻訳をブロックするものであることを特徴と
する方法が提供される。
アンチセンス オリゴヌクレオチドの特定の標的ポリ
ヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、ウ
イルスまたは細菌の完全性または増殖に関係しているウ
イルス性または細菌性タンパク質の合成および／または
毒素の合成を阻害することができる。
「他の疾病」と言及したのは、細胞にとって内生の遺
伝子の発現による疾病状態に関係している。例えば、my
cタンパク質などの細胞転換を引き起こすか、またはそ
れに関与しているタンパク質をコードしているmRNAを、
適切なアンチセンス オリゴヌクレオチドを有する本発
明のポリアミド−オリゴヌクレオチド コンジュゲート
で不活化することができる。
オリゴヌクレオチドの治療学的有効量とは、目的のポ
リヌクレオチドの転写または翻訳をブロックする量であ
る。この量は、目的のポリヌクレオチドの量および／ま
たはその合成速度、コンジュゲートの細胞取込み速度お
よび／またはその安定生、および治療しようとする対象
の体重および年齢に応じて変化するであろう。それぞれ
の場合において、治療学的有効量は診断を行う医師また
は獣医の決定に基づくであろう。
また、オリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲ
ートのポリアミド部分は、オリゴヌクレオチド部分を細
胞性の分解から安定化するように作用することもあるし
［Le Maitre et al.,（1987）,Biochemistry 84,pp.648
−652］。
さらに、オリゴヌクレオチド部分はポリアミドの性質
を高めることもある（例えば、その溶解性を改善するな
ど）。
本発明のさらに別の態様によれば、式:Z−Ｘ−Ｌ［式
中、Ｚは固相マトリックスを表し、ＸはそのＣ−末端で
固相マトリックスに結合したポリアミドを表し、そして
ＬはポリアミドのＮ−末端に結合される第１の反応性
基、およびヌクレオチドの３′ホスフェートと結合する
ことができる第２の反応性基を有する２官能性のリンカ
ーを表す］で示されるポリアミドが提供される。
このポリアミドは本発明のコンジュゲートの合成にお
ける中間体である。オリゴヌクレオチドを、２官能性リ
ンカーＬの第２の反応性基上で直接合成することもでき
る。
本発明のコンジュゲートは、標的試料中の特異的なDN
AまたはRNA配列の検出のためのハイブリダイゼーション
プローブとして重要な用途を有している。オリゴヌクレ
オチドの標的配列への結合を、ポリアミドに結合させた
リポーターグループによって、またはポリアミドに結合
している抗体によって検出する。従って、本発明のコン
ジュゲートは、ウイルス（例えば、AIDSウイルスまたは
肝炎ウイルスなど）の核酸、細菌の核酸、または遺伝的
障害（例えば、筋ジストロフィーまたは嚢性線維症な
ど）に関係しているDNAの検出に用いることができる。
本発明のコンジュゲートを、ニトロセルロース、誘導体
化した紙またはナイロンメンブランなどのマトリックス
に結合させた標的配列へのハイブリダイゼーションに用
いることができる。別法では、本コンジュゲートを組織
片へのその場でのハイブリダイゼーションに用いて
（「ハイブリダイゼーション組織化学」としても知られ
る）、組織片中の標的ポリヌクレオチドを検出すること
ができる。
本発明の別の態様においては、生物学的試料中の特定
のウイルス性、細菌性またはその他のポリヌクレオチド
の存在または非存在を検出するための方法であって、核
酸試料を本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミド コ
ンジュゲート（ここで、コンジュゲートのオリゴヌクレ
オチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相補性であ
る）と接触させ、次いでコンジュゲートのハイブリダイ
ゼーションが起こるかどうかを検出することを特徴とす
る方法が提供される。
生物学的試料は、生物学的液体（血液または血漿な
ど）、細胞（リンパ球など）、または組織バイオプシー
からなっていてよい。試料からの核酸、即ちDNAまたはR
NAは、当分野で自体既知の方法に従って抽出し、そして
コンジュゲートで検出してよい。コンジュゲートはそれ
自体がハイブリダイゼーションの検出用のリポーターグ
ループでラベルされていてもよく、またそれとは異な
り、標的ポリヌクレオチドに結合したコンジュゲート
を、例えば抗体試薬を用いて適切に検出することもでき
る。
本発明のさらに別の態様においては、支持マトリック
スに固定化されたか、または他の方法でそれに結合して
いる特定のポリヌクレオチドを検出するための方法であ
って、支持マトリックスを本発明のオリゴヌクレオチド
−ポリアミド コンジュゲート（ここで、コンジュゲー
トのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの
一部に相補性である）と接触させ、次いでコンジュゲー
トの支持マトリックスへのハイブリダイゼーションを検
出することを特徴とする方法が提供される。
また、本発明の別の態様においては、動物または植物
組織中の特定のポリヌクレオチド群の存在および位置を
測定するための方法であって、 （ａ）被験組織片を調製し； （ｂ）この組織片を本発明のオリゴヌクレオチド−ポリ
アミド コンジュゲート（ここで、コンジュゲートのオ
リゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に
相補相である）とハイブリダイズさせ； （ｃ）組織片からハイブリダイズしていないプローブ物
質を除去し； そして （ｄ）コンジュゲートのハイブリダイゼーションによっ
てラベル化された組織片中の位置を検出するか、または
同定化すること； を特徴とする方法が提供される。
さらに別の本発明の態様においては、目的のポリヌク
レオチドを検出するための診断用キットであって、本発
明のオリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲート
（ここで、コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は
目的のポリヌクレオチドの一部に相補性である）；およ
びコンジュゲートのハイブリダイゼーションを検出する
ための試薬からなるキットが提供される。
そのような診断用キットは組織片調製のための試薬を
さらに含有していてもよい。そのような試薬の例はホル
ムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよび酢酸である。
以下に実施例および図面を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
第１図は、固相ペプチド合成の反応工程を示すもので
ある。
第２図は、オリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジ
ュゲート製造の反応工程を示すものである。
第３図は、変性20％ポリアクリルアミドでの、32Pで
末端ラベルした粗製のKPIB−（AlaLys）５−Ala（レー
ン１）および正常なKPIB（レーン２）の電気泳動分析を
示すものである。
第４図は、ビオチンラベルしたポリアミド−オリゴヌ
クレオチドコンジュゲートを用いるドットブロット ハ
イブリダイゼーションを示すものである。NCはネガティ
ブ対照を示す。
第５図は、雄性マウス顎下腺の６μｍ凍結切片にハイ
ブリダイズするビオチンラベルしたポリアミド−カリク
レイン オリゴヌクレオチドを示すものである。暗い領
域はコンジュゲートのハイブリダイゼーションを示す。
実施例1:試薬の合成 ４−（4,4′−ジメトキシトリチルオキシ）酪酸４−ニ
トロフェニル（1 a） ４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（1.26g;10モル）およ
び4,4′−ジメトキシトリチルクロリド（DMTrCl）（3.3
9g;10mモル）をピリジン（30ml）中で16時間攪拌した。
４−ニトロフェノール（1.30g;10mモル）およびジシク
ロヘキシルカルボジイミド（DCC）（2.06g;10mモル）を
加え、さらに２日間攪拌した。この反応混合物を濾過
し、次いで溶液を濃縮し、25％EtOAc/石油エーテルを用
いてシリカゲル（70g）のフラッシュ・クロマトグラフ
ィーにかけ淡黄色の油状物を得た（5.0g;95％）。
1H NMR（CDCl3）：δ2.04（m,2H,H3）、2.7（t,J＝7.
2Hz,2H,H2）、3.2（t,J＝5.9Hz,2H,H4）、3.77（s,6H,O
CH3）、6.8−7.5（m,15H,ArH）、8.2（d,J＝9.2Hz,2H,P
hNO2m−Ｈ）。
13C NMR（CDCl3）：δ25.2（C3）、31.6（C2）、55.2
（OCH3）、62.0（C4）、86.0（CAr3）、113.1、126.8、
127.1、127.8、127.9、128.1、129.1、130.0、136.2、1
45.0、158.4（DMTr）、122.4、125.1、14.2、155.4（Ph
NO2）、171.1（CO2）。
この生成物は若干のEtOAC溶媒を含んでいた。
４−［（９−フェニル−９−キサンチル）オキシ］酪酸
４−ニトロフェニル（1 b） この化合物は、ピキシルクロリド（PxCl）をジメトキ
シトリチルクロリドの代わりに用いたことを除き、1 a
の合成に用いた方法と同じ方法を用いて合成し、80％の
収率で1 bを得た。
融点:130−130.5℃（EtOAc）。
1H NMR（CDCl3）：δ1.98（m,2H,H3）、2.7（t,J＝7.
3Hz,2H,H2）、3.0（t,J＝5.8Hz,2H,H4）、7.0−7.5（m,
15H,ArH）、8.2（d,J＝7.1Hz,2H,PhNO2m−Ｈ）。
13C NMR（CDCl3）：δ25.0（C3）、31.5（C2）、61.8
（C4）、75.4（CPh3）、116.3、123.2、123.5、126.4、
126.6、127.9、129.1、129.4、148.9、151.3（Px C）、
122.4、125.1、145.2、155.4（PhNO2C）、171.0（C
O2）。
元素分析値（C29H23NO6として）： Ｃ Ｈ Ｎ 計算値：72.3 4.8 2.9 実測値：72.0 4.4 3.2。
３−［６−（4,4′−ジメトキシトリチルオキシ）ヘキ
シルカルバモイル］プロパン酸４−ニトロフェニル
（２） ピリジン（10ml）中の無水コハク酸（1.0g;10mモル）
および６−アミノヘキサノール（1.17g;10mモル）を4d
攪拌した。次いで、DMTrCl（3.39g;10mモル）を加えて
さらに４時間攪拌し、続いてｐ−ニトロフェノール（1.
39g;10mモル）およびDCC（2.06g;10mモル）を加え、こ
の混合物をさらに2d攪拌した。反応混合物を濾過し、溶
液を濃縮し、50％EtOAc/石油エーテルを用いてシリカゲ
ル（100g）のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ淡
黄色の油状物を得た（4.09g;64％）。
1H NMR（CDCl3）：δ1.2−1.7（m,8H,CH2）、2.5（t,
J＝6.5Hz,2H,CH2）、2.93（t,J＝6.5Hz,2H,CH2）、3.01
（t,J＝6.4Hz,2H,CH2）、3.2（t,J＝6.4Hz,2H,CH2）、
3.76（s,6H,OCH3）、6.8−7.5（m,15H,ArH）、8.2（d,J
＝9.2Hz,2H,PHNO2m−Ｈ）。
13C NMR（CDCl3）：δ25.83、26.69、29.53、29.87、
30.55（CH2）、39.68（CH2NHCO）、55.14（OCH3）、63.
16（DMTrOCH2）、85.60（CAr3）、112.91、126.53、12
7.64、127.70、127.79、128.10、129.07、129.95、136.
60、145.32、158.26（DMTrC）、122.4、125.1、145.3
1、155.8（PhNO2C）、170.49、170.75（Ｃ＝Ｏ）。
この化合物は容易に除去することができないEtOAc溶
媒を若干含んでいた。
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミノヘキ
サン酸ペンタフルオロフェニル（FmocAhaOPfp;3） ６−アミノヘキサン酸（2.62g;20mモル）およびNa2CO
3（5.30g:50モル）をH2O（60ml）に溶解し、次いでジオ
キサン（25ml）を加え、続いてＮ−（フルオレニルメト
キシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Fmoc−NHS）
（6.75g;20モル）を加えた。この混合物を16時間激しく
攪拌した。次いで、この濁った反応混合物をH2O（1.2
l）に注ぎ、透明な溶液を得た。この溶液をEtOAc（２×
300ml）で抽出し、水層を濃HCl（約10ml）でpH3まで酸
性化して多量の沈澱を得た。これを16時間、４℃に保
ち、次いで濾過して6.05g（86％）のFmocAhaOHを得た。
DMF（8ml）中のFmocAhaOH（1.77g;5mモル）およびペ
ンタフルオロフェノール（Pfp;1.01g;5.5mモル）の溶液
に、DMF（2ml）中のDCC（1.03g;5mモル）の溶液を加え
た。この溶液を16時間攪拌し、濾過し、濾液を真空下で
蒸発乾固させて粗製のエステルを得、これを95％EtOH/1
％AcOH（約10ml）から再結晶して2.41g（93％）の白色
針状結晶を得た。
融点:128−129℃。
1H NMR（CDCl3）：δ1.4−1.8（m,6H,CH2）、2.7（t,
J＝7.2Hz,2H,CH2CO2）、3.2（m,2H,NHCH ２）、4.2（5,J
＝6.7Hz,1H,Fmoc CH）、4.4（d,J＝6.8Hz,2H,Fmoc C
H2）、7.3−7.8（m,8H,Fmoc ArH）。
13C NMR（CDCl3）：δ24.36（C4）、25.93（C3）、2
9.62（C5）、33.18（C2）、40.73（C6）、47.31（Fmoc
C）、66.54（Fmoc CH2）、119.98、125.00、127.02、12
7.67（Fmoc芳香族CH）、141.34、143.99（Fmoc芳香族
Ｃ）、156.46（Fmoc C＝Ｏ）、169.36（エステル C
O2）。
元素分析値（C27H11NO4F5として）： Ｃ Ｈ Ｎ 計算値：63.8 2.2 2.8 実測値：63.9 1.8 3.2。
Ｎ−（Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミ
ノヘキサノイル）−６−アミノヘキサン酸（FmocAha2O
H;6） DMF（8ml）中のFmocAhaOH（上記のようにして調製;1.
77g;5mモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（0.
575g;5mモル）の溶液に、DMF（2ml）中にDCC（1.03g;5m
モル）の溶液を加えた。これを16時間攪拌し、濾過し、
そして濾液を真空下で蒸発させてシロップを得た。これ
をイソプロパノール（〜10ml）から再結晶して1.94g（8
6％）の５を得た。
ジオキサン（10ml）中の５（0.912g;2mモル）の溶液
に、H2O（10ml）中の６−アミノヘキサン酸（0.524g;4m
モル）およびNa2CO3（0.424g;4mモル）を滴下した。得
られた懸濁液を48時間激しく攪拌し、次いでH2O（100m
l）中に注ぎ、透明な溶液を得た。この激しく攪拌して
いる溶液のpHを1M KHSO4（10ml）の滴下によって３まで
下げた。多量の沈澱が生成し、これを24時間、４℃に保
ち、次いで濾過して定量的収率の酸を得た。この粗製の
生成物をEtOAcから再結晶して0.679g（73％）の白色粉
末を得た。
融点:106.5−107℃。
1H NMR（CD3OD）：δ1.3−1.7（m,12H,内部CH2）、2.
1（t,J＝7.4Hz,2H,CH2CONH）、2.3（t,J＝7.3Hz,2H,CH2
CO2H）、3.0−3.2（m,4H,FmocNHCH2およびCH2CONHC
H2）、4.2（t,J＝6.8Hz,1H,FmocCH）、4.3（d,J＝6.8H
z,2H,Fmoc CH2）、7.2−7.8（m,8H,Fmoc ArH）。
元素分析値（C27H34N2O5として）： Ｃ Ｈ Ｎ 計算値：69.5 7.4 6.0 実測値：69.2 7.3 5.8。
Ｎ−（Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミ
ノヘキサノイル）アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェ
ニル（FmocAha2OPfp;4） DMF（1ml）中の６（233mg;0.5mモル）およびペンタフ
ルオロフェノール（101mg;0.55mモル）の溶液に、DCC
（103mg;0.5mモル）を加えた。これを2d攪拌し、次いで
濾過した。濾液を真空下で蒸発させてクリーム状の固体
とし、これを95％ETOH/1％AcOH（1ml）から再結晶して1
80mg（57％）の純粋な４を得た。
融点:126−127℃。
Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸
ペンタフルオロフェニル（８） EtOAc（50ml）中のＮ−Boc−６−アミノヘキサン酸
（4.78g;20.8mモル）およびペンタフルオロフェノール
（3.68g;20mモル）の溶液にDCC（4.12g;20mモル）を加
えた。これを16時間攪拌し、次いで濾過し、濾液を真空
下で蒸発させてシロップにした。これを放置しておくと
結晶化して7.46g（94％）のエステルが得られた。イソ
プロパノール/1％酢酸から再結晶して6.26gの白色針状
結晶を得た。
融点:81−83℃。
1H NMR（CDCl3）：δ1.4−1.6（m,15H,Boc CH3および
内部CH2）、1.8（m,2H,CH 2CH2CO2）、2.67（5,J＝7.3H
z,2H,CH2CO2）、3.1（m,2H,NHCH ２）、4.5（b,1H,N
H）。
13C NMR（CDCl3）：δ24.38（C4）、26.00（C3）、2
8.39（Boc CH3）、29.70（C5）、33.20（C2）、40.28
（C6）、79（Boc C）、156（Boc C＝Ｏ）、169（C1）。
元素分析値（C17H20NO4F5として）： Ｃ Ｈ Ｎ 計算値：51.4 5.1 3.5 実測値：51.5 5.0 3.4。
Ｎ−（Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−６−アミノヘキ
サノイル）−６−アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェ
ニル（BocAha2OPfp;9） 1M NaOH（5ml;5mモル）およびH2O（5ml）中の６−ア
ミノヘキサン酸（1.31g;10mモル）の溶液に、ジオキサ
ン（10ml）中の８（1.99g;5mモル）の溶液を加えた。得
られた微細な懸濁液を激しく3d攪拌すると透明になっ
た。この溶液をH2O（200ml）に加え、1MのKHSO4（約10m
l）の滴下によってそのpHを3.5まで下げ、得られた溶液
をEtOAc（3x100ml）で抽出し、乾燥し（Na2CO4）、そし
て真空下で3mlになるまで濃縮した。次いで、さらにEtO
Ac（10ml）を加え、続いてDCC（1.03g;5mモル）を加え
た。これを16時間攪拌し、濾過し、濾液を真空下で蒸発
乾固し、生成物を１％AcOH含有のEtOH/H2O（約10ml）か
ら再結晶して1.75g（67％）の白色針状結晶を得た。
融点:88−89℃ 1H NMR（CDCl3）：δ1.3−1.9（m,2H,CH2およびBoc C
H3）、2.2（t,J＝7.5Hz,2H,CH 2CONH）、2.7（t,J＝7.3H
z,2H,CH2CO2）、3.1（m,2H,Boc NHCH ２）、3.3（m,2H,C
ONHCH ２）、4.6（bs,1H,Boc NH）、5.6（bs,1H,CON
H）。
13C NMR（CDCl3）：δ24.35、25.31、26.10、26.41、
29.31、29.83、33.17、36.62、39.14、40.35（CH2）、2
8.44（Boc CH3）、79.12（Boc中心Ｃ）、156.05（Boc C
＝Ｏ）、169.39（エステルＣ＝Ｏ）、172.84（アミドＣ
＝Ｏ）。
元素分析値（C23H31N2O5F5として）： Ｃ Ｈ Ｎ 計算値：54.1 6.1 5.5 実測値：53.9 5.9 5.8。
ジイソブチリル−５（および６）−カルボキシフルオレ
セイン，ペンタフルオロフェニル エステル（７） 無水トリメリト酸（9.6g;0.05モル）およびレゾルシ
ノール（11g;0.11モル）を十分に混合し、190℃の油浴
に１時間入れた。次いで、温度を210℃まで上げ、その
温度に５分間保つと、溶融物が暗赤色の固体に固化し
た。次に、これを冷却し、DMF（50ml）に溶解した。こ
の溶液にピリジン（100ml）および塩化イソブチリル（1
5.4ml;0.15モル）を加え、これを24時間攪拌した。濾過
した後、得られた濃厚なシロップをEtOAc（40ml）に再
溶解し、1MH2SO4（2x300ml）およびH2O（1x300ml）で洗
浄し、乾燥し（Na2SO4）、そしてもう一度濃縮してシロ
ップにした。これをCH2Cl2に再溶解し、シリカゲルカラ
ム（170g）のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ、
最初はCH2Cl2（800ml）で、次いで２％MeOH/CH2Cl2で溶
離した。生成物を含む分画を集め、溶媒を真空下で除去
すると12.45g（48％）の粗製のジイソブチリル−５（お
よび６）−カルボキシフルオレセインが得られた。
この物質（5.77g;11mモル）およびペンタフルオロフ
ェノール（2.32g;21.1mモル）を1/1のEtOAc/CH2Cl2（12
5ml）に溶解した。この溶液を４℃まで冷却し、DCC（2.
5g;12.1mモル）を滴下した。これを２時間攪拌し、次い
で濾過し、溶媒を真空下で除去して油状物を得、これを
一晩、−20℃にして固化させた。これをCH2Cl2（50ml）
に再溶解し、シリカゲル（150g）のフラッシュ・クロマ
トグラフィーにかけ、CH2Cl2で溶離した。生成物を含む
分画を集め、溶媒を真空下で除去し、生成物を95％EtOH
/2％酢酸から再結晶すると3.68g（59％）の白色針状結
晶が得られた。
融点:184−188℃。
tlc（CH2Cl2）にかけると、この物質は、２つの異性体
に対応するRf0.58および0.63の２つの近接して移動する
スポットを与えた。
1H NMR（CDCl3）：δ1.31（d,J＝6.9Hz,12H,CH3）、
2.8（septet,J＝7.0Hz,2H,CH（CH3）２）、6.83（s,1H,
H1′およびH2′）、7.11（s,2H,H4′）、7.38（d,J＝8.
0Hz,0.5H,5−異性体のH7）、7.96（s,0.5H,6−異性体の
H7）、8.20（d,J＝8.0Hz,0.5H,5−異性体のH6）、8.5
（m,1H,6−異性体のH4およびH5）、8.87（s,0.5H,5−異
性体のH4）。
13C NMR（CDCl3）：δ18.82、34.18、82.11、82.24、
110.61、115.07、115.11、118.00、125.01、125.89、12
6.36、127.05、128.08、128.71、129.28、130.92、132.
23、133.30、136.32、137.05、138.2、139.62、141.8、
142.84、151.46、151.51、152.66、153.41、158.21、16
1.06、167.50、174.94。
元素分析値（C35H23F5O9として）： Ｃ Ｈ 計算値：61.6 3.4 実測値：61.5 3.0。
この物質は分析的に純粋であり、フルオレセインラベ
ル化実験で用いる物質なので、これを用いてカルボキシ
フルオレセイン（CF）のスペクトル特性を測定した。0.
1M NH4OAc（pH9.0）中の７の１μＭ溶液を3dの間放置し
て７をCF核に分解し、スペクトルの測定を行った。495
および496nmでのこの溶液の消衰係数75000M-1であり、2
60nmでは23000M-1であった。260nmでの同じ溶液中の放
出ペンタフルオロフェノキシドの消衰係数は極めて低く
（170M-1）、上記の吸収係数の誤差範囲内であったの
で、考慮に入れなかった。また、この溶液をフルオレセ
イン含有のポリアミド−オリゴヌクレオチド ハイブリ
ッドの蛍光収率のための標準対照として用いた。
1Hおよび13H NMRスペクトルは、内部対照としてテト
ラメチルシランを用い、それぞれ300および75MHzのBruk
er AM300で記録した。ジメチルホルムアミド（DMF）を
減圧下で蒸留し、１〜２日以内に用いた。ピリジンは水
酸化カリウムから蒸溜し、5Aのモレキュラー・シーブ上
で保存した。融点は、Electrothermal Melting Point A
pparatusを用い、一方が開いたキャピラリー中で測定し
た。フラッシュ・クロマトグラフィーはMerck Kieselge
l＃9385を用いて行った。
実施例2: ペプチド合成 Fmoc（フルオレニルメトキシカルボニル）ペプチド合
成法を用いて、複数のリジン残基（後に、非−放射活性
ラベルの結合部位として用いることができる）およびア
ラニン残基（リジン残基の間のスペーサーとして働く）
を含有するペプチドを合成した。このペプチドは配列
（AlaLys）5Alaを有している。調整された多孔ガラス
（CPG）をペプチド合成のための固体支持マトリックス
として用いた（この支持体はペプチド合成には普通では
ないが、オリゴヌクレオチド合成に選択した支持体であ
るので）。
第１図に示すように、アミノプロピルCPG（AP−CPG）
を誘導体化して、この固体支持マトリックスに結合した
遊離のヒドロキシ基を得た。AP−CPG（Fluka、孔の大き
さ500A、0.5g、20μモルのアミノ基）に、ジメチルホル
ムアミド（DMF）（2ml）中のジメチルアミノピリジン
（DMAP）（30.5mg;250μモル）およびα，ω−ヒドロキ
シカルボン酸誘導体1a、1bまたは２（250μモル）を加
えた。これを３時間振盪するか、または16時間放置し
た。次いで、このCPGを洗浄し、そして乾燥した。官能
基化の程度を、少量のCPGの酸処理によって放出される
ジメトキシトリチル（λ＝507nm、ε＝66500M-1）また
はピキシル（λ＝445nm、ε＝4770M-1）の分光光度検定
により定量する。次いで、残存のアミノ基（約10〜20
％）を、ピリジン（2ml）中で15分間、CPGを無水酢酸
（Ac2O）（0.5ml;2.5mモル）およびDMAP（50mg;0.4mモ
ル）で処理することによってアセチル化する。残存する
有意なアミノ基は検出されなかった。次いで、CPGをCH2
Cl3中の３％ジクロロ酢酸（2x5分）で処理し、CH2Cl2で
洗浄した。
別法では、γ−ブチロラクトンを用いてCPGを誘導体
化した。この場合、CPG（0.5秒）およびγ−ブチロラク
トン（3ml）を７日間、60℃のオーブン中に置いた。
次に、この修飾した固体支持体をペプチド合成に用い
た。最初のアミノ酸を結合させるために（エステル結合
の生成）、高濃度の活性アミノ酸を用いた。即ち、誘導
体化したCPG（100mg;2.7μモルのヒドロキシ官能基を含
む）を、DMF（2ml）中のＮ−BOC−アラニン対称無水物
およびDMAP（それぞれ0.2M）の溶液と20時間反応させ
た。上述のようにAc2O/DMAPを用いて残存のヒドロキシ
基をアセチル化し、アラニンを脱保護して遊離のアミノ
基を得た（25μモル/g）。90％トリフルオロ酢酸（TF
A）/H2Oで処理し（30分）、続いて洗浄し（CH2Cl2）、
中和し（20％トリエチルアミン/CH2Cl2）、洗浄し（CH2
Cl2）、そして乾燥することによって最初のアミノ酸か
らBoc基を除去した。次いで、DMF中、４倍モル過剰のFm
oc−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルおよび１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を用い、通常
のFmocの化学を用いて、手動のCRBペプチド合成機でさ
らにペプチド合成を行った。簡単に言うと、CPG基質
を、HOBtの存在下で30分間、DMF（2ml）中でＮ−α−FM
OC−Ｎ−ε−BOC−Lysペンタフルオロフェニルエステル
と反応させた。この反応はニンヒドリン検定によると定
量的であった。次いで、FMOC基をDMF中の20％ピペリジ
ン（1x3分、1x7分）で除去した。リジン残基とアラニン
（FMOC−Alaペンタフルオロフェニルエステルを用い
る）を交互に変え、同じ方法で次の結合を行って（AlaL
ys）5Alaを合成した。
実施例3: オリゴヌクレオチド−ペプチド コンジュゲートの合成 実施例２に従って合成したペプチドをオリゴヌクレオ
チド合成の出発原料として用いた。
ペプチドの末端アミノ基を20％ピペリジン/DMAで脱保
護し、CPGをDMF（0.5ml）中で16時間、α，ω−ヒドロ
キシカルボン酸リンカー1a、1bまたは２（0.2mモル）お
よび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.2mモル）と
反応させた（第２図参照）。残存するアミノ基をアセチ
ル化し、このCPGを、Applied Biosystems 380A自動DNA
合成機によるDNA合成に用いた。
別法では、γ−ブチロラクトンを1a、1bまたは２の代
わりにリンカーとして用いた。この場合には、CPG（100
mg）を60℃で７日間、γ−ブチロラクトン（2ml）と反
応させた。
DMTrまたはPx保護基をリンカー基から除去し、メチル
N,N−ジイソプロピルヌクレオチド ホスホルアミダイ
ト（BeaucageおよびCaruthers;上記）を用いてオリゴヌ
クレオチド合成を始めた。簡単に説明すると、ホスホル
アミダイトを乾燥アセトニトリル中の0.1M溶液とし、0.
5Mテトラゾールの存在下で結合させる。これに続いて、
未反応のヒドロキシ基のアセチル化（Ac2O/DMAP）、ホ
スファイトトリエステルのホスフェートへの酸化（I2/H
2O）、次のヌクレオシドホスホルアミダイトの結合の前
の脱トリチル化（DCl/CH2Cl2）を行う。最初のホスホル
アミダイトを末端の脂肪族ヒドロキシ基に結合させた。
オリゴヌクレオチドの合成を設け、マウスのカリクレイ
ンをコードしているmRNAの一部に相補性である30merの
オリゴデオキシリボヌクレオチドｄ（GGGCTTCACAACATCT
GTGATGTCAGCAGG）（KPIB）をこの固体支持体上で合成し
た。トリチル検定による平均の結合収率は99％を越えて
いた。
コンジュゲートを脱保護するため、固体支持体を自動
合成機から取り、PhSH/Et2N/CH3CN 1:1:2で２時間処理
してホスホトリエステル上のメチル保護基を除去した。
リジン残基上のBOC保護基（および５′−DMTr基も）
は、90％トリフルオロ酢酸/10％エタンジチオールによ
る５分間の処理、それに続く20％Et3N/CH2Cl2による中
和によって除去した。次いで、Ｃ−末端アミノ酸を固体
支持体に結合させているエステル基を濃NH3水溶液で切
断し（４時間）、この溶液を55℃でさらに16時間加熱し
てヌクレオシドのアミノ保護基を除去した。
第３図は、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる［γ−
32］−ATPによる粗製の生成物の５′−32P末端ラベル
化、および7M尿素を含む20％ポリアクリルアミドゲルで
の電気泳動の後に得られるパターンを示すものである。
オリゴヌクレオチド−ペプチド ハイブリッドは通常の
KPIBよりも遅く移動し、生成混合物の主成分である。未
ラベルの反応後を移動させ、UVで陰をつけることによっ
てDNAをゲル上で可視化したときに同様のパターンが観
察される。純粋なハイブリッド生成物は、10％ゲルでの
プレパラティブゲル電気泳動によって、またはHPLCによ
って得た。
生成物のアミノ酸分析は6Ala:5Lysの予想比を与え、
１モルのKPIBあたりに１モルの（AlaLys）5Alaポリアミ
ドを有していた。この生成物はヘビ毒ホスホジエステラ
ーゼに対して耐性であり（３′−末端をブロック）、脾
ホスホジエステラーゼによって一部だけが消化された
（５′−末端から10ヌクレオチド）（消化物のHPLC分析
によって評価）。３′−末端の正に荷電したポリアミド
の存在は分子のこの領域のホスホジエステラーゼ消化を
阻害するようである。P1ヌクレアーゼはこのコンジュゲ
ートをその成分であるヌクレオシドおよびヌクレオチド
に消化した。
DNA合成は、常法［Beaucage and Caruthers,（198
1）,Tetrahedron Lett.,22,pp.1859−1862］に従い、メ
チルおよびシアノエチルの両保護ヌクレオシドホスホル
アミダイトを用いて行った。これらの合成法において
は、それぞれのヌクレオシドホスホルアミダイトを支持
マトリックスに付加した後に、DMAP/Ac2Oによる60〜120
秒のキャッピング（capping）工程を用いた。
アミノ酸分析はBeckman System 6300アミノ酸分析機
で行った。蛍光分光光度計による測定はPerkin−Elmer
LS−５ ルミネセンス光度計で行った。HPLCはVydac C
18 5μ 25cmx4.6mmカラムを用い、Altexシステムで行っ
た。用いた緩衝液は、A:0.1M酢酸トリエチルアンモニウ
（pH7.0）、およびB:45％CH3CN含有の0.1M酢酸トリエチ
ルアンモニウ（pH7.0）であった。
実施例4: 合成アミノ酸を含むポリアミドの合成 非−ペプチドアミノ酸の使用は、ポリアミドの分子構
造の設計に尚一層の柔軟性を導入する。あらゆるα，ω
−アミノカルボン酸を天然アミノ酸の間のスペーサーと
して働かせることができる。容易に入手することができ
る６−アミノヘキサン酸（HAhaOH）を標準的な単位とし
て選択するが、その他のあらゆる類似のアミノカルボン
酸を用いることもできる。始めに、Ｎ−Fmocペンタフル
オロフェニル活性エステル誘導体３および４を合成し、
通常のFmocペプチド合成法において用いた。ダイマー４
は、モノマー５および６−アミノヘキサン酸から好収率
で調製することができる。また、酸６は、BOP［ベンゾ
トリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルア
ミノ）−ホスホニウム ヘキサフルオロボレート］法
（Castro;上記）を用いて固相合成において直接用い
た。この合成においては、４倍モル過剰の６、BOP試
薬、Ｎ−メチルモルホリンおよびHOBtをDTF中で用い
た。この方法は、活性エステルを調製することなくこの
スペーサーを導入する極めて効率的な方法であることが
わかった。
オリゴヌクレオチド部分から十分に離れた１個の１級
脂肪族アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成を説明
するために、４当量のＮ−Fmocアミノ酸活性エステル４
を用いたこと以外は実施例２に記載の方法を用い、そし
てオリゴヌクレオチドからの隔離のために活性エステル
４の２つのカップリングを用いて、ポリアミドAha4Lys
（Boc）Alaを合成した。次いで、実施例３の方法に従っ
てリンカー２を付加した後、マウスカリクレインmRNA
（KPIB）の一部に相補性である30merのオリゴヌクレオ
チドを合成した。このコンジュゲートを上記のようにし
て脱保護した。別の方法においては、Boc化学をポリア
ミドの合成に用いた。我々はリジン誘導体としてα−Bo
c−ε−FmocLysOPfp（または、BOP法による対応するカ
ルボン酸）を、そしてスペーサーとしてBocAha2OPfpを
用いた。４倍モル過剰の活性アミノ酸およびHOBtをDMF
中で0.5時間用いた。保護されたポリアミド−オリゴヌ
クレオチド ハイブリッドを通常のオリゴヌクレオチド
と全く同じ方法で脱保護し、上記と同一の産物を得た。
この場合、リジン残基上のFmoc保護基はアンモニア脱保
護工程の間に切断される。
また、このFmoc法を用いて10個のリジン残基を含むも
っと長いポリアミドを合成した。これはAla（LysAha4）
9LysAlaであり、手動のペプチド合成機を用い、Aha4Lys
Alaと同じ方法（Fmoc法）で合成した。この基質上でのK
PIBの合成に続く通常の脱保護プロトコール（実施例３
を参照）により、PAGE分析でKPIBよりもゆっくり移動す
る主バンドを与える産物が得られた。このバンドのPAGE
精製によって良好なアミノ酸分析結果を有する産物が得
られた。
実施例5: ラベルされたコンジュゲートの製造 ４種類の別の段階でリポーターグループを導入した：
即ち、（Ｉ）ポリアミド合成の後；（II）連結シンソン
の付加の後；（III）オリゴヌクレオチド合成の後；お
よび（IV）ハイブリッドの脱保護および精製の後であ
る。
（Ｉ）リジン側鎖上のBoc保護基の除去の後、この段階
でビオチンおよびフルオレセイン シンソンを結合させ
た。ビオチンは、DMF中のビオチン、BOP試薬、HOBtおよ
びＮ−メチルモルホリンのそれぞれ0.2M溶液を用いて30
分間結合させた。また、この結合は、それぞれのLys（B
oc）残基を付加した後のポリアミド合成の間に行うこと
もできる。別法では、ビオチンを例えばスクシンイミド
エステルなどの活性エステルとして付加することができ
る。フルオレセインは、この段階で、DMF中の７およびH
OBtの0.3M溶液との3dの反応によって結合させた。残存
するアミノ基はアセチル化した。後に行うピペリジン処
理はフルオレセイン上のイソブチリル保護基を除去する
ので、ピリジン中のDMAP/無水イソ酢酸で16時間再アシ
ル化した。
（II）リジン側鎖の保護基がFmocであり、ポリアミド合
成にBoc法を用いたときには、この段階でラベルの結合
を行うことができる。ε−Fmoc基の除去の後に、ビオチ
ンまたはフルオレセインを段階（Ｉ）での方法と同じ方
法で付加する。
（III）リジン側鎖のBoc保護基を上記のように除去（ハ
イブリッドの脱保護）、ラベルを結合させた。DMF（0.5
ml）中のビオチン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル活
性エステル（20当量）およびHOBt（20当量）との16時間
の反応によってビオチンを付加する。フルオレセインは
段階（Ｉ）でのようにして付加するが、フルオレセイン
の再アシル化は必要ではない。
（IV）常法によって１個のリジンを含有しているハイブ
リッドにビオチンを付加した。フルオレセインはフルオ
レセインイソチオシアネート（FITC）を用いて付加する
こともできる。
実施例6: オリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲートへの
蛍光団のコンジュゲート 下式で示される完全に保護されたオリゴヌクレオチド
−ポリアミド コンジュゲート： CPG−SL−Ala］Lys（Boc）Aha］9Lys（Boc）Ala−SL−K
PIB ［式中、Ahaは６−アミノヘキサン酸残基 であり、SLはリンカー1a、1bおよびから導かれる結合で
あり、そしてKPIBはその配列を上に示したオリゴヌクレ
オチドである］を実施例４に従い、30mgのCPGで合成し
た。始めに、Lys側鎖のBoc保護基を除去するため、コン
ジュゲートを90％トリフルオロ酢酸/10％エタンジチオ
ールで５分間処理し、次いで20％トリエチルアミン/CH2
Cl2で処理して生成した１級アミノ基を中和した。次い
で、このコンジュゲートを、DMF（0.5ml）中で３日間、
40倍過剰のジイソブチリルカボキシ フルオレセイン
ペンタフルオロフェニル エステル（107mg）および１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール（26mg）と反応させ
た。次に、このラベルされた化合物を脱保護した。ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけると、このラベルさ
れた化合物はキシレンシアノール染料と同じ位置に移動
する強い蛍光バンドを与えた。このバンドを切り出し、
精製してフルオレセインラベルされたオリゴヌクレオチ
ド−ポリアミド コンジュゲートを得た。
また、コンジュゲートCPG−SL−AlaLys（Boc）Aha4−
SL−KPIBを実施例４の方法に従って合成し、実施例５の
段階３に従ってフルオレセインでラベルした。次いで、
このラベルしたコンジュレートを当分野で自体既知の方
法に従いゲル電気泳動によって精製した。
実施例7: コンジュゲートの精製 ラベルした、およびラベルしていないハイブリッドの
ほとんどの精製は、10％ゲルを用いるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（PAGE）によって行った。Bocの化学に
よって調製した１個のリジンを含有するハイブリッドの
精製はVydac C18カラムによる逆相HPLCで行うのが好都
合であるが、これは、このハイブリッドの５′−DMTr基
が無傷であるためである。このDMTr含有のハイブリッド
を始めに次の条件を用いて精製した:33.3％のＢでイソ
クラティックに20分間、次いで66.6％のＢまでの勾配で
30分間。DMTr−KPIB−SL−Aha4LysAlaは44.0分で溶出す
る。溶出物の脱トリチル化（等容量の酢酸、15分）およ
び０〜66.6％のＢの勾配で30分間の再クロマトグラフィ
ーにより、26.0分で溶出する純粋な生成物が得られた。
フルオレセイン含有のハイブリッドを、H2O中でSephade
x G−25 Fine（2g）のカラムに通すことによって部分的
に精製し、すべての遊離のフルオレセインおよびその他
の低分子量の物質を主に除去することもできる。ボイド
ボリュームで溶出する高分子量の分画（0.5ml）を集
め、H2Oに対して徹底的に透析した。
実施例8: 標的配列へのコンジュゲートのハイブリダイゼーション 以下のビオチン化したコンジュゲートを実施例６の方
法に従って調製した： A.KPIB−LL−Aha4Lys（ビオチン）Ala（段階IVでラベ
ル） B.KPIB−SL−［Aha2Lys（ビオチン）］Ala（段階II） C.KPIB−SL−［AhaLys（ビオチン）］10Ala（段階III） D.KPIB−SL−［Aha2Lys（ビオチン）］10Al（段階III） ［ここで、LLおよびSLはそれぞれリンカー２および１か
ら導かれる連結を表す］。
第４図は、コンジュゲートＡ〜Ｄ（レーンＡ〜Ｄに対
応）を用いて、マウスのカリクレインcDNA挿入体を含む
pUCプラスミドを含有するドットプロットにハイブリダ
イズさせたときに得られる結果を示すものである。この
ドットブロットは、1kbのマウス腎カリクレインcDNA挿
入体を含有し、pUCから導かれる3.7kgプラスミドを含有
していた。ネガティブ対照（NC）は、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）構造遺伝子を
継ぎ合わせたメタロチオネインIIA遺伝子プロモーター
を含有する類似のpUCプラスミドであった。このニトロ
セルロースフィルターを、42℃で6.5時間、ハイブリダ
イゼーション緩衝液［0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナト
リウム、25mM NaH2PO4、25mMNa2HPO4、10mMピロリン酸
四ナトリウム、0.1mMアデノシン三リン酸二ナトリウ
ム、25mg/lサケ精子DNA、0.01％、w/v Ficoll、0.01％
ポリビニルピロリドン、0.01％ウシ血清アルブミン、
20％ホルムアミド］（10ml）中でプレハイブリダイズさ
せ、次いでプローブ（100ng）を加え、これを42℃で一
晩ハイブリダイズさせた。次いで、このフィルターを、
0.2xSSC［0.03M NaCl、0.003Mクエン酸ナトリウム］
中、42℃で４回（それぞれ10分間）洗浄した。BRL（Bet
hesda Research Labs）BluGENEキット（ビオチンに結合
するストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ コ
ンジュゲートを使用）、およびそれに続く現像反応［酵
素が基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（NBT）およ
び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェー
ト（BCIP）に作用して不溶性の染料沈澱を生成する］に
よってシグナルを検出した。
段階（IV）（レーンＡ）または段階（II）（レーン
Ｂ）のどちらかでビオチンを結合させたハイブリッドの
間には、シグナルの有意の差が存在しないことが明らか
である。これは、オリゴヌクレオチド合成の条件が、ス
トレプトアジピン コンジュゲートに結合することがで
きなくなるようにはビオチン残基に悪影響を及ぼさない
ことを示すものである。さらに、段階（III）で導入し
た10個のビオチン残基を含有するハイブリッド（レーＣ
およびＤ）は、１個のラベルのハイブリッドのシグナル
よりも約10倍強いシグナルを与える。ラベル間に１個を
Ahaスペーサー（レーンＣ）または２個のAhaスペーサー
（レーンＤ）を有する複数ラベルのハイブリッドのスト
レプトアジン結合親和性には有意差は存在しないようで
ある。従って、ビオチン残基の相対的な近接度は、スト
レプトアビジン−アルカリホスファターゼ コンプレッ
クスが有意な程度にビオチン残基に結合する能力に影響
を及ぼさないようである。ネガティブ対照（NC）（無関
係の挿入体を有するpUC）を考慮に入れると、このドッ
トブロット法による１個のラベルのプローブの感受性は
0.5ng（220aモル）であり、複数ラベルのプローブは0.0
5ng（22aモル）である。
また、これらのビオチン化したプローブを用いて組織
片にハイブリダイズさせた。
ハイブリダイゼイションの組織化学分析はCoghlan,J.
P.等［Anal.Biochem.,149,pp.1−28（1985）］の方法に
従って行った。簡単に説明すると、６μｍの当接切片を
0.1Mリン酸塩（pH7.2）中で５分間、４％ホルムアルデ
ヒドで固定し、10分間プレハイブリダイズさせた［50mM
リン酸ナトリウム（pH7.0）、5.0mM EDTA、0.02％
ficoll、0.02％ウシ血清アルブミン、0.02％ポリビニル
ピロリドン、および0.01％ニシン精子DNA中で］。次い
で、ラベルされたコンジュゲートを0.8ng/uの濃度で
加えた。ハイブリダイゼイションを40℃で３日間行っ
た。次に、この切片（顕微鏡スライドガラスに付着させ
た）を、4xSSC［保存溶液x20は、蒸留水中の3M塩化ナト
リウム、0.3Mクエン酸ナトリウム］中ですすいだ。次い
で、コンジュゲートのハイブリダイゼイションを光学顕
微鏡下で発色させて可視化した。
10個のビオチン残基を含むプローブＤを用いて、マウ
ス顎下腺の６μｍ切片中のカリクレインmRNAを検出し
た。第５図に示すように、プローブＤは、顎下腺の複雑
な細管に一致する、マウスカリクレイン遺伝子の大部分
の発現部位である腺の別個の領域を強くラベルした（光
学顕微鏡で検出）。
実施例9: 反応性の３′ヒドロキシ基を有するポリアミド−オリゴ
ヌクレオチド コンジュゲートの合成 式： ［式中、Ｒはアルキルまたは置換アルキルである］ で示されるウリジン誘導体を、本出願人の同時係属豪州
出願No.PI2666/87の方法に従って合成することができ
る。
次いで、このような化合物を、 （ここにスペーサー、例えばポリアミドが存在していて
もよい） とDCCの存在下で反応させて、 を得ることができる。
次いで、延長ポリアミドをＣ−５アーム上で合成する
ことができ、これに続いてオリゴヌクレオチドをヌクレ
オシドの５′−ヒドロキシ基上で合成することができ
る。
これらのウリジン誘導体類は、３′OHへの延長が必要
とされる状況下で、例えばDNAの配列決定において有用
である。そのような状況下において、ヌルケオシドをCP
Gに結合させているエステル基を都合よく切断すること
ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０８Ｇ 69/08 ＮＲＨ Ｇ０１Ｎ 33/53 69/42 ＮＳＮ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＤＺ (72)発明者 トリーギアー，ジェフリー・ウィリアム オーストラリア国、ビクトリア3122、ホ ーソーン、ホーソーン・グローブ 62番 (56)参考文献 特開 昭59−204200（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−148798（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−8396（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−501488（ＪＰ，Ａ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： Ｘ−Ｌ−Ｙ ［式中、Ｘはアミノ酸からなるポリアミドであり、 Ｙはデオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオ
    チドであり、そしてＬは以下の式で示され、かつヌクレ
    オチドの３′ホスフェート基と結合を形成するリンカー
    である： （式中、Ｒは、所望により−CO−および／または−NH−
    で遮断されたC2〜C10アルキレンである）］ で示されるコンジュゲート。
  2. 【請求項２】Ｌが、式： −CO（CH2）2CONH（CH2）6O− で示される基である請求項１記載のコンジュゲート。
  3. 【請求項３】Ｌが、式： −CO（CH2）3O− で示される基である請求項１記載のコンジュゲート。
  4. 【請求項４】ポリアミドＸが天然アミノ酸で構成されて
    いるペプチドである請求項１記載のコンジュゲート。
  5. 【請求項５】ポリアミドが合成α，ωアミノカルボン
    酸、または天然アミノ酸と合成α，ωアミノカルボン酸
    の組合せで構成されている請求項１記載のコンジュゲー
    ト。
  6. 【請求項６】ポリアミドが１またはそれ以上のリポータ
    ーグループを含んでいる前記請求項のいずれかに記載の
    コンジュゲート。
  7. 【請求項７】リポーターグループが蛍光団、ビオチン、
    酵素、またはコロイド状化合物から選ばれる請求項６記
    載のコンジュゲート。
  8. 【請求項８】リポーターグループがフルオレセイン、テ
    トラメチルローダン、テキサス・レッド、クマリン、炭
    酸脱水酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダー
    ゼ、テヒドロゲナーゼ、および／またはコロイド状の金
    または銀から選ばれる請求項７記載のコンジュゲート。
  9. 【請求項９】ポリアミドが抗原性であり、それに結合す
    る抗体によって検出することができる請求項１〜５のい
    ずれかに記載のコンジュゲート。
  10. 【請求項１０】式： Ｚ−Ｘ−Ｌ ［式中、Ｚは固相マトリックスを表し、 Ｘは該固相マトリックスにそのＣ−末端で結合している
    アミノ酸からなるポリアミドを表し、そして Ｌは以下の式で示されるリンカーを表す： （式中、Ｒは、所望により−CO−および／または−NH−
    で遮断されたC2〜C10アルキレンであり、Ｒ″はヌクレ
    オチドの３′ホスフェートと結合を形成し得る反応性基
    である）］ で示されるポリアミド。
  11. 【請求項１１】請求項７または８記載のリポーターグル
    ープを１またはそれ以上含んでいる請求項10記載のポリ
    アミド。
  12. 【請求項１２】請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴ
    ヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲートの製造方法
    であって、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはヌク
    レオチドの３′末端ホスフェートを、予め調製したポリ
    アミドのアミノ末端に結合させる工程を包含する方法。
  13. 【請求項１３】請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴ
    ヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲートの合成方法
    であって、 （ａ）第１のアミノ酸またはアミノ酸ユニット（アミド
    結合によって互いに結合している）のＣ−末端を支持マ
    トリックスと反応させて、それらの間に結合を形成さ
    せ； （ｂ）次いで、この支持マトリックスを、周知の固相ペ
    プチド合成法に従い、１またはそれ以上のアミノ酸と順
    次反応させてポリアミドを得； （ｃ）この支持マトリックス−ポリアミドをリンカーの
    第１の反応性基と反応させて、ポリアミドのアミノ末端
    とリンカーを結合させ； （ｄ）工程（ｃ）の生成物を第１のヌクレオチドと反応
    させて、リンカーの第２の反応性基とヌクレオチドの
    ３′ホスフェートを結合させ； （ｅ）次いで、この支持マトリックスを、周知の固相オ
    リゴヌクレオチド合成法に従い、１またはそれ以上のヌ
    クレオチドと順次反応させてオリゴヌクレオチドを得；
    そして （ｆ）所望により、支持マトリックスからオリゴヌクレ
    オチド−ポリアミド コンジュゲートを切断し、ポリア
    ミドまたはオリゴヌクレオチドの反応性基に結合してい
    るすべての保護基を除去し、そして得られたコンジュゲ
    ートを精製すること； を特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】動物または植物組織における特定のポリ
    ヌクレオチド群の存在およびその位置の測定方法であっ
    て、 （ａ）被験組織片を調製し； （ｂ）この組織片を請求項１〜９のいずれかに記載のオ
    リゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲート（ここ
    で、このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標
    的ポリヌクレオチドの一部に相補性である）とハイブリ
    ダイズさせ； （ｃ）組織片からハイブリダイズしていないプローブ物
    質を除去し；そして （ｄ）コンジュゲートのハイブリダイゼーションによっ
    てラベル化された組織片中の位置を検出するか、または
    同定すること； を特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】支持マトリックスに固定化されたか、ま
    たはその他の方法でそれに結合している特定のポリヌク
    レオチドの検出方法であって、支持マトリックスを請求
    項１〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド−ポリ
    アミド コンジュゲート（ここで、このコンジュゲート
    のオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一
    部に相補性である）と接触させ、次いでコンジュゲート
    の支持マトリックスへのハイブリダイゼーションを検出
    することを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】生物学的試料中の特定のウイルス性、細
    菌性またはその他のポリヌクレオチドの存在または非存
    在の検出方法であって、試料の核酸を請求項１〜９のい
    ずれかに記載のオリゴヌクレオチド−ポリアミド コン
    ジュゲート（ここで、このコンジュゲートのオリゴヌク
    レオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相補性で
    ある）と接触させ、次いでコンジュゲートのハイブリダ
    イゼーションが起こるか否かを検出することを特徴とす
    る方法。
  17. 【請求項１７】請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴ
    ヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲート（ここで、
    このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は所望の
    ポリヌクレオチドの一部に相補性である）；およびコン
    ジュゲートのハイブリダイゼーションを検出するための
    試薬；からなる所望のポリヌクレオチドを検出するため
    の診断キット。
  18. 【請求項１８】組織片調製のための試薬をさらに含有
    し、動物または植物組織中の特定のポリヌクレオチド群
    の存在およびその位置の測定に用いる請求項17記載の診
    断キット。
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