JPH03184992A - オリゴヌクレオチド誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はオリゴヌクレオチドの５−末端の水酸基に、リ
ンカ−を介して標識物質又は担体に結合させるための官
能基が導入されたオリゴヌクレオチド誘導体並びにその
製造方法に関するものである。

（従来の技術と課題） 従来、核酸は種々の分野で利用されている。例えば、有
用蛋白質のアミノ酸配列を暗号化する核酸を使用するこ
とで該有用な蛋白質を人工的に生産することが可能であ
り、合成核酸を使用することで遺伝子診断、遺伝子探査
等が可能である。また、核酸を固定化した担体を使用す
れば溶液からｍＲＮＡ等を分離・精製することが可能で
あり、更には核酸の塩基配列の決定（サンガー法等）に
於けるブライマーとしても使用可能である。

ところで、前記した様な核酸の利用において特に核酸を
担体等に固定化して使用する場合、従来、例えば担体の
エポキシ基と核酸塩基中のアミノ基を反応させる方法が
知られている。しかし、該方法では担体への核酸の固定
化量は微量であり、また、核酸が担体に多点結合してし
まう結果、動的自由度が失なわれ易いという課題がある
。

また、核酸をプローブ（探査子）として使用する場合に
は、放射性同位原素、酵素、蛍光物質等を標識物質（ラ
ベル）として使用しているが、これらのプローブを製造
する方法としえは、例えば標識物質を予め結合させたヌ
クレオチドモノマを、ターミナルトランスフェラーゼを
使用して核酸（ＤＮＡ）の３′末端に取込ませたり、ニ
ックトランスレーション法等が知ら・れでいる。しかし
、これらの方法においては、特殊な酵素を使用するため
にコストがかかり、また、酵素反応を利用するものであ
るために操作が複雑であり時間がかかる等の課題がある
。しかも、後者の方法では、均一で任意の塩基配列を有
する核酸プローブの合成は困難である等の課題がある。

（課題を解決するための手段） 以上のようなｐｉｓを解決するため、本発明者らは担体
に結合させたり標識物質を導入するための官能基を有す
るオリゴヌクレオチド誘導体について研究した結果、本
発明を完成した。即ち本発明は、下式の又は■で示され
るオリゴヌクレオチド誘導体並びに該誘導体の製造方法
を提供するものである。以下本発明の詳細な説明する。

；式の ；式■ （ただし、ｍは自然数、Ｂはヌクレオチドを構威す邑ア
デニン、チミン、シトシン又はケアニンかキシリボース
残基、Ｘは他の物質と反応可能な官能基、Ｙはリンカ−
をそれぞれ示す） 本発明が提供する前記式■又は■のオリゴヌクレオチド
誘導体は、以下の式■で示される中間体より製造される
ものである。

；式■ に２ （ただし、式中、−ＣＯＲＩはオリゴヌクレオチドの３
′末端の水酸基の保護基、Ｒ２はリン酸の保護基、Ｂ′
は必要に応じて保護されたヌクレオチドを構成するアデ
ニン、チミン、シトシン又はグアニンから選ばれる塩基
をそれぞれ示し、他の記号は前記に同じ） 式■の中間体は、例えばトリエステル法やフォスフォア
ミグイト法（丸善出版、ヌクレオシド、ヌクレオチドの
合成）等の既知の核酸合成法により製造することが出来
る。製造方法自体はこれらの例示に限定されるものでは
ない。また、この前駆体中のオリゴヌクレオチドの塩基
配列は任意である。

前記式■の中間体の５′末端の水酸基を、例えばＮ、Ｎ
’　−カルポニルジイミダゾル、２−Ｆ　１ｕｏｒｏ−
１−ＭｅｔｙｌＰｙｒｉｄｉｎｉｕｍ塩等の水酸基を活
性化する試薬により活性化し、ＮＨ２−Ｙ−Ｘ　（ただ
し、Ｙ及びＸは前記におなじ）型の化合物を反応させ、
縮合させて−Ｎｌ（Ｃ００−−ＮＨ−ＣＨ２−を形成し
た後、脱保護処理を実施して保護基をはずすことで本発
明が提供するオリゴヌクレオチド誘導体を製造すること
が出来る。官能基（Ｘ）としては１級又は２級アミン、
カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基等が例示
出来る。官能基は、標識又は製造されたオリゴヌクレオ
チド誘導体を結合させようとする担体中の化学反応可能
な基との関係において決定すれば良い。ここで、官能基
としてカルボキシル基又はチオール基を使用する場合に
は、該官能基を適当な保護基により保護しておくことが
好ましい。アミノ基と官能基をつなぐリンカ−（Ｙ）と
しては、骨格部分の原子数が２から３０の直鎖又は分岐
鎖を有する鎖状化合物を使用すると良い。

例えば、骨格部分の原子数が２から３０の炭素からなる
直鎖又は分岐鎖のアルキレン鎖が例示出来る。アルキレ
ン鎖において、炭素数が増すと製造されたオリゴヌクレ
オチド誘導体の溶解度及び親水性が低下するため、この
問題を解消するために直鎖又は分岐鎖中に親水基等を含
有するようなリンカ−を使用しても良い。

官能基がアミノ基である、ＮＨ２−Ｙ−Ｘ型化合物につ
いて、その−例を例示すれば、リンカ−（Ｙ）がアルキ
レン鎖のみのＮ　Ｈ２−（ＣＨ）　ｎ−ＮＨ，、型の化
合物がある。ｎ＝１の場合には該化合物はジアミノメタ
ンであり、以下ｎ−２，３゜４．５．６・・・ｎの場合
には該化合物はエチレンジアミン、トリメチレンジアミ
ン、テトラメチレンジアミン、ペンタメチレンジアミン
、ヘキサメチレンジアミン・・・である。ｎが大きくな
るに従って、該化合物は疎水性を増大するため、ｎが１
０以下の化合物が好ましい。これら化合物においては、
炭素鎖途中に分岐鎖があっても良い。

本発明においては、リンカ一部分をより長くすることも
可能である。即ち、リンカ−の骨格部分に親水性の基を
導入すれば良い。例えば−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−構造を
１個以上有する化合物としては例えばテトラエチレンペ
ンタミン、ペンタエチレンへキサミン等が例示出来る。

また、−ＣＨ−ＣＨ２−０−構造を１個以上有する化合
物としてはビス（３−アミノプロピル）エーテル、エチ
レングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、
ジエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エー
テル、１．４ブタンジオールビス（３−アミノプロピル
）エーテル等が例示出来る。これらの例示以外にも、例
えばアミド結合、３級アミン、ヒドロキシル基、ジスル
フィド基、シクロヘキシル基等を含むものが例示出来る
。

本発明においては、リンカ一部分にも官能基を導入する
ことができる。即ち、例えばリンカ一部分（Ｙ）にアミ
ノ基を有する分岐鎖を導入するこ０ とにより、標識物質を１以上結合したヌクレオチド誘導
体を製造することが可能になり、又は結合させようとす
る担体への固定化率の良いヌクレオチド誘導体を製造し
、得ることが出来る。

ここで、前記式■中のＢ（即ち、本発明が提供する前記
の又は■で示されるオリゴヌクレオチド誘導体中のＢ）
は、ヌクレオチドを構成する塩基であり、これらの配列
は製造された誘導体が核酸プローブとしての作用または
ｍＲＮＡ等の精製・及び５′位の水酸基を欠くデオキシ
ヌクレオシドで認識される化合物である。

前記式■中、Ｂ′中のアミノ基の保護基としては、アル
カリ条件下で脱保護可能なものが好ましく、例えば２８
％Ｗｔ、アンモニア水溶液中にて５５℃で５〜２４時間
の処理脱保護可能なベンゾ１ イル基又はイソブチリル基等が例示出来る。

Ｃ０ＲＩはオリゴヌクレオチドの３′末端の水酸基の保
護基であり、アルカリ条件下で脱保護可能なものが好ま
しく、例えば２８％Ｗｔ、アンモニア水溶液中で脱保護
可能なエステル基等が例示出来る。Ｒ１としては、低級
アルキル基、アリル基又は例えばシリカ等の固相合成の
際に用いられる適当なスペーサーを持つ担体等が例示出
来るが、合成土の操作をより簡便なものとするためには
合成担体を選択することが好ましい。

Ｒ２はリン酸の保護基であり、チオフェノール処理ある
いはアルカリ条件下で脱保護可能なものが好ましく、例
えばメチル基、β−シアノエチル基等が例示出来る。

以上に説明した本発明が提供する、前記式の又は■で示
されるオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法について詳
細にその手順を説明する。

前述のようにして合成された、前記式■に示される中間
体に、有機溶媒に溶解したＮ、Ｎ’　−カルボニルジイ
ミダブルを反応させ、下式■に示さ　２ れる活性型中間体を生成させる。

；式■ 上記式■の活性中間体に、ＮＨ２−Ｙ−Ｘ型の構造を有
する化合物を反応させて縮合し、−ＮＨＣＯＯ−を形成
させることで、５′末端に標識物質又は担体に結合させ
るための官能基（Ｘ）を有するオリゴヌクレオチド誘導
体が製造される。

一方、前記式■で示される中間体に、有機溶媒に溶解し
た２−Ｆｌｕｏｒｏ−１−ＭｅｔｈｙｌＰｙｒｉｄｉｎ
ｉｕｍ塩を反応させることで下記式■で示される活性中
間体が生成される。

；式■ この活性中間体■にＮ）Ｉ２−Ｙ−Ｘ型の構造を有する
化合物を反応させて縮合し、−ＮＨ−ＣＨ２−を形成さ
せることで、５′末端の炭素に官能基（Ｘ）を有するオ
リゴヌクレオチド誘導体が製造される。

以上のようにして製造されたオリゴヌクレオチド誘導体
について、３′末端の水酸基の保護基である一〇ＯＲＩ
、リン酸基の保護基であるＲ２及びＢ′中の塩基の保護
基をはずすことにより本発明のオリゴヌクレオチド誘導
体を製造することが出来る。即ち、前記式■の活性中間
体からは詳しくは前記式〇で示される本発明のオリゴヌ
クレオチド誘導体が、前記式■の活性中間体がらは詳し
くは前記式■で示される本発明のオリゴヌクレオチド誘
導体がそれぞれ製造される。

　４ （発明の効果） 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その分子中に通
常存在する、水酸基、リン酸基あるいは塩基部分のアミ
ノ基に比較して反応性の高い、例えば−級アミノ基等の
官能基が導入されたものである。従って、他の化合物、
即ち担体や標識物質と選択的に反応させ、該官能基部分
を結合させることが可能である。しかも、本発明のオリ
ゴヌクレオイド誘導体は、均一で、任意の塩基配列を有
する様にデザインすることが可能である。従って本発明
によれば、アフィニティークロマトグラフ用の固定化ヌ
クレオチドやノ１イブリダイゼーションプローブ等とし
て有用なオリゴヌクレオチドが提供される。

本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法は、従来
の酵素を使用する方法に比較して簡便であり、コスト的
にも安く、短時間のうちに実施可能である。しかも、従
来法ではヌクレオチドモノマーを個々に合成する必要が
あったが、本発明においてはその必要がないから、オリ
ゴヌクレオチ　５ ド誘導体の製造を機械化することをも可能にするもので
ある。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、本発明はこれら実施例により限定されるもので
はない。

実施例　１ 下に示されるような、５′末端が水酸基であるオリゴヌ
クレオチドを、ＤＮＡ自動合戊合成（Ａｐｐｌｉｅｄ　
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、３８ＩＡ）を用いて合成
した。なお、該ＤＮＡ合成装置はフオスフオアミグイト
法によりＤＮＡを合成ガラスピーズ、Ｒ２はβ−シアノ
エチル基、Ｂ−は塩基がアデニン又はシトシンの場合は
ペンシイ　６ ル基であり、塩基がグアニンの場合はイソブチリル基で
ある。なお、塩基の配列は、以下の様である。） （５′） ＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣ（３′） この５′末端が水酸基であるオリゴヌクレオチドをアセ
トニトリルに溶解した０、５ＭのＮ、　Ｎ−カルポニル
ジイミダゾルと１５分間反応させた後、アセトニトリル
に溶解した１、０Ｍのエチレンジアミンと室温で１５分
間反応させた。この後、室温条件下、２８％ｗ　ｔ　、
アンモニア溶液中で１１時間処理することによりオリゴ
ヌクレオチドを固相から切出し、該溶液中で５５℃条件
下、１７時間脱保護を行った。

カラムクロマトグラフィーを実施して、製造されたオリ
ゴヌクレオチド誘導体及びＤＮＡ合成装置で合成された
オリゴヌクレオチドについてその性質を調査した。

　７ 実施例　２ ２０ｍＭ’）リス塩酸緩衝液（ｐＨ９，ので平衡化した
ＤＥＡＥ基を有するイオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−ＮＰＲ
カラム、東ソー株式会社製）に実施例１で製造されたオ
リゴヌクレオチド誘導体及び実施例１で合成したオリゴ
ヌクレオチドをそれぞれ３０μｇ添加し、ｌ、Ｑｍｌ／
ｍｉｎの流速で塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ９，ので０，２〜０．５Ｍの塩濃度勾
配を付しながら溶出させた。その結果、５′末端の水酸
基が未修飾のオリゴヌクレオチド（合成されたオリゴヌ
クレオチド）は塩濃度が約０．３３Ｍで溶出し、実施例
１で製造されたオリゴヌクレオチド誘導体は塩濃度が約
０．３２Ｍで溶出した。

この結果は、実施例１により５′末端がアミノ化された
オリゴヌクレオチド誘導体が製造されたことを示すもの
である。

実施例３ ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で平衡化　８ したＤＥＡＥ基を有するイオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム、東ソー株式会社製）に実施例１で製造され
たオリゴヌクレオチド誘導体及び実施例１で合成したオ
リゴヌクレオチドをそれぞれ３０μｇ添加し、１．０ｍ
ｌ／ｍｉｎの流速で塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で０．２〜０．５Ｍの塩濃度
勾配を付しながら溶出させた。その結果、５′末端の水
酸基が未修飾のオリゴヌクレオチド（合成されたオリゴ
ヌクレオチド）は塩濃度が約０．４Ｍで溶出し、実施例
１で製造されたオリゴヌクレオチドは塩濃度が約０．３
８Ｍで溶出した。この結果は、実施例１により５′末端
がアミノ化されたオリゴヌクレオチド誘導体が製造され
たことを示すものである。

結果を図１に示す。

実施例　４ 実施例１で製造されたオリゴヌクレオチド誘導体３００
μｇを５０μｌの１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＩ（９，のに溶解
した後、ジメチルホルムアミドに溶解したとフルオロセ
インイソチオシアネートを５０μｌ添加して室温条件下
で一晩処理した。反応生成物をゲル濾適用カラム（セフ
ァデックスＧ２５、ファルマシア社製）で分離後、通常
の方法で濃縮し、逆相クロマトグラフィー用カラム（０
，ＤＳ−１２０Ｔ、東ソー株式会社製）でリテンション
タイム２３〜２４分のリテンションタイムのピーク画分
を分取した。逆相クロマトグラフィーの結果を図２に示
す。

分取したピーク画分について、２５０〜６００ｎｍの吸
光スペクトルを調査し、核酸の吸光ピークである２６０
ｎｍ及びフルオロセインの吸光ピークである４９０ｎｍ
の値から、それぞれのモル吸光係数を用いて分子量比を
求めたところ、核酸とフルオロセインの比は１．０１２
であった。

フルオロセインはオリゴヌクレオチド誘導体中のアミノ
基とのみ結合するから、この結果は実施例１で製造した
オリゴヌクレオチド誘導体には、１のアミノ基が存在す
ることを示すものである。

　０ ２５０〜６００ｎｍの吸光スペクトルを図３に示す。

実施例５ ＤＮＡ合成装置を使用して実施例１と同様のオリゴヌク
レオチドを合成し、アセトニトリルに溶解した０、５．
ＭのＮ、Ｎ’　−カルポニルジイミダゾルと反応させ、
活性中間体とした後、室温で３０分間、トリエチルアミ
ン及び１．０Ｍの６−アミノ−１−カプロン酸メチル塩
酸塩を溶解したアセトニトリルと反応させた。

なお、６−アミノ−１−カプロン酸メチル塩酸塩は、６
−アミノ−１−カプロン酸を塩化チオニルで活性化後、
メタノールを反応させて合成した。

また、トリエチルアミノは、６−アミノ−１−カプロン
酸メチル塩酸塩をアセトニトリルに溶解する目的で使用
した。

続いて実施例１と同様にしてオリゴヌクレオチドを固相
から切出し、脱保護を行った。

１ 実施例　６ 実施例２と同様にして、ＤＮＡ合成装置で合成されたオ
リゴヌクレオチド及び実施例４で製造されたオリゴヌク
レオチド誘導体の性質について調査した。その結果、５
′末端が未修飾のオリゴヌクレオチド（合成されたオリ
ゴヌクレオチド）は塩濃度が約０．３３Ｍで溶出したの
に対し、実施例４で製造されたオリゴヌクレオチド誘導
体は塩濃度が約０．３４Ｍで溶出した。この結果は、製
造されたオリゴヌクレオチド誘導体の５′末端がカルボ
キシル化されていることを示すものである。

実施例　７ ＤＮＡ合成装置を使用し、実施例１と同様に下記の塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、アセトニト
リルに溶解した０、５ＭのＮ、Ｎ’−カルポニルジイミ
ダゾルと反応させ、活性中間体とした後、室温で１５分
間、それぞれ１．ＯＭのペンタエチレンへキサミン、Ｎ
、Ｎ−ビス（３−アミノプロビル）メチレンアミン及び
エチレン　２ グリコールビス（３−アミノプロピル）エーテルを溶解
したアセトニトリルを反応させた。

続いて実施例１と同様にしてオリゴヌクレオチド誘導体
を固相から切出し、脱保護を行った。

（５′） ＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧ（３′） 実施例　８ リン酸緩衝液で平衝化したＤＥＡＥ基を有するイオン交
換樹脂（ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム、東ソー株式会社製）
に実施例６のようにして製造されたオリゴヌクレオチド
誘導体及び実施例６で合成されたオリゴヌクレオチドを
それぞれ３０μｇずつ添加し、１．Ｏｍｌ／ｍｉｎの流
速で０．２〜０．５Ｍの塩化ナトリウムを用いた塩濃度
勾配を付しながら２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６，８
）で溶出させた。その結果、リンカ一部分に−ＣＨ２−
ＣＨ２−ＮＨ−を有するペンタエチレンへキサミンでは
塩濃度が約０．３６５Ｍで溶出し、３３ 級アミノ基を有するＮ、Ｎ−ビス（３アミノプロピル）
メチルアミンの付加したオリゴヌクレオチド誘導体では
塩濃度が約０．３７５Ｍで溶出し、また、リンカ一部分
に−ＣＨ−ＣＨ，、−０−を有するジエチレングリコー
ルビス（３−アミノプロピル）エーテルでは塩濃度が約
０．３８Ｍで溶出した。これらの結果は、スペーサーの
種類により、前記カラムからの溶出時間が異なることを
示すものである。

実施例９ 実施例１と同様にしてチミジン２１星体を合成し、５′
末端が水酸基のものとアミノ化したものを調製し、ＩＭ
−リン酸緩衝液（ｐＨ９，のに溶解後、ゲル（トレシル
−５ＰＷ、東ソー株式会社製）１００■に対して２ｍｌ
の割合で混合し、室温で２４時間反応させた後に遠心分
離を行った。

ゲルに結合したＤＮＡの量を、前記のＤＮＡ溶液２ｍｌ
当たりのＤＮＡ量及びゲルに結合せずにゲル上清中に残
ったＤＮＡの量を既知量のＤＮＡに４ ついて２６０ｎｍの吸光度を測定して作成した標準曲線
から求め、これらを差し引いて求めたところ、５′末端
が水酸赳の２１ｍ体は固定化量が０゜２６μ／■乾燥ゲ
ルであったのに対し、４′アミノ化２１量体は２．７３
μｇ／■乾燥ゲルと約１０倍量であった。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の実施例３の結果を示すものである。横
軸は時間（分）を示し、縦軸は塩濃度の勾配（Ｍ）又は
２６．０ｎｍにおける吸光度を示す。 ２６０ｎｍの吸光度変化を示す曲線中、ａのピークは約
０．３８Ｍの塩濃度で溶出した、５′末端がアミノ化さ
れたオリゴヌクレオチド誘導体の、ｂのピークは約０１
４Ｍの塩濃度で溶出した、５′末端が未修飾のオリゴヌ
クレオチドの溶出を示すものである。 図２は、本発明の実施例４の逆相クロマトグラフィーの
結果を示すものである。横軸は時間（分）　５ Ｏｎｍの吸光度を示す。２６０ｎｍの吸光度変化を示す
曲線中、ａのピークは５′末端が未修飾のオリゴヌクレ
オチドの、ｂのピークは５′末端がアミノ化されたオリ
ゴヌクレオチド誘導体の溶出を示すものである。 図３は、本発明の実施例４において、リテンションタイ
ムが２３〜２４分で溶出した画分について２５０〜６０
０ｎｍの吸光スペクトルを測定した結果を示すものであ
る。横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は各々の波長にお
ける吸光度を示す。 図中、ａのピークは２６０ｎｍに吸光ピークを有するオ
リゴヌクレオチド誘導体に由来するものであり、ｂのピ
ークは４９０ｎｍに吸光ピークを有するフルオロセイン
に有由するものである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下式で示されるオリゴヌクレオチド誘導体（５′
   ）▲数式、化学式、表等があります▼（３′） （ただし、ｍは自然数、Ｂはヌクレオチドを構成するア
   デニン、チミン、シトシン又はグアニンから選ばれる塩
   基、■は２′デオキシリボースの３′及び５′位の水酸
   基を欠くデオキシリボース残基、Ｘは他の物質と反応可
   能な官能基、Ｙはリンカーをそれぞれ示す）
2. （２）下式で示されるオリゴヌクレオチド誘導体（５′
   ）▲数式、化学式、表等があります▼（３′） （ただし、式中の記号は前記に同じ）
3. （３）Ｙが、骨格部分の原子数が２〜３０の直鎖又は分
   岐鎖を有する鎖状化合物である請求項第（１）項又は第
   （２）項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
4. （４）式、 （５′）▲数式、化学式、表等があります▼（３′） （ただし、式中、−ＣＯＲ１はオリゴヌクレオチドの３
   ′末端の水酸基の保護基、Ｒ２はリン酸の保護基、Ｂ′
   は必要に応じて保護されたヌクレオチドを構成するアデ
   ニン、チミン、シトシン又はグアニンから選ばれる塩基
   をそれぞれ示し、他の記号は前記に同じ）で示されるオ
   リゴヌクレオチドをＮ，Ｎ′カルボニルジイミダゾール
   又は２−Ｆｌｕｏｒｏ−１−ＭｅｔｙｌＰｙｒｉｄｉｎ
   ｉｕｍ塩で活性化し、式、 （５′）▲数式、化学式、表等があります▼（３′） 又は、式、 （５′）▲数式、化学式、表等があります▼（３′） で示される活性中間体を生成させた後、該活性中間体と
   ＮＨ＿２−Ｙ−Ｘ（ただし、Ｘは官能基であり、Ｙはリ
   ンカーである）で示される化合物と反応させ、次いで脱
   保護処理して前記保護基をはずすことを特徴とする、請
   求項第（１）〜第（３）項記載のオリゴヌクレオチド誘
   導体の製造方法