JPH05509110A - オリゴヌクレオチドの標識方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドの標識方法Info
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- JPH05509110A JPH05509110A JP4503167A JP50316792A JPH05509110A JP H05509110 A JPH05509110 A JP H05509110A JP 4503167 A JP4503167 A JP 4503167A JP 50316792 A JP50316792 A JP 50316792A JP H05509110 A JPH05509110 A JP H05509110A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、オリゴヌクレオチドと呼ばれる核酸セグメントとの検出可能なマーカ
ー分子の共有結合に関する。さらに、本発明は各オリゴヌクレオチドがマーカー
1分子だけを含有する場合のオリゴヌクレオチドの5′末端標識に関する。
背景
標識化オリゴヌクレオチドには、DNA配列決定、診断的検出又は定量、及び法
科学を含めた多くの用途がある。一般に、標識化オリゴヌクレオチドを試料中の
核酸とハイブリダイズ又はアニーリングさせ、分離工程後に標識の存否を検出す
る。
オリゴヌクレオチドに標識を導入するために、多数の機序及び図式が用いられて
きた。これらの方法を理解するためには、Goodchild、Bioconj
ugateChemistry、 1(3):165−187 (1990)を
参照して頂きたい。Goodchildによれば、従来の研究者達は、酵素及び
化学合成手段により、そしてオリゴヌクレオチド当たり一つ又は多数のマーカー
分子を用いて、内部及び末端の同位置でオリゴヌクレオチドを標識化した。オリ
ゴヌクレオチドの内部位置にマーカ一部分を取り込む方法は、一般的にはその予
測し難いハイブリッド形成行動のために余り好ましくない。特に自動検出系に関
しては、末端標識オリゴヌクレオチドが好ましい。
同様に、多数の標識部分をオリゴヌクレオチドに取り込む方法は、化学量論的理
由で余り好ましくない。放射能標識化又はハプテン化塩基をオリゴヌクレオチド
に無作為に挿入する標識方法は、定量するのがさらに難しい標識化プローブを生
じる。
発生する信号と存在するプローブの量との相関関係は込み入っている。
いくつかの応用に関しては、標識化オリゴヌクレオチドが標識分子の正確な位置
及び数の点で十分でなくとも差支えはない。
しかしながら、自動診断検出及び定量に関しては、各オリゴヌクレオチドが末端
位置に単一マーカーを有するのが望ましい。
オリゴヌクレオチド上の末端位置に抗体又は他の特異的結合員と反応し得る単一
マーカー又はハブテンを配置する方法は、文献に記載されている。最も一般的に
は、第一アミン又は他の核性基を含有するリンカ−員を多数の電子性検出可能マ
ーカーの1つとの結合を可能にするのに用い得るヒドロキシルに結合させる。あ
るいは、オリゴヌクレオチドに直接標識又は反応性リンカ−を結合するために、
末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ、リパーゼ及びフォスフォラミ
ジト化学が用いられてきた。
例えば、Kempe、et al、、NucletcAcids Re5ear
ch 13 (1):45 (1985)は、合成オリゴヌクレオチドの5′末
端のビオチニル化を記載する。これは要するに、ビオチンのアミノエタノール誘
導体をポリマー支持誘導ヌクレオチドと縮合する。反応及び脱保護化後、ホスホ
ジエステル結合がアミノエタノール−ビオチンを5′ ヒドロキシルでヌクレオ
シドと結びつける。
Smi”th、et al、、Nucleic Ac1dsResearch
13 (7):2399−2412(1985)は、5′アミノデオキシチミジ
ンヌクレオチドを用いた5′標識法を記載する。5′アミノ基を先ず保護化し、
ホスホラミシトを調製する。次にこれを用いて、最終工程としてアミノ化塩基を
合成鎖の5′ ヒドロキシルに付加する。切断及び脱保護化後、アミノ基は多数
の異なる電子性フッ素運搬体と反応して5′標識オリゴヌクレオチドを生成し得
る。
Coull、et al、、TetrahedronLetters 27 (
34) :3991−3994(1986)は、自動合成下で保護化第一脂肪族
アミノ基をオリゴヌクレオチドの5′末端に導入する新規のホスホラミシト試薬
を記載する。支持体から脱保護化及び切断後、アミノ基は多数の電子性標識と反
応して5′末端を標識し得る。
B15choff、et al、、Anal。
Biochem、164:336−344 (1987)は、上記のCoall
の方法により生成されるアミノ基の官能化を記載する。例えば、5′第一アミン
と無水コハク酸との反応は5′カルボン酸を生じる。同様に、ジチオビス(スク
シニミジルプロピオネート)との反応とその後のジチオエリトリトールによる処
理は、5′チオール化オリゴヌクレオチドを生じた。
Connolly、Nucleic A−cicisResearch 15
(7)+3131−3139(1987)は、オリゴヌクレオチド上の5′位置
に保護化アミノ基を生じ得る保護化アミノホスホラミシト試薬を製造する試みを
記載する。Connollyは、従来の保護基と異なる条件下で除去し得るジメ
トキシトリチル及びモノメトキシトリチルから選択される異なる保護基を用いよ
うとした。
Thuong、et al、、TetrahedronLetters 29(
46):5905−5908(1988)は、ホスホラミシト化学を用いたアク
リジンによる支持オリゴヌクレオチドの5′末端標識方法を記載する。この方法
はある種の利点を有するが、しかし別々のホスホラミシト試薬が各所望の標識又
はマーカー用に調製されねばならない。
これは処理工程及び手順にかかる経黄を増大する。さらに、ホスホラミシト試薬
のホスホエステル結合及びスペーサーアームは、糖残基及びアクリジンハプテン
間で依然としてオリゴヌクレオチドに結合したままである。
上記の各々の方法を用いて検出可能なマーカー化合物がオリゴヌクレオチドの末
端位置に組み込まれた。しかしながら、各々、商業的量のオリゴヌクレオチドの
完全自動合成には望ましくない欠点を有する。例えば、支持体から外した後のオ
リゴヌクレオチドと標識部分の反応はさらに別の取扱を要する。さらに、過剰の
試薬を用いて反応を進めねばならない。これは望ましくない副反応を引き起こし
得るし、反応は通常完結しない。
したがって、さらなる精製工程(例えばクロマトグラフィー)をしばしば必要と
し、さらに合成工程が妨げられて標識オリゴヌクレオチドの収率が低い。
したがって、本発明は従来の方法に伴う問題を克服し、そして自動化にし易く、
各マーカーごとに固有の試薬調製の必要なしに、多数の異なるマーカーへの付加
に十分使えるオリゴヌクレオチドの末端標識方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、糖残基の5′炭素とマーカー分子との間のスペーサーアーム(
中間結合手)を必要としない。
本発明の要約
第一の態様において、本発明は、ヌクレオチド糖残基の5′末端炭素に遊離ヒド
ロキシルを有するように、固体支持体上で合成されたヌクレオチドの5′末端を
標識する方法であって、以下の:
a、ヌクレオチド糖残基の5′末端を反応体層と反応させてそれに結合する脱離
基を有する活性化5′末端を生ぜしめ;b、活性化5′末端を脱離基と置換する
ような核性基を含有するマーカー分子と反応させて、マーカー分子をヌクレオチ
ド糖残基の5′炭素に共有結合し;そしてC1固相から標識化ヌクレオチドを切
り離すことから成る方法に関する。
好ましくは、反応体層は塩化スルホニルであり請求核性基はアミン、チオール及
びアルコールから成る群から選択される。
最も好ましい核性基はアミンである。好ましいマーカ一部分はハプテンである。
別の態様において、本発明は上記の方法によりその5′末端で標識されたヌクレ
オチドに関する。本発明のヌクレオチドは以下の一般構造式を有する:
B−糖−CH2−N’ −MM
Rem
(式中、Bはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル及びその類似誘
導体から成る群から選択される塩基を示し:糖はリボース、デオキシリボース又
はその類似体を示し:CH2は糖残基の5′末端のメチレン基であり:MMはマ
ーカー分子を示し;N′はマーカー分子の核性基を示し;そしてRemは3′炭
素で糖残基に結合して、OH1第二のヌクレオチドとのホスホジエステル結合、
又は固体支持体と結合するスペーサーを示す)。
さらに別の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドの5′末端を標識するのに
有用な中間生成物質に関する。中間生成物質は以下の一般構造式を有する:
(式中、Bはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル及びその類似誘
導体から成る群から選択される塩基を示し;糖はリボース、デオキシリボース又
はその類似体を示し;CH2は糖残基の5′末端のメチレン基であり、LGは核
性基に置換され得る脱離基を示し;そしてRemは3′炭素で糖残基に結合して
、OH1第二のヌクレオチドとのホスホジエステル結合、又は固体支持体と結合
するスペーサーを示す)。脱離基の例としては、芳香族又は脂肪族スルホネート
、例えばトシレート又はメシレートが挙げられる。
詳しい説明
上記のように、本発明は、固体支持体上で合成されたオリゴヌクレオチドの5′
末端の新規の標識方法である。概念上、本方法は5′ ヒドロキシルを除去し、
ヒドロキシルを良好な脱離基と交換し得る反応体層で5′炭素を活性化して;そ
の後活性化5′末端をマーカー分子の核性基と反応させることから成固体支持体
上でのオリゴヌクレオチドの合成のための多数の方法が文献に記載されている。
例えば、Goodchild(上記)は、ジエステルアプローチ;トリエステル
アプローチ。
しばしばホスホラミシトアプローチと呼ばれる3価リン酸塩アプローチ;及び最
後に塩基性リン酸塩として公知の5価リンアプローチを記載する。オリゴヌクレ
オチドを合成するためのこれらの任意の方法は、末端ヌクレオシドの糖の5′
ヒドロキシル基が活性化に利用できる限りは、本発明と共C♂用い得ると考えら
れる。目下好ましい方法としては、ホスホラミシト法及びH−ホスホネート法が
挙げられている。
合成の方法を用いる場合、本発明とともに用いられる特定の固体支持体は重要で
はない。本質的に、固体支持体の唯一の要件は、それがヌクレオチドの3′末端
と〒応させるのに利用できる官能化又は誘導化基を有することである。このよう
な固体支持体としては、第一のヌクレオチドですでに利用されているもの、及び
第一のヌクレオチドを鎖中に取り込むために単に官能化されるものが挙げられる
。一般的固体支持体としては、制御細孔ガラス(CPG)、シリカゲル及びポリ
マーベースの樹脂が挙げられる。
CPG支持体は、結合する第一のヌクレオチドを有するもの、有さないもの共に
、C1ontech (Palo Alto。
CA)及びCPG、Inc、(Fairfield、NJ)から市販されている
。官能化固体支持体は、官能基として短鎖及び長鎖アミノ基を有するものが利用
できる。長鎖アミノ化CPG支持体が目下好ましい。
反応体層は、5′炭素のヒドロキシルを“良好な脱離基”と交換し得る試薬であ
る。良好な脱離基は、当業者には十分公知のものである。それらは、一般的にS
N2として公知の置換反応における核性物質により、それらを容易に置換させる
その電子密度を特徴とする。反応体層は2つの判定基準を満たさねばならない:
即ち、それらは“良好な脱離基°を包含する“R“基を含まねばならず;そして
それらは5′ヒドロキシルを置換し、その位置で脱離基を交換するのに十分に反
応性でなければならない。好ましい反応体層の例を以下に示す。
“活性化5′末端”は、通常のヒドロキシル基の代わりに“良好な脱離基”と共
有結合する糖残基の5′炭素を指す。良好な脱離基が強酸の塩を包含することは
、当業者には十分公知である。脱離基及び活性化末端の例は後述する。
好ましい反応体量は、−殻構造式:
%式%
(式中、Rは芳香族又は脂肪族基であり、Xはハロゲン、好ましくはCI又はB
rである)を有する芳香族又は脂肪族スルホニルハロゲン化物である。“芳香族
”という用語は、Huckelの(4n+2)π電子法則を満たす化合物を含め
たこの種類に属することが当業者に一般に公知の置換又は非置換環式構造を示す
。特に好ましいのは基の“脱離”能力を増強する置換を有するベンゼンの単環式
誘導体である。パラ位置におけるある種の置換は一般に、この関数を満たすと認
識される。
好ましい芳香族スルホニルハロゲン化物反応体量としては、p−トルエンスルホ
ニルクロリド(トシルクロリド)、p−ブロモベンゼンスルホニルクロリド(プ
ロシルクロリド)、及びp−ニトロベンゼンスルホニルクロリド(ノンルクロリ
ト)が挙げられる。
スルホニルハロゲン化物反応体具のR基は、脂肪族であってもよい。“脂肪族”
という用語は、直鎖又は分枝鎖、好ましくは直鎖で、理想的には全体が8主鎖原
子より長くない基を含む。
約8個未満、好ましくは4個未満の炭素原子を有するアルキル鎖が、スルホニル
ハロゲン化物反応体具として好ましい脂肪族基である。脂肪族及びアルキルR基
はともに、反応体量の判定基準を満たす限り、置換を包含し得る。ある種の置換
は脱離基としての反応体量の能力を増強するのに有用である。脂肪族反応体具の
例としては、メタンスルホニルクロリド、トリフルオロメタンスルホニルクロリ
ド、エタンスルホニルクロリド、2゜2.2−トリフルオロエタンスルホニルク
ロリド、プロパンスルホニルクロリド、及びアンモニオアルカンスルホニルノ1
ライドが挙げられる。
列挙した反応体量は主としてスルホニルクロリドであったが、しかし他のハロゲ
ン化物を用いてもよいことは当業者に認識される。例えば、スルホン酸プロミド
は、反応条件が適切に変更される場合は本発明における反応体量として機能する
ものとされる。
スルホニルハロゲン化物と等価の反応体量としては、好適な°脱離基”を有し、
5′ ヒドロキシルを置換させ得る任意の反応体量が挙げられることも、当業者
には認識される。反応体量として2つ又はそれ以上の試薬の組み合わせを用いる
ことも考えられる。例えば、四ハロゲン化炭素及びトリフェニルホスフィンを用
いて5′ ヒドロキシルをプロミド脱離基に転化し得る。
好ましい反応体量は、適切な条件下でヒドロキシル基と反応すると、表1に示す
活性化末端を生じることがさらに認識される。
p−トルエンスルホニルクロリド トシレートp−ブロモベンゼンスルホニルク
ロリド プロシレートルーニトロベンゼンスルホニルクロリド ノシレートメタ
ンスルホニルクロリド メシレートトリフルオロメタンスルホニルクロリド ト
リフレート2、2.2− )リフルオロエタンスルホニルクロリド トレシレー
トアンモニオアルカンスルホニルハライド ベタレート芳香族及び/又は脂肪族
スルホニルハロゲン化物が5′ ヒドロキシルと反応して活性化5′末端を形成
する反応条件は一般的に文献に記載されている。例えば、March、J、。
Advanced Organic Chemistry3rd Ed (19
85)pp310−320を参照していただきたい。任意の特定の反応体量に必
要な場合に反応条件を変更することは、当業者の能力の範囲内である。
出願人は特定の理論又は作用機序に束縛されるのを望まないが、活性化5′末端
はマーカー分子の核性基による核置換を受けると思われる。したがって、他の強
脱離基も上記のスルホニルハロゲン化物と等価であると考えられる。
標識工程に用いるマーカー分子は請求核性基を有する広範なこのような化合物か
ら選択される。゛マーカー分子°という用語は、少なくとも下記の3種類の分子
を包含するよう意図される:
(1)放射性分子及び化学発光分子のような検出可能な信号を直接提供し得る分
子;
(2)フルオロフォア(刺激は入射輻射線である)のような外部刺激の付加時に
検出可能な信号を示す分子;並びに(3)ハブテン(抗体と結合)及びビオチン
(アビジン又は抗体と結合)のような1対の特異的結合相手の1員である、時と
して鉤”と呼ばれる分子。
もちろん、各種類のマーカー分子の他の多数の例が当業者には公知である。事実
上、オリゴヌクレオチドの活性化5′末端との反応に立体的に利用できる核性基
を有するか又は含有するよう変更しうる場合には、任意のこのような分子を本発
明とともに用い得る。
第三の種類に属するマーカー分子を用いるのが目下好ましい:特に、分子量の小
さいハブテンを用いるのが好ましい。一般に当業者に公知のハブテンの例として
は、ビオチン、イミノビオチン、フルオレセイン、ダンンル、アクリジン、ジニ
トロフェノール、ジベンゾフラン、ルミノール(例えば、N−4−アミノブチル
−N−エチルイソルミノール−ABE I)が挙げられるが、これらに限定され
ない。他の有用なマーカー分子としては、フルオレセイン及びローダミンのよう
なフルオロフォア:並びにアクリジン及びルミノールのような化学発光団が挙げ
られる。
本発明に有用な核性基としては、アミン、チオール及びアルコールが挙げられる
が、しかし他の核性基も等価であると思われる。一般的に請求核性が強いほど、
その“脱離°能力の点で脱離基は弱くなる。したがって、より広範囲の脱離基及
び反応体具を用い得るように、弱いものよりはむしろ強い核性基が一般に好まし
い。しかしながら、安定性及び合成の容易性のために、本発明の好ましい核性基
はアミンである。第二級又は第三級の基よりも、第一級求核性基が一般に好まし
い。多数のマーカ一部分に最も普通にそして最も容易に利用できることが判明し
た核性基はアミノ基、好ましくは第一アミノ基である。
マーカー分子の核性基が活性化5′末端と反応する反応条件は、当業者には十分
公知である。この反応は核性置換であると考えられるため、標準的教科書(例え
ばMarch、J、。
上記を参照)は請求核性基が活性化5′末端と反応して脱離基を置換して、マー
カー分子を糖残基の5′炭素に直接共有結合させる反応条件を示す。これらの反
応条件の変更は、当業者の能力の範囲内である。
マーカー分子がオリゴヌクレオチドと共有結合したら、標識オリゴヌクレオチド
を固体支持体から切り離す。固体支持体からオリゴヌクレオチドを切り離す方法
も、当業者には公知である。例えば、Applied Biosystems3
80B合成機は一般に、濃水酸化アンモニウムを用いてオリゴヌクレオチドを支
持体から分離する。他の有用な方法としては、張水酸化ナトリウム及びエタノー
ル性1,8−ジアザビシクロ[5,4,0] ウンデス−7−エン(DBU−A
ldrich Chemical、Milwaukee。
Wl)を包含する。
本発明により調製される標識化オリゴヌクレオチドは、多数の診断的使用に用途
がある。例えば、Whitely等は米国特許第4.883,750号に、診断
プローブ及び隣接プローブを標的鏡上に置き、−緒に結紮する診断方法を記載す
る。次いで、結紮物質を検出する。3′末端が結紮を施されるプローブの5′末
端にマーカー分子が取り込まれているので、結紮物質が迅速に検出される。
別の診断方法は、欧州特許出願第320.308号に開示され、リガーゼ鎖反応
(LCR)として公知である。この方法では、2組のプローブを用い、このよう
な組の1員は他の員と並びに標的分子の隣接区分とハイブリダイズ可能である。
リガーゼ酵素を用いて、隣接プローブを一緒に共有結合させる。隣接ハイブリッ
ド形成のための鋳型として役立つような標的が存在する場合には、ハイブリッド
形成、結紮及び分離のサイクルを反復して、結紮物質の分子数を急速に増大する
。
以下の実施例で本発明をさらに説明する。しかしながら、本発明を限定するのは
添付の請求の範囲のみである。
標準計器操作によりABI 380A自動DNA合成機でホスホラミシト化学を
用いて、オリゴデオキシヌクレオチドを合成した。反応時間を増すよう修正した
1μモルスケールのプロトコールを用いて、16量体を合成した。この実験に関
しては、配列は規則的交互塩基としたが、配列を特定のものとすることは本発明
には重要でないと考えられる。合成は5′ ジメトキシトリチル保護オフ(“D
MT−off”、ABl 380A操作説明書参照)でプログラムされ、その間
、保護化オリゴヌクレオチドは制御細孔ガラスに結合したままであった。
カラムを合成機から取り出した。無水ピリジン中に新たに調製したp−トルエン
スルホニルクロリド(AldrichChemical、Milwaukee、
WI)の0.1M溶液 5mlを充填した10m1注射器をLuerチップを介
してカラムの一端に取り付けた。空の注射器を反対端に取り付けて、溶離液を受
けた。
0.1.Mp−トルエンスルホニルクロリド溶液を注意深くカラムに5回通して
、その後55℃でさらに24時間インキュベートした。余分のp−トルエンスル
ホニルクロリド溶液を除去し、カラムを無水アセトニトリル10m1で洗浄した
。
次に、無水ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した0、1M N−4−アミ
ノブチル−N−エチルイソルミノール(ABEり、ハブテン及び化学発光団2m
lを、Luerチップを介して5ml注射器に入れた(ABEI、ハブテン及び
DMFはAldrich Chemical。
M i I w a u k e e 、 W Iから販売されている)。この
注射器をカラムの一端に取り付けた。別の注射器にトリエチルアミン溶液2ml
を入れて、カラムの他端に取り付けた。これらの溶液をカラムを通過させて徐々
に混合した。混合物を55℃で24時間インキュベートし、余分の試薬を除去し
て、カラムをアセトニトリル20m1で洗浄した。
標準Applied Biosystem Tnc、 プロトコール(ABI
380A DNA合成機使用説明書)下で1時間濃NH4OHで処理して5′標
識化DNAをCPGから取り出した。5′標識化オリゴヌクレオチドを55℃で
一夜過熱して保護化塩基から保護基を除去した。NH4OHを蒸発させて、粗製
5′標識化オリゴヌクレオチドを得た。
実施例2:メタンスルホニルクロリドを用いた5′標識化オリゴヌクレオチドの
調製
標準計器操作によりABl 380A自動DNA合成機でホスホラミシト化学を
用いて、オリゴデオキシヌクレオチドを合成した。反応時間を増すよう修正した
1μモルスケールのプロトコールを用いて、第二の16量体を合成した。この実
験に関しては、配列は単一塩基反復としたが、配列を特定のものとすることは本
発明には重要でないと考えられる。合成は5′ジメトキシトリチル保護オフ(”
DMT−off”、ABI380A 操作説明書参照)でプログラムされ、その
間、保護化オリゴヌクレオチドは制御細孔ガラスに結合したままであった。
カラムを合成機から取り出した。無水ピリジン中に新たに調製したメタンスルホ
ニルクロリド(AldrichCh e m i c a I 、 M i !
w a u k e e 、 W I )の0.1M溶液 5mlを充填した
10m1注射器をLuerチップを介してカラムの一端に取り付けた。空の注射
器を反対端に取り付けて、溶離液を受けた。
0.1M メタンスルホニルクロリド溶液を注意深くカラムに数回通して、その
後25℃でさらに24時間インキュベートした。余分のメタンスルホニルクロリ
ド溶液を除去し、カラムを無水アセトニトリル10m1で洗浄した。
次に、無水ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した0、1MN−4−アミノ
ブチル−N−エチルイソルミノール(ABEI)、ハブテン及び化学発光団2m
lを、Luerチップを介して5ml注射器に入れた(ABEI。
ハブテン及びDMFはAldrich Chemical。
Mi Iwaukee、WTから販売されている)。この注射器をカラムの一端
に取り付けた。別の注射器にトリエチルアミン溶液2mlを入れて、カラムの他
端に取り付けた。これらの溶液をカラムを通過させて徐々に混合した。混合物を
25℃で24時間インキュベートし、余分の試薬を除去して、カラムをアセトニ
トリル20m1で洗浄した。
標準Applied Biosystem Inc、プロトコール(ABI 3
80A DNA合成機使用説明書)下で1時間濃NH4OHで処理して5′標識
化DNAをCPGから取り出した。5′標識化オリゴヌクレオチドを55℃で一
夜加熱して保護化塩基から保護基を除去した。NH4OHを蒸発させて、粗製5
′標識化オリゴヌクレオチドを得た。
実施例3:ABEI I識化オリゴヌクレオチドの評価A、ゲル分離による:実
施例1及び2の両方からの粗5′ABE I−標識化オリゴヌクレオチドを別々
に0.3MNa0Ac中に再溶解し、4℃で70%エタノールで沈殿させた。D
NAペレットを母液から単離して、蒸発、乾燥した。
15%ポリアクリルアミド、7M尿素ゲル中での電気泳動により、5’ABEI
−標識化DNAを分析した。いずれの場合も、電気泳動結果は、未修飾対照オリ
ゴヌクレオチドと比較して出発点により近い単一青色蛍光バンドとして移動する
ハブテン標識化DNAを示した。
B、紫外/可視スペクトルによる:5’ABEI−標識化オリゴヌクレオチドバ
ンド及び対照オリゴヌクレオチドバンドをポリアクリルアミドゲルから抽出し、
紫外/可視分光分析で検定した。いずれの場合も、スペクトルは327nm(A
BEIに関して)、並びに260nm (DNAの特徴)で吸収ピークを示した
。
C0化学発光による:実施例1からの5’ ABEI標識化オリゴヌクレオチド
1μLを、蒸留水100μLを含有するTD (Abbott Labora
tories。
!
Abbott Park、IL)キュヴzットに加えた。次に0.3mg/ml
バナジウム■触媒 100μLを加え、キュヴエットを化学発光計(Abbot
t
Laboratories、IL;任意の市販の化学発光計でもよいが)内に置
いた。0.25N NaOH溶液に溶解した3%過酸化水素200μLをキュヴ
エット中に注入し、注入直後から5秒間、発光を測定した。対照として、非標識
化オリゴヌクレオチドを用いて実験を繰り返したが、発光は認められなかった。
実施例2の標識化オリゴヌクレオチドを用いて、あるいは任意の化学発光性マー
カー分子で標識したオリゴヌクレオチドを用いても、この評価手順を繰り返すこ
とができる。
実施例4LL−トルエンスルホニルクOIJ Fを用いた5′標識化オリゴヌク
レオチドの調製
実施例1を反復したが、但しABEI試薬の代わりにアミノメチルフルオレセイ
ン(AMF +米国特許第4.510.251号 Abbott
Laboratories参照)を用いた。本実施例に関しては、マーカー試薬
に関する条件を除き実施例1と同じであった。
この標識化オリゴヌクレオチドの評価は、電気泳動及び/又は紫外/可視分光分
析法を用いて実施した。AMF標識化オリゴヌクレオチドは260nmの特徴的
DNAピークの他に、約495nmで吸収ピークを示した。
実施例2を反復したが、但し0.1Mメタンスルホニルクロリドの代わりに0.
1Mp−二トロベンゼンスルホニルクロリドを用いた。他の条件及び工程は同一
であったが、しかし反応時間は25℃で少し長かった。反応温度を高くすれば、
反応時間は短くなるはずである。
実施例2を反復したが、但し0.1Mメタンスルホニルクロリドの代わりに、ア
セトニトリルに溶解した四塩化炭素及びトリフェニルホスフィン(各々0.1M
)から成る溶液を用いた。
その結果5′−クロロ活性化誘導体を生じ、これを実施例2と同じ条件下で核性
マーカー分子と反応させて、オリゴヌクレオチドを標識した。
実施例2を反復したが、但し0.1Mメタンスルホニルクロリドの代わりに、ア
セトニトリルに溶解した四臭化炭素及びトリフェニルホスフィン(各々O,LM
)から成る溶液を用いた。
その結果5′−ブロモ活性化誘導体を生じ、これを実施例2と同じ条件下で核性
マーカー分子と反応させて、オリゴヌクレオチドを標識した。
実施例2を反復したが、但しカラムの第一の端の注射器には、アセトニトリルに
溶解したトリフェニルホスフィン及び3−ヒドロキシジベンゾフラン(ハブテン
)から成る溶液(0,1M。
5m l)を入れた。カラムの他端に取り付けた注射器は、アセトニトリルに溶
解したジエチルアゾジカルボキシレートの溶液(0,1M、5m1)を含有した
。2つの溶液を交互にカラムに通して、適切に混合し、カラムを25℃で24時
間インキュベートした。余分の試薬を除去し、カラムをアセトニトリル(20m
l)で洗浄した。その結果ジベンゾフラン−標識化オリゴヌクレオチド(5′末
端で)を生じ、実施例2と同様にして標識化オリゴヌクレオチドを取り出した。
要 約
固体支持体上に合成されたヌクレオチドの5′末端の標識方法を提供する。本発
明の方法では、遊1115’ ヒドロキシルを5′末端を活性化するよう選択さ
れた反応体層と反応させ:活性化5′末端を核性基を含有するマーカー分子と反
応させ:そして固相から標識化ヌクレオチドを切り離すことを包含する。
本発明はさらに、マーカ一部分の核性基が5′炭素と直接共有結合する上記の方
法によりその5′末端で標識されたヌクレオチド、並びに活性化5′末端を有す
るヌクレオチド中間生成物質に関する。
国際調査報告
Claims (14)
- 1.ヌクレオチド糖残基の5′末端炭素に遊離ヒドロキシルを有するように、固 体支持体上で合成されたヌクレオチドの5′末端を標識する方法であって、以下 の:a.ヌクレオチド糖残基の5′末端を反応体員と反応させてそれに結合する 脱離基を有する活性化5′末端を生ぜしめ;b.活性化5′末端を脱離基と置換 するような求核性基を含有するマーカー分子と反応させて、マーカー分子をヌク レオチド糖残基の5′炭素に共有結合し;そしてc.固相から標識化ヌクレオチ ドを切り離すことから成る方法。
- 2.工程aの反応体員が芳香族スルホニルハロゲン化物である請求項1記載の方 法。
- 3.工程aの反応体員が脂肪族スルホニルハロゲン化物である請求項1記載の方 法。
- 4.反応体員がアルキルスルホニルクロリドである請求項3記載の方法。
- 5.工程aの反応体員がスルホニルクロリドである請求項1記載の方法。
- 6.工程bの求核性基がアミンである請求項1記載の方法。
- 7.一般構造式: B−糖−CH2−N′−MM Rem (式中、Bはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル及びその類似誘 導体から成る群から選択される塩基を示し;糖はリボース、デオキシリボース又 はその類似体を示し;CH2は糖残基の5′末端のメチレン基であり;MMはマ ーカー分子を示し;N′はマーカー分子の求核性基を示し;そしてRemは3′ 炭素で糖残基に結合して、OH、第二のヌクレオチドとのホスホジエステル結合 、又は固体支持体と結合するスペーサーを示す) を有するその5′末端で標識されたヌクレオチド。
- 8.N′が窒素、イオウ及び酸素から成る群から選択される請求項7記載のヌク レオチド。
- 9.MMがフルオロフォア、化学発光団及びハプテンから成る群から選択される 請求項7記載のヌクレオチド。
- 10.Remが第二のヌクレオチドとのホスホジエステル結合を含有し、次いで これが1つ又はそれ以上の付加的ヌクレオチドと結合し、3′末端ヌクレオチド が固体支持体と結合する請求項7記載のヌクレオチド。
- 11.活性化5′末端を有するヌクレオチド中間生成物質であって、以下の一般 構造式: B−糖−CH2−LG Rem (式中、Bはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル及びその類似誘 導体から成る群から選択される塩基を示し;糖はリボース、デオキシリボース又 はその類似体を示し;CH2は糖残基の5′末端のメチレン基であり;LGは求 核性基に置換され得る脱離基を示し;そしてRemは3′炭素で糖残基に結合し て、OH、第二のヌクレオチドとのホスホジエステル結合、又は固体支持体と結 合するスペーサーを示す)を有する中間生成物質。
- 12.LGが一般構造式: −−SO2−R (式中、Rは芳香族又は脂肪族基を示す)を有する請求項11記載のヌクレオチ ド中間生成物質。
- 13.LGがトシレート、プロシレート及びトシレートから成る群から選択され る請求項12記載のヌクレオチド中間生成物質。
- 14.Rが4個未満の主鎖炭素を有する置換又は非置換アルキル鎖を包含する脂 肪族基である請求項12記載のヌクレオチド中間生成物質。
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-
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