KR950014923B1 - 올리고뉴클레오타이드를 3'표지시키기 위한 방법, 키트 및 반응성 지지체 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

올리고뉴클레오타이드를 3'표지시키기 위한 방법, 키트 및 반응성 지지체

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 올리고뉴클레오타이드로 언급되는 핵산 단편에 검정가능한 마커 분자를 공유 결합시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드를 자동 3' 말단 표지시키는데 유용한 고체 지지체 및 방법에 관한 것이다.

[배경]

표지된 올리고뉴클레오타이드는 DNA 서열분석, 진단 검정 또는 정량 및 법의학을 포함한 많은 적용분야에서 유용성을 갖는다. 통상적으로, 표지된 올리고뉴클레오타이드는 샘플중에 존재하는 핵산과 하이브리드화되거나 어닐링되고 분리 단계를 거친 후 표지물의 존재 또는 부재가 탐지된다.

올리고뉴클레오타이드에 표지물을 도입시키는데는 많은 기작과 도식이 이용되었다. 이러한 방법에 대한 이해를 돕기위해 문헌[참조 : Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1(3) : 165-187(1990)]을 참조한다. Goodchild에 따라서, 과거의 연구자들은 효소적 및 화학적 합성 방법에 의해 올리고뉴클레오타이드당 하나 또는 많은 마커 분자들을 사용하여 내부 및 말단 위치 모두에서 올리고뉴클레오타이드를 표지시켰다. 올리고뉴클레오타이드의 내부 위치에 마커잔기의 도입을 수반하는 방법은 일반적으로 이의 낮은 예측가능한 하이브리드화 양상 때문에 덜 바람직하다. 이러한 이유 때문에, 종종 말단 표지된 올리고뉴클레오타이드가 특히 자동 검출 시스템에 바람직하다. 마찬가지로, 올리고뉴클레오타이드로 다수의 표지 잔기를 도입시키는 방법은 화학량론적 이유 때문에 덜 바람직하다. 몇몇 적용에 대해서는, 표지된 올리고뉴클레오타이드가 표지 분자의 정확한 위치결정 및 수에 있어서 불충분하게 특징화 된다는 것이 중요하지 않을 수 있다. 그러나, 자동 진단 검정에 있어서는, 각각의 올리고뉴클레오타이드가 말단 위치에서 단일 마커 잔기, 바람직하게는 합텐성 "훅(hook)"을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

단일 마커, 또는 항체 또는 기타 특정한 결합원과 반응할 수 있는 합텐을 올리고뉴클레오타이드상의 말단 위치에 위치시키는 방법이 문헌에 기술되어 있다. 가장 일반적으로, 1급 아민 또는 기타 문헌에 기술되어 있다. 가장 일반적으로, 1급 아민 또는 기타 친핵성 그룹을 포함하는 링커원을, 3' 또는 5' 말단 결합시켜 다수의 친전자성의 검정가능한 마커중의 하나에 결합시킬 수 있다. 다른 방법으로는, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라제, 리가제 및 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 직접 표지를 또는 반응성 링커를 올리고뉴클레오타이드에 연결시켰다.

예를 들어, Kepmpe등 등[참조 : Nucleic Acids Research 13(1) : 45-57(1985)]은 3' 말단의 합성후 바이오티닐화 방법을 기술한다. 제1방법은 3' 하이드록실을 3' 알데하이드로 산화시킨 후, 알킬 디아민과의 축합 반응으로 바이오틴과 축합반응하기 위한 반응성 아민을 제공한다. 제2방법에서는, 바이오틴을 RNA 리가제에 의해 3'말단에 연결시킨다.

Zuckermann등[참조 : Nucleic Acids Research 15(13) : 5305-5321(1987)]은 디설파이드 결합을 갖는 링커 아암을 도입시키기 위해 변형된 뉴클레오타이드를 기술한다. 디설파이드 결합을 이용하여 고체 지지체에 변형된 뉴클레오타이드를 결합시킨다. 이때 뉴클레오타이드는 포스포르아미다이트 또는 포스포트리에스테르 방법에 따라 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있다. 합성 반응 후, 디설파이드를 절단시키고, 유리 설피드릴 그룹을 사용하여 형광 리포터를 탐침에 결합시킬 수 있다.

Nelson등[참조 : Nucleic Acids Research 17(18) : 7187-7194(19989)]은 차폐된 아미노 그룹과 보호된 하이드록실 그룹 모두를 갖는 다작용성 제제가 삽입된 조절된 세공 유리 고체 지지체를 기술한다. 하이드록실 그룹은 당 분야에 공지된 바와 같이 올리고뉴클레오타이드의 표준 합성법에 사용될 수 있다. 보호된 아미노 그룹은 리포터 분자에 커플링하기 위해 올리고뉴크레오타이드의 합성 및 절단 후 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 시판된 3' Amine-OnCPG^TM(Clontech, Palo Alto, CA.)와 매우 유사하다.

상기의 방법들은 각각 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 위치로 검정가능한 마커 화합물들을 삽입시키는데 성공적으로 이용되었다. 그러나, 어떠한 방법도, 표지 잔기가 지지체로부터 절단시키기 전에 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있도록 자동 합성법에 용이하게 적용할 수 없다. 각각의 경우에서, 올리고뉴클레오타이드는 표지물을 절단된 올리고뉴클레오타이드에 커플링시키기 위한 하나 이상의 추가의 단계를 거쳐야 한다. 이는 자동 합성법에 의해 상업량의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 생산하는 경우에는 바람직하지 못하다.

따라서, 본 발명은 선행 방법과 관련된 문제점을 극복하고, 자동 화학 합성법에 적용가능한 올리고뉴클레오타이드를 3' 말단 표지시키기 위한 방법 및 고체 지지체를 제공하는 것이다. 이러한 신규한 지지체를 제조하는 방법도 또한 기술되어 있다.

[발명의 요지]

제1양상으로, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 자동 합성법에 유용한 반응성 고체 지지체이다. 이 반응성 지지체는, 하이드록실 그룹을 포함하는 삼작용가 스페이서에 안정한 결합을 통해 공유 결합된 표지 잔기를 포함하여 표지된 스페이서 컴플렉스를 형성하고, 표지된 삼작용가 스페이서 컴플렉스는 절단가능한 결합을 통해 고체 지지체에 공유적으로 결합된다. 표지 잔기, 하이드록실 및 고체상을 연결하는 삼작용가 스페이서는 사이클릭, 헤테로사이클릭 또는 하기와 같이 쇄(chain)-형일 수 있다. 바람직하게는, 스페이서는 쇄-형일 수 있으며, 반응성 지지체는 하기 식을 가질 수 있다 :

상기식에서, n 및 m은 독립적으로 1 내지 약 30의 정수이고, p는 0 내지 약 30의 정수이며, G는 H 또는 보호 그룹이고, z는 절단가능한 결합을 갖는 연결 그룹이다.

바람직하게는, n 및 m은 독립적으로 1 내지 8, 보다 바람직하게는 1 내지 3의 정수이과 ; p는 0 내지 약 8, 보다 바람직하게는 0 내지 3, 이상적으로는 0의 정수이다. 절단가능한 연결부(linkage)는 바람직하게는 산에 안정하고 염기에 불안정한 절단가능한 결합(예 : 에스테르 결합)을 포함한다. 이는 공지된 자동 합성기를 사용한 반응성 지지체의 이용을 가능하게 한다.

또다른 양상에 있어서, 본 발명은 표지된 올리고뉴클레오타이드를 합성하는데 유용한 표지물 및 하이드록실 그룹을 갖는 반응성 지지체를 제조하는 방법을 포함한다. 이 방법은

(a) 3개의 작용기(이중 제1작용기는 하이드록실 그룹 또는 보호된 하이드록실 그룹이고, 작용기 각각은 상이한 반응성을 갖거나 갖도록 제조될 수 있다)를 갖는 삼작용가 링커를 제공하고,

(b) 삼작용가 링커의 제2작용기를 제2작용기와 반응할 수 있는 반응성 그룹을 갖는 표지 잔기와 반응시켜 표지 잔기를 삼작용기 링커에 연결시키는 안전한 결합을 형성한 후,

(c) 삼작용기 링커가 절단가능한 결합을 통해 고체 지지체에 공유적으로 결합되는 조건하에, 삼작용가 링커의 제3작용기를 삼작용가 링크에 절단가능한 결합을 부여할 수 있는 하나 이상의 시약, 및 작용화된 고체 지지체와 반응시키는 단계를 포함한다.

삼작용가 스페이서와 같이 삼작용가 링커는 사이클릭, 헤테로사이클릭 또는 쇄-형일 수 있다. 바람직하게는, 삼작용가 링커는 쇄-형이고 하기 식을 갖는다 :

상기식에서, n 및 m은 독립적으로 1 내지 약 30의 정수이고, p는 0 내지 약 30의 정수이며, X 및 Y는 독립적으로 하이드록실, 아미노, 티올 및 카복실로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 바람직하게는, n 및 m은 독립적으로 1 내지 약 8, 보다 바람직하게는 1 내지 3의 정수이고 ; p는 0 내지 약 8, 보다 바람작하게는 0 내지 3, 이상적으로는 0의 정수이다. 삼작용가 스페이서는 삼작용가 링커에서 이의 반응성 작용기 X 및 Y를 뺀 것이다.

본 발명의 또다른 양상으로, 고체 지지체상에 합성된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단을 표지화하는 방법이 기술된다. 이 방법은 상기한 방법에 따라 보호된 하이드록실 그룹을 갖는 반응성 지지체를 제조한 후, 하이드록실 그룹을 탈보호 시키고 탈보호된 하이드록실 그룹으로부터 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 공지된 자동화된 방법으로 합성된다.

마지막으로, 본 발명은 상기한 반응성 지지체(여기에서 표지물은 합텐이다) ; 및 검정가능한 마커 또는 고체상에 결합된 항합텐 항체를 포함하는 키트를 포함한다. 바람직하게는 검정가능한 마커는 효소 표지물이다. 임의로, 키트는 DNA 합성에 필요한 보호된 핵산 포스포르아미다이트 시약을 포함할 수 있다.

[상세한 설명]

[반응성 지지체]

본 발명의 신규한 반응성 지지체는 일반적으로 하기식으로 특징화될 수 있다 :

상기식에서, Z는 절단가능한 결합을 갖는 연결 그룹이고, TF는 후술하는 바와 같이 삼작용가 스페이서이며, G는 H 또는 보호 그룹이고, 표지물은 검정가능한 표지 잔기, 바람직하게는 합텐이다. 보다 바람직하게는, 반응성 고체 지지체는 하기식을 갖는다 :

상기식에서 n 및 m은 독립적으로 1 내지 약 30의 정수이고, p는 0 내지 약 30의 정수이며, G는 H 또는 보호그룹이고, Z는 절단가능한 결합을 갖는 연결 그룹이다. 바람직하게는, 정수 m 및 n은 1 내지 약 8이고, p는 0 내지 약 8이다. 가장 바람직하게는 n 및 m은 1 내지 3이고, p는 0 내지 2, 종종 0이다.

신규한 반응성 지지체의 주요 특징은 삼작용가 링커분자로부터 유도되는 삼작용가 스페이서이다. 삼작용가 링커는 3개의 반응성 작용기(이중 제1의 작용기는 보호된 하이드록실 그룹이고, 3개의 작용기 각각은 상이한 반응성을 갖거나 갖도록 할 수 있다)를 갖는 시약이다. 용어 "삼작용강 스페이서"는, 링커의 반응성 작용기중 2개가 다른 분자와 반응되어 단지 보호된 하이드록실 그룹(이는 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용된다)을 남기는 경우 사용된다.

삼작용가 시약(링커 또는 스페이서, 총체적으로 "TF"로 나타냄)은 상기 정의 와 일치되는 한 많은 다른 구성물을 포함한다. 예를 들어, TF는 하기 식을 갖는 사이클릭일 수 있다 :

치환체-OG는 제1반응성 작용 그룹이고, X 및 Y는 나머지 2개의 반응성 작용기를 나타낸다. 환 구조물은 5 내지 7개의 원자, 바람직하게는 탄소일 수 있다. 환에 -OG, X 및 Y를 연결시키는 단일 연결은 단일 결합일 수 있거나, 예를 들어 알킬 쇄내의 2이상의 결합을 나타낼 수 있다. 반응성 작용기중 2개가 동일한 경우, 하나를 연결하는 결합은 다른 하나를 연결하는 결합과 다른 것이 바람직하다. 이러한 방법으로, 2개의 동일한 작용기는 상이한 반응성을 가질 수 있다. 예를 들어, Y가 하이드록실 그룹인 경우, (OG인 경우에서와 같이)이는 하나를 환에 직접적으로 연결시켜 2차 알콜을 만들고, 다른 하나는 하나 이상의 메틸렌 그룹에 의해 간격을 두어 1차 알콜을 만드는 것이 바람직하다. 이러한 유형의 TF예는 하기와 같다 :

달리는 TF는 하기식과 같은 헤테로사이클릭일 수 있다 :

치환체-OG는 제1반응성 작용 그룹이고, X 및 Y는 나머지 2개의 반응성 작용기이다. N은 이의 3가 특성에 의해 이러한 구성에서 Y에 대해 가장 바람직한 작용기이다. 환은 다시 5 내지 7개의 원자, 바람직하게는 탄소를 포함할 수 있다. 또한, X가 하이드록실인 경우, 이는 G 또는 X를 2차 그룹으로 만들고 다른 것을 1차로 만들어 상이한 반응성을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 유형의 TF의 예는 하기와 같다 :

바람직한 TF는 쇄-형이고 하기 식을 갖는다 :

상기식에서, n, m 및 p 및 치환체 G는 상기 정의한 바와 같다. 치환체-OG는 제1반응성 그룹이고, X 및 Y는 나머지 2개의 반응성 작용기이다. 후술하는 바와 같이, 삼각용가 링커는 신규한 반응성 지지체를 제조하는데 유용하다. 바람직한 링커(및 반응성 지지체의 상응하는 스페이서)는 3개의 스페이서 아암(각각의 반응성 작용기와 중심 탄소 원자 사이에 1개)을 포함한다. 이들 스페이서 아암의 길이는 정수 n, m 및 p에 의해 조절된다. n 및 m에 대해 보다 작은 수는 DNA가 합성되는 하이드록실에 대해 표지 잔기의 보다 조밀한 연결을 가능하게 한다. p가 보다 작아질수록, 완결시 표지 합성된 DNA에 결합되어 있는 테일 또는 잔기는 보다 작다. 이는, p가 절단가능한 결합과 이작용가 링커의 나머지 사이의 스페이서 길이를 조절하기 때문이다.

또한, 삼작용가 링커에서 스페이서 아암의 특성은 중요한 것으로 간주되지 않으며, 다른 스페이서 그룹이 등가인 것으로 고려된다. 예를 들어, 메틸렌 스페이서중 적어도 몇몇을 등가를 상실하지 않으면서 다른 그룹으로 대체시킬 수 있다. 예를 들어, 비교적 안정한 결합을 형성하고, DNA 합성, 하이브리드화 또는 표지검출을 방해하지 않는한 에테르 연결부, 측쇄 알킬 연결부 및 방향족 연결부를 이용할 수 있다.

고체 지지체는 바람직하게는 조절된 세공 유리(CPG)를 포함한다. CPG는 CPG, Inc.(Fairfield, NJ)를 포함한 많은 공급처로부터 시판된다. 달리는, 폴리스티렌[예 : TentaGel^TM수지(Rapp Polymere 시판 : Tubingen, Germang)]을 포함한 다양한 수지가 고체 지지체로서 적합할 수 있다. 간단한 제조를 위해(하기 참조), 고체 지지체는 삼작용가 링커가 절단가능한 결합을 통해 결합될 수 있는 반응성 그룹을 포함하도록 유도체와 되어야 한다. 하이드록실, 아미노, 티올 및 카복실과 같은 다양한 반응성 그룹이 유도체로서 사용될 수 있으며, 하이드록실 및 아미노가 바람직하다.

본 발명에서 유용한 표지 잔기는 다양한 화합물을 포함할 수 있다. 적어도 3개 유형의 표지 잔기가 본 발명에서 사용될 수 있다 :

(1) 직접적으로 결합될 수 있는 직접 표지물(예 : 방사성 또는 화학발광성 마커) ;

(2) 검출되기 위해서 외부적 자극을 가해야 하는 조절된 표지 잔기[예 : 형광 표지물(부수적인 방사 자극이 필요)] ; 및

(3) 궁극적적으로 제1의 2개 유형의 표지물중 하나 또는 효소 표지물을 갖는 특정 결합원에 의해 인지될 수 있는 합텐을 일반적으로 포함하는 "훅(Hook)"타입 표지 잔기.

본 발명에서, 합텐은 바람직한 표지 잔기이다. 이들은 효소와 같은 검출가능한 마커에 커플링된 항체와 같은 특정 결합 파트너에 의해 검출될 수 있다. 합텐의 에는 바이오틴, 플루오레세인, 카바졸, 디벤조푸란, 퀴놀린, 단실 및 기타 등을 포함한다. 사실상, 핵산 합성의 비교적 거센 조건에 안정한 경우, 항체를 형성하는 면역 반응을 유도하도록 만들 수 있는 어떠한 화합물도 본 발명에서 합텐으로 사용될 수 있다. 이들 조건은 문헌에 상세히 기술되어 있으나, 간단히 산탈트리틸화 단계, 산화 단계, 및 염기성 염기 탈보호 단계를 포함한다.

바람직하게는, 보호 그룹은 제1작용기를 목적하지 않는 상황에서의 반응으로부터 보호한다. 이러한 공정은 당 분야 기술의 전문가에서 널리 공지되어 있어 DNA 또는 다른 올리고뉴클레오타이드의 연속적 합성을 위해 하이드록실 그룹을 보존한다. 적합한 보호 그룹은 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸(MMT), 테트라하이드로피리닐(THP) 및 치환된 THP, 2-메톡시에톡시메틸(MEM) 및 치환된 에틸 에테르(예 : t-부틸 에테르 및 1-에톡시에틸에테르)를 포함한다.

이러한 고체 지지체의 최종 성분은 절단가능한 결합을 포함하는 연결 그룹, Z이다. "절단가능한 결합"은, 산성 조건하에서의 통상의 탈트리틸화 단계를 포함한 자동 DNA 또는 RNA 합성이 수행되는 조건에는 안정하고 이에 의해 절단되지 않으나 다른 조건하에서는 절단될 수 있는 결합을 의미한다. 따라서, 절단가능한 결합은 산에 안정하고 염기에 불안정한 결합(예 : 에스테르)이 바람직하다. 목적하는 DNA 또는 RNA 분자의 합성이 완결되었을 때 절단가능한 결합은 고체 지지체로부터 합성된 분자를 분리시키는데 사용된다. 따라서, 절단가능한 결합은, 삼작용가 링커 분자의 나머지에 인접한 연결 그룹 Z내에서 발생하여 DNA 하이브리드화를 방해할 수 있는 잔기를 거의 또는 전혀 남기지 않는 것이 바람직하다. 절단가능한 결합의 대표적인 예는 에스테르, 디설파이드 및 인접 디올(예 : 타르트레이트로부터의 것)을 포함한다.

이와는 대조적으로, "안정한 결합"은 자동 DNA 또는 RNA 합성 조건 및 합성된 올리고뉴클레오타이드가 지지체로부터 절단되는 조건 모두를 견디는 것을 의미한다. 안정한 결합은 또한 하이브리드화 조건, 및 바람직하게는 증폭 조건 모두를 견딘다. 안정한 결합은 C-C 결합, C-N 결합, 및 탄소원자와 헤테로 원자 사이의 많은 유사한 결합(예 : 아미드 결합)을 포함한다.

후술하는 바와 같이, 바람직한 절단가능한 결합은 삼작용가 링커상의 2차 하이드록실 작용기와 산 무수물과의 반응을 통해 도입되는 에스테르 연결물이다. 이어서 산 작용기는 유도체화된 고체 지지체와 반응시킬 수 있다(필요한 경우 활성화 후), 따라서, 생성된 연결 그룹 Z는 2개의 성분을 포함한다 : 삼작용가 링커에 인접한 절단가능한 에스테르 결합, 및 절단 가능한 결합과 고체 지지체 사이의 스페이서 아암, 스페이서 아암은 고체와 유도체화된 반응 그룹사이에 위치된 특정 길이의 스페이서를 포함할 수 있다. 이 스페이서는 약 2 내지 약 40개 이상의 원자 길이를 가질 수 있다. 이들 스페이서 분자의 특성은, 통상의 DNA 합성동안 결합이 본래대로 남아있는 한 중요하지 않다. 장단쇄 알키 아미노 유리 지지체 모두가 사용되었으며, 시판되고 있다(CPG, Inc.), 최적의 스페이서 길이는 결정되지 않았으며, 이는 스페이서 길이가 본 발명에 중요한 요소가 아님을 제시한다.

[방법]

신규한 고체상을 제조하는 방법이 상기 제시되었으며, 삼작용가 링커에 의존한다. 삼작용가 링커는 상이한 반응성을 갖거나 갖도록 만들 수 있는 3개의 반응성 작용기를 갖는 비교적 작은 분자이다. 삼작용가 링커 시약 및 상응하는 스페이서(TF)가 상술되어 있다. 바람직한 쇄-형 TF에서, 작용기 각각이 중심 탄소로부터 연장된 짧은 스페이서 아암상에 존재한다. 일반식은 상기에 나타내었다.

상술한 바와 같이, 구조물내의 n, m 또는 p회 반복된 메틸렌 그룹에 의해 나타낸 스페이서 그룹의 길이는 정수 n, m 및 p에 의존하며, 짧은 것이 바람직하다. 정수 p는 또한 0일 수 있고, 이로써 반응성 작용기 x는 2차 그룹(예 : 2차 알콜 또는 아미노)을 구성한다. 이것이 작용기와 1차 위치의 동일한 반응 그룹사이에 상이한 반응성을 갖기 위한 바람직한 방법이다. 예를 들어, 하나의 하이드록실이 2차일 경우 디올 및 트리올이 사용될 수 있다. 전술한 바와같이, 메틸렌 그룹에 대한 치환체는, 결합이 안정한 경우, 스페이서와 등가물인 것으로 간주된다.

반응성 작용기중 적어도 제1의 작용기는 궁극적으로 자동 DNA 합성을 위한 토대로서 사용되는 하이드록실 또는 보호된 하이드록실 그룹이다. 일반적으로 나머지 반응성 작용기는 하이드록실, 아미노, 및/또는 카복실 그룹을 포함할 것이다. 3개의 반응성 작용기 각각은, 이들이 상이한 반응성을 갖거나 갖도록 만들 수 있는 경우 동일하거나 상이할 수 있다. 예로써, 나머지 2개의 반응성 작용기는 하기 표에 나타난 구성을 가질 수 있다.

[표 1]

나머지 2개의 반응성 작용기중 하나는 안정한 결합을 통해 표지 잔기를 공유적으로 결합하는데 사용된다. 안정한 결합을 통해 표지 잔기를 연결시키는 화학은 통상적인 것이다. 다양한 반응성 작용기를 표지물상의 이용가능한 그룹과 커플링시키기 위한 많은 시약이 당 분야의 전문가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 아미노 작용기는 설포닐클로라이드, 카복실(활성화 후 또는 카보디이미드를 통해), 하이드록실(토실화 후) 및 티올(말레이미드를 통해)과 반응하도록 만들 수 있다. 마찬가지로, 하이드록실 작용기는 무수물 및 아민과 반응하도록 만들수 있다. 많은 다른 예들이 주어질 수 있다.

기타 나머지 작용기(일반적으로 2차 작용기)는 절단 가능한 결합을 포함하는 절단가능한 연결 그룹 Z의 적어도 일부분을 도입시키는데 사용될 수 있다. 상기 제시한 바와 같이, 절단가능한 결합을 도입시키기 위한 바람직한 방법은 제3의 작용기를 절단가능한 연결 그룹과 반응시키는 것을 포함한다. 연결 그룹은 절단 가능한 결합을 포함하고, 고체 지지체에 결합하기 위한 또다른 반응 그룹을 생성한다. 특히, 2차 하이드록실 작용기와 사이클릭 산 무수물과의 반응은 카복실 반응 그룹을 갖는 에스테르를 만든다. 이렇게 형성된 에스테르 결합이 본 명세서에서 정의한 바와 같은 절단가능한 결합이다. 카복실산은 아미노 유도체화된 고체 지지체와 반응할 활성 에테르로 전환될 수 있다.

산 무수물의 예는 숙신산 및 말레산 무수물을 포함하며, 다른 것도 등가물로서 간주된다. 또한, 절단가능한 결합을 삼작용가 링커와 고체 지지체 사이에 도입시키는 다른 방법도 본 발명의 범위내에 있다.

반응성 작용기를 반응시키는 순서는 본 발명에서 중요한 것이 아니다. 그러나, 보다 초기 단계에서 형성된 결합이 연속한 단계의 결합을 생성하는데 필요한 조건을 견딜 수 있다는 것은 중요하다. 따라서, 표지물이 먼저 결합되는 것이 보다 안정한 결합일 수 있으므로, 일반적으로 표지물을 먼저 결합시킬 수 있다는 것이 당 분야의 전문가에 의해 인지된다. 일반적으로 절단가능한 결합을 포함한 연결 그룹은 다음에 첨가된다. 물론, 최종 작용기는 보호된 하이드록실 그룹을 유지할 것이며, 이는 표지물이 3' 말단에 결합할 핵산의 연속한 합성에 사용된다.

당 분야의 전문가라면, 본 명세서에서는 상세히 제시하지 않았으나 중간체 보호 및 탈보호 단계가 필요할 것이라는 것을 알 것이다. 보호 그룹은 본 발명에 필요한 상이한 반응성을 갖는데 필요할 수 있다. 예를 들어, 2개의 1차 하이드록실을 구별할 수 있는 경우, 티올 삼작용가 링커(예 : 2개의 1차 하이드록실 및 1개의 2차몰)가 가능할 수 있다. 실시예 1은 이를 성취하는 한가지 방법을 보인다. DMF 또는 MMT와 같은 통상의 보호 그룹이 올리고뉴클레오타이드 합성에 필요한 하이드록실 그룹을 보존하는데 필요할 수 있다.

신규한 고체상이 제공되는 경우, 올리고뉴클레오타이드를 표지시키기 위해 이를 사용하는 방법이 기술되어 있다. 자동 DNA 합성기(예 : Applied Biosystems 380B)가 시판된다. 이러한 자동 합성기의 이용이 본 발명에 바람직하다. 표지된 고체 지지체를 필수적인 핵산 포스포르아미다이트 시약과 함께 기기에 가한다. 지지체가 하이드록실에 보호 그룹을 포함하는 경우, 제1단계는 보호 그룹을 제거시키는 것이다. 사용가능한 하이드록실을 이용하여, 제조자의 교시에 따라, DNA를 합성한다. 합성이 완결되면, 지지체를 절단가능한 결합을 끊는 조건에 노출시켜 고체 지지체로부터 합성된 DNA를 분리시킨다. 통상적으로, 염기성 조건이 이용된다.

합성된 DNA는 샘플중의 상보성 DNA 검출을 위한 탐침으로 사용될 수 있다. 적합한 탐침이 3' 말단에서 표지되는 경우 리가제 쇄 반응(LCR)으로 공지된 증폭 체계에서 탐침으로 사용될 수도 있다. LCR은 EP-A-320 308 및 기타 문헌에 기술되어 있다.

[키트]

본 발명은 또한 (1) 표지물이 합텐을 포함하는 본 발명의 반응성 지지체 ; 및 (2) 항합텐 항체를 포함하는 키트를 고려한다. 대부분의 경우에서, 항체를 검정가능한 마커에 결합시킨다. 키트는 3' 말단에 합텐으로 표지된 DNA 또는 RNA를 합성하는데 사용될 수 있다. 항체는 검정가능한 마커(예 : 효소)에 결합되는 경우 RNA 또는 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다.

달리는, 항체 결합체는 다른 샘플 성분으로부터 DNA 또는 RNA를 분리시키는데 사용될 수 있다. 이러한 결합체는 불용성 고체상에 피복되거나 고정된 항합텐을 필요로 한다. "포착"항체는 비표지된 올리고뉴클레오타이드 및 다른 샘플 성분으로부터 합텐처리된 올리고뉴클레오타이드를 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 양상은 주형 의존적 결합이 표적물의 존재하에서만 합텐처리된 탐침에 대한 또다른(표지된) 탐침을 커플링하는 LCR에서 특히 유용하다. 포착 항체 결합체는 분리시킬 수 있으며, 다른(결합된) 탐침상의 표지물은 샘플 DNA 또는 RNA의 측정으로 결정될 수 있다.

임의로, 키트는 DNA 또는 RNA 합성에 필요한 데옥시 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클에오타이드 포스포르아미다이트 시약을 포함할 수 있다.

[실시예]

[실시예 1]

아미노프로판티올 링커를 사용한 단실-CPG의 합성

A. 단실-디올. 합텐, 단실 클로라이드(1.0g, 3.7m㏖)을 THF(20㎖)중에 용해시키고, 10% 탄산 나트륨(20㎖)중의 삼작용가 링커, 3-아미노-1,2-프로판디올(0.34g, 3.7m㏖)의 냉각 용액에 적가한다. 첨가후, 빙욕을 제거시키고, 반응물을 광으로부터 보호하면서 18시간 동안 실온에서 교반시킨다. 반응물은 아미노 작용기를 사용하여 표지된 디올 생성물을 수득하고, 이를 에틸 아세테이트로 추출하고, 건조시킨 후, 감압하에 용매를 제거시킨다. 다음 반응에 사용하기에 충분히 순수한 생성물의 수율은 1.1g이다.

B. 단실-디올-DMF. 단실-디올(1.1g, 3.4m㏖)을 피리딘(20㎖)중에 용해시키고, 디이소프로필에텔아민(0.9㎖, 51m㏖), N,N-디메틸아미노피리딘(0.02g, 0.17mmol), 및 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(1.3g, 37m㏖)을 가한다. 반응물을 18시간 동안 실온에서 교반시킨 후, 용매를 감압하에 제거시킨다. 생성물(보호된 1차 하이드록실을 갖는 표지된 삼각용기 링커을 2 : 8에틸 아세테이트/헥산으로 용출시키면서 섬광 크로마토그래피로 정제한다. 용매를 제거시켜 황색 유리 1.4g을 수득한다.

C. 단실-디올-DMT-숙신산 에스테르. 단실-디올-DMT(1.0g, 1.6m㏖)를 피기딘(7㎖)중에 용해시킨다. 이 용액에 숙신산 무수물(0.17g, 1.7m㏖) 디이소프로필에틸아민(0.042㎖, 2.4m㏖), 및 N,N-디메틸아미노피리딘(0.01g, 0.08m㏖)을 가한다. 반응물을 18시간 동안 질소 대기하에 실온에서 교반시킨다. 용매를 감압하에 제거시키고, 잔사를 5 : 95 메탄올/디클로로메탄으로 용출시키면서 실리카겔(200 내지 400메쉬)을 사용하여 섬광 크로마토그래피로 정제한다. 절단가능한 결합을 도입한 에스테르의 수율은 0.97g이다.

D. 단실 CPG. 단실-디올-DMT-숙신산 에스테르(0.3g, 0.44m㏖)을 N-메틸피롤리돈(NMP)(3㎖)중에 용해시킨다. 이 용액에 N-하이드록시숙신이미드(0.016g, 0.53m㏖), 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(0.1g, 0.48m㏖)을 가한다. 이 반응물을 8시간 동안 질소 대기하에 실온에서 교반시킨다. 반응물을 여과시키고, 여과물을 조절된 세공 유리(CPG Inc., LCA 00500C, lot 06C406) 0.5g에 가한다. 충분한 NMP를 가하여 회전기상에서 교반시키면서 CPG를 혼합시킨 후, 디이소프로필에틸아민(0.3㎖, 1.8m㏖)을 가한다. 48시간 후, 유리를 아세토니트릴, 디클로로메탄으로 세척한 후, 감압하에 건조시켜 표지된 고체 지지체를 수득한다.

[실시예 2]

아미노헥산디올 링커를 사용한 단실-CPG의 합성

삼작용가 링커로서 3-아미노-1,2-프로판디올 대신에 6-아미노-1,3-헥산디올을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1을 반복한다.

[실시예 3]

단실-폴리스티렌 지지체의 합성

단실-4,6-디올-DMT-Tenta Gel. 상기 실시예 2에서 제조된 바와 같은 단실-디올-DMT-숙신산에스테르(0.265g, 0.34m㏖)을 테트라하이드로푸란(3㎖)중의 p-니트로페놀(0.05g, 0.36m㏖) 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(0.78g, 0.38m㏖)과 배합한다. 반응물을 4.5시간 동안 실온에서 교반시킨 후, 여과시켜 침전된 N,N'-디사이클로헥실우레아를 제거시킨다. 용액을 무수 아세토니트릴(2㎖)과 함께 TentaGel 수지 Amine NH₂(0.5g, 0.23meq NH₂/g, RAPP POLYMERE, Tubingen)에 가하고, 반응물을 회전기를 사용하여 교반시킨다. 48시간 후, 후지를 분리시키고, 아세토니트릴, 이어서 메틸렌 클로라이드로 세척하고, 먼저 질소 기류 이어서 감압하에 건조시킨다.

[실시예 4]

디벤조푸란-CPG의 합성

A. 트리올 아세토나이드. 삼작용가 링커, (S)-(-)-1,2,4-부탄트리올(10g, 94m㏖), p-톨루엔설폰산(50㎎, 0.26m㏖), 및 2,2-디메톡시프로판(13.9㎖, 113m㏖)을 활성화된 4A 시이브를 포함하는 속슬레(Soxhlet)를 갖는 기구에서 벤젠중에 환류시킨다. 수시간 후, 탄산칼륨 0.5g을 가하고, 혼합물을 30분동안 가열없이 교반시킨다. 반응물을 여과시키고, 용매를 감압하에 제거시킨다. 이로써, 하이드록실 작용기중 2개가 사이클릭 생성물을 형성함으로써 디메톡시 프로판으로 보호된 생성물을 수득한다. 이 생성물은 추가의 정제가 필요없다.

B. 디벤조푸란-디올. 2-하이드록시디벤조푸란(2.5g, 13.6m㏖), 트리페닐포스핀(7.12g, 27m㏖), 및 트리올 아세토나이드(2.0g, 13.6m㏖)을 THF(20㎖)중에 용해시킨다. 이 용액에 디에틸아조디카복실레이트(5.3㎖, 27m㏖)를 5분에 걸쳐 적가한다. 이 반응물을 18시간 동안 광으로부터 보호시키면서 질소 대기하에 교반시킨다. 용매를 감압하에 제거시키고, 잔사를 에틸 아세테이트/헥산, 2 : 8로 용출시키면서 실리카겔을 사용하여 섬광 크로마토그래피로 정제한다. 정제된 아세토나이드를 테트라부틸암모늄 플루오라이드로 처리하여 표지된 이작용가 디올(1.9g, 51%)을 수득한다.

C. 디벤조푸란-디올-DMT. 디벤조푸란-디올(0.8g, 2.9m㏖)을 디이소프로필 에틸아민(0.72㎖, 4.0m㏖) 및 N,N'-디메틸아미노 피리딘(0.018g, 0.15m㏖)과 함께 피리딘(4㎖)중에 용해시킨다. 이 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(1.2g, 3.5m㏖) 및 추가의 피리딘(5㎖)을 가한다. 이 반응물을 18시간 동안 광으로부터 보호하면서 질소대기하에 교반시킨다. 용매를 감압하에 제거시키고, 잔사를 에틸 아세테이트/헥산, 2 : 8로 용출시키면서 실리카겔을 사용하여 검광 크로마토그래피로 정제한다. 감압하에 용매를 제거시켜 보호된 1차 하이드록실 생성물을 백색 고체(1.42g, 84%)로서 수득한다.

D. 디벤조푸란-디올-DMT-숙신산 에스테르. 디벤조푸란-디올-DMT(1.42g, 2.5m㏖), 숙신산 무수물(0.26g, 2.6m㏖), N,N'-디메틸아미노피리딘(0.015g, 0.12m㏖) 및 디이소프로필에틸아민(0.86㎖, 5.0m㏖)을 피리딘(7㎖)중에 용해시킨다. 반응물을 18시간 동안 실온에서 교반시킨다. 용매를 감압하에 제거시키고, 잔사를 섬광크로마토그래피(실리카겔, 메탄올/디클로로메탄/아세트산, 5 : 94 : 1)로 정제한다. 톨루엔을 사용하여 잔류 아세트산을 제거시킨다. 생성물은 표지된 삼작용가 링커에 절단가능한 에스테르 결합을 가한다.

E. 디벤조푸란-디올-DMT-숙신산 활성 에스테르. 디벤조푸란-디올-DMT-숙신산 에스테르(1.5g, 2.2m㏖)를 N-메틸피롤리디논(10㎖)중의 N-하이드록시숙신아미드(0.31g, 2.7m㏖), 1-하이드록시-벤조트리아졸 수화물(0.20g, 1.5m㏖) 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(0.51g, 2.5m㏖)와 배합한다. 반응물을 질소 대기하에 실온에서 18시간 동안 교반시킨다. 용매를 감압하에 제거시키고, 잔사를 섬광크로마토그래피(실리카겔, 에틸 아세테이트/핵산, 1 : 1)로 정제한다. 이 단계는 CPG 고체 지지체상의 아민과의 반응을 위해 에스테르를 활성화시킨다.

F. 디벤조푸란-CPG. 장쇄 알킬아민 CPG(0.24g, g당 100μ㏖ N)를 N-메틸프롤리디는(1.5㎖)중의 상기한 디벤조푸란 활성 에스테르(0.185g, 0.24m㏖) 및 디이소프로필 에틸아민(0.1㎖)과 반응시킨다. 회전기를 사용하여 실온에서 60시간 동안 혼합시킨다. 유도체화된 유리를 아세토니트릴 이어서 디클로로메탄으로 세척하고 질소 기류로 건조시켜 합텐처리된 고체 지지체를 수득한다.

[실시예 5]

카바졸-폴리스티렌 지지체의 합성

A. 1,2,6-헥산트리올 아세토나이드, 환저 플라스크에 1,2,6-헥산트리올(10g, 74.5m㏖), 2,2,-디메톡시프로판(10㎖, 81m㏖), p-톨루엔설폰산(0.05g, 0.26m㏖) 및 벤젠 100㎖을 가한다. 플라스크는 4A 분자 시이브를 포함하는 속슬레 추출기, 베넨 100㎖, 및 수냉각기가 장치된다. 반응물을 2시간 동안 환류시키고, 탄산칼슘(0.5g)을 가한 후, 30분 동안 교반시킨다. 용액을 여과시키고, 용매를 감압하에 제거시키고, 잔사를 에틸 아세테이트/헥산, 4 : 6으로 용출시키면서 크로마토그래피로 정제한다. 수율은 9.3g이다.

B. 카바졸-5,6-디올-아세토나이드. 2-하이드록시카바졸(10g, 54,6m㏖), 1,2,6-헥산트리올 아세토나이드(9.5g, 54.6m㏖), 및 트리페닐포스핀(17.2g, 65.5m㏖)을 무수 테트라하이드로푸란(100㎖)중에 용해시키고, 빙욕중에서 냉각시킨다. 디에틸아조디카복실레이트(12.9㎖, 65.5m㏖)를 9분에 걸쳐 적가한다. 광으로부터 보호하면서 실온에서 18시간 후, 용매를 감압하에 제거시키고, 잔사를 메틸렌 클로라이드중에 취한다. 침전물을 수집하여 순수한 생성물(9.9g, 29.2m㏖)을 수득한다.

C. 카바졸-5,6-디올. 카바졸-디올-아세토나이드(5.32g, 15.7m㏖)을 24시간 동안 50℃에서 80% 수성 아세트산(60㎖)중에서 가열시킨다. 용매를 감압하에 제거시키고, 잔류 아세트산을 톨루엔과 공비등시킨다. 다음 반응에 사용하기에 충분히 순수한 생성물의 수율은 4.7g이다.

D. 카바졸-5,6-디올-DMT. 카바졸-5,6-디올(4.5g, 15m㏖)을 무수 피리딘(50㎖)중에 용해시킨후, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(6.1g, 18m㏖), 디이소프로필에틸아민(3.7㎖, 21m㏖) 및 N,N-디메틸아미노피리딘(0.1g, 0.75m㏖)을 추가의 피리딘(10㎖)과 함께 가한다. 밀폐된 반응물을 8시간 동안 광으로부터 보호하면서 실온에서 교반시킨다. 용매를 감압하에 제거시키고, 잔사를 크로마토그래피(실리카겔 ; 에틸 아세테이트/핵산/트리에탈아민, 40 : 60 : 1)로 정제한다. 다음 반응에 사용하기에 충분히 순수한 생성물의 수율은 2.3g이다.

E. 카바졸-5,6-디올-DMT-숙신산. 카바졸-5,6-디올-DMT(0.84g, 1.4m㏖)을 무수 피리딘(5㎖)중에 용해시킨 후, 숙신산 무수물(0.15g, 1.5m㏖), 디이소프로필에틸아민(DIEA, 0.37㎖, 2.1m㏖), 및 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP, 0.009g, 0.01m㏖)을 가한다. 밀폐된 반응물을 광으로부터 보호시키면서 18시간 동안 실온에서 교반시킨다. 용매를 감압하에 제거시키고, 반응물을 무수 에틸렌 클로라이드(5㎖)중에 취한다. 추가의 DMAP(0.02g, 0.2m㏖) 및 숙신산 무수물(0.15g, 1.5m㏖)을 가한다. 48시간 동안 교반시키고, 용매를 감압하에 제거시킨다. 잔사를 메틸렌 클로라이드(5㎖) 및 트리에틸아민(1㎖)중에 취한다. 이 용액을 에틸 아세테이트/트리에틸아민(99 : 1, 250㎖), 메탄올/메틸렌 클로라이드/트리에틸아민(4 : 96 : 1, 500㎖), 및 메탄올/메틸렌 클로라이드/트리에틸아민(5 : 95 : 1, 500㎖)로 용출시키면서 크로마토그래피로 정제한다. 생성물의 수율은 890㎎이다.

F. 카바졸-5,6-디올-DMT-숙신산 p-니트로페닐 활성 에스테르. 카바졸-5,6-디올-DMT-숙신산(0.17g, 0.24m㏖) 및 p-니트로페놀(0.035g, 0.25m㏖)을 무수 테르라하이드로푸란(3㎖) 중에 용해시킨다. 이 용액에 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(0.055g, 0.27m㏖)을 가한다. 밀폐된 반응물을 광으로부터 보호시키면서 4.5시간 동안 실온에서 교반시킨다. 이 용액을 0.45PTFE 필터를 통해 여과시키고, 다음 반응에 사용한다.

G. 카바졸-5,6-디올-DMT-TentaGel. 카바졸-5,6-디올-DMF-숙신산 활성 에스테르를 TentaGel 수지 Amine NH₂(0.5g, 0.23m㏖e NH₂/g, RAPP POLYMERE, Tbingen)와 무수 아세토니트릴(3㎖)에 가한다. 반응물을 광으로부터 보호시키고 48시간 동안 회전기를 사용하여 혼합한다. 수지를 용액으로부터 분리시키고, 용액을 다음 시용을 위해 보관한다. 수지를 아세토니트릴 및 메틸렌 클로라이드로 번갈아 세척한다. 건조시킨 후, 수지를 수거한다(0.38g).

Claims (20)

1. 하이드록실 그룹을 포함하는 삼작용가 스페이서에 안정한 결합을 통해 공유적으로 결합되어 표지된 링커 컴플렉스를 형성하는 표지 잔기를 포함하고 표지된 링커 컴플렉스가 절단가능한 결합을 통해 고체 지지체에 공유적으로 결합되는, 올리고뉴클레오타이드합성에 유용한 유리되거나 보호된 하이드록실 그룹을 갖는 반응성 지지체.
2. 제1항에 있어서, 하기 일반식을 갖는 반응성 지지체.

   상기식에서, n 및 m은 독립적으로 1 내지 약 30의 정수이고, p는 0 내지 약 30의 정수이며, G는 H 또는 보호 그룹이고, Z는 절단가능한 결합을 갖는 연결 그룹이다.
3. 제1항에 있어서, 고체 지지체가 조절된 세공 유리 및 중합체 수지로 이루어진 그룹중에서 선택되는 반응성 지지체.
4. 제1항에 있어서, n 및 m이 독립적으로 1 내지 약 8의 정수이고, p가 0 내지 약 8의 정수인 반응성 지지체.
5. 제4항에 있어서, n 및 m이 독립적으로 1 내지 3의 정수이고, p가 0 내지 3의 정수인 반응성 지지체.
6. 제1항에 있어서, Z가 산에 안정하고, 염기에 불안정한 절단가능한 결합을 포함하는 반응성 지지체.
7. 제1항에 있어서, Z가 에스테르 연결부를 포함하는 절단가능한 결합을 포함하는 반응성 지지체.
8. 제1항에 있어서, 표지 잔기가 합텐인 반응성 지지체.
9. 제1항에 있어서, 삼작용가 스페이서가 사이클릭 또는 헤테로사이클릭 분자인 반응성 지지체.
10. (a) 3개의 작용기(이중 제1작용기는 하이드록실 그룹 또는 보호된 하이드록실 그룹이고, 이들 각각은 상이한 반응성을 갖거나 갖도록 제조될 수 있다)를 갖는 삼작용가 링커를 제공하고, (b) 삼작용가 링커의 제2작용기를 제2작용기와 반응할 수 있는 반응성 그룹을 갖는 표지 잔기와 반응시켜 표지 잔기를 삼작용가 링커에 연결시키는 안정한 결합을 형성시킨 후, (c) 삼작용가 링커가 절단가능한 결합을 통해 고체 지지체에 공유적으로 결합되는 조건하에, 삼작용가 링커의 제3작용기를 삼작용가 링크에 절단가능한 결합을 부여할 수 있는 하나 이상의 시약, 및 작용화된 고체 지지체와 반응시킴을 특징으로 하여, 표지된 올리고뉴클레오타이드를 형성하는데 유용한 표지물 및 하이드록실 그룹을 갖는 반응성 지지체를 제조하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 삼작용가 링커의 제2 및 제3반응성 작용기가 독립적으로 하이드록실, 아미노 및 티올로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
12. 제10항에 있어서, 삼작용가 링커에 절단가능한 결합을 부여할 수 있는 단계 C의 시약이 절단가능한 에스테르를 부여하는 숙신산 무수물 및 말레산 무수물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
13. 제10항에 있어서, 삼작용가 링커가 하기 일반식을 갖는 방법.

    상기식에서, n 및 m은 독립적으로 1 내지 약 30의 정수이고, p는 0 내지 약 30의 정수이며, G는 H 또는 보호 그룹이고, X 및 Y는 독립적으로 하이드록실, 아미노, 티올 및 카복실로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
14. 제10항의 방법에 의해 제조된 반응성 지지체.
15. (a) 3개의 작용기(이중 제1작용기는 하이드록실 그룹 또는 보호된 하이드록실 그룹이고, 이들 각각은 상이한 반응성을 갖거나 갖도록 제조될 수 있다)를 갖는 삼작용가 링커를 제공하고, (b) 삼작용가 링커의 제2작용기를 제2작용기와 반응할 수 있는 반응성 그룹을 갖는 표지 잔기와 반응시켜 표지 잔기를 삼작용가 링커에 연결시키는 안정한 결합을 형성시킨 후, (c) 삼작용가 링커가 절단가능한 결합을 통해 고체 지지체에 공유적으로 결합되는 조건하에, 삼작용가 링커의 제3작용기를 삼작용가 링크에 절단가능한 결합을 부여할 수 있는 하나 이상의 시약, 및 작용화된 고체 지지체와 반응시키고,

    (d) 하이드록실 그룹을 탈보호시키며, 이어서 (e) 보호된 하이드록실 그룹으로부터 올리고뉴클레오타이드를 합성함을 특징으로 하여, 고체 지지체상에 합성된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단을 표지하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 합성된 올리고뉴클레오타이드를 절단가능한 결합에서 지지체로부터 절단시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
17. 제15항에 있어서, 삼작용가 링커의 제2 및 제3반응성 작용기가 독립적으로 하이드록실, 아미노, 티올 및 카복실로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
18. 제15항에 있어서, 삼작용가 표지 생성물에 절단가능한 결합을 부여할 수 있는 단계(b)의 시약이 숙신산 무수물 및 말레산 무수물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
19. (a) 표지물이 합텐을 포함하는, 제1항의 반응성 지지체 및 (b) 검정가능한 마커 또는 고체상에 결합된 항합텐 항체를 포함하는 키트.
20. 제19항에 있어서, 분리 용기에 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가로 포함하는 키트.