JPH0730108B2 - 修飾された核酸を製造するための修飾されたホスホルアミダイト法 - Google Patents

修飾された核酸を製造するための修飾されたホスホルアミダイト法

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JPH0730108B2
JPH0730108B2 JP2132429A JP13242990A JPH0730108B2 JP H0730108 B2 JPH0730108 B2 JP H0730108B2 JP 2132429 A JP2132429 A JP 2132429A JP 13242990 A JP13242990 A JP 13242990A JP H0730108 B2 JPH0730108 B2 JP H0730108B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、修飾された核酸を製造するための修飾された
ホスホルアミダイト法およびこの方法に用いる新規な化
合物に関するものである。
（従来の技術） 核酸は、世界中の生命によって基本的に重要であり、し
たがって、全ての生物中に存在している化合物である。
遺伝情報は、その核酸中に蓄積される。核酸配列が個々
の生物について特徴的であるので、該核酸は、異なる種
の生物の区別および同定に関する基準でもある。したが
って、核酸の合成および検出が多く試みられてきた。
核酸は、化学的または酵素的に合成することができる。
自然に生じるβ配置の核酸の化学合成によると、定義さ
れたヌクレオチド配列を有する、該核酸を大量に製造す
ることができるので、近年、該化学合成は一層多く増加
してきている。該化学合成は、特に、β配置のオリゴヌ
クレオチドの合成について、行うことができる。別の方
法は、使用するヌクレオチドビルディングブロックのタ
イプおよび配列中の隣接するヌクレオチドに結合させる
反応工程によって区別することができる。
ホスホジエステル法では、カップリング試薬、例えばト
リアルキルアリルスルホン酸塩化物と共に、リン酸エス
テル残基以外の全ての反応性基が保護されているヌクレ
オシドーリン酸を、反応を起こすべきヒドロキシル基以
外の全ての反応性基が保護されている別のヌクレオシド
と反応させる。主として、オリゴヌクレオチド鎖を構築
する縮合工程中に、内部ヌクレオチド（リン酸エステ
ル）結合の非エステル化OH基において望ましくない副反
応が生じ、複雑な反応混合物となるために、この方法に
おける収率は低い。さらに、形成されたリン酸ジエステ
ルは、いくつかのプロトン性溶媒にだけしか溶解するこ
とができず、該溶媒中でエステル化を行わなければなら
ないという大きい欠点を有している。ピリジン、ジメチ
ルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドのような溶
媒は、例えば、沸点が高いというような周知の欠点を有
している。ホスホジエステル誘導体の極性特性の結果と
して、単離および精製は、イオン交換体によって行われ
るべきであり、簡単な方法で、例えば低沸点を有する溶
媒（例えば、ジクロロメタン）を用いてシリカゲルによ
って行うことはできない。
生成物が多くの有機溶媒に不溶であるという欠点は、ホ
スホトリエステル法によって回避される。
ホスホトリエステル法では、反応性基を１つだけ有し、
リン原子の隣りの２つのヒドロキシル基が異なる保護基
で保護されているリン酸誘導体が用いられる。第１のヌ
クレオシドとの反応に後、保護基のうちの１つを開裂
し、次いで、形成されたヒドロキシル基を、第２のヌク
レオシドとの反応のために活性化することができる。こ
の方法の結果、活性化されたヌクレオシドホスフェート
の収量を減少させる２つの追加の反応工程を、ヌクレオ
シドホスフェートにおいて行うことが必要である。
比較的高価な合成ビルディングブロックにおいて、より
少ない反応工程で操作される時に優れている方法は、ホ
スホルアミダイト法として知られている［ゲイト，エム
・ジェイ（Gait,M.J.）等、オリゴヌクレオチド・シン
セシス：ア・プラクティカル・アプローチ（Oligonucle
otide Synthesis:A Practical Approach）、IRLプレス
（Press）オックスフォード（Oxford）］。この方法で
は、リン酸誘導体ではなくむしろ亜リン酸の誘導体、い
わゆるホスホルアミダイト（phosphoramidite）が用い
られる。以下の基： −第１のヌクレオシドと結合することができる反応性
基、例えばハロゲン原子、 −活性化の後に第２のヌクレオシドとの結合を行うこと
ができる第２アミノ基、 −保護基によって遮蔽されたヒドロキシル基を３価のリ
ン原子に結合させる。
ホスホルアミダイト法の第１工程において、亜リン酸誘
導体と、第１のヌクレオシドとを反応させる；この工程
において、該ヌクレオシドは、反応性基を置換する。第
２工程において、第２アミノ基を第２のヌクレオシドに
よって選択的に置き換える。該第２工程では、活性化試
薬として、通常、テトラゾールが用いられる。次の工程
において、このヌクレオチド配列を、例えばヨウ素を用
いて酸化し、保護基を開裂除去する。１つの変法として
は、ホスホルアミダイト法が固相法として開示されてい
る。この変法では、成長するヌクレオチド配列を固相に
結合させる。過剰の合成試薬およびビルディングブロッ
クの分離ならびにオリゴヌクレオチド配列の精製は、こ
の方法によって非常に簡素化される。市販の入手可能な
自動核酸合成器は、この方法に従って作動する。これら
の構造は、例えば、ホスホルアミダイト法の特定の工程
に適合している。
特に、生物学的試料中のDNAの特異的な検出に、既知の
ヌクレオチド配列を有する核酸を適用している。
このような検出法では、ある核酸と別の核酸の一重鎖が
互いに相補的であるヌクレオチド配列を有しており、両
者がリボースのＣ−１で同一の配置（αまたはβ）を有
している場合には、ある核酸の一重鎖が別の一重鎖核酸
と反応して、二重鎖を形成することができるという性質
を利用している。自然に生じる核酸は塩基類および糖類
の結合に関してβ配置を有しているので、特に、β核酸
は、相補的核酸として考慮され得る。この二重鎖形成方
法は、ハイブリダイゼーションと称されている。
修飾された一重鎖の相補的核酸を、一重鎖核酸とのハイ
ブリダイゼーションに用いると、二重鎖の形成を検出す
ることができる。その後、例えば放射性標識であっても
よい修飾によって、ハイブリダイズされた核酸の量を測
定する。
修飾された核酸の合成に関して、既に入手可能である天
然の核酸を化学的もしくは酵素的に修飾することができ
るか、または既に修飾されたヌクレオチドビルディング
ブロックの助けによってヌクレオチド配列を合成するこ
とができる。
しかし、例えば、WO86/07363において５′−末端につい
て示唆されているように、既に完全に合成された核酸の
末端を修飾することによって、一重鎖あたり修飾された
ヌクレオチドを１つだけ含む核酸を製造することができ
る。したがって、プローブとしてこのタイプの修飾され
た核酸を用いて核酸の量を測定する方法は、あまり感受
性が強くない。
したがって、EP−A0173251において、完全な核酸の塩基
が化学反応によって修飾されることが示唆されていた。
しかし、このために、いくつかの核酸の反応工程が必要
であり、修飾の割合は、核酸が遊離アミノ基を含む塩基
を含有しているか否かに依存しており、この修飾は、相
補的核酸とハイブリダイズする能力を損なわない。
ジェゲル（Ｊger）等［バイオケミストリー（Biochem
istry）、第27巻、第7237頁、1988年］には、リン原子
に修飾を有するジヌクレオチドの製造が記載されてい
る。該修飾は、リンカーを介して結合している第１アミ
ノ基からなっており、通常のホスホルアミダイト法と類
似の方法に導入される。
しかし、この方法は、ホスホルアミダイトを使用する通
常の自動合成器では行うことができない。他の欠点は、
遊離アミノ基が、これに使用する求電子試薬と反応する
ので、もはや追加のヌクレオチドと結合し得ないという
ことである。
したがって、入手可能な従来技術の方法は、それぞれ、
かなりの欠点を有している。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、既知の方法の欠点を回避すること、さらに詳
細には、高い収率を有し、いくつかの反応工程において
簡単な出発物質で行うことができるリン酸エステル残基
の位置で修飾されたβ配置の核酸の固相上における合成
方法を利用可能にすることを目的とするものである。
（課題を解決するための手段） 本発明は、ヌクレオシドホスホルアミダイトを、遊離ヒ
ドロキシル基を有する別のヌクレオチドと反応させ、つ
いでリン酸エステルに形成されるヌクレオチド配列を酸
化することを特徴としており、該ヌクレオシドホスホル
アミダイトとして式（Ｉ）： ［式中、 Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、N3、低級アルコキ
シ、または所望により保護されたヒドロキシル基であ
り、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜200の自然基であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示される化合物を使用する、式（IX）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 ｎは、１〜200の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列の製造方法を提供するもの
である。
低級アルキル基および低級アルコキシ基は、炭素原子を
１〜６個、好ましくは１〜４個有する。
いわゆるホスホルアミダイト法による核酸の製造方法
は、例えば、ビオシミィ（Biochimie）1985、第67巻、
第673頁〜第684頁によって、本質的には知られている。
本発明の方法に、特に、式（１）で示される別のヌクレ
オシドホスホルアミダイトを出発物質として用いる従来
技術の方法とは異なる。
式（Ｉ）における残基Ａは、好ましくは、酸素原子保護
基である。ヌクレオチド合成において５′−ヒドロキシ
ル基の保護に適している保護基は、公知である。酸性条
件下で開裂することができるトリフェニルメチル基また
はジメトキシトリフェニルメチル基のような保護基が非
常によく用いられる。
残基Ａがヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである
場合、それは天然のまたは修飾されたヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴ
ヌクレオチドを用いる合成はより困難であるので、オリ
ゴヌクレオチドよりもヌクレオチドのほうが好ましい。
残基Ａのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、本
発明によって製造される残基であってもよい。残基Ａの
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの反応性基を適
当な保護基によって保護するのが好ましい。特に、残基
Ａのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの末端の
５′−ヒドロキシル基を酸素原子保護基によって保護す
る。この酸素原子保護基は、特に、残基Ａについて上述
した定義を有する。
残基Ｂの天然の核塩基は、好ましくは、アデニン、チミ
ン、シトシン、ウラシルまたはグアニンである。修飾さ
れた塩基は、例えば、それらの構造を環または置換基に
おいて変化させた塩基であってもよい。例えば、７−デ
アザグアニンまたは５−アミノアルキルウラシルまたは
８−アミノヘキシル−アミノ−アデニンが挙げられる。
これらの塩基は好ましく、該塩基において相補的核酸の
とワトソン‐クリック塩基対に全く影響を与えないか、
または極僅かだけに影響を与えるだけである。
残基Ｔは、リボまたはアラビノ配置を有し得る。好まし
くは、リボ配置である。塩基性、酸性または求核条件下
で開裂することができる基、好ましくは、ｔ−ブチルジ
メチルシリル基またはトリイソプロピリシリル基は、ヒ
ドロキシル基に関する保護基として使用することができ
る。
保護基Ｖは、選択的に開裂し得る保護基であるのが好ま
しい。完全なヌクレオチド配列を固形担体から開裂する
条件下で同時に開裂し得る保護基が好ましい。したがっ
て、例えば残基Ａにおいて記載したような酸性条件下で
開裂し得る保護基は、好ましくない。故に、アルカリま
たはアンモニア条件下で開裂し得る保護基が特に好まし
く、フルオレニルメトキシカルボニル基またはトリフル
オロアセチル基が特に好都合であることが確認された。
式（Ｉ）で示される化合物は、式（II）： ［式中、 Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、（所望により保護された）ヒドロキシ
ル基、低級アルキル基、N3または低級アルキルオキシ基
である］ で示される化合物を、式（III）： ［式中、 Ｚは、良好な離脱基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、少なくとも２価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜200の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示されるホスファンと反応させることによって製造す
ることができる。
該反応条件としては、従来技術のヌクレオシドホスホル
アミダイトについて既述した条件に類似の条件が当業者
によって選択され得る。しかし、この方法において、試
薬を用いる場合は、保護基Ｖを開裂し得る試薬を用いな
いように注意しなければならない。個々の保護基に関す
るこれらの反応条件は、当業者に知られている。
式（III）で示されるホスファンは、簡単な方法で、市
販の入手可能な出発物質から合成され得る。好ましい製
造方法において、第２アミンがより安価な粗製物質であ
るが故に、第２アミンとの反応が最初に計画される。こ
の反応工程において、必要であれば、非特異的な反応に
よる収率の減損は容認し得る。式（III）で示されるホ
スファンは、好ましくは、式（VI）： Ｐ(-Z)3 （VI） ［式中、Ｚは良好な離脱基である］ で示される化合物と、式（VII）： Ｈ−Ｄ （VII） ［式中、Ｄは第２アミン残基である］ で示される第２アミンとを反応させ、得られた生成物
を、式（VIII）： Ｈ−Ｘ−Ｌ(-U-V)n （VIII） ［式中、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜200の自然数である］ で示される化合物と反応させ、形成された生成物を単離
することによって製造される。残基Ｚは、好ましくはハ
ロゲン原子であり、特に好ましくは塩素原子である。
式（VII）で示される化合物は、特に、式： Ｈ−NR1R2 ［式中、R1およびR2は、同一または異なっており、１〜
10個の炭素原子を有する第１、第２または第３アルキル
基であるか、または所望により、一緒に、ヘテロ原子と
して１または２つの窒素原子、酸素原子および／または
硫黄原子を含有し得る５〜７個の炭素原子を有するアル
キル分枝鎖状シクロアルキル基を示すか、またはNR1R2
はイミダゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、
３−ニトロ−1,2,4−トリアゾリル基、チアゾリル基、
ピロリル基、ベンゾトリアゾリル基もしくはベンゾヒド
ロキシトリアゾリル基である］で示される、当業者に知
られている第２アミンである。ジイソプロピルアミンお
よびモルホリンが特に好ましいアミンであることが確認
されている。
直鎖状または分枝鎖状の、飽和または不飽和の、炭素原
子１〜10個、好ましくは２〜６個を有する炭化水素、架
橋結合基として有用である。炭化水素鎖は、ヘテロ原
子、例えば酸素原子または硫黄原子によって中断されて
いてもよい。該架橋結合基は、脂肪族環系または芳香族
環系を含んでいてもよい。さらに、該架橋結合基は、ヘ
テロ原子を含んでいてもよい。しかし、本発明方法にお
いてこの架橋結合基を含有する化合物と行われるべき反
応に関して、これらの架橋結合基としては、置換基とし
て遊離非置換アミノ基もしくは第１アミノ基またはヒド
ロキシル基を有するものを除外しなければならない。該
架橋結合基は、ｎ個の共有結合を介して、ｎ個の基Ｕと
結合する。ｎの数は、１から200までが好ましい。
式（III）で示される化合物は、核酸のホスホルアミダ
イト合成用のヌクレオシドホスホルアミダイトの合成に
用いることができ、かつ保護された形の反応性基を有す
る、従来技術のホスファンに比べて優れており；これ
は、検出可能な基に関する結合部位として作用すること
ができる。
ヌクレオチド配列の製造に関する本発明の方法は、特
に、下記工程を含む： −式（Ｉ）で示されるヌクレオシドホスホルアミダイト
と、遊離ヒドロキシル基を有するヌクレオチドとのカッ
プリング反応。遊離ヒドロキシル基を有するヌクレオシ
ドは、固形担体に共有結合されるのが好ましい。アミノ
基、カルボニル基または別のヒドロキシル基のようなヌ
クレオシドの別の反応性基は、カップリング反応の条件
下で安定である保護基によって保護されているのが好ま
しい。糖残基に存在し得る２′−ヒドロキシル基は、ｔ
−ブチルジメチルシリル基によって保護されているのが
好ましい。遊離ヒドロキシル基は、糖残基の５′−ヒド
ロキシル基であるのが好ましい。
ヌクレオシドは、モノヌクレオシド、オリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドであってよい。しかし、２〜
200、好ましくは20〜60のヌクレオチドビルディングブ
ロックを有するモノヌクレオシド、オリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドが好ましい。ヌクレオチドビル
ディングブロックは天然のまたは修飾されたヌクレオチ
ドであってよい。
該ヌクレオシドは、本発明の方法で修飾されたヌクレオ
シドであってもよい。
その後、固相に結合したヌクレオチド配列を酸化する。
ヨウ素が好ましい酸化剤であることが確認されている。
次に、キャッピング工程（capping step）を行うのが好
ましい。これは公知の方法に従って行われる。
−保護基Ａまたは残基Ａのヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチドの末端５′−ヒドロキシル基の酸素原子保護
基の選択的開裂。好ましい場合において、残基Ａの酸素
原子保護基が酸性条件下で開裂し得るジメトキシトリフ
ェニルメチル基のような保護基である場合、それは、例
えば、ジクロロ酢酸によって開裂され得る。
−ここで、所望により、これら第１の工程を繰り返すこ
とができる。これに関して、モノヌクレオシドホスホル
アミダイトとして、慣用のモノヌクレオシドホスホルア
ミダイトまたは式（Ｉ）で示されるモノヌクレオシドホ
スホルアミダイトを用いることができる。
−ヌクレオチド配列が所望の長さに達するとすぐに、保
護基Ｖを開裂する。アミノ保護基の場合、トルフルオロ
アセチルまたはフルオレニルメトキシカルボニル基（Fm
oc）が特に優れていることが確認されている。
−その後、既知の方法で固形担体からヌクレオチド配列
を開裂する。この条件は、共有結合のタイプに応じて選
択され、本発明の修飾によっては影響されない。
しかし、これらの条件としては、保護基Ｖの開裂および
担体からのヌクレオチド配列の開裂が同時に行われる条
件が特に好ましい。これは、例えば、３′−Ｏ−スクシ
ニルを介してCPG［制御されたポアガラス（controlled
pore glass）］に結合した担体および残基ＶとしてのFm
oc保護基の利用によって行うことができ、これには、開
裂試薬として、アルカリ、好ましくは濃アンモニア水溶
液またはアミン溶液が用いられる。
‐通常、次に、精製工程、例えばHPLCクロマトグラフィ
ーまたは／および透析による精製が行われる。一般的に
オリゴヌクレオチド合成に用いられるのと同一の条件が
適用される。
これら全ての工程は、別のヌクレオシドホスホルアミダ
イトが用いられ、リン酸エステル残基の酸素原子保護基
を開裂するための試薬の代わりに保護基Ｖの開裂用の既
存の試薬が用いられるとい事は別にして、この方法の慣
用の反応経路の変化を必要としないという共通点を有す
る。特に、工程の数は、慣用のホスホルアミダイト法と
同じであるかまたはそれよりも少ない。すなわち、本発
明の方法は、装置を変えずに、ホスホルアミダイト合成
用の入手可能な核酸合成器で行うことができる。
この方法で製造される式（IX）で示されるヌクレオチド
配列は、好ましくは２〜200、特に好ましくは20〜60の
ヌクレオチドビルディングブロックを有する。ヌクレオ
チドビルディングブロックの10〜80％、特に好ましくは
20〜50％は、リン原子の位置で修飾された式（Ｉ）で示
されるヌクレオシドーリン酸から形成されたヌクレオチ
ドビルディングブロックである。これらの修飾されたヌ
クレオチドビルディングブロックは、配列中で互いに２
〜５ヌクレオチド間隔であるのが好ましい。式（IX）で
示される化合物は多くの用途を有する。
例えば、ヌクレオチド配列は、簡単な方法で、検出可能
な基または検出可能な基に変化し得る基を有する、本発
明方法で製造した式（IX）で示されるヌクレオチド配列
から製造することができる。ヌクレオチド配列がいくつ
かの修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを有
する場合、このような基をいくつか含有するヌクレオチ
ド配列を製造することができる。結果として、核酸の測
定がより高感度になることが確認されており、このため
に、この方法は好ましい。
さらに、本発明は、上記工程の後に、形成された式（I
X）で示されるヌクレオチド配列と式（IV）： Ｙ−Ｗ （IV） ［式中、 Ｙは、反応性基であり、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
である］ で示される化合物とを反応させることからなる、 式（Ｖ）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
であり、 Ｘ、Ｌ、Ｕおよびｎは前記定義と同じである］ で示されるヌクレオチド配列の製造方法を提供するもの
である。
容易に置換することができる求核基、または求電子基
は、例えば、反応性基Ｙとして使用することができる。
式（IV）で示される化合物は、例えば、カルボン酸ハロ
ゲン化物である。
求電子基は、例えば、活性化エステルまたは無水物中の
基である。これらがカルボキシル基である場合、好まし
いエステルは、例えば、バプテンのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルである。
残基ＫまたはＪの定義に含まれる別のヌクレオチドは、
天然のまたは修飾されたヌクレオチドであってよい。残
基ＫまたはＪの定義に含まれるヌクレオチド配列は、天
然のおよび修飾されたヌクレオチドビルディングブロッ
クを含有し得る。式（Ｖ）で示されるヌクレオチド配列
は、好ましくは２〜200、特に好ましくは20〜60のヌク
レオチドビルディングブロックを有する。ヌクレオチド
ビルディングブロックの10〜80％、特に好ましくは20〜
50％は、式（Ｉ）で示されるヌクレオシドーリン酸から
形成されたヌクレオチドビルディングブロックである。
残基Ｗは、低分子構造および高分子構造であってよい。
好ましい低分子のレポーター分子は色素およびハプテン
であり；好ましい高分子群は、例えば、酵素、または抗
原もしくは抗体のような免疫学的に活性な物質である。
特に好ましくは、ハプテンである。例えば、ジゴキシゲ
ニンのような体液中で通常の条件下では生じないものが
特に好ましい。ハプテンおよび特に好ましいジゴキシゲ
ニンは、これらを有するヌクレオチド配列の分子量が修
飾によってあまり変化せず、例えばゲルクロマトグラフ
ィーにおいて、長さの標準として用いることができるの
で、免疫学的に活性な物質として特に優れていることが
確認されている。
さらに、ヌクレオチド配列の構築に関する本発明方法
は、従来技術と比較して以下の優れた点を有しているこ
とがわかった： −修飾がリン原子の位置で生じるので、相補的ヌクレオ
チド配列と共に形成されたヌクレオチド配列の塩基対は
損なわれない。
−形成されたヌクレオチド配列はポリメラーゼによって
プライマーとして受け入れられる。
−修飾は、例えば糖残基もしくは塩基の別の修飾、また
は３′−もしくは５′−末端標識に付加的に生じる。
−該方法は、必要なビルディングブロックの集中合成
（convergent synthesis）を含む。このような方法は、
特に高価なヌクレオチドビルディングブロックの収率を
高く維持することができるので、特に優れている。
−容易に入手でき、自然に生じるβヌクレオチドをヌク
レオシドホスホルアミダイトの合成に用いることができ
る。
−リン酸エステル基の位置で修飾されたヌクレオチド配
列を合成するために、同一または減少した反応工程の数
と共に、ヌクレオチド配列の合成のための固相ホスホル
アミダイト法の周知の長所を利用することができた。
−本発明の方法を用いて、配列における全く特定の部位
で非常に特定数の修飾を導入することができる。
−一般に、形成された修飾されたヌクレオチド配列を用
いることができる。例えば、異なる検出可能な基を選択
することができる。
−検出可能な基がヌクレオシドホスホルアミダイトに最
初から存在しないので、酵素標識または別の感受性レポ
ーター基を用いる場合に予想されるヌクレオチドの化学
合成の間の複雑化が回避される。
−レポーター分子による立体障害は、オリゴヌクレオチ
ド合成の収率および効率を減少することがある。この欠
点は、本発明の方法で回避される。
試料中の核酸に本質的に相補的である核酸と試料との接
触、他方に相補的である核酸のハイブリダイゼーション
を生起させる条件下での該混合物の処理および検出可能
な基の検出による試料中の核酸の検出方法において、式
（Ｖ）で示されるヌクレオチド配列は、試料DNAに相補
的なヌクレオチド配列として好都合に用いることができ
る。検出可能な基の検出は、既知の方法によって行うこ
とができる。検出可能な基が免疫学的に活性な物質であ
る場合、該基は、標識化された免疫学的パートナーと反
応し得る。その後、標識を測定する。本発明の核酸利用
の場合、基Ｗとして、ハプテン、特にジゴキシゲニンが
好ましい。
これらは、一重鎖核酸から二重鎖核酸への酵素的合成に
おけるプライマーとして同等に好適である。形成された
二重鎖核酸は、２つの鎖のうちいずれか一方にヌクレオ
チド配列を配列している。
（実施例） 以下の実施例によって、本発明を説明する。
２−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエ
タノール 容量１の丸底フラスコ中、撹拌しながら、ジオキサン
300mlに９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル）（Fmoc−Ｏ−Su）6
8.0g（約200ミリモル）を溶解した。該透明溶液に、水2
00mlに溶解したNa2CO340gおよびエタノールアミン14.4m
l（238ミリモル）を連続して添加した。すぐに形成した
パルプ状（pulpy）反応混合液を、室温で一晩撹拌し、
翌日、吸引濾過した。未反応のFmoc−Ｏ−Su、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドおよび目的生成物を含有する濾過
残渣を酢酸エステルから再結晶した。減圧乾燥した後、
純な生成物47.4g（理論収量の76％）を得た。1 H‐NMR（ppm）（DMSO）:3.4（ｍ、CH2O、2H）;3.6（t,
CH2N、2H）;4.2-4.5（ｍ、CH2OCO＋Ｈ［C9］、3H）;5.2
（ｓ［ｂ］、NH、1H）;7.2-7.9（ｍ、芳香族、8H）。
実施例２ ジクロロ−N,N−ジイソプロピルアミノ−ホスファン 容量500mlの滴下漏斗、KPGスターラー、温度計およびア
セトン／ドライアイス浴を装着した容量2lの３つ口丸底
フラスコ中、撹拌しながら、無水エーテル300ml、無水
ピリジン81mlおよびPCl387.5ml（１モル）を−70℃に予
め冷却した。それに無水エーテル250ml中ジイソプロピ
ルアミン142ml（１モル）を、２時間以内で滴下し、温
度を約−60〜−65℃に維持した。添加終了後、濃いパル
プ状反応混合液を室温にし、無水エーテル約600mlで希
釈して、さらに撹拌し易くした。室温でさらに３時間撹
拌した後、形成した沈殿物をガラスフィルターで吸引濾
過し、エーテルで数回洗浄した。常圧でエーテルを排水
した後、水流ポンプ（water-jet vacuum）で未反応PC
l3、ジイソプロピルアミンおよびピリジンを除去し、次
いで、残存した油状物をオイル‐ポンプバキューム（oi
l-pump vacuum）（Kp46℃/0.35Torr）で分別蒸留した。
理論収量の36％に相当するホスファン73.4gを得た。
31P−NMR（ppm）（CHCl3）:167.5。
実施例３ ２−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエ
チル−N,N−ジイソプロピルアミノ−ホスホクロリダイ
ト 容量100mlの丸底フラスコ中、無水テトラヒドロフラン3
0mlにジクロロ−N,N0−ジイソプロピルアミノ−ホスフ
ァン0.9ml（５ミリモル）を溶解し、これに無水ピリジ
ン0.4mlを添加した。磁気的に撹拌しながら、この混合
液に、無水テトラヒドロフラン20mlに２−（９−フルオ
レニルメトキシカルボニル）アミノエタノール（５ミリ
モル）1.4gを溶解した溶液を、約５時間、ゆっくりと滴
下した。テトラヒドロフランを分離および排水したピリ
ジン・塩酸塩を吸引濾過した後、残存した油状物（2.2g
＝理論収量の98％）を、ヌクレオシドホスホルアミダイ
トの製造に直接用いた（実施例４参照）。
実施例４ ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミジ
ン−３′−Ｏ−［２−（９−フルオレニルメトキシカル
ボニル）アミノエチル］−N,N−ジイソプロピルアミノ
−ホスファン ａ）容量100mlの丸底フラスコ中、ジクロロメタン（Na2
CO3で蒸留した）50mlおよびＮ−エチル−N,N−ジイソプ
ロピルアミン2.5mlに５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−
２′−デオキシチミジン2.5g（4.6ミリモル）を溶解し
た。使い捨て注射器を用いて、これに２−（９−フルオ
レニルメトキシカルボニル）アミノエチル−N,N−ジイ
ソプロピルアミノ−ホスホクロリダイト20ml（約５ミリ
モル）を加えた。室温で48時間撹拌し、減圧下で蒸発さ
せ、粘稠性の残留物を得た。
粗生成物をシリカゲル60［カラム30×2cm、移動溶媒：
石油エーテル50〜70℃／酢酸エチル／ジクロロメタン／
ピリジン（4:8:8:2）］によるクロマトグラフィーによ
って精製した。生成物を含有する画分を集め、溶媒を完
全に減圧除去した。
理論収量の20％に相当する白色の泡状残留物0.9gを得
た。
ｂ）別法として、撹拌しながら、無水ジオキサン100ml
に５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミ
ジン5.45g（10ミリモル）を溶解した。この溶液に、ハ
ンモト（S.Hammoto）、タカク（H.Takaku）［ケミスト
リー・レターズ（Chemistry Lett.）、1986、1401-140
4］に従って調製したビス−（ジイソプロピルアミノ）
−クロロホスファン2.7g（10ミリモル）、およびトリエ
チルアミン2.1ml（15ミリモル）をジオキサン100mlに溶
解した溶液を、30分以内で滴下した。反応の後、移動溶
媒として塩化メチレン／酢酸エチル（1:1）を用いる薄
層クロマトグラフィーにかけた。２時間後、保護アルゴ
ンガス（protective gas argon）の存在下、塩化トリエ
チルアンモニウムの沈殿物を濾去し、濾液を濃縮した
（無色の泡状物）。さらに単離せずに、形成された５′
−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミジン−
３′−Ｏ−ビス−（N,N−ジイソプロピルアミノ）ホス
ファンを目的生成物に転換した。これについては、無色
の泡状物を無水アセトニトリル100ml中に取り、２−
（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエタノ
ール（実施例１）3gおよびテトラゾール（昇華した）35
mg（５ミリモル）を添加した。室温で一晩撹拌し、酢酸
エチル100mlの添加によって、反応を停止した。塩化ナ
トリウム飽和数溶液で３回抽出した後、合わせた有機相
を硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾去し
た後、濾液を濃縮した。粗生成物を、シリカゲル60H
［ｌ＝24cm、ｄ＝4cm;移動溶媒：塩化メチレン／酢酸エ
チル（5:1）］によるクロマトグラフィーによって精製
した。溶媒の除去後、無色の泡状物を再度得た。これを
塩化メチレン10ml中に取り、氷冷したｎ−ヘキサン400m
lによって沈殿させた。理論収量の20％に相当する無色
粉末の目的生成物1.8gを得た。
２つのジアステレオマーは、TLCおよび31P−NMRによっ
て識別することができる。
Rf値（CH2Cl2/EA＝1:1）:0.04、0.15。
31P−NMR（ppm）（CD3CN）:146.7、145.8。
実施例５ ｄ（TpAETpTpTpTpTpTpTpAET）の合成 オリゴヌクレオチドの合成は、バイオサーチ・カンパニ
ー（BioSearch Company）から入手した完全自動DNAシン
セサイザー8600において標準的なプロトコールに従って
１マイクロモルの大きさで行った。合成装置は、１マイ
クロモルのチミジン担体で被覆された反応カラムを装着
しており、第１反応工程において、ジクロロメタン中２
％ジクロロ酢酸溶液で処理して、５′−OH保護基（ジメ
トキシトリチル−）を開裂させた。該カラムをアセトニ
トリルで洗浄した後、本発明に従ってＰ原子の位置で修
飾された実施例４の５′−Ｏ−ジメトキシ−トルフェニ
ルメチル−２′−デオキシチミジン−３′−Ｏ−［２−
（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエチ
ル］−N,N−ジイソプロピルアミノ−ホスファンと、出
発ヌクレオチドの遊離５′−OH基とをカップリングし、
同時に、アセトニトリル中でテトラゾールによって活性
化した。３価の形で存在したままであるＰ原子を、洗浄
を繰り返した後、THF/ルチジン／H2Oにヨウ素を溶解し
た溶液で酸化することによって、天然の５価のリン酸エ
ステルに転換した。次の無水酢酸／ジメチルアミノピリ
ジンによるキャッピング工程によって、アセチル化によ
る非‐結合の５′−OH−ヌクレオシドを保護した。この
方法によって、正しくない配列の形成が抑制された。洗
浄後、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル保護基を繰り返し
開裂することによって出発から合成サイクルを再開し
た。この方法で、最終段階におけるアミノエチル化チミ
ジン‐ホスホルアミダイト（TpAE）とさらにカップリン
グを行う前に、非修飾ホスホルアミダイト分子を有する
６チミジンビルディングブロックお反応配列に導入し
た。合成終了後、担体に結合したオリゴヌクレオチド
を、濃アンモニア水溶液による処理によって解放し、こ
れによって、同時にアミノエチル化リン酸エステルのFm
oc保護基が除去された。結果は、86ODU/A260であった。
この粗製混合物を以下の条件下でHPLCにかけた。
カラム：モノ（Mono）Q HR 10/10［ファルマシア（Phar
macia）］。
溶離液A:水。
溶離液B:0.5N LiCl。
勾配液:60分間でＡから50％Ｂまで。
溶出液をH2Oに対して一晩透析した［スペクトレーパー
（Spektrapor）、MWCO 1000］。
収量:55 ODU。
実施例６ ジゴキシゲニンによる実施例５からのオリゴヌクレオチ
ドの標識化 0.1mホウ酸ナトリウム緩衝液1ml（pH8.5）に実施例５か
らのオリゴマー55 ODU/A260を溶解し、ジメチルホルム
アミド1mlにジゴキシゲニン−Ｏ−スクシニル−アミド
カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル10
mgを溶解した溶液と混合した。この混合液を室温で18時
間撹拌し、減圧下で蒸発乾固し、H2Oに溶解し、生成物
を含有する混合液を以下のHPLCで分離した： カラム・シャンドン・ハイパーシル（Shandon Hypersi
l）ODS、25cm×0.4cm。
溶離液A:0.1m酢酸トリエチルアンモニウム溶液。
溶離液B:0.1m酢酸トリエチルアンモニウム溶液／イソプ
ロパノール。
勾配液:30分間かけてＡから50％Ｂまで。
生成物画分を、減圧下で蒸発によって濃縮し、水中に取
り、蒸留水に対して一晩透析した［スプレクトレーパー
（Sprectrapor）、MWCO1000］。
収量:11 ODU/A260。
実施例７ DNA試験における検出限界の比較 HIVに対して特異的な配列を有する３つの同一のオリゴ
ヌクレオチド（38mers）のハイブリダイゼーション特性
を、クローンしたHIV-DNAフラグメント（HIV-Wfl.13−
アイソレートのgag領域由来の954bp PvuII/BglIIフラグ
メント）に対して試験した。オリゴヌクレオチドの下記
部位を、ジゴキシゲニンで標識化した： 1.それぞれ、５′−末端ウラシルおよび中央部に位置す
るウラシル（すなわち、２つのディグ標識（dig label
s）、ウラシルのＣ−５での塩基標識）、 2.それぞれ、５′−末端、３′−末端および中央部に位
置するウラシル（すなわち、３倍のディグ標識、ウラシ
ルのＣ−５での塩基標識）、 3.それぞれ、５′−末端リン酸エステル残基および中央
でに位置するリン酸エステル残基（本発明に従って標識
する、２つのディグ標識／分子）。
ａ）ディグ標識を有するオリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーション調製法 試料DNAを１μｌの容量ずつ一連の希釈系にフィルター
上で直接スポットするか、または、アガロースゲル中で
分離した後、フィルター上に、20xSSC緩衝液を用いるサ
ザーンブロットによって移した。３分間、UV照射によっ
て固定化を行った。
フィルターを以下の条件下で予めハイブリダイズした:5
xSSC中、40℃で１時間、0.5％保護試薬。以下の条件下
で、ディグ標識化したオリゴヌクレオチドとの次のハイ
ブリダイゼーションを行った:5xSSC中、４℃で一晩、0.
5％保護試薬、ハイブリダイゼーション溶液1mlあたりオ
リゴヌクレオチド200ng。
次いで、フィルターを、2xSSC、0.1％SDS中、40℃で10
分間、４回洗浄した。
ジゴキシゲニンに対するPOD-標識化抗体を用いて、非放
射性標識化および検出装置［ベーリンガー・マンハイム
・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツ
ング（Boehringer Mannheim GmbH）］に類似の検出を行
った。
ｂ）結果 スポット／ブロットされた試料DNAの検出限界は、 （１）２倍塩基標識化オリゴヌクレオチドで10ng、 （２）３倍塩基標識化オリゴヌクレオチドで10ng、 （３）リン酸エステルによって２倍標識化されたオリゴ
ヌクレオチドで１〜10ng であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス・ミューレゲル ドイツ連邦共和国8121ポリンク、レーメル ストラーセ７番 (72)発明者 ヘルベルト・フォン・デル・エルツ ドイツ連邦共和国8120バイルハイム、イ ン・デル・アウ21番 (72)発明者 ハンス―ゲオルグ・バツ ドイツ連邦共和国8132トゥーツィンク、ト ラウビンゲルーストラーセ63番 (56)参考文献 特開 昭61−57596（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−141598（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−500248（ＪＰ，Ａ)

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式（IX）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
    レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
    はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
    キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
    り、 ｎは、１〜200の自然数であり、 ここに、］ で示されるヌクレオチド配列を、式（IV）： Ｙ−Ｗ （IV） ［式中、 Ｙは、反応性基であり、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
    である］ で示される化合物と反応させることを特徴とする、式
    （Ｖ）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
    レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
    はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
    キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
    り、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
    であり、 ｎは、１〜200の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列の製造方法。
  2. 【請求項２】式（Ｖ）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
    レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
    はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
    キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
    り、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
    であり、 ｎは、１〜200の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列。
  3. 【請求項３】式（Ｉ）： ［式中、 Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
    レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
    キルオキシ基または所望により保護されたヒドロキシル
    基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
    り、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜200の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示される化合物を、遊離５′−ヒドロキシル基を有す
    る別のヌクレオシドと反応させ、ついで生成したヌクレ
    オチド配列を酸化することを特徴とする式（IX）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
    レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
    はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
    キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
    り、 ｎは、１〜200の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列の製造方法。
  4. 【請求項４】式（IX）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
    レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
    はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
    キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
    り、 ｎは、１〜200の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列。
  5. 【請求項５】式（Ｖ）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
    レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
    はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
    キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘ、Ｌ、Ｕ、Ｗおよびｎは、上記定義と同じである］ で示されるヌクレオチド配列に対して本質的に相補的で
    あるヌクレオチド配列検出用の該式（Ｖ）で示されるヌ
    クレオチド配列。
  6. 【請求項６】試料DNAに対して相補的である核酸とし
    て、請求項２に記載の式（Ｖ）で示されるヌクレオチド
    配列を含むことを特徴とする試料に対して本質的に相補
    的である核酸と接触させることによる試料中の核酸の検
    出試薬。
  7. 【請求項７】二重鎖核酸の酵素合成におけるプライマー
    用の式（Ｖ）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
    レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
    はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
    キルオキシ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘ、Ｌ、Ｕ、Ｗおよびｎは、上記定義と同じである］ で示されるヌクレオチド配列。
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