DE4418691A1

DE4418691A1 - 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer

Info

Publication number: DE4418691A1
Application number: DE4418691A
Authority: DE
Inventors: Konrad Dipl Chem Faulstich; Siegfried Dipl Chem Brandtner; Rainer Dipl Chem Wechselberger; Joachim Prof Engels; Christian Prof Griesinger
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1994-05-28
Filing date: 1994-05-28
Publication date: 1996-02-22
Also published as: JPH10500963A; EP0763051A1; ZA954333B; CA2190982A1; WO1995032985A1

Description

Die Erfindung betrifft in 3′-(4′-)Position mit nicht-radioaktiv markierten Gruppen modifizierte Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie ihre Verwendung.

Markierte Nukleotide haben in der Gentechnologie außerordentlich viele Anwen dungen gefunden, da ihre Anwendung leichter ist als die der herkömmlich als Hy bridisierungsproben verwendeten DNA-Sonden, die durch Restriktionsverdau aus nativem Genmaterial hergestellt werden.

Modifizierte Oligonukleotide, die in Form von sogenannten "antisense"-DNA- Oligonukleotiden eingesetzt werden, können regulierend in das Zellgeschehen ein greifen und gewinnen damit z. B. für die in vivo-Untersuchung der Expression von Proteinen sowie in der Krebs-, Virus- und Gentherapie immer größere Bedeutung. Der Mechanismus läuft dabei über DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA- Wechselwirkungen ab, bedarf im einzelnen aber noch vollständiger Klärung.

In vitro dienen markierte Oligonukleotide, z. B. der Identifizierung von Genfrag menten innerhalb einer Genbank, indem man mit Hilfe eines markierten Oligo nukleotids geblottete Genproben der Genbank sondiert und identifiziert.

Neben der radioaktiven Markierung durch geeignete Isotope werden als Form einer nicht-radioaktiven Markierung beispielsweise derivatisierte Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die die Möglichkeit einer leichteren und ungefährlicheren Handhabung bieten.

Bislang wurde eine solche Technik erfolgreich zur nicht-radioaktiven Sequenzie rung von DNA angewendet. Hier sind im wesentlichen auf der Methode von Sanger [F. Sanger, S. Nicklen und S. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)] basierende Ansätze durchgeführt worden.

Das Fluoreszenzlabel wurde dabei entweder am 5′-Ende des Nukleotids [L. E. Hood, L. M. Smith und C. Heiner, Nature 321, 674 (1986)] oder an der Nukleobase [J. M. Prober, G. L. Trainor und R. J. Dain, Science 238, 336 (1987)] angebracht [G. L. Trainor, Anal. Chem. 62, 418 (1990)]. Dies ist mit den Nachteilen verbunden, daß nur bestimmte Polymerasen für die Synthese eingesetzt werden kön nen, die Akzeptanz der Triphosphate durch die Polymerasen sinkt und daß außer dem ein großer Substratüberschuß notwendig ist.

Auch die chemische Sequenzierung nach Maxam-Gilbert mit Fluoreszenzlabel ist bekannt [H. Voss, C. Schwager, U. Wirkner, B. Sproat, J. Zimmermann, A. Rosenthal, H. Erfle, J. Stegmann und W. Ansorge, Nucl. Acids. Res. 17, 2517 (1989)].

Außerdem ist bekannt, daß ein Fluoreszenzfarbstoff direkt über eine Amino- oder Thiolgruppe in 3′-Position eines Nukleosids, Nukleotids oder Oligonukleotids ge koppelt und diese Verbindung vorteilhaft für Synthese von Gegensträngen in An wesenheit eines Template-Stranges sowie für die Detektion von genetischem Mate rial in vivo und in vitro eingesetzt werden kann (EP 0490281). Diese Verbindun gen sind jedoch mit dem Nachteil verbunden, daß Quantenausbeute relativ gering ist und die Synthese der Verbindungen mit langwierigen, aufwendigen chromatogra phischen Reinigungsschritten verbunden ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, neue nicht-radioaktiv markierte Nukleoside bzw. Nukleotide zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile der vorbe kannten Verbindungen nicht aufweisen.

Gelöst wird die Aufgabe durch an 3′- bzw. 4′-Position modifizierte Nukleoside bzw. Nukleotide der folgenden allgemeinen Formel:

wobei:
R′: Wasserstoff, Mono-, Di- oder Triphosphat, Alkylphosphonat, Dial kylphosphinat oder Phosphoramidit
X: Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel
Y: Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel
Z: Wasserstoff, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe
R: Spacergruppierung, woran eine nicht-radioaktive, detektierbare Gruppe oder ein Effektormolekül gebunden ist
Base: Purin oder Pyrimidinbase oder deren Derivate darstellen,
n: 0 oder 1 ist.

Die Spacergruppierung besteht vorzugsweise aus einer geschützten oder unge schützten bi-, tri- oder polyfunktionellen Carbonsäure, Aminocarbonsäure oder einem Peptid bzw. entsprechenden Derivaten oder Salzen. Besonders bevorzugte Spacer stellen alle natürlich vorkommenden Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin oder Asparaginsäure, Carbonsäuren bzw. Aminocarbonsäuren mit 2 bis 20 Atomen, aber auch Diamine, Thiole und Aminoalkohole dar.

Als ganz besonders geeignet für Spacergruppierungen haben sich Di- bzw. Tetra mere von Aminosäureeinheiten erwiesen; desweiteren, wenn die Spacergruppierung eine Länge aufweist, die einer Kohlenstoffkette von 2 bis 12 Atomen entspricht.

Als nicht-radioaktive, detektierbare Gruppe, sogenannte Reportermoleküle, kommen alle chemisch, physikalisch oder biologisch nachweisbare Gruppen in Betracht. Sol che Gruppierungen sind dem Fachmann bekannt. Auch sind hier sogenannte Effek tormoleküle geeignet, die direkt oder nach chemischer, physikalischer oder bio logischer Aktivierung zu Wechselwirkungen chemischer, physikalischer oder bio logischer Art mit bestimmten Zielmolekülen in der Lage sind (wie Alkylierungs mittel, π-Systeme aromatischer Verbindungen, Enzyme usw.). Beispielhaft sei hier die Interkalation an DNA/RNA durch Acetylaminofluorene, Spaltung von DNA/RNA durch Nukleasen oder die teilweise oder vollständige kovalente Bindung von Alkyl- oder Arylgruppen an DNA/RNA durch Alkylierungsmittel oder Psora lene, sowie z. B. Metallcluster, die lokal zu einer starken Erhöhung des Ein fangquerschnitts von therapeutisch wirksamer elektromagnetischer Strahlung füh ren, genannt. Als Reportermoleküle kommen insbesondere Lumineszenzfarbstoffe, die im Wellenlängenbereich von ca. 630 bis 670 nm emittieren, Enzyme, wie Peroxidase oder alkalische Phosphatase und Haptene, wie beispielsweise Biotin/ Iminobiotin, in Betracht. Insbesondere haben sich hier Fluorophere als geeignet er wiesen, z. B. für die Sequenzierung nach Sanger. Die mit Effektorgruppen substi tuierten Verbindungen sind insbesondere für die Antisense-Therapie von besonde rem Wert.

Die in 3′- und/oder 4′-Position befindliche OH-Gruppe, Amino- oder Thiolgruppe eines Nukleosids, Nukleotids oder Oligonukleotids wird mit einer Spacergruppe, wie beispielsweise eine Aminocarbonsäure, Carbonsäure oder einem Peptid, ge koppelt und anschließend ein Reporter- oder Effektormolekül angeknüpft. Die ent standenen 3′- bzw. 4′-Hydroxyl-, Amino- oder Thiol-modifizierten Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide können dann für die Synthese von Gegensträngen in Anwesenheit eines natürlichen oder synthetischen Templatestranges sowie für die Detektion bestimmter Sequenzen oder die Lokalisierung eines Effektormoleküls an bestimmte Sequenzen in genetischem Material verwendet werden. Sie bieten ins besondere den Vorteil, daß die Modifizierung nicht mehr, wie in bisher bekannten Markierungstechniken, am 5′-Ende des Nukleotids oder an der Nukleobase ange bracht wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der 3′- (4′-)modifizierten Nukleosiden bzw. Nukleotiden gemäß der allgemeinen For mel (1). Verbindungen der allgemeinen Formel (2)

wobei:
Linker: eine selektiv spaltbare Ankergruppierung
X: Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel
Y: Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel
Z: Wasserstoff, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe
R: Wasserstoff
Base: Purin oder Pyrimidinbase oder deren Derivate darstellen,
n: 0 oder 1 ist.

Die Umsetzung zu über einen Linker in 5′-(6′-)Position an einen festen Träger ge bundenen Nukleosiden kann darüber hinaus nach anderen, dem Fachmann bekann ten, Methoden erfolgen. Als Linker-Gruppierung können sämtliche selektiv spaltba ren Ankergruppierungen verwendet werden [z. B. G. B. Fields und R. L. Noble, Int. J. Peptide Prot. Res. 35 (1990), 165-171]. Gruppierungen, die unter schonen den Bedingungen spaltbar sind, wie beispielsweise photochemisch, durch Hydrie rung oder im sauren bzw. alkalischen Bereich, haben sich als besonders geeignet erwiesen. Bevorzugte Linker-Gruppen sind Tritylgruppierungen, die gegebenenfalls substituiert sein können. Methoxy- und Halogenreste sind hier geeignete Substitu enten. Dimethoxy- und o-Chlortritylgruppen haben sich hier als besonders geeignet erwiesen. Außerdem ist das prinzipielle Vorgehen für die Verknüpfung der Linker gruppierung mit der 5′- bzw. 6′-Position von Nukleosiden dem Fachmann bekannt (M.J. Gait: "Oligonucleotide synthesis; a practical approach"; IRL Press, Oxford, Washington DC (1984), S. 12 ff).

Als Trägermaterial ist erfindungsgemäß jedes feste, chemisch inertes Material ge eignet, welches unlöslich in dem jeweils verwendeten Lösungsmittel ist und mög lichst leicht filtrierbar sein sollte. Bevorzugte Trägermaterialien sind anorganische, polymere Materialien (Harze) auf Polystyrol- bzw. Polyethylenglykolbasis.

In dieser Art an feste Träger gebundene Nukleoside werden anschließend mit einem entsprechenden Carbonsäure-, Aminocarbonsäure- oder Peptidderivat in Gegenwart von Aktivierungsreagenz, wie beispielsweise Kondensationsmittel wie DCC, DIC oder HOBT, versetzt.

Nach Verknüpfung der Aminocarbonsäure, des Peptides oder der Carbonsäure oder deren Derivaten oder Salzen mit dem an fester Phase gebundenen Nukleosid oder seinem Analogon, erfolgt die Einführung eines oder mehrerer, gleicher oder ver schiedener Reporter-/Effektormoleküle kovalent selektiv in der Seitenkette oder C- oder N-terminal, beispielsweise über Veresterung, Amidierung, Sulfonamidierung, Sulfonsäureveresterung oder durch Umsetzung mit Isothiocyanaten. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt.

Als Reportermoleküle bzw. Effektormoleküle kommen solche Verbindungen bzw. Verbindungsklassen in Betracht, die sich an eine Hydroxy-, Amino- oder Thiol gruppe kovalent anknüpfen lassen (s. o.).

Die Abspaltung der Nukleosidderivate von der Linkergruppe erfolgt bevorzugt unter schwach sauren, basischen, photochemischen oder reduktiven Bedingungen.

Nukleosidderivate, die an der Spacergruppierung eine oder mehrere Schutzgruppen oder Seitenketten aufweisen, können entsprechend hergestellt werden.

Die auf diese Weise hergestellten Nukleosidderivate können anschließend, nach dem Fachmann bekannten Verfahren, in die entsprechenden 5′- bzw. 6′-Mono-, Di- oder Triphosphate(Nukleotide), Alkylphosphonate, Dialkylphosphinate oder Phos phoramidit überführt werden.

Vorteilhaft ist die erfindungsgemäße Synthese der 5′- bzw. 6′-modifizierten Nu kleosiden insbesondere deshalb, da - anders als bei bekannten Verfahren - problem los ein hoher Überschuß der Farbstoffkomponente eingesetzt und einfach abgetrennt werden kann. Für die vorbekannten Verfahren schließen sich für Abtrennung des nicht-umgesetzten Farbstoffs langwierige und teure chromatographische Auf reinigungsschritte an das eigentliche Herstellungsverfahren an.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (1), wobei Rest R′ eine Triphosphatgruppe darstellt, sind mittels eines Primers und eines Templatestranges und in Gegenwart der vier Nukleosidtriphosphate vorteilhaft als Substrate für DNA/RNA-Polymerasen verwendbar. Als geeignete Polymerasen sind hier T7-, Taq-Polymerase, DNA-Polymerase I und reverse Transcriptasen zu nen nen. Außerdem sind die Verbindungen als Terminatoren bei der enzymatischen DNA/RNA-Sequenzierung geeignet. Die Termination der Synthese kann dabei je weils durch Einsatz eines 3′-(4′-)modifizierten A, C, G, T-Nukleotids der Formel (1) spezifisch bestimmt werden. Dies ist für die Synthese von DNA-Gegensträngen in Anwesenheit eines Templatestranges (und damit auch für die Sequenzierung von DNA-Strängen) von besonderer Bedeutung, da der Einsatz eines modifizierten Nu kleotids einen sehr basenspezifischen Abbruch der Reaktion gewährleistet.

Die Synthese von RNA-Nukleosiden und Oligonukleotiden erfolgt in analoger Art und Weise.

Darüber hinaus ist die Synthese von derivatisierbaren Oligonukleotiden mit Hilfe eines Startnukleotids, welches am 3′-(4′)-Ende eine Spacergruppierung trägt und amino- oder thiovariiert und an einem polymeren Träger fixiert wurde, möglich.

Als Oligonukleotide gelten alle im herkömmlichen Sinn hergestellten DNA- und RNA-Nukleotide, vorzugsweise jedoch in einer Länge von 2 bis 100, besonders be vorzugt 12-50 Nukleotiden (chemische Synthese) bzw. in einer Länge bis ca. 3.000 Nukleotiden (enzymatische Synthese), je nach Effizienz der verwendeten Polymerase.

Die Oligonukleotidsynthese erfolgt, ausgehend von dem Startnukleotid-Träger- Komplex, im herkömmlichen Sinn, d. h. in 3′- und 5′-Richtung und ermöglicht die Synthese eines Oligonukleotids definierter Sequenz.

Die Fixierung des Startnukleosids an handelsüblichen Trägern erfolgt über einen Verbindungsarm (Spacer), der sich nach der Synthese spalten läßt; beispielsweise über die literaturbekannte Bernsteinsäureverknüpfung oder aber über eine Ver knüpfung mit Urethan (Efimov et al., Nucl. Acids. Res. 11, 8369, 1983).

Nach erfolgter Synthese muß das Oligonukleotid mit geeigneten Reagenzien vom Träger abgespalten werden. Die Derivatisierung mit einem beliebigen Fluoreszenz farbstoff erfolgt direkt danach.

Auch die umgekehrte Syntheserichtung (5′ → 3′) von Oligonukleotiden ist möglich, indem das Startnukleosid über die 5′-OH-Gruppe mit der Linkergruppierung des Trägermaterials verknüpft wird und man analog zur herkömmlichen Oligonukleotid synthese verfährt. Die Farbstoffmarkierung des Oligonukleotids kann dabei an der festen Phase erfolgen.

Die so synthetisierten und am 3′(4′)-Ende modifizierten Oligonukleotide können dann zur Detektion von z. B. komplementären Oligonukleotiden bzw. Nucleinsäu ren und entsprechenden Derivate verwendet werden.

Aber auch als in vivo- und in vitro-Sensoren in der Analytik und als Gensonden in der Gentherapie und für diesbezügliche analytische Zwecke sind die erfindungsge mäßen Verbindungen geeignet.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Beispiel 1 Veresterung von Fmoc-Aminosäurederivaten mit dem 2-Chlorotrityl Harz

1 Gramm Harz, das mit 1,1-1,6mmol 2-Chlorotritylchlorid-Linker [K. Barlos, O. Chatzi, D. Gatos, G. Stauropoulos, Int. J. Peptide Prot. Res. 37, (1991), 513-520] beladen ist, wird mehrere Minuten in abs. DCM geschüttelt. Nach Zu gabe von 3 mmol DIEA werden 1,2 mmol Fmoc geschützte Aminosäure zugegeben. Die Reaktionszeit beträgt 90 min. Nach der Zugabe von weiteren 3 mmol DIEA wird mit 5 ml abs. Methanol während ungefähr 30 min die unveresterte Linkerfunk tionalität verethert. Das belegte Harz wird abfiltriert und mehrmals mit DMF, DCM, Isopropanol und letztlich mit Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen im Öl pumpenvakuum wird mit dem quantitativen Ninhydrintest (Beispiel 7b) oder durch UV-spektrometrische Bestimmung der Fmoc-Abspaltung die Aminosäurebeladung bestimmt. Durch die Variation der Aminosäuremenge erhält man Aminosäurebela dungen zwischen 0,05 und 1,1 mmol/g.

Beispiel 2 Nα-Ankupplung von Fluoreszenzfarbstoffen auf harzgebundene Aminosäuren oder Peptide

Pro Äquivalent des harzgebundenen, N-terminal entschützen Peptids oder der zu markierenden Aminosäure werden 3 Äquivalente des Fluoreszenzfarbstoffs, 1,2 Äquivalente DIEA und eine katalytische Menge DMAP (4,4′-Dimethylamino pyridin) in einer Lösung aus DMF/DCM (v/v 4 : 1) in einem Schüttelgefäß mit Fritte während 48 h zur Reaktion gebracht. Um Zersetzungsreaktionen der Farbstoffe zu vermeiden, wird unter Lichtausschluß geschüttelt. Der Reaktionsverlauf kann mit der Ninhydrin-Reaktion oder mit DC verfolgt werden. Sollten noch freie Amino funktionalitäten vorhanden sein, so kann mit Ac₂O/DIEA (Äquivalente/Äqui valente 1 : 2) acetyliert werden. Nicht umgesetzter Farbstoff wird abfiltriert und mehrmals mit jeweils 10 ml DMF, DCM, DMSO, MeOH und letztlich mit Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen im Ölpumpenvakuum können die Aminosäure-Peptid-Farbstoffkonjugate im Kühlschrank gelagert werden.

Orthogonalität der Schutzgruppen erlaubt auch die Einführung eines oder mehrerer, gleicher oder verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe selektiv in die Seitenkette oder N- terminal. Die Einführung von Fluoreszenzfarbstoffen in die Seitenkette von trifunk tionalen Aminosäuren verläuft analog der Na-Ankupplung, jedoch ist der Anteil von DMAP zu erhöhen.

Beispiel 3 Abspaltung vom 2-Chlorotrityl Harz zur Darstellung fluoreszenzmarkierter Aminosäuren oder Fluoreszenzmarkierter Peptide

Die Esterspaltung wird unter schwach sauren Bedingungen durchgeführt. Man ver wendet je 1 g Peptidharz etwa 20 ml einer Mischung aus Eisessig/TFE/DCM im Verhältnis von (v/v/v 1 : 2 : 7) [K. Barlos, O. Chatzi, D. Gatos, G. Stauropoulos, Int. J. Peptide Prot. Res. 37, (1991), 513-520]. Die Abspaltzeit beträgt üblicher weise ungefähr 90 min. Ist kein His (N^im Trt)-Rest enthalten, so kann mit einem Gemisch aus DCM/TFE (v/v 1 : 1) abgespalten werden. Anschließend wird vom Harz abfiltriert und die Peptidlösung mit etwa 100 ml Wasser aufgefüllt. Das zugegebene Wasser verhindert die Aufkonzentration der Essigsäure beim anschließenden Ab destillieren der leicht flüchtigen Komponenten am Rotationsverdampfer. Die hydro phoben Aminosäure- und Peptidderivate werden beim Einrotieren ausgefällt und nun an der Gefriertrocknungsanlage getrocknet.

Beispiel 4 Veretherung von Nukleosiden über die 5′-OH-Gruppe mit dem 2-Chlorotrityl Harz

1 Gramm Harz, das mit 1,1-1,6 mmol 2-Chlorotritylchlorid-Linker beladen ist, wird mehrere Minuten in einer Mischung aus CHCl₃/DMSO (v/v 1 : 2) geschüttelt. Nach Zugabe von 2,5 mmol DIEA werden 0,52 mmol Nukleosid zugegeben. Die Reak tionszeit beträgt ca. 120 min. Nach der Zugabe von weiteren 3 mmol DIEA wird mit 5 ml abs. Methanol während 30 min die unveretherte Linkerfunktionalität mit Methanol verethert. Das belegte Harz wird abfiltriert und mehrmals mit DMF, DCM, Isopropanol und letztlich mit Diethylether gewaschen. Nach dem Trocknen im Ölpumpenvakuum wird mit dem quantitativen Ninhydrintest, im Falle der 3′- Amino-Nukleotide (Beispiel 7 b), durch UV-spektrometrische Bestimmung nach geeigneter Derivatisierung der 3′-Funktionalität des Nukleosids oder durch Abwie gen des Harzes die Harzbeladung bestimmt. Durch die Variation der Nukleosid menge erhält man Harzbeladungen zwischen 0, 1 und 1 mmol/g.

Beispiel 5 Kupplung von Aminosäuren, Peptiden und Carbonsäuren und deren Derivate auf trägergebundene Nukleoside

Die Kupplung erfolgt nach den aus der Peptidchemie bekannten Aktivierungs methoden (Dauer: ca. 12 Stunden). Die Verwendung basenlabiler Schutzgruppen erlaubt die Aminosäurekettenverlängerung oder Fragmentkondensationen nach den bekannten Methoden [M. Bodanszky Principles of Peptide Syntheses, 2nd Edition, Springer 1993, G. B. Fields & R. L. Noble, Int. J. Peptide Prot. Res. 35, (1990), 161-214]

Beispiel 6 Abspaltung von Nukleosiden, Nukleosid-Aminosäuren, Nukleosid-Peptiden, sowie deren Farbstoffderivate vom 2-Chlorotrityl Harz

Die Etherspaltung wird unter sauren Bedingungen durchgeführt. Man verwendet je 1 g beladenem Harz etwa 10 ml einer Lösung aus Dichloressigsäure/DCM im Ver hältnis von (v/v 3 : 97). Die Abspaltzeit beträgt ca. 1 min. Anschließend wird vom Harz abfiltriert und die Produktlösung sofort mit einer äquimolaren Lösung von DIEA/DCM im Verhältnis (v/v 63 : 937) neutralisiert. Man wäscht das Harz mehr mals mit wenig ACN nach. Es werden ca. 10 ml Wasser zugegeben. Das Produkt wird nun an der Gefriertrocknungsanlage getrocknet.

Beispiel 7 Ninhydrin-Test

Zur Durchführung des Ninhydrin-Tests [I. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook, 3. Anal. Biochem, 34, (1970), 595] werden folgende drei Lösungen be nötigt:
Lösung 1: Eine Lösung von 80 g Phenol in 20 ml Ethanol.
Lösung 2: Eine 2%ige Lösung von 33 mg Kaliumcyanid KCN in 50 ml Wasser in Pyridin.
Lösung 3: Eine Lösung von 500 mg Ninhydrin in 10 ml Ethanol.

a) Qualitativer Ninhydrin-Test

Für den Nachweis, ob eine Acylierung quantitativ verlaufen ist, bringt man jeweils zwei bis drei Tropfen der drei Lösungen mit einer Mikrospatelspitze des belegten Harzes in einem Eppendorf gefäß zur Reaktion. Man erwärmt das Reaktionsgemisch auf etwa 5 min im Wasserbad auf 100 °C. Ist die Acylierungsreaktion nicht vollständig verlaufen, so erhält die Lösung eine tiefdunkelblaue Farbe, während im Falle quantitativer Kupplungsreaktionen das Reaktionsgemisch seine gelbe Farbe behält.

b) Quantitativer Ninhydrin-Test

Zur quantitativen Bestimmung der Harzbeladung mit Aminosäure werden die Fmoc-Aminosäurederivate während 40 min mit Pipe ridin/DMF (v/v 40 : 60) entschützt.

Nach dem Waschen mit DMF, Isopropanol und DCM wird das Harz getrocknet. Eine Probe von etwa 3-5 mg wird mit den Lö sungen 1 (4 Tropfen), 2 (8 Tropfen) und 3 (4 Tropfen) im Ther moheizblock während 7 min auf 100 °C erhitzt. Das Reaktions gemisch wird sofort mit 60% Ethanol verdünnt und in einen Meßkolben geeigneter Größe überführt.

Nach der Kalibrierung des UV-Spektrometers mit 60% Ethanol wird die Extinktion bestimmt und durch Einsetzen der entspre chenden Werte in die folgende Gleichung wird die Harzbeladung in µmol/g ermittelt.

Die folgenden aufgeführten Verbindungen wurden gemäß den obigen Beispielen 1-6 synthetisiert:

Aminosäure-/Peptid-Farbstoffkonjugate Beispiel 8 FITC-Gly(OH)3

Ansatz:
0,17 mmol (673 mg) Harz-Gly(Fmoc)
0,5 mmol (193 mg) FITC
Retentionszeit: 10,05/11,00 Min.
Ausbeute (77,9 mg) 91%

HPLC-Analytik:
Säule Nucleosil RP18, 5 µm, 300A, 4 × 250 mm
Gradient 20-100% ACN (0, 1% TFA) 40′ Flowrate 1 ml/min. Abs. bei 235,0 nm und 225,0 nm.

Beispiel 9 FITC-Gly₂(OH)4

Ansatz:
0,43 mmol Harz-Gly₂(Fmoc)
1,3 mmol (504 mg) FITC
Retentionszeit: 8,00 Min.
Ausbeute (220,4 mg) 89%

HPLC-Analytik:
Säule Nucleosil RP18, 5 µm, 300A, 4 × 250 mm
Gradient 20-100% ACN (0,1% TFA) 40′ Flowrate 1 ml/mm.
Abs. 287,5 und 425,0 nm

Beispiel 10 FITC-Gly₄(OH)5

Ansatz:
0,2 mmol Harz-Gly₄(Fmoc)
0,5 mmol (195 mg) FITC
Retentionszeit: 17,5 Min.
Ausbeute (77 mg) 74%

HPLC-Analytik:
Säule Nucleosil RP18, 5 µm, 300A, 4 × 250 mm
Gradient 0-80% ACN (0,1% TFA) 40′ Flowrate 1 ml/min. Abs. bei 287,5 nm.

Beispiel 11 Thymidin-Cys(Trt)(Fmoc)6

Ansatz:
0,25 mmol Harz-Thymidin
0,5 mmol (Fmoc)Cys(Trt)OH
Retentionszeit: 28,5 Min.
Ausbeute: Die Abspaltung erfolgte im analytischen Maßstab

HPLC-Analytik des Rohproduktes:
Säule Vydac RP18, 5 µm, 300A, 4 × 250 mm
Gradient 0-60% ACN (0,1% TFA) 20′. 60-100% 25′ 100% 30′. 0%35′
Flowrate 1 ml/min
Abs. bei 265 nm.

Beispiel 12 Thymidin-Arg(Pmc)(Fmoc)7

Ansatz:
0,25 mmol Harz-Thymidin
0,5 mmol (Fmoc)Arg(Pmc)OH
Retentionszeit: 26,7 Min.
Ausbeute: Die Abspaltung erfolgte im analytischen Maßstab

HPLC-Analytik des Rohproduktes:
Säule Vydac RP18, 5 µm, 300A, 4 × 250 mm
Gradient 0-60% ACN (0,1% TFA) 20′, 60-100% 25′ 100% 30′, 0% 35′
Flowrate 1 ml/min
Abs. bei 265 nm.

Beispiel 13 Thymidin-Leu(Fmoc)8

Ansatz:
0,25 mmol Harz-Thymidin
0,5 mmol (Fmoc)LeuOH
Retentionszeit: 25,5 Min.
Ausbeute: Die Abspaltung erfolgte im analytischen Maßstab

HPLC-Analytik des Rohproduktes:
Säule Vydac RP18, 5 µm, 300A, 4 × 250 mm
Gradient 0-60% ACN (0,1% TFA) 20′, 60-100% 25′ 100% 30′, 0% 35′
Flowrate 1 ml/min
Abs. bei 265 nm

Beispiel 14

Beispiel 14, Verbindung 9 wurde sukzessive am Träger aufgebaut (1. Belegung des Harzes mit Thymidin, 2. Ankopplung einer (Fmoc)-Aminosäure, 3. Entschützung der Aminosäure, 4. Ankopplung des Farbstoffs).

Thymidin-Gly-FITC 9

Ansatz:
0,5 mmol Harz-Thymidin
0,5 mmol (Fmoc)Gly(OH)
1,0 mmol FITC
Ausbeute: Die Abspaltung erfolgte im analytischen Maßstab
R_f-Wert (Kieselgel 60, F₂₅₄, Merck): 0,35; CHCl₃/MeOH (v/v 9 : 1).

Die folgenden Beispiele 15-17, Verbindungen 10-12, wurden ebenfalls am Träger aufgebaut, anschließend vom Harz abgespalten und in Lösung zu den Triphosphaten weiter umgesetzt.

Die Triphosphatsynthese wurde nach [Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem. 54, 631-635, (1989)] durchgeführt.

Beispiel 15 3′-Amino-Gly-FITC,3′-Desoxy,5′-Triphosphat-Thymidin 10

Ansatz:
0,031 mmol Harz-3′Amino-3′-Desoxy-Thymidin
0,047 mmol FITC-Gly(OH)
Retentionszeit: 11,95 Min.
Ausbeute: über alle Stufen (17,4 mg) 60,1%
R_f-Wert (Kieselgel 60, F₂₅₄, Merck): 0,59; Isoprop./NH₄OH/Wasser (v/v/v 7 : 1 : 4)

HPLC-Analytik des Rohproduktes:
Säule Supersphere RP18(e); 3 µm; 2 × 125 mm Grad. 0-2% B 20′; 2-4% B 25′; 4-20% B
A = TEAA, pH 7.0; B = ACN Flowrate 0,15 ml/min. Abs. bei 265 nm

Beispiel 16 3′-Amino-Gly₂-FITC,3′-Desoxy,5′-Triphosphat-Thymidin 11

Ansatz:
0,031 mmol Harz-3′Amino-3′-Desoxy-Thymidin
0,052 mmol FITC-Gly₂(OH)
Retentionszeit: 12,8 Min.
Ausbeute über alle Stufen (19,9 mg) 54%
R_f-Wert (Kieselgel 60, F₂₅₄, Merck): 0,29; CHCl₃/MeOH (v/v 1 : 1)

HPLC-Analytik des Rohproduktes:
Säule Supersphere RP18(e); 3 µm; 2 × 125 mm Grad. 0-2% B 20′; 2-4% B 25′; 4-20% B
A = TEAA, pH 7.0; B = ACN Flowrate 0, 15 ml/min. Abs. bei 265 nm

Beispiel 17 3′-Amino-Gly₄-FITC,3′-Desoxy,5′-Triphosphat-Thymidin 12

Ansatz:
0,031 mmol Harz-3′Amino-3′-Desoxy-Thymidin
0,045 mmol FITC-Gly₄(OH)
Retentionszeit: 12,8 Min.
Ausbeute über alle Stufen (21,9 mg) 64,2%
R_f-Wert (Kieselgel 60, F₂₅₄, Merck): 0,53 Isoprop./NH₄OH/Wasser (v/v/v 7 : 1 : 4)
R_f-Wert (Kieselgel 60, F₂₅₄, Merck): 0,26 CHCl₃/MeOH (v/v 1 : 1)

Beispiel 18 Verwendung von 3′-modifizierten Nukleotiden für die enzymatische DNA-Se quenzierung

Es wurden folgende, nach Beispiel 1 bis 6 hergestellte, Nukleotide verwendet:

1: n = 0
2: n = 1
3: n = 2
4: n = 4

1 µg M13mp18 einsträngige DNA (5 µl), 2 µl Fluoreszin markierter Universal- Primer (1 pmol, Pharmacia LKB), 2 µl Mn-Puffer I (311 mM Tris· HCl, pH 7.5), 2 µl Mn-Puffer II (177 mM DTT) und 2 µl Mn-Puffer III (62 mM MnCl₂, 460 mM Natriumisocitrat) werden miteinander vermischt und auf 70 °C erhitzt und dann auf 25 °C gekühlt (ca. 40 min). Zum dem auf 37 °C erhitzten Template und Primer werden dann 2 µl einer verdünnten T7 DNA-Polymerase (4 Einheiten, Phamacia) gegeben. In der Zwischenzeit werden 3 µl eines Termination-Mixes (T-mix 1 : 150 µl/Verbindung 1; T-mix Verbindung 2 : 200 µM II; T-mix Verbindung 3 : 300 µM Verbindung 4; außerdem erhält jeder Mix: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 50 mM NaCl, 40 mM Tris· HCl, pH 7.5) in vier Reak tionsgefäße pipettiert und mindestens 1 Minute auf ca. 37 °C erwärmt. Anschlie ßend werden sofort 3,8 µl des ersten Mix (annealing mix) in die vorgewärmten Termination-Mixe pipettiert. Nach einer Inkubation von ca. 10 Minuten bei 37 °C werden zu jeder Reaktionslösung 4 µl eines Stopreagenzes (deionisierte Formamid lösung, Dextran Blau) gegeben. Die Reaktionslösungen werden für 2 Minuten bei ca. 90 °C erhitzt und auf ein 6%iges denaturierendes Sequenzgel in die einzelnen Taschen gegeben (à 6 µl). Anschließend wurden die einzelnen DNA-Fragmente mittels eines Fluoreszenz-Detektionsgerätes nachgewiesen und identifiziert.

Fig. 1 zeigt den Quotient aus Fluoreszenzemission F (λ_ex = 488 nm; λ_em = 520 mm) und Adsorption A (λ_abs = 265 nm) für die Verbindungen 1-4 be stimmt während RP-HPLC-Analyse.

Für Verbindung 1 wurden danach die geringste Fluoreszenzintensität erhalten. Die Intensität für die Verbindungen 2 bis 4 steigt deutlich mit Länge der Spacerfunktion in 3′-(4′-)Position an.

Alle vier modifizierten Nukleotide werden von der angesetzten DNA-Polymerase als Substrat akzeptiert und zeigen vergleichbare Terminationsqualität, wie z. B. ddTTP. Dies ist bemerkenswert, da aufgrund der sperrigen Reste in 3′-(4′-)Position der Nukleotide der erfindungsgemäßen Verbindungen 2 bis 4 zu erwarten gewesen wäre, daß die Verbindungen von DNA-Polymerasen nicht als Substrate erkannt und umgesetzt werden.

Abkürzungen

Entsprechen den Vorschlägen der IUPAC-IUB Kommission für biochemische Nomeuklatur (J. Biochem. 138, (1984), 9; J.Biol. Chem. 247, (1972), 977; Biochemistry 9, (1970), 3471).

ACN
Acetonitril
AcOH	Eisessig
AS	Aminosäure
CDCl₃	Deuterochloroform
CH₃OH	Methanol
CHCl₃	Trichlormethan
DC	Dünnschichtchromatographie
DCA	Dichloressigsäure
DCC	N-N′-Dicyclohexylcarbodiimid
DCM	Dichlormethan
ddTTp	2′,3′-Didesoxy, 5′-Triphosphat
DIC	N-N′-Diisopropylcarbodiimid
DIEA	Diisopropylethylamin
DMAP	4,4′-Dimethylaminopyridin
DMF	N,N-Dimethylformamid
DMTr	4,4′-Dimethoxytrityl
DNA	Desoxynucleic Acid
Et₂O	Dieethylether
FITC	Fluoresceinisothiocyanat (5-Isomer)
Fmoc	9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt	1-Hydroxybenzotriazol
HPLC	High Performance Liquid Chromatography
KCN	Kaliumcyanid
Linker	Ankergruppe zwischen AS und dem Harz
MeOH	Methanol
MG	Molgewicht
ml	Milliliter
mM	Millimolar
Mn	Mangan
nm	Nanometer
NMR	Nuclear Magnetic Resonance
Pmc	Pentamethylchroman
R_f	Relative Wanderungsstrecke der Probe bei der DC
RNA	Ribunucleic Acid
RP	Reversed-Phase
RT	Raumtemperatur
Rt	Retentionszeit
SPPS	solid phase peptide synthesis
T	Thymidin
T7	Escherichia coli Phage T7
Taq	Thermococcus aquaticus
TBTU	2-(1H-Benzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uroniumtetrafluoroborat
TEAA	Tetraethylammoniumacetat
TFA	Trifluoressigsäure
TFE	Trifluorethanol
Tris	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Trt	Triphenylmethyl (Trityl)
TTp	5′-Triphosphat-Thymidin
UV	Ultraviolett
VIS	Visible
µl	Mikroliter

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel (1) wobei:
R′ Wasserstoff, Mono-, Di- oder Triphosphat, Alkylphosphonat, Dialkylphosphinat oder Phosphoramidit
X Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel
Y Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel
Z Wasserstoff- Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe
R Spacergruppierung, woran eine nicht-radioaktive, detektierbare Gruppe oder ein Effektormolekül gebunden ist,
Base Purin oder Pyrimidinbase oder deren Derivate darstellen,
n 0 oder 1 ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spacergruppierung des Restes R 2 bis 12 Atome aufweist.

3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Rest R eine (Aminoacyl)_2-6-Gruppierung aufweist.

4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-radioaktive, detektierbaren Gruppe ein Fluoreszenzfarbstoff ist.

5. 3′-Amino-(glycly)_2-6-FITC-3′-deoxy-5′-triphosphat-Nukleotide.

6. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen einer der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der allgemeinen Formel (2) wobei:
Linker eine selektiv abspaltbare Ankergruppierung
X Sauerstoff, Stickstoff, Kohlenstoff oder Schwefel
Y Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel
Z Wasserstoff, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe
R Wasserstoff
Base Purin oder Pyrimidinbase oder deren Derivate darstellen,
n 0 oder 1 ist
über die Linker-Gruppierung an einen festen Träger gebunden werden, eine gegebenenfalls durch Schutzgruppen versehene bi- oder polyfunktionelle Verbindung, anschließend eine gegebenenfalls reaktivierte, detektierbare Farbstoffkomponente zugegeben wird, die Abspaltung des Nukleosidderivats von der Trägermix vorgenommen wird und gegebenenfalls eine Derivatisierung der 5′-Position erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der bi- bzw. poly-funktionellen Verbindung um ein oder mehrere Carbonsäure-, Aminocarbonsäure- oder Peptidderivate handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurekomponente in der ein- oder zweifachen äquimolaren Menge der Verbindung (2) zugesetzt wird und dieser Vorgang gegebenenfalls ein oder mehrere Male wiederholt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Linker-Gruppierung um einen unsubstituierten Methoxy- oder Halogen substituierten Tritylrest handelt.

10. Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (1) zur Sequenzierung von RNA- oder DNA-Sequenzen.

11. Verwendung der allgemeinen Formel (1) zum nicht-radioaktiven Nachweis von Oligo-, Polynukleotiden oder Nukleinsäuren.

12. Verwendung der Verbindungen/der allgemeinen Formel (1) als Antisense- bzw. Gentherapeutika.