DE4239531A1 - Reagenz zur Kupplung verschiedener Substanzen an Nukleinsäuren sowie Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents
Reagenz zur Kupplung verschiedener Substanzen an Nukleinsäuren sowie Verfahren zu dessen HerstellungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Ribooligonukleotid, das heißt ein
Reagenz zur Kupplung mindestens eines Moleküls an Nukleinsäuren, insbesondere
Ribonukleinsäuren (RNA), ein Verfahren zu dessen Herstellung, dessen
Verwendung sowie ein auf diesem modifizierten Ribooligonukleotid basierendes
Reagenzkit. Bei diesem Kupplungsreagenz handelt es sich um ein spezifisch
modifiziertes Ribooligonukleotid, das im Prinzip aus beliebig vielen, mindestens aber
aus einem Ribonukleotid besteht. Mit Hilfe dieses Kupplungsreagenz ist es möglich,
mittels enzymatischer Methoden verschiedenste Markierungen, insbesondere
Fluoreszenzmarkierungen aber auch Digoxigenin- oder Biotinderivate, oder auch
andere Moleküle, wie z. B. Proteine an Nukleinsäuren, insbesondere
Ribonukleinsäuren (RNA), zu kuppeln.
Die Kupplung unterschiedlichster Moleküle an Nukleinsäuren ist ein weitverbreitetes
Verfahren in der Molekularbiologie. Besonders zur Markierung von Nukleinsäuren
sind derartige Verfahren von großer Bedeutung. Sie werden eingesetzt für Protein-
Nukleinsäure-Wechselwirkungsstudien, Nukleinsäure-Strukturuntersuchungen, zur
DNA- und RNA-Sequenzierung oder, für die medizinische Diagnostik von enormer
Bedeutung, bei Hybridisierungsverfahren, insbesondere in-situ-
Hybridisierungsverfahren. Die Markierung erfolgte bisher hauptsächlich auf
radioaktiver Basis mit Hilfe von isotop-substituierten Nukleotiden und
entsprechenden Enzymen. Da radioaktiv markierte Stoffe aber recht teuer sind, der
Umgang mit ihnen nicht ungefährlich ist und auch die Entsorgung des radioaktiven
Abfalls aus ökologischen Erwägungen heraus problematisch ist, gibt es seit einiger
Zeit Bemühungen, alternative (d. h. nicht radioaktive) Markierungsmöglichkeiten
einzusetzen.
Die wohl am häufigsten eingesetzte Markierungstechnik für RNA bedient sich eines
3′,5′-Bisphosphats, normalerweise [5′-32P]pCp(Cytidin-3′,5′-Bisphosphat), aber
pCp kann auch mit anderen Isotopen als 32P markiert werden. Unter Katalyse einer
RNA-Ligase wird dieses pCp an das 3′-Ende einer RNA gekuppelt. Das Produkt
dieser Reaktion ist ein RNA-Molekül, das um ein Nukleotid verlängert ist und eine
radioaktive Markierung am 3′-Terminus trägt. Diese Methode erlaubt ausschließlich
die radioaktive Markierung von RNA.
In der Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 12 (4) 1791-1810 (1984) ist eine
enzymatische Methode zur Fluoreszenzmarkierung von tRNA und
Oligodeoxynukleotiden beschrieben. Als Kupplungsreagenz wird ein modifiziertes
pdCp verwendet, bei dem ein Sauerstoffatom der 3′-Phosphatgruppe gegen ein
Schwefelatom ausgetauscht ist, so daß ein Molekül der Form pdCp(S) entsteht. An
dieses Schwefelatom wird ein fluoreszentes Molekül, ein Biman, gebunden. Mittels
T4 RNA-Ligase wird dieses Molekül dann an das 3′-Ende einer tRNA, sowie an
verschiedene synthetische Oligodeoxynukleotide, die als Modelle für
Deoxynukleinsäuren verwendet werden, gebunden. Nachteilig dabei ist, daß man bei
der Auswahl des Fluoreszenzmarkers sehr beschränkt ist, da sich nur wenige der
gebräuchlichen Marker an den Schwefel binden lassen.
Im "Journal of Histochemistry and Cytochemistry" 29, 227-237 und 238-246 (1981), ist
eine Methode beschrieben, mit der sich durch Periodatoxidation der benachbarten
2′,3′-Hydroxylgruppen eines endständigen Ribosids geeignete Markierungen an die
entstehenden Aldehydgruppen binden lassen. Nachteilig an dieser Methode sind die
auftretenden Nebenreaktionen. So geht ein Großteil des Produktes durch die
zwangsläufig eintretende β-Eliminierung verloren. Lediglich bei Verwendung von
Hydraziden gelangt man zu befriedigenden Ergebnissen, da in diesem Fall keine β-
Eliminierung eintritt. Ein weiterer Nachteil ist, daß die als Donor verwendeten
Substanzen einer recht aufwendigen chemischen Vorbehandlung unterzogen werden
müssen. Darüberhinaus haben derartige chemische Markierungsmethoden gegenüber
enzymatischen Verfahren ganz allgemein den großen Nachteil, weniger spezifisch zu
sein. Durch die hohe Spezifität von Enzymen werden Nebenreaktionen von
vornherein weitestgehend ausgeschlossen.
Einen Fortschritt bringt bereits die von R.W. Richardson und R.I. Gumport in der
Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 11 (18), 6167-6184 (1983) beschriebene weitere
Markierungsmethode für RNA. Es wird vorgeschlagen, β-substituierte ADP-Derivate
der Form Ado-5′PP-X dazu zu verwenden, unter Katalyse des Enzyms T4 RNA-
Ligase den Molekülteil P-X unter Bildung einer 3′-Phosphodiester-Bindung an das
3′-Ende einer RNA zu binden. X kann dabei z. B. ein Fluoreszenzmarker wie
Fluoreszein oder Rhodamin sein. Ein Nachteil dieser Methode ist darin zu sehen, daß
die Synthese der ADP-Derivate relativ kompliziert und aufwendig ist. Darüberhinaus
ist auch bei dieser Methode die Anzahl der Markersubstanzen, die verwendet werden
können, sehr eingeschränkt.
Ein weiterer Fortschritt ist in der Methode von Zuckermann et al. (vgl. Zeitschrift
"Nucleic Acids Research" 15 (13), 5305-5321 (1987)) zu sehen. Die Autoren
beschreiben ein Verfahren zur Synthese von DNA-Oligomeren mit einer freien 3′-
Thiolgruppe, die mit geeigneten Proben markiert werden können. Die SH-Gruppe,
die zur Bindung des Markers vorgesehen ist, fungiert während der Synthese als
Bindemolekül an das Säulenmaterial. Dies bedingt aber beispielsweise, daß nur ein
Marker an das Oligonukleotid gebunden werden kann. Ein weiterer Nachteil ist, daß
eine freie SH-Gruppe relativ empfindlich ist, so daß eine längere Aufbewahrung des
unmarkierten Oligonukleotids kritisch ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein spezielles Ribooligonukleotid, d. h.
ein Reagenz zur Kupplung mindestens eines Moleküls, allgemeiner betrachtet
verschiedener Substanzen, insbesondere eines Fluoreszenzmarkers, eines
Biotinderivates, eines Digoxigeninderivates oder eines Proteins an Nukleinsäuren,
insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), zur Verfügung zu stellen, das die genannten
Nachteile vermeidet, dessen Verwendung also auf enzymatischen Umsetzungen
beruht und dadurch eine hohe Spezifität besitzt, die einfach durchführbar ist und die
es erlaubt, viele verschiedene Substanzen an Nukleinsäuren zu kuppeln. Weiterhin ist
es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, spezifische Verwendungsmöglichkeiten
für das modifizierte Ribooligonukleotid, sowie ein Reagenzkit auf der Basis dieses
Ribooligonukleotids zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Kupplungsreagenz mit einer Struktur
gemäß Formel (I) nach Anspruch 1 oder (II) nach Anspruch 2 oder (III) nach
Anspruch 3 zur Verfügung gestellt wird. An dieses Kupplungsreagenz wird das
Molekül R3 (oder die Moleküle), das an die Nukleinsäure gekuppelt werden soll,
gebunden und mittels eines einfachen Verfahrens mit der zu markierenden
Nukleinsäure gekuppelt. Das Molekül (R3) das mittels des Kupplungsreagenz an eine
Nukleinsäure gekuppelt wird, ist bevorzugt ein Fluoreszenzmarker, z. B. ein
Fluoreszeinderivat, kann aber beispielsweise auch ein Digoxigenin- oder
Biotinderivat oder ein Protein sein. Unabhängig von der Natur dieses Moleküls R3
wird es im folgenden der Einfachheit halber als Marker bezeichnet. Grundsätzlich ist
auch die Einführung eines radioaktiven Isotops möglich, wobei im Gegensatz zu dem
herkömmlicherweise für radioaktive Markierungen benutzten pCp mit dem
erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz auch "exotische" Isotope , wie z. B. 125J
eingeführt werden können.
Die durch das erfindungsgemäße Kupplungsreagenz nunmehr gute Verfügbarkeit von
Fluoreszein-markierter RNA ermöglicht es auch, RNA-Sequenzanalysen in Analogie
zu DNA-Sequenzanalysen mit Hilfe von DNA-Sequenzanalysegeräten automatisch
durchzuführen. Die automatische DNA-Sequenzanalyse ist ausführlich beschrieben
bei Ansorge et al., Zeitschrift "Nucleic Acids Res". 16, 2203 (1988).
Die Option, neben Markersubstanzen auch Proteine mit Hilfe von modifizierten
Ribooligonukleotiden gezielt an Nukleinsäuren kuppeln zu können, eröffnet ganz
neue Möglichkeiten in der Manipulation von Nukleinsäuren. Durch Kupplung von
entsprechenden Nukleasen an Ribooligonukleotide, die als Sonde eingesetzt werden,
ist es möglich, Nukleinsäuren an genau definierter Stelle zu spalten. Daß hierfür
großer Bedarf besteht, wird von U. Englisch und D.H. Gauss explizit betont: "An der
Möglichkeit zur künstlichen ortsspezifischen Spaltung von immer wieder anderen
RNA- oder DNA-Einzelsträngen besteht Bedarf." [Chemisch modifizierte
Oligonukleotide als Sonden und Agentien; Zeitschrift "Angewandte Chemie" 103 (6),
629-739 (1991)]. Besonders vorteilhaft ist die Kupplung eines DNA-spaltenden
Enzyms an ein Ribooligonukleotid, da auf diese Weise ausgeschlossen ist, daß das
Enzym das als Sonde fungierende Oligonukleotid, an das es gekoppelt ist, zerstört.
Weitere Spezifikationen im Hinblick auf die erfindungsgemäße RNA sind
Gegenstand der Unteransprüche.
Mit anderen als im Hauptanspruch gebrauchten Worten besteht das
erfindungsgemäße Kupplungsreagenz aus einem Ribooligonukleotid beliebiger
Länge, bei dem an eine oder mehrere 3′-Phosphatgruppen direkt oder über eine
Spacergruppe eine reaktive Gruppe, insbesondere eine Aminogruppe gebunden ist.
Auch eine Sulfhydrylgruppe ist als reaktive Gruppe einsetzbar, sie ist allerdings
empfindlicher und reagiert nicht mit so vielen Substituenten wie eine Aminogruppe.
Mit der minimalen Anzahl an Nukleotiden, mit der es erfindungsgemäß
funktionsfähig ist, besitzt das Kupplungsreagenz z. B. die Form gemäß Anspruch 2:
wobei jeweils
R1 eine Phosphatgruppe
R2 eine Nukleobase, insbesondere Cytidin
R3 das zu kuppelnde Molekül und
R4 ein Wasserstoffatom bedeuten,
und wobei m = 1, n1 = 1 und n2 = 1.
R2 eine Nukleobase, insbesondere Cytidin
R3 das zu kuppelnde Molekül und
R4 ein Wasserstoffatom bedeuten,
und wobei m = 1, n1 = 1 und n2 = 1.
Bei Verwendung der Basen Adenin, Guanin oder Uracil erhält man ebenfalls ein
erfindungsgemäß funktionierendes Kupplungsreagenz, die Umsatzraten der
Kupplungsreaktion liegen allerdings bis zu 50% niedriger als bei Verwendung von
Cytidin. Das Ribooligonukleotid kann an seiner 3′Phosphatgruppe mit weiteren
Nukleotiden verlängert werden, die ebenfalls substituiert sein können.
In einer weiteren Ausführungsform enthält die als Spacer verwendete Alkylkette
keine Phosphatgruppe und damit auch keinen Rest R4. An das C-Atom der
Alkylkette, an das nach den Ansprüchen 1 und 2 eine Phosphatgruppe gebunden ist,
ist dann statt dessen ein Wasserstoffatom gebunden. Eine Verlängerung des
Kupplungsreagenz auf die oben beschriebene Art ist dann nicht möglich und das
Kupplungsreagenz verfügt nur über ein einziges Markermolekül R3.
Einer der Vorteile der Verwendung eines modifizierten Ribooligonukleotids als
Kupplungsreagenz liegt darin, daß seine Kupplung an das 3′-Ende einer
Nukleinsäure enzymatisch erfolgen kann, unter Verwendung einer RNA-Ligase,
insbesondere der T4-RNA-Ligase. Die Mindestanforderungen dieses Enzyms an sein
Substrat sind ein 3′,5′-Ribonukleosid-Bisphosphat. Ribooligonukleotide, die an
ihrem 5′-Ende eine solche Gruppe enthalten, werden von der RNA-Ligase an die 3′
OH-Gruppe einer beliebigen Ribonukleinsäure gebunden. Auch an eine DNA kann
das Reagenz gekuppelt werden, es muß hierzu nur vor der Kupplung ein
Ribonukleotid an das 3′-Ende der DNA angehängt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die den Marker bindende reaktive Gruppe
über einen Phosphat enthaltenden Spacer an die 3′-Phosphatgruppe des
Kupplungsreagenz gebunden. Der Spacer ist eine Alkylkette mit einer Länge
zwischen 1 und 30 C-Atomen, an den eine Phosphatgruppe gebunden sein kann. An
dieser Phosphatgruppe des Spacers kann das Kupplungsreagenz weiter verlängert
werden: Entweder, indem ein weiteres Nukleosid, an das wiederum ein Marker
gebunden sein kann, angehängt wird (siehe Formel I), oder indem direkt weitere
Markermoleküle mit Spacer eingeführt werden (siehe Formel II).
Da die Länge des Ribooligonukleotids ganz nach Bedarf gewählt werden kann und
prinzipiell die Möglichkeit besteht, Marker beliebig an mehrere oder alle
Phosphatgruppen mit Ausnahme der 5′terminalen Phosphatgruppe zu binden, steht
mit dem erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz ein Reagenz zur Verfügung, mit dem
Nukleinsäuren in einem Arbeitsschritt mit mehreren Markern gekuppelt werden
können, wodurch beispielsweise ein stärkeres Signal erhalten wird. Insbesondere im
Zusammenhang mit in situ Hybridisierungsverfahren ist dies ein wesentlicher Vorteil
des erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz, da es bei konventionellen
Markierungsmethoden sehr aufwendig ist, zu einer Signalverstärkung zu gelangen.
Die Synthese des Kupplungsreagenz erfolgt analog zur automatischen DNA-
Synthese. Es ist erfindungswesentlich, daß das Kupplungsreagenz automatisch mit
Hilfe von herkömmlichen DNA-Synthesegeräten synthetisiert werden kann, wobei
der Synthesezyclus in geeigneter Weise auf die Belange der RNA-Synthese
modifiziert ist.
Das heißt, es werden Ribonukleotide anstatt Desoxyribonukleotiden als Bausteine
verwendet und statt Thymidin wird Uracil eingesetzt. Weiterhin wird die 2′-OH-
Gruppe durch eine Schutzgruppe, beispielsweise eine Silylgruppe während der
Reaktion geschützt. Schließlich beträgt die Reaktionszeit bei der RNA-Synthese ca.
10 min gegenüber ca. 3 min bei der DNA-Synthese.
Das Ribooligonukleotid wird nach der Phosphoramidit-Methode, die im Einzelnen
beschrieben ist bei T. Atkinson und M. Smith (in: Oligonucleotide Synthesis; A
Practical Approach; M. J. Gait (Hrsg.) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1984) an
der Festphase von 3′ nach 5′ aufgebaut.
Die Einführung einer reaktiven Aminogruppe erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines
speziellen Aminierungsreagenz der Form (1-Dimethoxytrityloxy-3-
fluorenylmethoxycarbonylamino-propan-2-yl)-(2-cyanoethyl)-(N,N-diiso-propyl)-
phosphoramidit (z. B. bei der Firma Glen Research [Sterling, Vancouver, Kanada] als
5′-Branched Modifier C3 erhältlich). Bei Verwendung dieses Aminierungsreagenz
resultiert ein Kupplungsreagenz mit einem 3′-terminalen Nukleosid. Dieses kann
weiter modifiziert werden, beispielsweise, indem die 2′- und 3′-OH-Gruppen zu
Aldehydgruppen oxidiert werden. Diese Aldehydgruppen können mit Aminogruppen
unter Ausbildung einer Schiff′schen Base reagieren. Läßt man die Aldehydgruppen
mit entsprechenden Aminogruppen von Enzymen reagieren, erreicht man eine
Bindung des Enzyms an das Oligonukleotid.
Erfolgt keine Modifikation des endständigen Nukleosids, besteht die Gefahr, daß die
3′-OH-Gruppe dieses Nukleosids mit der 5′-Phosphatgruppe gleichartiger Moleküle
reagiert. Um eine solche Selbstligierung des erfindungsgemäßen Ribooligonukleotids
zu vermeiden, wodurch ein kleiner Prozentsatz des Kupplungsreagenz inaktiviert
werden kann, kann das Nukleosid am 3′-Ende mittels ß-Eliminierung abgespalten
und dadurch die Selbstligierung unterbunden werden.
Alternativ kann die reaktive Aminogruppe auch mit einem Aminierungsreagenz der
Form (1-Dimethoxytrityloxy-3-fluorenylmethoxycarbonylamino-propan-2-succi-noyl)
aminoalkan (z. B. bei der Firma Glen Research als 3′-Amino-Modifier-CPG
erhältlich) eingeführt werden, wobei direkt eine 3′-Phosphatgruppe gemäß Formel
(I) oder (II) resultiert. In diesem Fall spart man sich die β-Eliminierung, wenn man
kein endständiges Nukleosid wünscht.
Mit der eingeführten Aminogruppe werden dann verschiedene Substanzen (R3), die
leicht mit einer Aminogruppe reagieren, wie Fluoreszenzmarker, z. B. ein
Fluoreszeinderivat, oder Digoxigenin- oder Biotinderivate oder auch Proteine,
insbesondere Nukleasen, verknüpft. Aktivierte Substituenten können vorliegen als
Isothiocyanate, Isocyanate, als N-Hydroxysuccinimidester, p-Nitrophenylester,
Sulfonsäurechloride, Triazinchloride oder als Säureazide.
Bevorzugt werden folgende Substanzen als Marker verwendet:
Fluoreszein-Succinimidester, NBD-F (4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3diazol), Tetramethylrhodamin5(6)isothiocyanat, Texas Rot (Sulphorhodamin-101- Säurechlorid), Biotin-Succinimidester, Digoxygenin-Succinimidester.
Fluoreszein-Succinimidester, NBD-F (4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3diazol), Tetramethylrhodamin5(6)isothiocyanat, Texas Rot (Sulphorhodamin-101- Säurechlorid), Biotin-Succinimidester, Digoxygenin-Succinimidester.
Neben derartigen Markersubstanzen können auch Proteine, insbesondere Nukleasen
an das Kupplungsreagenz gebunden werden. Dieses "Crosslinking" eines Enzyms an
ein Oligonukleotid kann neben der oben bereits beschriebenen Methode prinzipiell
auf folgenden Wegen erfolgen: Zum einen kann durch Einbau eines Cysteinrestes
eine freie Sulfhydrylgruppe in das Enzym eingebaut werden (siehe R. Zuckermann et
al., Zeitschrift "J. Am. Chem. Soc." 110, 1614 (1988)), die dann mit der
Sulfhydrylgruppe eines sogenannten Heteroquervernetzungsreagenz (z. B. N-
succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionat) unter Ausbildung einer Disulfidbrücke
reagiert. Der Succinimidylrest des Heteroquervernetzungsreagenz reagiert mit der
Aminogruppe des Kupplungsreagenz, wodurch das Enzym über das
Vernetzungsreagenz an das Kupplungsreagenz gebunden wird. Eine weitere
Möglichkeit, eine freie SH-Gruppe in das entsprechende Enzym einzuführen, ist die,
eine Aminogruppe chemisch in eine SH-Gruppe umzuwandeln (siehe Carlsson et al.,
Zeitschrift "Biochem. J". 173, 723-737 (1978)). Die eigentliche Quervernetzung
erfolgt wie oben beschrieben. Eine dritte Möglichkeit der Bindung eines Enzyms an
das Kupplungsreagenz besteht in der Verwendung eines
Homoquervernetzungsreagenz, das im Gegensatz zum oben genannten
Heteroquervernetzungsreagenz zwei Succinimidylreste besitzt. Es reagiert sowohl mit
der Aminogruppe des Kupplungsreagenz als auch mit einer Aminogruppe des
Enzyms.
Die Einführung einer Phosphatgruppe am 5′-Terminus des Ribooligonukleotids, die
für die Reaktion des Ribooligonukleotids mit der zu markierenden Nukleinsäure
nötig ist, erfolgt bevorzugt mittels eines Phosphorylierungsreagenz der Form: 2-[2-
(4,4′-Dimethoxy-trityloxy)ethylsulfonyl]ethyl-(2-cyanoethyl)-(N,N-di-isopropyl)
phosphoramidit (z. B. bei der Firma Glen Research als Chemical Phosphorylation
Reagent erhältlich). Eine solche 5′-Phosphorylierung ist auch mit anderen Methoden
möglich, z. B. mittels ATP und dem Enzym Polynukleotidkinase. Diese Methode ist
aber insbesondere im größeren Maßstab äußerst umständlich und langwierig.
Unter Verwendung der entsprechenden aktivierten Nukleoside sowie der oben
beschriebenen Aminierungs- und Phosphorylierungsreagenzien kann das
erfindungsgemäße Kupplungsreagenz mit Hilfe konventioneller DNA-Synthesegeräte
automatisch synthetisiert werden. Im folgenden wird als Ausführungsbeispiel die
Synthese eines Kupplungsreagenz der Form 5′pCpCp-Fluoreszein näher erläutert.
Mit Hilfe des DNA-Synthesegerätes 394 der Firma Applied Biosystems [Foster City,
Kalifornien, USA] wurde mittels der Phosphoramidit-Methode zunächst ein
modifiziertes RNA-Triplett hergestellt aus folgenden Bausteinen (Richtung: 5′-3′):
5′ 1.) Phosphorylierungsreagenz (Chemical Phosphorylation Reagent)
2.) RiboC-Phosphoramidit
3.) RiboC-Phosphoramidit
4.) Aminierungsreagenz (5′-Branched Modifier C3)
3′ 5.) RiboA-CPG (control pore glass).
2.) RiboC-Phosphoramidit
3.) RiboC-Phosphoramidit
4.) Aminierungsreagenz (5′-Branched Modifier C3)
3′ 5.) RiboA-CPG (control pore glass).
Die Reagenzien wurden bei der Fa. Glen Research bezogen, sind aber auch bei
anderen Firmen erhältlich.
Für die Synthese von ca. 1 µmol pCC(Amino)A werden 30 mg RiboA-CPG in eine
Säule gefüllt und diese danach abgedichtet. Der Synthesezyklus der RNA wird
gestartet. Die Einstellung am DNA-Synthesegerät ist: Tr off, auto. Das bedeutet, daß
die Schutzgruppen abgespalten sowie das Produkt vom Träger abgespalten wird.
Hierzu wird nach Beendigung der Reaktion die Säule gespült mit Ethanol:NH3/1 : 3.
Inkubation der erhaltenen Lösung für 12 h bei 55°C vervollständigt die Abspaltung
der Schutzgruppen.
Das so erhaltene Produkt wird lyophilisiert und anschließend wieder aufgenommen in
0,2 ml 1 M Tetraethylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran. Anschließend wird für 6 h
bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch die Schutzgruppen an der Ribose
abgespalten werden.
Dieser Lösung wird nun 0,3 ml 1 M Ammoniumacetat-Lösung, pH 5,3, zugesetzt und
mit 5 ml Wasser verdünnt. Diese Lösung wird zur Aufreinigung des
Ribooligonukleotids mittels Ionenaustauschchromatographie auf eine mit 50 mM
Triethylammoniumacetat (TEAA) äquilibrierte Sephadex A25 Ionenaustauschsäule
(Pharmacia [Uppsala, Schweden]) mit einem Volumen von 1 ml gegeben. Diese
Säule wird anschließend zunächst mit 0,2 M TEAA, danach mit 0,5 M TEAA
gewaschen und das Produkt anschließend mit 2 M TEAA eluiert. Das so erhaltene
Produkt wird lyophylisiert, in 70% Ethanol aufgenommen und wiederum
lyophylisiert. Schließlich wird das modifizierte Ribooligonukleotid in 100 µl Wasser
gelöst und seine Konzentration ermittelt durch spektralphotometrische Bestimmung
der Absorption bei 260 nm (1 OD = 30 µg/ml). Die Substanz läßt sich bei -20°C oder
lyophilisiert für längere Zeit ohne Verlust aufbewahren.
Das Inkubationsmedium enthält:
- - 0,1 µmol des modifizierten Ribooligonukleotids in 1 ml Wasser
- - 0,1 ml 1 M Natriurnhydrogencarbonat, pH 8,8
- - 3 mg Fluoreszein-Succinimidester (FLUOS, Fa. Boehringer [Mannheim, BRD]) in 150 µl Dimethylformamid.
Diese Mischung wird für 18 h bei Raumtemperatur im dunkeln inkubiert.
Nach 18 h werden 0,2 ml 1 M Arnmoniumacetat-Lösung, pH 5,3, zugegeben und
diese Lösung dann lyophylisiert. Freies Fluoreszein wird vom getrockneten Produkt
durch viermaliges Extrahieren mit je 1 ml Ethanol entfernt. Anschließend wird das
Produkt in 100 µl 2 M TEAA, pH 7, aufgenommen und wiederum lyophylisiert. Die
Reinigung erfolgt anschließend chromatographisch, wie unter a) beschrieben.
Um das 3′-Ende vor Selbstligation zu schützen, wird der 3′-terminale Adenosinrest
durch Periodatoxidation entfernt.
Das Inkubationsmedium enthält:
- - 50 µl markiertes Ribooligonukleotid (aus b)
- - 1 µl 3 M Natriumacetat, pH 4,8
- - 50 µl 50 mM Natriumperiodat.
Die Inkubation erfolgt bei 0°C für 1 h. Durch Zugabe von 50 µl Ethylenglycol und
weitere Inkubation für 30 min bei 0°C wird überschüssiges Periodat zerstört. Durch
anschließende Zugabe von 150 µl 0,5 M Lysin (oder beliebige primäre Amine), pH
9,3 und Inkubation für 4 h bei Raumtemperatur wird die Ribose zusammen mit der
daranhängenden Adeninbase mittels β-Eliminierung entfernt. Die Reaktionslösung
wird nun mit Wasser auf 1,5 ml verdünnt und, wie unter a) beschrieben, auf eine
Sephadex A 25 Säule aufgegeben, gewaschen, eluiert, das Eluat lyophylisiert, in
Wasser gelöst und seine Konzentration bestimmt.
Das Kupplungsreagenz hat jetzt die Form gemäß Formel II (Anspruch 2), wobei R1
3′,5′-CytidyIbisphosphat, R2 Cytidin, R3 eine Fluoresceinylgruppe und R4 ein
Wasserstoffatom sind und wobei n1 = 1, n2 = 1 und m = 1 sind.
In dieser Form wird das Kupplungsreagenz zur Kupplung an Nukleinsäuren
verwendet.
Ein Enzym, und zwar eine RNA-Ligase, bevorzugt die T4 RNA-Ligase, katalysiert
die Bindung zwischen dem 5′-Phosphatende des Kupplungsreagenz und dem 3′-OH-
Ende der zu modifizierenden Nukleinsäure. Die Reaktion wird durchgeführt in
einem speziellen RNA Ligase-Puffer, der bei einem leicht alkalischen pH-Wert
Magnesiumchlorid, ein organisches Lösungsmittel, ATP, Kupplungsreagenz, die zu
modifizierende Nukleinsäure sowie die RNA Ligase enthält. Diese Mischung wird bei
Temperaturen zwischen 0 und 10°C für 4 bis 24 h inkubiert und die modifizierte
Nukleinsäure anschließend mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
Als Beispiel ist im folgenden die Markierung einer RNA mit Fluoreszein mittels des
Kupplungsreagenzes ausgeführt, dessen Synthese im obigen Beispiel beschrieben
wurde.
Das Inkubationsmedium enthält im Gesamtvolumen von 30 µl:
- - 15 µl doppelt konzentrierter RNA-Ligase-Puffer (100 mM Hepes/KOH, pH 7,8; 40 mM Magnesiumchlorid; 7 mM Dithiothreitol; 20 µg/ml Rinderserumalbumin; 20% Dimethylsulfoxid)
- - 3 µl 1 mM ATP
- - 1 µl 180 µM Kupplungsreagenz (an das Fluoreszein gebunden ist)
- - 5 µg RNA (oder auch weniger)
- - 20 U T4-RNA-Ligase.
Diese Mischung wird bei 4°C für 8 h inkubiert. Die markierte RNA wird danach
durch Phenolextraktion und anschließender Fällung mit Ethanol gewonnen.
Eine Hauptanwendung des erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz ist die Kupplung
von Markierungssubstanzen (R3), insbesondere Fluoreszenzmarkern, an
Nukleinsäuren. Die Unkompliziertheit des Verfahrens, Markersubstanzen an das
Kupplungsreagenz sowie das Kupplungsreagenz an eine Nukleinsäure zu binden,
ermöglicht in der Praxis, dem Anwender beispielsweise in Form eines Kits das noch
unmodifizierte Kupplungsreagenz und separat diverse Markersubstanzen zur
Verfügung zu stellen. Der Anwender kann sich dann je nach Bedarf das
Kupplungsreagenz leicht selbst in der richtigen Menge und der benötigten
Modifikation herstellen. Da es sich bei der Kupplung des modifizierten
Kupplungsreagenz an die zu markierende Nukleinsäure um ein enzymatisches
Verfahren handelt, ist dem Anwender eine einfache Möglichkeit gegeben, sehr
schonend und mit hoher Spezifität beliebige Nukleinsäuren mit Markern seiner Wahl
zu kuppeln.
Claims (9)
1. Ribooligonukleotid zur Kupplung mindestens eines Moleküls, beispielsweise
eines Fluoreszenzmarkers oder eines Biotinderivates oder eines
Digoxigeninderivates oder eines Proteins, an Nukleinsäuren, insbesondere
Ribonukleinsäuren (RNA), gekennzeichnet durch folgende Strukturformel (I):
wobei jeweils
R1 eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein 3′,5′-Nukleotidbisphosphat,
R2 eine Nukleobase,
R3 das zu kuppelnde Molekül und
R4 ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten,
und wobei
m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, und
n1 entweder 0 oder eine Zahl zwischen I und 30, insbesondere 1, und
n2 entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, sind.
R1 eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein 3′,5′-Nukleotidbisphosphat,
R2 eine Nukleobase,
R3 das zu kuppelnde Molekül und
R4 ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten,
und wobei
m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, und
n1 entweder 0 oder eine Zahl zwischen I und 30, insbesondere 1, und
n2 entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, sind.
2. Ribooligonukleotid zur Kupplung mindestens eines Moleküls, beispielsweise
eines Fluoreszenzmarkers oder eines Biotinderivates oder eines
Digoxigeninderivates oder eines Proteins, an Nukleinsäuren, insbesondere
Ribonukleinsäuren (RNA), gekennzeichnet durch folgende Strukturformel (II):
wobei jeweils
R1 eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein 3′,5′-Nukleotidbisphosphat,
R2 eine Nukleobase,
R3 das zu kuppelnde Molekül und
R4 ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten,
und wobei
m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, und
n1 entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, und
n2 entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, sind.
R1 eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein 3′,5′-Nukleotidbisphosphat,
R2 eine Nukleobase,
R3 das zu kuppelnde Molekül und
R4 ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten,
und wobei
m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, und
n1 entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, und
n2 entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, sind.
3. Ribooligonukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die als Spacer dienende Alkylkette keine Phosphatgruppe mit daran
gebundenem R4 und statt dessen ein Wasserstoffatom enthält (Formel III).
4. Ribooligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die Nukleobase (R2) ein Adenin, Guanin, Uracil oder
Cytidin ist.
5. Ribooligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das zu kuppelnde Molekül R3 ein Fluoreszenzmarker,
insbesondere ein Fluoreszeinderivat, ein Biotinderivat, ein Digoxigeninderivat,
oder ein Protein, insbesondere eine Nuklease, ist.
6. Verfahren zur Synthese eines Ribooligonukleotids gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese eines mit einer
oder mehreren Aminogruppen modifizierten Ribooligonukleotids mit einem
DNA-Synthesegerät bei modifiziertem Synthesezyclus durchgeführt wird, wobei
die Bestandteile:
- - Phosphoramidite
- - Aminierungsreagenzien
- - Phosphorylierungsreagenz
verwandt werden und der gewünschte Marker (R3) anschließend mittels an sich
bekannter Methoden an dieses modifizierte Ribooligonukleotid gebunden wird.
7. Verwendung von Ribooligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5
- a) für Hybridisierungsverfahren, insbesondere in situ Hybridisierungsverfahren oder
- b) für RNA-Strukturuntersuchungen oder
- c) für Protein-RNA-Wechselwirkungsstudien oder
- d) zum gezielten Bearbeiten von Nukleinsäuren.
8. Reagenzkit zur Kupplung von Molekülen an Nukleinsäuren, insbesondere
Ribonukleinsäuren, bestehend aus:
- a) Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R1, R2 und gegebenenfalls R4 die obige Bedeutung haben und R3 anstatt des zu kuppelnden Moleküls ein Wasserstoffatom ist
- b) Markersubstanz oder Nuklease
- c) RNA Ligase, insbesondere T4 RNA Ligase.
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DE19924239531 DE4239531A1 (de) | 1992-11-25 | 1992-11-25 | Reagenz zur Kupplung verschiedener Substanzen an Nukleinsäuren sowie Verfahren zu dessen Herstellung |
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- 1992-11-25 DE DE19924239531 patent/DE4239531A1/de not_active Withdrawn
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- 1993-11-19 WO PCT/DE1993/001101 patent/WO1994012518A2/de active Application Filing
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Also Published As
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WO1994012518A3 (de) | 1994-07-21 |
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