DE60207995T2

DE60207995T2 - Verfahren zum entschützen von oligonukleotiden

Info

Publication number: DE60207995T2
Application number: DE60207995T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Nelson
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 2001-03-08
Filing date: 2002-03-04
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2022-03-05
Also published as: WO2002072864A3; WO2002072864A2; CA2468425A1; EP1366057B1; EP1366057A4; JP2004521628A; EP1366057A2; ATE312841T1; DE60207995D1; US20040191808A1; US20030181712A1; US6664388B2

Description

I. GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft allgemein synthetische Oligonukleotid-Verbindungen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Abspaltung von Oligonukleotiden von Festträgern und die Entschützung von Oligonukleotiden.
II. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Oligonukleotide sind notwendige Reagenzien bei vielen wichtigen molekularbiologischen Experimenten, Untersuchungen und Informations-sammelnden Vorgängen, wie die Polymerasekettenreaktion (PCR), diagnostische Sonden, Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) und Genomsequenzierung. Die Vorteile der Durchführung der Synthese von Oligonukleotiden durch die sequenzielle Zugabe und kovalente Bindung von monomeren Einheiten an einen Festträger ist bekannt. Insbesondere ist das Verfahren von Caruthers hochoptimiert und fast universell angenommen (US-PSen 4,458,066 und 4,973,679). Die große Mehrheit der Millionen von jedes Jahr verbrauchten Oligonukleotiden wird durch automatisierte Synthese mit Phosphoramiditnukleosid-Monomeren hergestellt (Beaucage (1992) Tetrahedron Lett. 22: 1859–62; US-PS 4,415,732).
Das Ausführen chemischer Reaktionen auf Festträgern hat einige praktische Vorteile: (i) überschüssige Reagenzien und lösliche Nebenprodukte können durch einfache Wasch- und Filtrationsschritte leicht entfernt und getrennt werden, (ii) das Verteilen, Handhaben und Organisieren der parallelen Herstellung von vielen Oligonukleotiden wird erleichtert und (iii) Reaktionen können für die Wirtschaftlichkeit und leichte Handhabbarkeit in ihrem Umfang vergrößert und verkleinert werden.
Viele Anwendungen verwenden Oligonukleotide mit einer kovalent gebundenen Markierung. Die Markierungen können manche Funktion gewähren, z.B. Affinität, Nachweis oder andere physikalische Eigenschaften. Oligonukleotid-Markierungen haben oft reaktive Funktionalitäten, die bevorzugt geschützt sein können, um Nebenreaktionen und Modifikationen zu minimieren.
Bei Beendigung der Synthese wird das Festträger-gebundene Oligonukleotid von dem Träger durch chemische Spaltung der kovalenten Bindung zwischen dem Oligonukleotid und dem Festträger entfernt und entschützt, um alle verbleibenden Schutzgruppen von dem Oligonukleotid zu entfernen. Die Schritte der Abspaltung und Entschützung können gleichzeitig und mit dem gleichen Reagenz durchgeführt werden. Alternativ können Abspaltung und Entschützung bei unterschiedlichen Temperaturen und mit unterschiedlichen Reagenzien durchgeführt werden.
Typischerweise wird die Abspaltung des Oligonukleotids (20 nmol bis 1 μmol) von dem Festträger in der Synthesesäule bei Raumtemperatur unter Verwendung von ungefähr 1 bis 3 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid NH₄OH (ungefähr 28–30% NH₃ in Wasser) durchgeführt (US-PS 5,932,718). Die Spaltung der typischen Esterbindung am 3'-Ende des Oligonukleotids ist unter diesen Bedingungen in etwa einer Stunde abgeschlossen. Während die Bindung zwischen dem Oligonukleotid und dem Festträger gespalten wird, entfernt Ammoniumhydroxid auch die 2-Cyanoethylgruppen von den Internukleotid-Phosphaten und die Schutzgruppen der Nukleobasen. Abhängig von der Nukleobase und der Art der Schutzgruppen benötigt die Entschützung (Entfernung der Schutzgruppen) des Oligonukleotids ungefähr 1 bis 8 Stunden bei 55°C und Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid.
Alternativ kann die Abspaltung und Entschützung mit wasserfreien Aminen (US-PS 5,750,672), Methylamin (US-PSen 5,348,868 und 5,518,651), Hydrazin und Ethanolamin (Polushin (1991) Nucleic Acids Res. Symposium Series Nr. 24, S. 49–50; Polushin (1994) Nucleic Acids Res. 22: 639–45) durchgeführt werden.
Eine typische Postsynthese, Abspaltungs-/Entschützungsroutine auf automatisierten DNA-Synthetisierern (z.B. Modelle 392, 394, 3948, Applied Biosystems, Foster City, CA) befördert konzentriertes Ammoniumhydroxid durch die Synthesesäule nach Abschluss der Oligonukleotidsynthese und lässt es in der Säule für ungefähr eine Stunde verbleiben, mit cyclischen Lieferungen von mehr Ammoniumhydroxid und Auffangen des Eluats in einem Gefäß. Das das gespaltene und teilweise entschützte Oligonukleotid enthaltende Gefäß kann dann in eine Heizvorrichtung befördert werden, um die Entschützung zu vervollständigen. Alternativ kann die Schutzgruppe der Nukleobase ausreichend labil sein, um keine weitere Erhitzung zum Erhalt eines vollständig entschützten Oligonukleotids zu benötigen. Das Ammoniumhydroxid wird bei vermindertem Druck oder in einem Strom aus Luft oder Inertgas entfernt. Das ungereinigte Oligonukleotid kann durch verschiedene Verfahren gereinigt werden, einschließlich hydrophober Kartuschenreinigung, Umkehrphasen-HPLC, Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Präzipitation. Für einige Anwendungen kann das ungereinigte Oligonukleotid rein genug sein, um angemessen zu funktionieren.
Nach Abschluss der Abspaltung der Oligonukleotide von dem Träger werden die verbleibenden Schutzgruppen durch Inkubation mit der Ammoniumhydroxid-Lösung bei entweder Raumtemperatur oder unter Erhitzung, z.B. 55°C für 6 bis 24 Stunden, entfernt. Alternativ können die Oligonukleotide mit Ammoniak oder anderen Aminen in der Gasphase abgespalten und/oder entschützt werden, wobei das Gasreagenz mit dem Oligonukleotid in Kontakt kommt, während dieses gebunden an oder in der Nähe des Festträgers ist (US-PSen 5,514,789; 5,738,829).
Das in der jeweiligen Situation verwendete spezielle Abspaltungs- und Entschützungsprotokoll ist größtenteils durch die Schutzgruppen bestimmt, die an den Nukleobasen, dem Internukleotid-Phosphor, den Zuckern, dem 3'- oder 5'-Ende und der jeweiligen kovalent gebundenen Markierung eingesetzt wurden. Die Nukleobasen-Schutzgruppen der ersten Generation, die bei dem Phosphodiesterverfahren der Synthese benutzt werden, umfassen Benzoyl-(bz) und Isobutyryl-(ibu)Schutzgruppen, die als Adenosin A^bz, Cytosin C^bz und Guanosin G^ibu verwendet werden (Schaller (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85, 3821–3827 und Buchi (1972) J. Mol. Biol. 72: 251). Im Allgemeinen ist Thymidin T nicht geschützt.
Es ist bekannt, dass bestimmte Nebenreaktionen während der Abspaltungs- und Entschützungsreaktionen stattfinden. Modifikationen der Nukleobasen, Internukleotid-Phosphatgruppen und anhängenden Aminogruppen sind charakterisiert worden (Chang (1999) Nucleosides & Nucleotides 18: 1205–1206; Manoharan (1999) Nucleosides & Nucleotides 18: 1199–1201). Das durch die Entschützung der Internukleotid-Phosphatgruppen freigesetzte Acrylnitril kann Addukte mit den Nukleobasen, Markierungen und anderen Stellen bilden ( EP 1028124 ; WO 0046231; Eritja (1992) Tetrahedron 48: 4171–82; Wilk (1999) J. Org. Chem. 64: 7515–22). Andere Verunreinigungen sind nicht charakterisiert, dabei ist es bekannt, dass sie die Reinheit der Oligonukleotide beeinträchtigen und Leistungsverlust verursachen. Wenn die Entschützung der Schutzgruppen unvollständig ist, können Oligonukleo tide mit geringerer Spezifität oder Affinität hybridisieren, was zu fehlerhaftem Priming oder Mutagenese führt.
Neue Reagenzien und Verfahren zur Abspaltung und Entschützung von Oligonukleotiden sind wünschenswert. Bestimmte Schutzgruppen können möglicherweise nicht mit Entschützungsreagenzien oder automatisierten Synthetisierern und Protokollen kompatibel sein, was zu Modifikationen führt. Bestimmte Markierungen, z.B. solcher mit erweiterter Konjugation oder reaktiver Funktionalität, können zu Modifikationen der Markierungen oder des Oligonukleotids während der Abspaltungs- und Entschützungsschritte führen. Reagenzien und Verfahren, die Nebenreaktionen und Modifikationen minimieren oder ausschließen, sind wünschenswert.
III. ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Entfernung von Schutzgruppen, d.h. Entschützung, von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden bereit, die mindestens eine 2-Cyanoethylphosphat-Internukleotidbindung enthalten. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Reagenzien, die für die Verwendung in solch einem Verfahren geeignet sind, und Kits bereit, in die solche Reagenzien in einem praktischen, benutzungsbereiten Format eingebaut sind. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und Reagenzien können Nebenreaktionen minimiert werden, die zu bestimmten Verunreinigungen führen, die die synthetisierten Oligonukleotide verunreinigen.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Entschützung eines Oligonukleotids durch Umsetzung eines geschützten Oligonukleotids mit einem Entschützungsreagenz bereit, wobei das Entschützungsreagenz eine aktive Methylenverbindung und ein Aminreagenz umfasst. Die aktive Methylenverbindung hat die Formel:
Der Substituent EWG ist eine Elektronen-abziehende Gruppe ausgewählt aus Nitro-, Keton-, Ester-, Carbonsäure-, Nitril-, Sulfon-, Sulfonat-, Sulfoxid-, Phos phat-, Phosphonat-, Nitroxid-, Nitroso-, Trifluormethyl- und Arylgruppen, die mit einer oder mehreren Nitro-, Keton-, Ester-, Carbonsäure-, Nitril-, Sulfon-, Sulfonat-, Sulfoxid-, Phosphat-, Phosphonat-, Nitroxid-, Nitroso- und Trifluormethylgruppen substituiert sind. Der Substituent R ist ausgewählt aus einem Wasserstoffatom, einer C₁-C₁₂-Alkylgruppe, einer C₆-C₂₀-Arylgruppe, einem Heterocyclus und einer Elektronen-abziehenden Gruppe. Das Aminreagenz kann wässriges Ammoniumhydroxid, wässriges Methylamin oder ein wasserfreies C₁-C₆-Alkylamin sein. Zusätzlich zu einer aktiven Methylenverbindung und einem Aminreagenz kann das erfindungsgemäße Entschützungsreagenz Wasser oder ein Alkohol-Lösungsmittel beinhalten. Schutzgruppen werden von dem Oligonukleotid durch Behandlung mit dem Entschützungsreagenz entfernt.
Das Oligonukleotid kann durch eine Bindung kovalent an einen Festträger gebunden sein. Das Oligonukleotid kann von dem Festträger abgespalten werden, entweder bevor, während oder nachdem die Schutzgruppen entfernt werden. Der Festträger kann ein organisches Polymer oder anorganisch sein. Der Festträger kann eine Membran oder Fritte sein, die den Durchlass des Entschützungsreagenzes erlaubt.
Der Festträger kann in einer Säule oder einem anderen Gehäuse eingeschlossen sein, die/das Einlass- und Auslassöffnungen für den Durchlass oder Durchfluss des Entschützungsreagenzes aufweist. Die Säulen können in einer Auswahl an Ausführungen gestaltet sein, einschließlich Halter für viele Säulen, z.B. 96- oder 384-Schalenmikrotiterplattenformate. Eine Vielzahl an Oligonukleotiden in einem Halter kann gleichzeitig oder getrennt voneinander durch unterscheidende oder nicht unterscheidende Lieferung oder Aussetzung der Entschützungsreagenzien entschützt werden.
Oligonukleotide, die durch die erfindungsgemäßen Entschützungsreagenzien entschützt werden können, beinhalten Nukleinsäureanaloge. Oligonukleotide können eine oder mehrere kovalent gebundene Markierungen tragen, wie einen Fluoreszenzfarbstoff, einen Quencher, Biotin, ein Mobilitätsmodifizierungsmittel und einen Kleine-Furche-Binder (minor groove binder).
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Entschützung eines Oligonukleotids bereit, bei dem zuerst das kovalent an den Festträger gebundene geschützte Oligonukleotid mit einer aktiven Methylenverbindung und einem Lösungsmittel benetzt wird und dann das geschützte Oligonukleotid mit einem Amin reagenz umgesetzt wird. Das Aminreagenz kann flüssig oder gasförmig, wässrig oder wasserfrei sein, z.B. wässriges Ammoniumhydroxid, Ammoniakgas oder ein C₁-C₆-Alkylamin.
IV. KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1a–1b zeigen Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramme von T₁₅-Q-CDPI₃, abgespalten und entschützt mit 15% Ethanol:NH₄OH allein (1a) und mit 3% Diethylmalonat (DEM) in 15% Ethanol:NH₄OH (1b).
2a–2d zeigen Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramme von 5' F-CAG TCG CCC TGC C-Q-CDPI₃ 3' (SEQ ID NO: 3), abgespalten und entschützt mit 15% Ethanol:NH₄OH und entweder 0% DEM (2a), 0,1% DEM (2b), 1% DEM (2c) oder 3% DEM (2d).
3a–3d zeigen Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramme von 5' F-CTT CTT GCT AAT TCC-Q-CDPI₃ 3' (SEQ ID NO: 4), abgespalten und entschützt mit 15% Ethanol:NH₄OH und entweder 0% DEM (3a), 0,1% DEM (3b), 1% DEM (3c) oder 3% DEM (3d).
4a–4b zeigen Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramme von 5' F-CCA TGC GTT AGC C-Q-CDPI₃ 3' (SEQ ID NO: 5), abgespalten und entschützt mit 15% Ethanol:NH₄OH allein (4a) und mit 3% Diethylmanolat (DEM) in 15% Ethanol:NH₄OH (4b).
5a–5b zeigen Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramme von 5' H₂N-(PEO)₂-AAA ATC AAG AAC TAC AAG ACC GCC C 3' (SEQ ID NO: 6), abgespalten und entschützt mit konzentrierter NH₄OH allein (5a) und mit 1% Diethylmalonat (DEM) in 15% Ethanol:NH₄OH (5b).
V. GENAUE BESCHREIBUNG VON BEISPIELHAFTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wird nun genauer auf bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsformen Bezug genommen, von denen Beispiele in den angefügten Zeichnungen veranschaulicht sind. Während die Erfindung in Zusammenhang mit den veranschaulichten Ausführungsformen beschrieben wird, wird es zu verstehen sein, dass sie nicht dazu bestimmt sind, die Erfindung auf diese Ausführungsformen zu beschränken. Im Gegenteil ist die Erfindung dazu bestimmt, alle Alternativen, Modifikationen und Äquivalente zu umfassen, die in der Erfindung wie in den Patentansprüchen definiert enthalten sein können.
V.1 DEFINITIONEN
Soweit nicht anders dargestellt sollen die folgenden Bezeichnungen und Ausdrücke, soweit hierin verwendet, die folgenden Bedeutungen haben:
"Nukleobase" bedeutet eine Stickstoff-haltige heterocyclische Gruppe, die imstande ist, Watson-Crick-Wasserstoffbindungen bei der Paarung mit einer komplementären Nukleobase oder einem Nukleobase-Analog zu bilden, z.B. ein Purin, ein 7-Deazapurin oder ein Pyrimidin. Typische Nukleobasen sind die natürlich vorkommenden Nukleobasen Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil und Thymin und Analoge von natürlich vorkommenden Nukleobasen, z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 7-Deaza-8-azaguanin, 7-Deaza-8-Azaadenin (US-PS 5,912,340), Inosin, Nebularin, Nitropyrrol, Nitroindol, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudouridin, Pseudocytosin, Pseudoisocytosin, 5-Propinylcytosin, Isoguanin, 2-Thiopyrimidin, 6-Thioguanin, 4-Thiothymin, 4-Thiouracil, O⁶-Methylguanin, N⁶-Methyladenin, O⁴-Methylthymin, 5,6-Dihydrothymin, 5,6-Dihydrouracil, 4-Methylindol, Phenoxazin, 7-Deazapurin, Pseudoisocytidin, Isoguanosin, 4-(3H)-Pyrimidon, Hypoxanthin, 8-Oxopurine, Pyrazolo[3,4-D]pyrimidine (US-PSen 6,143,877 und 6,127,121) und Ethenoadenin (Fasman (1989), Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Seiten 385–394, CRC Press, Boca Raton, FL).
"Nukleosid" bedeutet eine Verbindung bestehend aus einer Nukleobase verbunden mit dem C-1'-Kohlenstoffatom eines Ribosezuckers. Die Ribose kann substituiert oder unsubstituiert sein. Substituierte Ribosezucker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf solche Ribosen, in denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome, z.B. das 2'-Kohlenstoffatom, substituiert ist mit einer oder mehrerer der gleichen oder verschiedener -R-, -OR-, -NRR- oder Halogengruppen, wobei jedes R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine C₁-C₆-Alkyl- oder eine C₅-C₁₄-Arylgruppe ist. Die Zucker umfassen Ribose, 2'-Desoxyribose, 2',3'-Didesoxyribose, 2'-Halogenribose, 2'-Fluorribose, 2'-Chlorribose, 2'-C-Alkyl-, 2'-Alkylribose, z.B. 2'-O-Methyl-, 4'-α-anomerische Nukleotide, 1'-α-anomerische Nukleotide, 2'-4'- und 3'-4'-verbundene und andere "geschlossene", bicyclische Zuckermodifikationen (WO 98/22489; WO 98/39352; WO 99/14226). Modifikationen an der 2'- oder 3'-Position umfassen ein Wasser stoffatom, eine Hydroxy-, Methoxy-, Ethoxy-, Allyloxy-, Isopropoxy-, Butoxy-, Isobutoxy-, Methoxyethyl-, Alkoxy-, Phenoxy-, Azido-, Amino-, Alkylaminogruppe, ein Fluor-, Chlor- und Bromatom. Wenn die Nukleobase ein Purin ist, z.B. A oder G, ist der Ribosezucker an die N⁹-Position der Nukleobase gebunden. Wenn die Nukleobase ein Pyrimidin ist, z.B. C, T oder U, ist der Pentosezucker an die N¹-Position der Nukleobase gebunden (Kornberg und Baker, (1992) DNA Replication, 2. Auflage, Freeman, San Francisco, CA).
"Nukleotid" bedeutet ein Phosphatester eines Nukleosids als eine Monomereinheit oder innerhalb einer Nukleinsäure. Nukleotide werden manchmal als "NTP", oder "dNTP" und "ddNTP" bezeichnet, um besonders die strukturellen Eigenschaften des Ribosezuckers herauszustellen. "Nukleotid-5'-Triphosphat" bezeichnet ein Nukleotid mit einer Triphosphatestergruppe an der 5'-Position. Die Triphosphatestergruppe kann Schwefelatom-Substitutionen für die verschiedenen Sauerstoffatome beinhalten, z.B. α-Thio-Nukleotid-5'-Triphosphate.
Soweit hierin verwendet, werden die Ausdrücke "Oligonukleotid" und "Polynukleotid" untereinander austauschbar verwendet und bedeuten einzelsträngige und doppelsträngige Polymere von Nukleotid-Monomeren, einschließlich 2'-Desoxyribonukleotide (DNA) und Ribonukleotide (RNA) verbunden durch Internukleotid-Phosphodiesterbindungen oder Internukleotidanaloge, und assoziierte Gegenionen, z.B. H⁺, NH₄ ⁺, Trialkylammonium, Mg²⁺, Na⁺ und dergleichen. Ein Polynukleotid kann vollständig aus Desoxyribonukleotiden, vollständig aus Ribonukleotiden oder aus chimären Gemischen davon zusammengesetzt sein. Polynukleotide können aus Internukleotid-, Nukleobase- und Zuckeranalogen bestehen. Polynukleotide reichen typischerweise in ihrer Größe von ein paar Monomereinheiten, z.B. 5–40, wobei sie häufig als Oligonukleotide bezeichnet werden, bis zu einigen 1000 monomeren Nukleotideinheiten. Soweit nicht anders gekennzeichnet, ist es zu verstehen, dass, wann immer eine Polynukleotid-Sequenz dargestellt ist, die Nukleotide in 5' nach 3'-Richtung von links nach rechts geschrieben sind und dass "A" Desoxyadenosin, "C" Desoxycytidin, "G" Desoxyguanosin und "T" Thymidin bezeichnet, soweit nicht anders angegeben.
"Geschütztes Oligonukleotid" bedeutet ein beliebiges mit synthetischen Mitteln hergestelltes Oligonukleotid oder Polynukleotid, z.B. durch das Phosphoramidit-Nukleosid-Verfahren der automatisierten Synthese auf einem Festträger, was eine oder mehrere Schutzgruppen an den funktionellen Gruppen wie dem exocyclischen Amin einer Nukleobase, der Internukleotid-Phosphatbindung oder der Hydroxyl- oder Amingruppe am 5'-Ende umfasst. Die Schutzgruppenterminologie folgt der allgemeinen Strategie nach Greene, T. und Wuts, P. "Protective Groups in Organic Synthesis", 3. Auflage, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1999).
Der Ausdruck "Nukleinsäureanaloge" bezeichnet Analoge von Nukleinsäuren, die eine oder mehrere Nukleotidanalog-Einheiten umfassen und einige der Qualitäten und Eigenschaften besitzen, die mit Nukleinsäuren verbunden werden, z.B. Watson/Crick-, Wobble- und Hoogsteen-Basenpaarung und andere Sequenzerkennungseffekte. Nukleinsäureanaloge können modifizierte Nukleobasegruppen, modifizierte Zuckergruppen und/oder modifizierte Internukleotid-Bindungen haben (Englisch (1991) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 613–29). Die Modifikationen umfassen Markierungen. Eine Klasse an Nukleinsäureanalogen ist die, bei der die Internukleotidgruppe modifiziert ist, um neutral und ungeladen bei oder nahe dem neutralen pH zu sein, wie Phosphoramidat-, Phosphotriester- und Methylphosphonat-Oligonukleotide, wobei eines der Nichtbrückensauerstoffatome durch einen neutralen Substituenten ersetzt ist, z.B. -NR₂, -OR, -R. Eine weitere Klasse an Nukleinsäureanalogen ist die, bei der die Zucker- und Internukleotidgruppen durch ein ungeladenes, neutrales Amidrückgrat ersetzt worden ist, wie Morpholinocarbamat und Peptidnukleinsäuren (PNA). Eine Art von PNA ist ein N-(2-Aminoethyl)glycinamid-Rückgratpolymer (Nielsen, 1991). Wann immer eine PNA-Sequenz dargestellt ist, ist zu verstehen, dass der Aminoterminus an der linken Seite und der Carboxyterminus an der rechten Seite liegt.
"Entschützungsreagenz" bedeutet ein beliebiges Reagenz oder eine Rezeptur in einem flüssigen oder gasförmigen Zustand, das/die eine Schutzgruppe von einem geschützten Oligonukleotid durch eine chemische Reaktion entfernt oder ein Oligonukleotid von einem Festträger abspaltet.
"Festträger" bedeutet ein beliebiges Teilchen, eine Kugel oder eine Oberfläche, auf dem/der die Synthese eines Oligonukleotids abläuft.
"Aktive Methylenverbindung" bedeutet ein beliebiges organisches Reagenz, das ein azides Proton trägt, das an Kohlenstoff gebunden ist und unter basischen Bedingungen abgespalten werden kann, typischerweise mit einem pKa-Wert von etwa 6 bis 20.
Die Ausdrücke "Spaltung" oder "Abspaltung" bezeichnen den Bruch einer kovalenten Bindung, die ein Oligonukleotid an einen Festträger bindet.
Der Ausdruck "Markierung", soweit hierin benutzt, bedeutet eine beliebige Gruppe, die an ein Oligonukleotid gebunden werden kann und die die Funktionen hat: (i) ein detektierbares Signal bereitzustellen; (ii) mit einer zweiten Markierung zu interagieren, um das detektierbare Signal zu modifizieren, das von der ersten oder zweiten Markierung bereitgestellt wird, z.B. FRET; (iii) die Hybridisierung, d.h. Duplexbildung, zu stabilisieren; (iv) die Beweglichkeit, z.B. elektrophoretische Mobilität oder Zellpermeabilität, durch Ladung, Hydrophobizität, Form oder andere physikalische Eigenschaften zu beeinflussen, oder (v) eine Bindungsgruppe, z.B. Affinität, Antikörper/Antigen oder ionische Komplexierung, bereitzustellen.
Die Ausdrücke "Linker", "LINKER" und "Bindung" werden untereinander austauschbar verwendet und bedeuten eine chemische Gruppe, die eine kovalente Bindung oder Kette an Atomen umfasst, die kovalent eine Markierung an ein Polynukleotid, eine Markierung an eine andere oder einen Festträger an ein Polynukleotid oder Nukleotid bindet oder daran gebunden ist.
"Bindungsgruppe" bedeutet eine chemisch reaktive Gruppe, einen Substituent oder einen Rest, z.B. ein Nukleophil oder Elektrophil, die/der in der Lage ist, mit einem anderen Molekül zu reagieren, um eine kovalente Bindung oder eine Bindung zu bilden.
"Substituiert", soweit hierin verwendet, bezeichnet ein Molekül, in dem ein oder mehrere Wasserstoffatome durch ein oder mehrere Nichtwasserstoffatome, funktionelle Gruppen oder Reste ersetzt sind. Zum Beispiel ist ein unsubstituiertes Stickstoffatom -NH₂, während ein substituiertes Stickstoffatom -NHCH₃ ist. Beispielhafte Substituenten umfassen in nicht beschränkender Weise Halogenatome, z.B. Fluor oder Chlor, eine (C₁-C₈)-Alkyl-, Sulfat-, Sulfonat-, Sulfon-, Amino-, Ammonium-, Amido-, Nitril-, Niederalkoxy-, Phenoxygruppe, eine aromatische Gruppe, eine Phenylgruppe, eine polycyclische aromatische Gruppe, ein Heterocyclus, eine wasserlöslich machende Gruppe und eine Bindungsgruppe.
"Alkylgruppe" bedeutet ein gesättigter oder ungesättigter, verzweigter, unverzweigter, verzweigter oder cyclischer Kohlenwasserstoffrest, erhalten durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzelnen Kohlenstoffatom eines Ausgangs alkans, -alkens oder -alkins. Typische Alkylgruppen bestehen aus 1–12 gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoffatomen, einschließlich in nicht beschränkender Weise eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butylgruppe und dergleichen.
"Alkoxygruppe" bedeutet eine -OR-Gruppe, wobei R eine (C₁-C₆)-Alkylgruppe ist.
"Alkyldiylgruppe" bedeutet ein gesättigter oder ungesättigter, verzweigter, unverzweigter oder cyclischer Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und mit zwei monovalenten Radikalzentren, erhalten durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von demselben oder zwei verschiedenen Kohlenstoffatomen eines Ausgangsalkans, -alkens oder -alkins. Typische Alkyldiylreste umfassen in nicht beschränkender Weise eine 1,2-Ethyldiyl-, 1,3-Propyldiyl-, 1,4-Butyldiylgruppe und dergleichen.
"Arylgruppe" bedeutet ein monovalenter aromatischer Kohlenwasserstoffrest mit 6–20 Kohlenstoffatomen, erhalten durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzelnen Kohlenstoffatom eines aromatischen Ausgangsringsystems. Typische Arylgruppen umfassen in nicht beschränkender Weise Reste, abgeleitet von Benzol, substituiertem Benzol, Naphthalin, Anthrazen, Diphenyl und dergleichen.
"Aryldiylgruppe" bedeutet ein ungesättigter cyclischer oder polycyclischer Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, mit einem konjugierten Resonanzelektronensystem und mit mindestens zwei monovalenten Radikalzentren, abgeleitet von der Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von zwei verschiedenen Kohlenstoffatomen einer Ausgangsarylverbindung.
"Heterocyclus" bedeutet ein beliebiges Ringsystem mit mindestens einem Nichtkohlenstoffatom im Ring.
"Substituierte Alkylgruppe", "substituierte Alkyldiylgruppe", "substituierte Arylgruppe" und "substituierte Aryldiylgruppe" bedeuten eine Alkyl-, Alkyldiyl-, Aryl- bzw. Aryldiylgruppe, in der ein oder mehrere Wasserstoffatome unabhängig voneinander durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten umfassen in nicht beschränkender Weise -X, -R, -OH, -OR, -SR, -SH, -NH₂, -NHR, -NR₂, -⁺NR₃, -N=NR₂, -CX₃, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO₂, -N₂ ⁺, -N₃, -NHC(O)R, -C(O)R, -C(O)NR₂, -S(O)₂O-, -S(O)₂R, -OS(O)₂OR, -S(O)₂NR, -S(O)R, -OP(O)(OR)₂, -P(O)(OR)₂, -P(O)(O^–)₂, -P(O)(OH)₂, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -CO₂-, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NR₂, -C(S)NR₂, -C(NR)NR₂, wobei jedes X unabhängig ein Halogenatom und jedes R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine C₁-C₆-Alkyl-, C₅-C₁₄-Arylgruppe, ein Heterocyclus oder eine Bindungsgruppe ist.
"Internukleotidanalog" bedeutet ein Phosphatesteranalog eines Oligonukleotids wie: (i) Alkylphosphonat, z.B. C₁-C₄-Alkylphosphonat, insbesondere Methylphosphonat; (ii) Phosphoramidat; (iii) Alkylphosphotriester, z.B. C₁-C₄-Alkylphosphotriester; (iv) Phosphorothioat; und (v) Phosphorodithioat. Internukleotidanaloge umfassen auch Nichtphosphatanaloge, wobei die Zucker-/Phosphatuntereinheit durch eine phosphatfreie Rückgratstruktur ersetzt ist. Eine Art von phosphatfreien Oligonukleotidanalogen hat eine Amidbindung, wie eine 2-Aminoethylglycineinheit, allgemein als PNA bezeichnet (Nielsen (1991) "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymidine-substituted polyamide", Science 254: 1497–1500).
"Wasserlöslich machende Gruppe" bedeutet ein Substituent, der die Löslichkeit von erfindungsgemäßen Verbindungen in wässrigen Lösungen erhöht. Beispielhafte wasserlöslich machende Gruppen umfassen in nicht beschränkender Weise quaternäre Amin-, Sulfat-, Sulfonat-, Carboxylat-, Phosphonat-, Phosphat-, Polyether-, Polyhydroxyl- und Boronatgruppen.
"Array" bedeutet eine vordefinierte räumliche Anordnung von Oligonukleotiden auf einem Festträger oder in einer Anordnung von Gefäßen.
V.2 OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE
Oligonukleotide, die durch die erfindungsgemäßen Reagenzien und Verfahren abgespalten und entschützt sind, können auf Festträgern durch das Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert werden (US-PSen 4,415,732 und 4,973,679; Beaucage, S. und Iyer, R. (1992) Tetrahedron 48: 2223–2311) unter Verwendung von: (1) 3'-Phosphoramiditnukleosiden, I, (2) Trägermaterialien, z.B. Siliziumdioxid, controlled-pore-glass (US-PS 4,458,066) und Polystyrol (US-PSen 5,047,524 und 5,262,530), und (3) automatisierte Synthetisierer (Modelle 392, 394, 3948, 3900 DNA/RNA-Synthetisierer, Applied Biosystems). Andere Trägermaterialien umfassen Polyacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Polyamid, Polyethylen, Polyethylenoxy oder Copolymere und Pfropfpolymere davon.
Im Allgemeinen ist das Phosphoramidit-Verfahren der Synthese wegen der wirksamen und schnellen Kupplung und der Stabilität der Ausgangsnukleosid-Monomere bevorzugt. Das Verfahren führt zur cyclischen Addition von Monomeren, z.B. Struktur I, an eine Oligonukleotidkette, die an einem Festträger wächst, am häufigsten in der 3' nach 5'-Richtung, bei der das 3'-terminale Nukleosid zu Beginn der Synthese durch eine Bindung an den Festträger gebunden wird. Die Bindung umfasst typischerweise eine Base-labile Funktionalität, wie ein Succinat, Diglycolat, Oxalat oder Hydrochinondiacetat (Pon (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3629–35), und ist durch Ammoniak, Amine, Carbonat, Hydroxid und andere basische Reagenzien spaltbar. Die 3'-Phosphoramidit-Nukleosidmonomereinheiten sind kommerziell erhältlich und teilen die allgemeine Formel I:
wobei R₁ eine Schutzgruppe oder ein Substituent ist, z.B. eine 2-Cyanoethyl-, Methyl-, Niederalkyl-, substituierte Alkyl-, Phenyl-, Aryl- und substituierte Arylgruppe; R₂ und R₃ Aminsubstituenten sind, z.B. eine Isopropyl-, Morpholino-, Methyl-, Ethyl-, Niederalkyl-, Cycloalkyl- und Arylgruppe; R₄ eine Schutzgruppe für exocyclischen Stickstoff ist wie eine Benzoyl-, Isobutyryl-, Acetyl-, Phenoxyacetyl-, Aryloxyacetyl-, Phthaloyl- (US-PS 5,936,077), 2-(4-Nitrophenyl)ethyl-, Pent-4-enoyl-, Dimethylformamidin-(dmf), Dialkylformamidin- und Dialkylacetamidingruppe; und R₅ eine Säure-labile Schutzgruppe ist, wie eine 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT), 4-Methoxytrityl-(MMT), Pixyl-, Trityl- und Trialkylsilylgruppe. Alternativ können Oligonukleotide in der 5' nach 3'-Richtung mit 5'-Phosphoramidit-Nukleosidmonomeren synthetisiert werden, z.B. trägt das 5'-Ende eine Phosphoramiditgruppe und das 3'-Ende eine Säure-labile Schutzgruppe (Wagner (1997) Nucleosides & Nucleotides, 16: 1657–60).
Abspaltung und Entschützung mit den erfindungsgemäßen Reagenzien und Verfahren kann an Oligonukleotiden mit labileren Bindungen an einen Festträger und labileren Schutzgruppen ausgeführt werden. Labilere Nukleobase-Schutzgruppen sind kommerziell erhältlich, z.B. vom Phenoxyacetyl-Typ: Expedite^TM (Sinha (1993) Biochimie 75: 13–23; erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, CA) und PAC^TM Phosphoramidite (US-PS 4,980,460; Schulhof (1987) Nucleic Acids Res. 15: 397–416; Schulhof (1988) Nucleic Acids Res. 16: 319; erhältlich von Amersham Pharmacia), und Formamidine und Acetamidine (McBride (1986) J. Amer. Chem. Soc. 108: 2040–48; Froehler (1983) Nucleic Acids Res. 11: 8031–36; Theisen (1993) Nucleosides & Nucleotides 12: 1033–46). Diese labilen Schutzgruppen werden deutlich schneller entschützt als der Satz der ersten Generation. Zum Beispiel benötigt der Satz A^bz, C^bz, G^dmf, T (Fastphoramidite^TM, Applied Biosystems, Foster City, CA) nur eine Stunde bei 65°C in konzentriertem Ammoniumhydroxid zur vollständigen Entschützung.
Die Erfindung kann mit Oligonukleotiden ausgeführt werden, die kovalent an einen beliebigen Festträger durch eine Bindung gebunden sind. Der Festträger kann ein beliebiges Material in einer beliebigen Konfiguration, Dimension oder Umfang sein, auf dem das Oligonukleotid gebunden oder synthetisiert werden kann. Typische Festträger umfassen Kügelchen oder Teilchen aus hochvernetztem Polystyrol (US-PSen 5,047,524; 5,262,530) oder controlled-pore-glass. Festträger können in ihrer Dimension einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 1 bis 100 μm haben und in ihrer Größe und Form monodispers oder weit voneinander abweichend sein. Die Kügelchen oder Teilchen können in einer Säule mit Einlass- und Auslassöffnungen eingeschlossen sein. Reagenzien zur Durchführung des Phosphoramidit-Verfahrens der Synthese können durch eine Säule fließen gelassen werden, die an einem automatisierten Synthetisierer angebracht ist. Alternativ kann der Festträger eine poröse Membran, ein Filter, eine Fritte oder eine andere Durchflussvorrichtung oder -konfiguration sein, die vergleichbaren Reagenzienfluss zulässt.
Alternativ kann der Festträger ein undurchlässiges, starres organisches Polymer sein, wie Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polystyrol, Polyacrylat, Polycarbonat und Copolymere davon. Ein anderer Festträger kann ein nicht-poröses, planares Material sein wie Glas, Quarz oder Diamant ( EP 1063286 ). Geeignete Materialien umfassen auch Metalle, z.B. Aluminium, Gold, Platin, Silber, Kupfer und dergleichen oder Legierungen davon. Die Metalle können feste Blöcke oder Oberflächen sein, einschließlich Schichten. Die Materialien können mindestens eine im Wesentlichen planare Oberfläche in Form einer Folie, eines Objektträgers, einer Platte oder einer Scheibe haben (WO 01/01142). In einer Ausführungsform ist ein Blockmaterial wie Glas mit einer metallischen Schicht oder einem dünnem Film aus z.B. Gold, Silber, Kupfer oder Platin beschichtet. Das Aufbringen der Metallfilme kann durch Verfah ren wie Elektronenstrahlverdampfung durchgeführt werden. Die Metallschicht wird mit einer reaktiven Funktionalität derivatisiert, an die ein Oligonukleotid gebunden ist. Zum Beispiel kann eine Goldschicht mit einer Disulfitbindung an dem 3'- oder 5'-Ende eines Oligonukleotids derivatisiert werden.
Anorganische Festträger wie Glas, controlled-pore-glass oder Kieselgel werden typischerweise mit Silanreagenzien wie Aminoalkyltrialkoxysilanen oder Mercaptoalkyltrialkoxysilanen derivatisiert, was funktionelle Amino- bzw. Thiolgruppen ergibt. Oligonukleotide, die Startnukleoside für die Oligonukleotidsynthese oder universelle Trägerreagenzien können danach kovalent an die mit Amino- oder Thiolgruppen derivatisierten Festträger gebunden werden.
Ein Array an Festträgeroberflächen, an die Oligonukleotide synthetisiert oder gebunden werden können, kann durch die erfindungsgemäßen Verfahren in einer parallelen oder sequenziellen Weise zur Abspaltung oder Entschützung mit den Reagenzien veranlasst werden. Ein oder ein Teil der geschützten Oligonukleotide auf einem Array kann durch Maskierung, gezielter Reagenzienzuführung oder durch andere Mittel, die die Aussetzung mit dem Reagenz kontrollieren, selektiv abgespalten und entschützt werden (Fodor, US-PS 5,445,934).
V.3 VERFAHREN ZUR OLIGONUKLEOTID-ABSPALTUNG UND -ENTSCHÜTZUNG
Nach Vollendung der Synthese wird das Festträger-gebundene Oligonukleotid von dem Träger durch chemische Spaltung der kovalenten Bindung zwischen dem Oligonukleotid und dem Festträger entfernt und entschützt, um alle verbleibenden Schutzgruppen von dem Oligonukleotid zu entfernen, einschließlich P von den Nukleobasen und Cyanoethylgruppen von den Internukleotidbindungen. Die Schritte der Abspaltung und der Entschützung können gleichzeitig und mit demselben Reagenz durchgeführt werden, z.B. mit konzentriertem Ammoniumhydroxid, wenn P eine Amid-artige Schutzgruppe und LINKER ein Ester ist, Formel II. Alternativ können die Schritte der Abspaltung und Entschützung getrennt voneinander mit "orthogonalen" Reagenzien ausgeführt werden. Wenn z.B. LINKER eine Disulfidgruppe ist, können das P der Nukleobase und die Schutzgruppen des Phosphats von einem geschützten Oligonukleotid mit Ammoniumhydroxid entfernt werden und das entschützte Oligonukleotid bleibt an dem Festträger gebunden. Umgekehrt kann das gleiche geschützte Oligonukleotid mit intakten Schutzgruppen von dem Festträger mit einem Disulfid-selektiven Spaltreagenz wie Dithiothreit abgespalten werden. Das Nettoergebnis der Abspaltung und Entschützung ist beispielhaft durch die Formeln eines geschützten Oligonukleotids II und eines abgespalteten und entschützten Oligonukleotids III dargestellt:
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das 3'-Ende des geschützten Oligonukleotids durch Formel II dargestellt, die zwei Nukleotide von 5 bis ungefähr 100 Nukleotiden zeigt. Die Nukleobasen sind mit Base-labilen Schutzgruppen, P, geschützt. Einen beispielhaften Satz bilden A^bz, G^ibu, C^bz und T. Die Internukleotid-Phosphatgruppen können durch eine 2-Cyanoethylgruppe, Methylgruppe oder eine andere Schutzgruppe geschützt sein. Das 3'-Ende ist durch eine Bindung, LINKER, an einen Festträger, S, in Formel II gebunden. Die Bindung umfasst eine Base-labile Funktionalität, wie eine Ester-, Carbamat- oder Phosphatgruppe ( EP 839 829 ). Typischerweise ist die 3'-Estergruppe ein Succinat, Diglycolat, Oxalat oder Hydrochinondiacetat. Nach der Synthese wird das geschützte Oligonukleotid mit einem erfindungsgemäßen Entschützungsreagenz umgesetzt, um die Entfernung der Nukleobase-Schutzgruppen, P, und der Internukleotid-Phosphatschutzgruppen, 2-Cyanoethylgruppen, zu bewirken. Gleichzeitig oder getrennt davon wird die 3'-Endebindung gespalten, um das Oligonukleotid von dem Festträger zu trennen und letztendlich das abgespaltene und entschützte Oligonukleotid gezeigt durch Formel III zu erhalten.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine nicht-spaltbare Bindung ausgewählt, d.h. resistent gegen die Abspaltung während der Synthese- und Entschützungs schritte. Eine nicht-spaltbare Bindung kann inerte Arten an Funktionalitäten enthalten, wie Amid-, Alkyl-, Phosphat- oder Ether-Funktionalitäten. Ein mit einer nicht-spaltbaren Bindung synthetisiertes Oligonukleotid kann durch die erfindungsgemäßen Reagenzien und Verfahren entschützt und in einem Festphasenformat verwendet werden, z.B. einem Biochip, DNA-Chip oder Array, wobei eine Vielzahl an entschützten Oligonukleotiden auf einem Festträger immobilisiert sind. Ein Gitter oder eine Matrix von Festträger-gebundenen Oligonukleotiden kann folglich an bekannten Stellen und durch komplementäre Nukleinsäuren oder andere Reagenzien, Licht, einem Laser, Spannung oder einer Detektionsvorrichtung ansprechbar untersucht werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Bindung an den Festträger als selektiv abspaltbar ausgesucht, d.h. resistent gegen die Abspaltung während der Synthese- und Entschützungsschritte, aber spaltbar mit anderen Reagenzien oder Bedingungen. Eine Bindung an einen Festträger kann selektiv spaltbar sein, wenn sie eine C-Si- oder eine O-Si-Bindung enthält und die Spaltung mit einem Fluoridanionenreagenz ausgeführt wird, z.B. mit Tetrabutylammoniumfluorid oder Triethylammoniumhydrogenfluorid. Eine Bindung kann selektiv spaltbar sein, wenn sie eine Disulfidfunktionalität, -S-S-, enthält und durch Dithiothreit oder andere Disulfid-Spaltmitteln gespalten wird. Eine Bindung kann selektiv spaltbar sein, wenn sie eine ortho-Nitrobenzylgruppe enthält und unter Fotolyse-Bedingungen gespalten wird.
Ein überraschender und unerwarteter Aspekt der Erfindung ist, dass ein Entschützungsreagenz, das eine aktive Methylenverbindung und ein Aminreagenz beinhaltet, wirksam und effizient bei der Abspaltung und Entschützung von Oligonukleotiden ist. Die neuen erfindungsgemäßen Entschützungsreagenzien und -verfahren können unerwünschte Nebenreaktionen minimieren, die zu Verunreinigungen und Modifikationen der Oligonukleotide, einschließlich ihrer kovalent gebundenen Markierungen, führen. Das Aminreagenz dient als Nukleophil, um die Schutzgruppen zu entfernen, und die aktive Methylenverbindung dient dazu, mit bestimmten Zwischenprodukten, die weiter reagieren und so die Oligonukleotide und jegliche Markierung an den Oligonukleotiden modifizieren können, zu reagieren oder diese inert zu machen. Andere Mechanismen können vorkommen und andere Vorteile können aus der Verwendung des erfindungsgemäßen Entschützungsreagenzes entstehen.
Bei einer Ausführungsform werden das Aminreagenz und die aktive Methylenverbindung zusammen vermischt, um ein Entschützungsreagenz bereitzustellen, das auf ein geschütztes Oligonukleotid gegeben werden kann, um Schutzgruppen zu entfernen (Beispiele 1 bis 3). Die Reaktion kann bei Raumtemperatur oder bei einer erhöhten Temperatur ausgeführt werden. Wenn das geschützte Oligonukleotid an einen Festträger durch eine Bindung kovalent gebunden ist, kann der Vorgang der Entfernung der Schutzgruppen gleichzeitig mit der Abspaltung des Oligonukleotids von dem Festträger geschehen. Nach der Abspaltung kann das abgespaltene Oligonukleotid von dem Festträger durch Filtration durch eine Fritte oder Membran oder durch Dekantieren getrennt werden. Das abgespaltene Oligonukleotid kann weiter bei einer erhöhten Temperatur oder unter Zugabe von anderen Reagenzien entschützt werden, die bei der Entfernung von Schutzgruppen helfen. Wenn die Entschützung abgeschlossen ist, kann das entschützte Oligonukleotid von den Entschützungsreagenzien durch herkömmliche bekannte Maßnahmen wie Verdampfung, Präzipitation, Elektrophorese, Chromatographie oder hydrophobe Kartuschenverfahren getrennt werden. Eine oder mehrere der Verbindungen im Entschützungsreagenz können ausreichend flüchtig sein, um durch Verdampfung unter einem Gasstrom oder unter verringertem Druck entfernt zu werden.
Das Aminreagenz kann in einer flüssigen Rezeptur oder in einem gasförmigen Zustand verwendet werden (Boal (1996) Nucleic Acids Res. 24: 3115–17). Bestimmte Amine sind bei Raumtemperatur und Normaldruck gasförmig, wie Ammoniak (Siedepunkt = –33°C), und sind bei der Entfernung von Oligonukleotid-Schutzgruppen und bei der Durchführung der Abspaltung wirksam (Kempe, US-PS 5,514,789). Das geschützte Oligonukleotid kann mit Ammoniakgas in einem geschlossenen, unter Druck stehenden Raum, Behälter oder Bombe in Berührung gebracht werden. Das Ammoniak kann durch eine Rohrleitung von einem unter Druck stehenden Behälter als Gas eingeleitet werden (Kempe, US-PS 5,738,829) oder kann aus wässrigem Ammoniumhydroxid in einem geschlossenen Raum gebildet werden, der auch das geschützte Oligonukleotid enthält. In der letzteren Ausführungsform kann Ammoniakgas oder ein Dampf aus Ammoniak und Wasser durch den Einschluss eines offenen Behälters, z.B. einer Pfanne oder Flasche, mit Ammoniumhydroxid-Lösung in einem geschlossenen Raum gebildet werden. Der gasförmige Zustand des Reagenzes nimmt durch die Erhöhung der Temperatur in dem geschlossenen Raum in der Konzentration zu (Beispiel 6).
Bei einer weiteren Ausführungsform kann die aktive Methylenverbindung mit dem geschützten Oligonukleotid vor dem Aminreagenz oder in einem das Aminreagenz beinhaltenden Gemisch zusammengebracht werden. In einer Ausführungsform werden die aktive Methylenverbindung und ein Lösungsmittel gemischt und verwendet, um einen Festträger zu benetzen, auf dem ein geschütztes Oligonukleotid kovalent gebunden ist. Ein ausreichendes Volumen des Gemisches wird zugegeben, um den Festträger zu bedecken oder die Oberfläche zu benetzen, z.B. in einem Durchflussgefäß, wie eine Säule (Beispiel 6). Das Aminreagenz wird neben den Festträger gegeben, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge des aktiven Methylenreagenzes erhalten bleibt. Die Vorteile der Nebenreaktionsunterdrückung des aktiven Methylenreagenzes werden folglich durch eine sequenziell Lieferung von Reagenzien erreicht.
V.4 REAGENZIEN ZUR OLIGONUKLEOTID-ABSPALTUNG UND -ENTSCHÜTZUNG
Oligonukleotide können durch die neuen erfindungsgemäßen Reagenzien, die eine aktive Methylenverbindung und ein Aminreagenz beinhalten, abgespalten und/oder entschützt werden. Aktive Methylenverbindungen umfassen organische Reagenzien, die ein azides Proton gebunden an Kohlenstoff tragen, das unter basischen Bedingungen abgespalten werden kann, typischerweise mit einem pKa-Wert von ungefähr 6 bis 20. Die aktive Methylenverbindung kann 1 bis 10 Vol.-% des Entschützungsreagenzes ausmachen. Aktive Methylenverbindungen werden durch folgende Formel dargestellt:
wobei die Acidität der Kohlenstoffgruppe durch eine Elektronen-abziehende Gruppe (EWG) erhöht wird. Andere Substituenten (R) an dem aziden Kohlenstoff können eine zweite oder dritte Elektronen-abziehende Gruppe, ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, Arylgruppe oder eine beliebige funktionelle Gruppe sein, die dem aziden Proton einen pKa-Wert im Bereich von etwa 6–20 verleiht. Elektronen-abziehende Gruppen umfassen Nitro-, Keton-, Ester-, Carbonsäure-, Nitril-, Sulfon-, Sulfonat-, Sulfoxid-, Phosphat-, Phosphonat-, Nitroxid-, Nitroso- und Trifluormethylgruppen.
Elektronen-abziehende Gruppen umfassen auch Arylgruppen, die mit einer oder mehreren Nitro-, Keton-, Ester-, Carbonsäure-, Nitril-, Sulfon-, Sulfonat-, Sulfoxid-, Phosphat-, Phosphonat-, Nitroxid-, Nitroso- und Trifluormethylgruppen substituiert sind. Geeignete Klassen von aktiven Methylenverbindungen umfassen: (i) 1,3-Ketoester, z.B. Ethylacetoacetat; (ii) 1,3-Diketone, z.B. 2,4-Pentandion und Cyclohexandion, (iii) Malonatderivate, z.B. Malononitril, Malonsäure, Malonamid und Dialkylmalonatdiester. Dialkylmalonatdiester umfassen Dimethylmalonat, Diethylmalonat (DEM), Di-n-propylmalonat und Diisopropylmalonat.
Die Wirkungen der Konzentration einer aktiven Methylenverbindung wurden mit vier Ethanol-haltigen Ammoniakreagenzien (15% Ethanol:konz. NH₄OH) untersucht, die 0%, 0,1%, 1% und 3% Diethylmalonat enthielten (2a–2d). Jedes der vier Reagenzien wurde verwendet, um einen Teil eines Oligonukleotids abzuspalten und zu entschützen, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einer Quenchergruppe und einem Kleine-Furche-Binder markiert war (Beispiel 3). Die Analyse durch Umkehrphasen-HPLC zeigte signifikante Verunreinigungen in dem Reagenz ohne eine aktive Methylenverbindung (0% DEM). Die Anwesenheit von 0,1% DEM verhinderte die meisten Verunreinigungen. Die Anwesenheit von 1% und 3% verhinderte im Wesentlichen alle spät eluierenden Verunreinigungen.
In einer Ausführungsform, in der die aktive Methylenverbindung in einem Lösungsmittel gelöst ist und zur Benetzung eines Festträgers, an den ein geschütztes Oligonukleotid kovalent gebunden ist, vor der Behandlung mit dem Aminreagenz verwendet wird, kann das Lösungsmittel aus einem Alkohol, einem Ether, einem Amid, Acetonitril, Dichlormethan oder Dimethylsulfoxid ausgewählt werden. Alkohol-Lösungsmittel umfassen Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol oder 1,2-Ethylenglykol. Ether-Lösungsmittel umfassen Diethylether, Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan oder 1,2-Dimethoxyethan. Amid-Lösungsmittel umfassen Acetamid, Formamid, Benzamid oder Dimethylformamid.
Das Aminreagenz kann in gasförmigem Zustand oder gelöst in Wasser, als Lösung zur Behandlung des Oligonukleotids auf dem Festträger verwendet werden. Die Zusammensetzung des Aminreagenzes beinhaltet ein beliebiges Reagenz mit einer primären, sekundären oder tertiären Aminogruppe, die mit einem geschützten Oligonukleotid reagiert, um die Entfernung der Schutzgruppen zu bewirken. Aminreagenzien umfassen folglich: (i) Ammoniak-(NH₃)-Gas; (ii) Ammoniak gelöst als Ammoniumhydroxid (NH₄OH) in Wasser oder in Gemischen aus Wasser und Alkohol-Lö sungsmitteln; (iii) Alkylamine, R₂NH und RNH₂, wobei R eine C₁-C₆-Alkylgruppe ist; (iv) Alkyl- und Aryldiamine, H₂N-R-NH₂, wobei R eine C₁-C₂₀-Alkyldiyl- oder eine C₆-C₂₀-Aryldiylgruppe ist; und (v) Formamidine wie 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) und 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en (DBN).
Alkohol-Lösungsmittel umfassen Methanol, Ethanol, Ethylenglykol, Isopropanol, und andere Hydroxylgruppen-enthaltende Reagenzien, die die Löslichkeit der Reagenzien, die Benetzung des Festträgers, die Erhöhung der Reaktionsraten oder die Minimierung der Nebenreaktionen unterstützen. Das Alkohol-Lösungsmittel kann 1 bis 30 Vol.-% des Entschützungsreagenzes ausmachen.
Das Aminreagenz kann mit dem Oligonukleotid in gasförmigem Zustand zusammengebracht werden, hergestellt aus einer Lösung in einem geschlossenen System oder Umgebung mit dem Oligonukleotid. Zum Beispiel kann das an einen Festträger gebundene geschützte Oligonukleotid in einem Behälter eingeschlossen sein, der ferner ein offenes Gefäß mit einer Ammoniumhydroxid-Lösung enthält. Der Behälter kann der Umgebung gegenüber abgedichtet oder offen sein. Wenn er abgedichtet ist, kann der Behälter im Sinne einer Bombenvorrichtung erhitzt werden. Die Ammoniakdämpfe können dadurch mit dem Oligonukleotid in Berührung kommen und Schutzgruppen entfernen. Alternativ kann das Aminreagenz durch oder in eine Säule oder einen Behälter gegeben werden, die/der das Oligonukleotid enthält. Zum Beispiel kann das Aminreagenz bei einem automatisierten Synthetisierer eingesetzt und zu einer Säule geliefert werden, als Teil der programmierten Lieferung von Reagenzien, die durch die Einlass- und Auslassöffnungen der Säule fließen können. Das aktive Methylenreagenz kann vor dem Aminreagenz oder als Gemisch mit dem Aminreagenz in das das Oligonukleotid enthaltene Gefäß geliefert werden.
Eine oder mehrere Säulen, in denen die Oligonukleotide synthetisiert werden, können in einer Haltevorrichtung platziert oder dorthin transferiert werden, z.B. in ein Mikrotiter-Schalentablett, in dem das erfindungsgemäße Verfahren der Entschützung ausgeführt werden kann. Der Halter kann in einem abdichtbaren Gefäß eingeschlossen sein, in das auch die Entschützungsreagenzien platziert oder geliefert werden. Zum Beispiel kann ein Halter, der geschützte Oligonukleotide auf Festträgern in Säulen enthält, in einem Gefäß aus korrosionsbeständigem Stahl dicht eingeschlossen werden. Ein Entschützungsreagenz kann entweder vor der Abdichtung in dem Gefäß platziert werden oder durch eine Rohrleitung in das Gefäß geliefert werden. In dieser allgemeinen Weise kann eine Vielzahl, z.B. einige oder Hunderte, an Oligonukleotiden gleichzeitig abgespalten und entschützt werden. Alternativ können mehr als ein Säulenhalter in dem Gefäß dicht eingeschlossen werden. Die Halter können auch serienmäßig, durch manuellen Eingriff oder durch programmierte Automatisierung eingebracht und bearbeitet werden.
V.5 MARKIERTE OLIGONUKLEOTIDE
Oligonukleotide, die mit den neuen erfindungsgemäßen Reagenzien und Verfahren abgespalten und entschützt werden sollen, können mit Markierungsreagenzien konjugiert, "markiert" werden. Solche Konjugate können als DNA-Sequenzierprimer, PCR-Primer, Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, Oligonukleotid-Ligationssonden, doppelt-markierte 5'-Exonuklease-(TagMan^TM)-Sonden, Größenstandards für Elektrophorese, d.h. "Spurstandards" oder "Spurmarkierer", und dergleichen Verwendung finden (US-PS 4,757,141; Andrus, "Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54; Herrmanson, Bioconjugate Techniques, (1996) Academic Press, San Diego, CA, Seiten 40–55, 643–71; Mullah (1998) Nucl. Acids Res. 26: 1026–1031).
Bestimmte Markierungen stellen ein Signal zur Detektion der markierten Oligonukleotide durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder elektrochemische Lumineszenz bereit (Kricka, L. in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992), Academic Press, San Diego, Seiten 3–28). Für die Markierung von Oligonukleotiden geeignete Fluoreszenzfarbstoffe umfassen Fluoresceine, Rhodamine (US-PSen 5,366,860; 5,847,162; 5,936,087; 6,008,379; 6,191,278), Energietransferfarbstoffe (US-PSen 5,863,727; 5,800,996; 5,945,526) und Cyanine (Kubista, WO 97/45539). Beispiele für Fluoresceinfarbstoffe umfassen 6-Carboxyfluorescein; 2',4',1,4-Tetrachlorfluorescein; und 2',4',5',7',1,4-Hexachlorfluorescein (Menchen, US-PS 5,118,934). Fluoreszenz hat Radioaktivität als das bevorzugte Detektionsverfahren bei vielen Ligationsexperimenten und -anwendungen größtenteils ersetzt, wie bei dem Oligonukleotid-Ligationsassay und anderen in vitro DNA-Sonden-basierten Diagnosetests.
Eine weitere Klasse an Markierungen umfasst Fluoreszenz-Quencher. Das Emissionsspektrum eines Quenchers überlappt mit einem nahen intramolekularen oder intermolekularen Fluoreszenzfarbstoff, so dass die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs durch das Phänomen des Fluoreszenzresonanzenergietransfers "FRET" wesentlich verringert oder gequencht wird (Clegg (1992) "Fluorescence resonance ener gy transfer and nucleic acids", Meth. Enzymol. 211: 353–388). Ein Beispiel für FRET in der vorliegenden Erfindung ist, wenn das Oligonukleotid mit einem Fluoreszenzfarbstoff und einem Fluoreszenz-Quencher markiert ist. Besondere Quencher umfassen, sind aber nicht beschränkt auf (i) Rhodaminfarbstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), Tetrapropano-6-carboxyrhodamin (ROX); (ii) Diazoverbindungen, z.B. DABSYL, DABCYL (Matayoshi (1990) Science 247: 954–58; Tyagi, WO 95/13399), Fast Black, (Nardone, US-PS 6,117,986); (iii) Cyanin-Farbstoffen (Lee, US-PS 6,080,868) und (iv) anderen Chromophoren, z.B. Anthrachinon-, Malachitgrün-, Nitrothiazol- und Nitroimidazolverbindungen und dergleichen.
Energietransferfarbstoffe sind eine weitere Art von Oligonukleotid-Markierungen. Eine Energietransfer-Farbstoffmarkierung umfasst einen Donor-Farbstoff verbunden mit einem Akzeptorfarbstoff (US-PS 5,800,996). Licht, z.B. von einem Laser, wird bei einer ersten Wellenlänge von einem Donorfarbstoff, z.B. FAM, absorbiert. Der Donorfarbstoff emittiert Exzitationsenergie, die von dem Akzeptorfarbstoff absorbiert wird. Der Akzeptorfarbstoff fluoresziert bei einer zweiten, längeren Wellenlänge. Die Donorfarbstoff- und Akzeptorfarbstoffgruppen einer Energie-Transfer-Markierung können durch eine Bindung aneinander gebunden sein, die die 4'- oder 5'-Positionen des Donorfarbstoffes, z.B. FAM, an eine 5- oder 6-Carboxygruppe des Akzeptorfarbstoffes bindet. Andere starre oder nicht-starre Bindungen können geeignet sein.
Metallporphyrinkomplexe, z.B. Aluminiumphthalocyanintetrasulfonat (Stanton, WO 88/04777), und Chemilumineszenzverbindungen, z.B. 1,2-Dioxetanchemilumineszenzgruppen (Bronstein, US-PS 4,931,223), sind andere Beispiele für geeignete Oligonukleotid-Markierungen.
Eine weitere Klasse an Markierungen, hierin bezeichnet als Hybridisierungs-stabilisierende Gruppen, umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Kleine-Furche-Binder (Blackburn, M. und Gait, M. Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996) Oxford University Press, Seiten 337–46), Interkalierer, Polykationen wie Polylysin und Spermin, und funktionelle Vernetzungsgruppen. Hybridisierungs-stabilisierende Gruppen können die Stabilität der Basenpaarung, d.h. ihre Affinität, oder die Hybridisierungsgeschwindigkeit erhöhen, veranschaulicht durch hohe thermische Schmelztemperaturen, Tm, des Duplexes. Hybridisierungs-stabilisierende Gruppen können auch die Spezifität der Basenpaarung erhöhen, veranschaulicht durch große Unter schiede in Tm-Werten zwischen einem exakten komplementären Oligonukleotid und Zielsequenzen und resultierenden Duplexen, die eine oder mehrere Fehlpaarungen der Watson/Crick-Basenpaarung enthalten (Blackburn, M. und Gait, M. Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996) Oxford University Press, Seiten 15–81). Markierungen, die die Hybridisierungsspezifität und -affinität erhöhen, sind wünschenswert, z.B. Kleine-Furche-Binder und Affinitätsligandenmarkierungen. Biotin und Digoxigenin sind geeignete Affinitätsligandenmarkierungen zum Einfangen und Isolieren von Oligonukleotiden. Kleine-Furche-Binder umfassen Hoechst 33258, CDPI_1-3 (US-PS 6,084,102; WO 96/32496; Kutyavin (2000) Nucleic Acids Res. 28: 655–61), Netropsin und Distamycin. Andere geeignete Markierungen umfassen elektrophoretische Mobilitätsmodifizierungsmittel, Aminosäuren, Peptide und Enzyme.
Ein markiertes Oligonukleotid kann die Formel IV haben:
wobei das Oligonukleotid 2 bis 1000 Nukleotide umfasst. LABEL ist eine geschützte oder ungeschützte Form eines Fluoreszenzfarbstoffes, eine beispielhafte Klasse von Markierungen, die einen Energie-Transfer-Farbstoff umfasst. B ist eine beliebige Nukleobase, z.B. Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin, 7-Deazaadenin, Guanin und 8-Deazaguanosin. L ist eine Bindung wie Propargylamin (US-PSen 5,047,519; 5,770,716; 5,821,356; 5,948,648). R⁶ ist ein Wasserstoffatom, eine OH-, Halogenid-, Azid-, Amin-, C₁-C₆-Aminoalkyl-, C₁-C₆-Alkyl-, Allyl-, geschützte Hydroxyl-, Trialkylsilyloxy-, tert-Butyldimethylsilyloxy-, C₁-C₆-Alkoxy-, OCH₃- oder OCH₂CH=CH₂-Gruppe. R⁷ ist ein Wasserstoffatom, Phosphat, Internukleotid-Phosphodiester oder Internukleotidanalog. R⁸ ist ein Wasserstoffatom, Phosphat, Internukleotid-Phosphodiester oder Internukleotidanalog. In dieser Ausführungsform kann das Nukleobase-markierte Oligonukleotid IV mehrfache über die Nukleobasen gebundene Markierungen tragen. Das Nukleobase-markierte Oligonukleotid IV kann gebildet werden durch: (i) Kupplung eines Nukleosidphosphoramidit-Reagenzes durch automatisierte Synthese oder (ii) post-synthetische Kupplung mit einem Markierungsreagenz. Am 5'-Ende markierte Oligonukleotide haben die Formel V:
wobei X ein Sauerstoffatom, eine NH-Gruppe oder ein Schwefelatom ist; R⁶ ein Wasserstoffatom, eine OH-, Halogenid-, Azid-, Amin-, C₁-C₆-Aminoalkyl-, C₁-C₆-Alkyl-, Allyl-, C₁-C₆-Alkoxy-, -OCH₃- oder -OCH₂CH=CH₂-Gruppe ist; R⁷ ein Wasserstoffatom, Phosphat, Internukleotid-Phosphodiester oder Internukleotidanalog ist; und L eine C₁-C₁₂-Alkyldiyl-, C₆-C₂₀-Aryldiyl- oder Polyethylenoxygruppe mit bis zu 100 Ethylenoxyeinheiten ist.
Eine Auswahl an Markierungen kann kovalent an das 3'-Ende der Oligonukleotide gebunden sein. Ein Festträger, der eine Markierung oder eine Funktionalität trägt, die durch eine post-synthetische Reaktion markiert werden kann, kann als Festträger für die Oligonukleotidsynthese verwendet werden (US-PSen 5,141,813; 5,231,191; 5,401,837; 5,736,626). Durch diesen Ansatz ist die Markierung oder die Funktionalität während der Synthese des Oligonukleotids anwesend. Während der Abspaltung und Entschützung bleibt die Markierung oder die Funktionalität kovalent an das Oligonukleotid gebunden. Am 3'-Ende markierte Oligonukleotide können die Formel VI haben:
Die Bindung L in den Formeln IV, V und VI kann an einer beliebigen Stelle der Markierung, LABEL, gebunden sein.
Das Markieren kann unter Verwendung von einer beliebigen einer großen Anzahl an bekannten Techniken ausgeführt werden, die bekannte Markierungen, Bindungen, Bindungsgruppen, Standardreagenzien und -reaktionsbedingungen, und Ana lyse- und Reinigungsverfahren anwendet. Im Allgemeinen sollte die Bindung, die die Markierung und das Oligonukleotid verbindet, nicht (i) die Hybridisierung stören, (ii) die enzymatische Aktivität unterdrücken oder (iii) die Eigenschaften der Markierung nachteilig beeinflussen, z.B. durch Quenchen oder Ausbleichen der Fluoreszenz eines Farbstoffes. Oligonukleotide können an Stellen wie einer Nukleobase, einem Zucker, einer Internukleotidbindung und den 5'- und 3'-Enden markiert werden. Oligonukleotide können funktionalisiert werden, um reaktive Amino-, Thiol-, Sulfid-, Disulfid-, Hydroxyl- und Carboxylgruppen an beliebigen dieser Stellen zu tragen. Nukleobase-Markierungsstellen umfassen im Allgemeinen die 7-Deaza- oder C-8-Positionen des Purins oder Deazapurins und die C-5-Position des Pyrimidins. Die Bindung zwischen der Markierung und der Nukleobase kann eine acetylenische oder alkenische Amidobindung sein. Typischerweise wird eine Carboxylgruppe an der Markierung durch die Bildung eines aktiven Esters aktiviert, z.B. N-Hydroxysuccinimid-(NHS)-Ester, und mit einer Aminogruppe der Alkinylamino- oder Alkenylamino-derivatisierten Nukleobase umgesetzt. Markierungen werden in geeignetster und wirksamster Weise am 5'-Ende (Andrus, A. "Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54) als Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Markierungen angebracht, die als Phosphoramidit-Reagenzien als Teil des automatisierten Protokolls funktionalisiert worden sind.
Oligonukleotide können sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende markiert werden. Jedes Ende kann ein oder mehrere Markierungen tragen. Zum Beispiel umfassen Beispiele 1–4 Oligonukleotide mit einem 5'-Fluoreszenzfarbstoff und zwei Markierungen, einem Quencher Q und einem Kleine-Furche-Binder CDPI₃, am 3'-Ende.
In einem ersten Verfahren zur Markierung von synthetischen Oligonukleotiden wird eine nukleophile Funktionalität, z.B. ein primäres aliphatisches Amin, an einem Markierungsbefestigungspunkt eines Oligonukleotids angebracht, z.B. am 5'-Ende. Nachdem die automatisierte Festträgersynthese abgeschlossen ist, wird das Oligonukleotid von dem Träger abgespalten und alle Schutzgruppen werden entfernt. Das Nukleophil-Oligonukleotid wird mit einem Überschuss an Markierungsreagenz, das eine elektrophile Gruppe enthält, z.B. Isothiocyanat oder aktivierten Ester, z.B. N-Hydroxysuccinimid (NHS), unter homogenen Lösungsbedingungen umgesetzt (Hermanson, Bioconjugate Techniques, (1996) Academic Press, San Diego, CA, Seiten 40–55, 643–71; Andrus, A. "Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54). Die markierten Oligonukleotide IV, V oder VI können durch Umsetzung einer reaktiven Bindungsgruppenform, z.B. NHS, eines Farbstoffes mit einem Oligonukleotid, funktionalisiert mit einer Amino-, Thiol- oder anderen nukleophilen Gruppe, gebildet werden (US-PS 4,757,141).
In einem zweiten Verfahren wird eine Markierung direkt in das Oligonukleotid während oder vor der automatisierten Synthese eingebaut, z.B. als Trägerreagenz (US-PSen 5,736,626 und 5,141,813) oder als Nicht-Nukleosidphosphoramidit-Reagenz. Bestimmte Fluoreszenzfarbstoffe und andere Markierungen sind als Phosphoramidit-Reagenzien zur 5'-Markierung funktionalisiert worden (Theisen (1992) Nucleic Acid Symposium Series Nr. 27, Oxford University Press, Oxford, Seiten 99–100).
Polynukleotide können mit Gruppen markiert werden, die die elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit beeinflussen, d.h. Mobilitäts-modifizierende Markierungen. Mobilitäts-modifizierende Markierungen umfassen Polyethylenoxyeinheiten, -(CH₂CH₂O)_n-, wobei n 1 bis 100 sein kann (US-PS 5,624,800). Die Polyethylenoxyeinheiten können durch Phosphatgruppen unterbrochen sein. Speziell markierte Polynukleotide mit Polyethylenoxymarkierungen von bestimmter und bekannter Größe erlauben eine Trennung durch Elektrophorese, die im Wesentlichen unabhängig von der Anzahl der Nukleotide im Polynukleotid ist. Also können Polynukleotide der gleichen Länge aufgrund der Anwesenheit von spektral auflösbaren Farbstoffmarkierungen und Mobilitäts-modifizierenden Markierungen unterschieden werden. Polynukleotide, die sowohl Farbstoffmarkierungen als auch Mobilitäts-modifizierende Markierungen tragen, können enzymatisch durch Ligation oder Polymerase-Erweiterung der einfach markierten Polynukleotid- oder Nukleotidkomponenten gebildet werden.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere gut geeignet für die Abspaltung und Entschützung von Polynukleotiden mit vielen und verschiedenen Markierungen.
V.6 BEISPIELE
Die Erfindung wird ferner durch die Betrachtung der folgenden Beispiele verdeutlicht, die dazu bestimmt sind, rein beispielhaft für die Erfindung zu sein und in keiner Weise ihren Umfang zu beschränken. BEISPIEL 1 Oligonukleotid T₈-Q-CDPI₃:
wurde auf dem DNA-Synthetisierer Modell 3948 (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Acht Zyklen Phosphoramiditchemie wurden mit Thymidin-3'-Phosphoramidit in einer Säule durchgeführt, die 16 mg (200 nmol) hochvernetzten Polystyrol-Kügelchen als Träger enthielt. Der Träger wurde mit 12 μmol/gm einer Bindung beladen, die eine Quencher-Markierung Q und eine Kleine-Furche-Binder-Markierung CDPI₃ umfasste. Die Quencher-Markierung, Q, hat die Formel:
wobei X der Befestigungspunkt an eine Bindung ist. Die Kleine-Furche-Binder-Markierung, CDPI₃, hat die folgende Formel:
wobei X der Befestigungspunkt an eine Bindung ist.
Der Träger wurde in zwei Anteile geteilt. Der erste Anteil wurde mit 15% Ethanol-haltigem Ammoniak (15:85 v/v EtOH:konz. NH₄OH) für 2 Stunden bei 55°C behandelt, um die Abspaltung und Entschützung zu bewirken. Der zweite Anteil wurde mit 3% Diethylmalonat (DEM), gelöst in 15% Ethanol-haltigem Ammoniak (3:15:82 v/v/v DEM:EtOH:konz. NH₄OH), für 2 Stunden bei 55°C behandelt.
Nach dem Abkühlen wurde eine Probe von jedem Anteil durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Das Adsorptionsmittel bestand aus 2–5 μm Teilchen von C-18-Polystyrol/Divinylbenzol. Die mobilen Phasen waren ein Gradient von Acetonitril in TEAA (Triethylammoniumacetat) bei ungefähr pH 7 (Transgenomic WAVE, Transgenomic, Inc., San Jose, CA). Andere mobile Phasen, Bedingungen und HPLC-Ausrüstung sind auch zur Analyse der Oligonukleotide geeignet, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien abgespalten und entschützt sind. Der Hauptprodukt-Peak und die spät-eluierende (erste) Hauptverunreinigung wurden bei jeder Probe getrennt und isoliert. Die spät-eluierende(n) Verunreinigung(en) des ersten Anteils, gespalten und entschützt ohne DEM, wurden durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert (PerSeptive Biosystems Voyager-DE, Framingham, MA) und zeigten eine Masse von 3485,5 [M + 26] Masseneinheiten. Diese Masse stimmt mit einer zusätzlichen Vinylgruppenmodifikation (-CH₂=CH₂) überein. Der Haupt-Peak der HPLC in jedem Anteil wurde über den starken Molekularionen-Peak bei 3459,41 Masseneinheiten (positive mode) T₈-Q-CDPI₃ zugeteilt, wie erwartet. BEISPIEL 2 Oligonukleotid T₁₅-Q-CDPI₃:
wurde auf dem DNA-Synthetisierer Modell 3948 (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. 15 Zyklen Phosphoramiditchemie wurden mit Thymidin-3'-Phosphoramidit in einer Säule durchgeführt, die 16 mg (200 nmol) hochvernetzten Polystyrol-Kügelchen als Träger enthielt. Der Träger wurde mit 12 μmol/gm einer Bindung beladen, die die Quencher-Markierung Q und die Kleine-Furche-Binder-Markierung CDPI₃ umfasste. Der Träger wurde in zwei Anteile geteilt. Der erste Anteil wurde mit 15% Ethanol-haltigem Ammoniak (15:85 v/v EtOH:konz. NH₄OH) für 2 Stunden bei 55°C behandelt, um Abspaltung und Entschützung zu bewirken. Der zweite Anteil wurde mit 3% Diethylmalonat (DEM), gelöst in 15% Ethanol-haltigem Ammoniak (3:15:82 v/v/v DEM:EtOH:konz. NH₄OH), für 2 Stunden bei 55°C behandelt. Nach dem Abkühlen wurde eine Probe von jedem Anteil durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Der ohne DEM abgespaltene und entschützte Anteil zeigt ein komplexes Produktgemisch, das nur 26,5% des gewünschten Produkts, eluiert bei 6,1 Minuten (1a), enthält. Das Produktgemisch ist mit signifikanten (50%) später eluierenden Verunreinigungen verunreinigt. Der mit 3% DEM abgespaltene und entschützte Anteil zeigt eine erhöhte Reinheit, 76,8%, des gewünschten Produktes, das bei 6,1 Minuten eluiert, und eine verringerte Menge an später eluierenden Verunreinigungen (1b).
BEISPIEL 3
Oligonukleotide, die am 5'-Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff (F = 6-Carboxyfluorescein) und am 3'-Ende mit einer Quencher-Gruppe (Q) und einem Kleine-Furche-Binder (CDPI₃) markiert sind:
wurden auf einem DNA-Synthetisierer Modell 3900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Phosphoramiditchemie wurde mit Nukleosid-3'-Phosphoramiditen, einschließlich A^bz, G^dmf, C^bz und T, in einer Säule durchgeführt, die 16 mg (200 nmol) hochvernetzten Polystyrol-Kügelchen als Träger enthielt. Der Träger wurde mit 12 μmol/gm einer Bindung beladen, die eine Quencher-Markierung Q und eine Kleine-Furche-Binder-Markierung CDPI₃ umfasste.
Nach jeder Synthese wurde der Träger in 4 Anteile geteilt. Jeder Anteil wurde mit einem Reagenz, das 0%, 0,1%, 1% oder 3% Diethylmalonat (DEM) in 15% Ethanol-haltigem Ammoniak (15:85 v/v EtOH:konz. NH₄OH) enthielt, für 2 Stunden bei 65°C behandelt, um Abspaltung und Entschützung zu bewirken.
Nach dem Abkühlen wurde eine Probe von jedem Anteil durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Die ohne DEM abgespaltenen und entschützten Anteile zeigen ein komplexes Produktgemisch, das nur 21,8% des gewünschten Produkts, das bei 6,5 Minuten eluiert (2a), bzw. 32,7% des gewünschten Produkts, das bei 6,4 Minuten eluiert (3a), für SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4 enthält. Die Produkt gemische sind mit signifikanten (50%) später eluierenden Verunreinigungen verunreinigt. Die mit 0,1% DEM abgespalteten und entschützten Anteile zeigen verbesserte Reinheiten, 65,8% (2b) und 64,4% (3b), und verringerte Mengen an später eluierenden Verunreinigungen für SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4. Die mit 1% DEM abgespaltenen und entschützten Anteile zeigen ebenfalls verbesserte Reinheiten, 76,7% (2c) und 76,7% (3c) für SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4. Die mit 3% DEM abgespaltenen und entschützten Anteile zeigen ebenfalls verbesserte Reinheiten, 79,5% (2d) und 77,5% (3d) für SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4.
Der Fluoreszenzfarbstoff, 6-Carboxyfluorescein, (F) hat die folgende Formel:
wobei X der Befestigungspunkt an eine Bindung ist.
BEISPIEL 4
Dem Verfahren von Beispiel 3 folgend wurde das 13 nt Oligonukleotid:
synthetisiert und der Träger in zwei Anteile geteilt. Ein Anteil wurde nur mit 15% Ethanol:NH₄OH und der andere mit 3% DEM in 15% Ethanol:NH₄OH abgespalten und entschützt. Eine Probe von jedem Anteil wurde durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Der ohne DEM abgespaltene und entschützte Anteil zeigt ein komplexes Produktgemisch, das nur 26% des gewünschten Produkts enthält, das bei 6,1 Minuten eluiert (4a). Das Produktgemisch ist mit signifikanten später eluierenden Verunreinigungen verunreinigt. Der mit 3% DEM abgespaltene und entschützte Anteil zeigt verbesserte Reinheit, 67%, des gewünschten Produktes, das bei 6,1 Mi nuten eluiert, und eine verringerte Menge an später eluierenden Verunreinigungen (4b).
BEISPIEL 5
Abspaltung/Entschützung in der flüssigen Phase:
Ein Satz von bis zu 48 Oligonukleotiden wird auf dem DNA-Synthetisierer Modell 3948 (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Jedes Oligonukleotid wird mit einer Menge von 50–100 nmol auf ungefähr 20 mg hochvernetztem 3'-Nukleosid-Polystyrol in einer OneStep^TM-Synthese/Reinigungssäule (Applied Biosystems, Foster City, CA; Andrus, US-PSen 5,935,527 und 6,175,006; Baier (1996) BioTechniques 20: 298–303) synthetisiert. Oligonukleotide können 15–50 nt oder länger sein. Oligonukleotide können unmarkiert oder mit Markierungen markiert sein, wie Fluoreszenzfarbstoffe oder Hybridisierungs-stabilisierende Gruppen. Die Synthese wird mit dem FastPhoramidite^TM-Satz an 3'-Phosphoramiditnukleosiden (A^bz, G^dmf, C^bz, T) durchgeführt, die in Acetonitril gelöst sind und an das 5'-Ende der wachsenden Oligonukleotidkette mit Tetrazol oder einem Tetrazolanalog, z.B. 5-Ethylthiotetrazol, als Protonenquellenaktivator gekoppelt werden. Die Synthese kann so programmiert werden, dass entweder die 5'-DMT-Gruppe von dem 5'-Ende des Oligonukleotids durch azide Detritylierung entfernt wird oder dass sie durch Verzicht auf den finalen Detritylierungsschritt intakt bleibt. Wenn ein Satz von 3 Oligonukleotiden den Synthesevorgang unter dem Syntheseflüssigkeitszuflusskopf beendet, rotiert der Satz der drei Säulen unter den Abspaltungs-/Entschützungszuflusskopf. Das erfindungsgemäße Entschützungsreagenz kann zu den Säulen geliefert werden, z.B. 0,5 bis 1,5 ml eines Gemisches an konzentriertem Ammoniumhydroxid und einer aktiven Methylenverbindung. Die aktive Methylenverbindung kann 1 bis 10 Vol.-% des Reagenzes ausmachen. Das Entschützungsreagenz kann ferner 1 bis 30 Vol.-% eines Alkohol-Lösungsmittels enthalten. Das Entschützungsreagenz wird bei Umgebungs- oder höherer Temperatur für einige Minuten bis eine Stunde in der Säule stehen gelassen oder durch diese zirkuliert. Das Oligonukleotid wird dadurch von dem Festträger abgespalten und kann in eine angeschlossene Leitung geliefert werden, die für etwa 1 bis 2 Stunden auf etwa 65°C erhitzt wird, um die Entschützung abzuschließen, d.h. Entfernung der Nukleobase- und Internukleotid-Schutzgruppen.
Wenn die 5'-DMT-Gruppe intakt gelassen worden ist, kann die das entschützte Oligonukleotid enthaltende Lösung mittels Trityl-selektiver hydrophober Interaktion durch Absorption auf das Polystyrol in der OneStep-Säule gereinigt werden, in der es synthetisiert wurde. Nach der Absorption (Beladung) wird die Säule mit Reagenzien behandelt, um das Auswaschen von Verunreinigungen, die Detritylierung des Oligonukleotids und die Elution des entschützten, gereinigten und detritylierten Oligonukleotids zu bewirken.
BEISPIEL 6
Abspaltung/Entschützung in der Gasphase:
Ein Satz von 48 Oligonukleotiden wurde in einem einzelnen vorprogrammierten Lauf auf dem DNA-Synthetisierer Modell 3900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Jedes Oligonukleotid wurde in einer Menge von 200 nmol auf ungefähr 10 mg Polystyrolträger in einer Säule mit Einlass- und Auslassöffnungen synthetisiert. Die Oligonukleotide reichten in der Größe von 15 bis 30 nt Länge. Nachdem die Synthese der 48 Oligonukleotide abgeschlossen war, wurden 200 μl einer 1% DEM-Lösung in Acetonitril auf jede Säule gegeben. Argongas wurde für etwa 30 Sekunden durch die Öffnungen geleitet, um den Großteil der Lösung auszutreiben. Die Säulen wurden dann in einen Halter transferiert, z.B. im 96-Schalenmikrotiterformat. Der Halter wurde in einem abdichtbaren Gefäß aus korrosionsbeständigem Stahl mit einem Innenvolumen von ungefähr einer Gallone platziert. Bis zu vier solcher Halter konnten für parallele Abspaltungs- und Entschützungsvorgänge in dem Gefäß platziert werden. Die Halter wurden auf einem Maschensieb platziert, das ungefähr 1 Inch über dem Boden des Gefäßes angebracht war. Ungefähr 450 ml kalte, konzentrierte Ammoniumhydroxid-Lösung wurde auf den Boden des Gefäßes oder in eine flache Pfanne, die auf dem Boden des Gefäßes sitzt, unter das Maschensieb gegeben. Die Säulen oder Halter waren nicht in direktem Kontakt mit der Ammoniumhydroxid-Lösung. Das Gefäß wurde abgedichtet und für etwa 2 Stunden auf 65°C erhitzt. Der im Inneren während der Erhitzungszeit generierte Druck war etwa 45 psi. Das Gefäß wurde gekühlt, gelüftet und geöffnet.
Die die Säulen enthaltenden Halter wurden aus dem Gefäß entfernt und in eine Vorrichtung platziert, wobei ein Unterdruck angeschlossen werden kann, um Flüssigkeiten und Luft durch die Einlassöffnung der Säulen zu entziehen. Auf jede Säule wurden 250 μl Wasser gegeben und in den Ausschuss durchgezogen. Die abge spaltenen und entschützten Oligonukleotide wurden eluiert, indem jede Säule mit 250 μl 20% (50% für markierte Oligonukleotide) Acetonitril in Wasser beschickt wurden und das Eluat in einem Gefäß gesammelt wurde, das unter der Auslassöffnung der Säule angebracht war. Alternativ können die flüssigen Reagenzien, d.h. Waschwasser oder Eluatlösung, mittels Zentrifugation durch die Säule geleitet werden, wobei der Halter in einer Zentrifuge rotiert wird. Die eluierten Oligonukleotide können unter vermindertem Druck getrocknet und in einem wässrigen Medium aufgenommen, weiter verdünnt oder direkt als Aliquot in Experimenten verwendet werden.
BEISPIEL 7
Dem Verfahren von Beispiel 3 folgend wurde das 25 nt Oligonukleotid:
auf einem C-Polystyrolträger synthetisiert. Nachdem das letzte A-Phosphoramidit gekoppelt wurde, wurden zwei PEO (Pentaethylenoxy; -(CH₂CH₂O)₅-)-Linker als PEO-Phosphoramidit gekoppelt, gefolgt von Aminolink TFA (Applied Biosystems, Foster City, CA)-Phosphoramidit, um die 5'-Aminogruppe mit 2 PEO-Bindungen zu erhalten (Vinayak, WO 00/50432; Andrus, WO 98/39353). Der Träger wurde in zwei Anteile geteilt. Ein Anteil wurde nur mit NH₄OH abgespalten und entschützt. Der andere Anteil wurde mit 1% DEM in 15% Ethanol:NH₄OH abgespalten und entschützt. Eine Probe von jedem Anteil wurde durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Der nur mit NH₄OH abgespaltene und entschützte Anteil zeigt ein komplexes Produktgemisch, das nur 25,8% des gewünschten Produktes enthält, das bei 6,5 Minuten eluiert (5a). Das Produktgemisch ist mit signifikanten später eluierenden Verunreinigungen verunreinigt. Der mit 1% DEM abgespaltene und entschützte Anteil zeigt eine verbesserte Reinheit, 48,9%, des gewünschten Produktes, das bei 6,5 Minuten eluiert, und verringerte Mengen an früher und später eluierenden Verunreinigungen (5b).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Entschützen eines geschützten Oligonukleotids, das mindestens eine 2-Cyanethylphosphat-Internukleotidbindung enthält, wobei das Verfahren den Schritt eines Umsetzens des geschützten Oligonukleotids mit einem Entschützungsreagenz umfasst, das eine aktive Methylen-Verbindung und ein Aminreagenz umfasst, wobei die aktive Methylen-Verbindung mindestens einen 1,3-Ketoester, ein 1,3-Diketon, Malononitril, Malonsäure, Malonamid oder einen Dialkylmalonatdiester umfasst, wobei die Alkylgruppen C₁-C₆-Alkylgruppen sind, wodurch Schutzgruppen von dem Oligonukleotid entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das geschützte Oligonukleotid an einen Festträger über eine Bindung kovalent gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner den Schritt eines Abspaltens des Oligonukleotids von dem Festträger umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid an den Festträger nach einem Umsetzen mit dem Entschützungsreagenz kovalent gebunden verbleibt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Festträger in einer Säule vorliegt, die Einlass- und Auslassöffnungen aufweist, wodurch Reagenzien durch die Säule fließen können.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das geschützte Oligonukleotid mindestens ein Nukleinsäure-Analogon umfasst, ausgewählt aus LNA, PNA und 2'-O-Methyl-RNA.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das geschützte Oligonukleotid an mindestens eine Markierung kovalent gebunden ist, ausgewählt aus einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Quencher, Biotin, einem Mobilitätsmodifizie rungsmittel, einem Kleine-Furche-Binder und einem Linker, ausgewählt aus C₁-C₆-Alkylamin und C₁-C₆-Alkylthiol.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Entschützungsreagenz ferner Wasser oder ein Alkohol-Lösungsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Alkohol-Lösungsmittel ausgewählt ist aus Methanol, Ethanol oder Ethylenglykol.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Entschützungsreagenz ein Gemisch aus einem Dialkylmalonatdiester, wobei die Alkylgruppen C₁-C₆-Alkylgruppen sind, wässrigem Ammoniumhydroxid und einem Alkohol-Lösungsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Dialkylmalonatdiester ausgewählt ist aus Dimethylmalonat, Diethylmalonat, Di-n-propylmalonat oder Diisopropylmalonat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Aminreagenz ausgewählt ist aus wässrigem Ammoniumhydroxid, Methylamin, Ethylamin, Isopropylamin, n-Propylamin, n-Butylamin, 1,2-Ethylendiamin, 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) oder 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en (DBN).
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Umsetzungsschritt erfolgt durch: Benetzen des geschützten Oligonukleotids, das an den Festträger kovalent gebunden ist, mit einer aktiven Methylen-Verbindung und einem Lösungsmittel und sodann Behandeln des geschützten Oligonukleotids mit einem Aminreagenz.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Festträger in einer Säule abgegrenzt ist, die Einlass- und Auslassöffnungen aufweist, wodurch Reagenzien durch die Säule fließen können.
Verfahren nach Anspruch 13, das ferner den Schritt umfasst, wobei das geschützte Oligonukleotid und das Aminreagenz in ein abdichtbares Gefäß gegeben werden, wodurch das Oligonukleotid entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Aminreagenz ausgewählt ist aus wässrigem Ammoniumhydroxid, Ammoniakgas oder C₁-C₆-Alkylamin.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Lösungsmittel ein Alkohol, ein Ether, ein Amid, Acetonitril, Dichlormethan oder Dimethylsulfoxid ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Alkohol Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol oder 1,2-Ethylenglykol ist.