DE60034354T2

DE60034354T2 - Verbindungen zum schutz von hydroxylgruppen und ihre anwendung

Info

Publication number: DE60034354T2
Application number: DE60034354T
Authority: DE
Inventors: Marek Kwiatkowski
Original assignee: Helicos BioSciences Corp
Current assignee: Helicos BioSciences Corp
Priority date: 1999-10-05
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2020-10-06
Also published as: US20040175726A1; WO2001025247A1; ATE359289T1; EP1218391A1; CA2386221C; EP1218391B1; DE60034354D1; US7279563B2; US6309836B1; JP2003511386A; US6639088B2; US20020015961A1; CA2386221A1; AU7979200A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die biologische Chemie im Allgemeinen. Insbesondere betrifft die Erfindung den Schutz von Hydroxygruppen in organischen Molekülen.
Hintergrund der Erfindung
Der temporäre Schutz oder das temporäre Blockieren von chemisch reaktiven Funktionen in biologischen Verbindungen ist ein wichtiges Hilfsmittel auf dem Gebiet der biologischen Chemie. Zu diesem Zweck haben Forscher eine Reihe von Schutzgruppen entwickelt. Die überwiegende Mehrzahl der bekannten Schutzgruppen sind jedoch säure- oder baseempfindlich, und obwohl es Schutzgruppen gibt, die unter neutralen Bedingungen empfindlich sind, sind die meisten dieser Schutzgruppen auch etwas säure- und baseempfindlich. Greene, TW, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley-Interscience (1981). Außerdem gibt es bei vielen Schutzgruppen zusätzliche Probleme, was Synthese, Nebenreaktionen und/oder Löslichkeit betrifft. Beispielsweise halten nur wenige Schutzgruppen, die als Teil eines Kupplungssystems zwischen der festen Phase und dem Oligonukleotid Anwendung finden, allen Belastungen bei der Oligonukleotidsynthese und Entschützung stand und erleichtern dadurch die abschließende Reinigung von Oligonukleotiden frei von verkürzten oder depurinierten Fragmenten. Siehe "Solid Phase Synthesis", Kwaitkowski et al., Internationale Anmeldung WO 98/08857 (1996). Die selektive postsynthetische Derivatisierung von Oligonukleotiden erfordert auch selektiv abspaltbare Schutzgruppen. Siehe z. B. Kahl & Greenberg, "Introducing Structural Diversity in Oligonucleotides via Photolabile, Convertible C5-substituted Nucleotides", J. Am. Chem. Soc., 121(4), 597–604 (1999).
Schutzgruppen sollten auch entfernbar sein. Idealerweise lässt sich die Schutzgruppe unter schonenden Bedingungen entfernen, beispielsweise ohne Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen zu stören. Diese Arten von Schutzgruppen können sich eignen, um Oligonukleotide zu entschützen, ohne Wechselwirkungen zwischen Oligo/Polynukleotidsträngen zu stören. Beispielsweise offenbart die Internationale Anmeldung WO 96/23807 mit dem Titel "Novel Chain Terminators, The Use Thereof for Nucleic Acid Sequencing and Synthesis and a Method of their Preparation", Verfahren, die Nukleotide verwenden, die an der 3'-Hydroxygruppe reversibel blockiert sind. Diese reversibel blockierten Nukleotide können bei Sequenzierverfahren verwendet werden, bei denen die temporär 3'-OH-geschützten Intermediate, anders als bei dem allgemein bekannten Sequenzierverfahren von Sanger, bei dem kettenabbrechende Didesoxynukleotide verwendet werden, in Nukleotide mit einem freien 3'-OH überführt werden, die weiter verlängert werden können.
Eines dieser Sequenzierungsverfahren, das reversibel blockierte Nukleotide verwendet, ist als "Sequenzierung durch Synthese" (Sequencing by Synthesis; SBS) bekannt. Bei der SBS wird die DNA-Sequenz durch basenweisen Einbau von Nukleotiden und gleichzeitiger Bestimmung der Sequenz bestimmt. Um lange Abschnitte einer Nukleinsäure mit SBS effektiv zu sequenzieren, ist es vorteilhaft, dass sich der Einzelnukleotideinbau viele Male wiederholen lässt. Dementsprechend erfordern SBS-basierte Verfahren 3'-OH-Schutzgruppen, die unter Bedingungen entfernt werden können, die die Wechselwirkungen zwischen Primer und Target-DNA nicht unterbrechen. Daher besteht Bedarf an Nukleotidtriphosphaten, die an der 3'-Position reversibel blockiert sind und die gleichzeitig effektive Substrate für DNA-Polymerasen sind.
Tetrahedron Letters, Bd. 32, Nr. 26, S. 3053–3056 beschreibt bifunktionelle Oligodesoxyribonukleotide, die am 3'-Ende eine maskierte Thiolgruppe tragen. Die Thiolgruppe wird von einer Polymerase nicht akzeptiert, so dass mit Primern, die nach diesem Verfahren modifiziert sind, keine Sequenzierungsreaktion durchgeführt werden kann. Demgegenüber liefert die vorliegende Methodik als Einzige das notwendige 3'-OH und verwendet einen Linker, der unter stark basischen Bedingungen, wie sie beim Entschützen von Oligonukleotiden verwendet werden, stabil ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung eine hydrocarbyldithiomethylmodifizierte Verbindung der Formel R¹-O-CH₂-S-S-R² oder ein Salz davon bereit, wobei
R¹ ausgewählt ist aus modifizierten oder unmodifizierten Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Sterinen, Steroiden, Ribonukleosiden, Ribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleosiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleotiden, Desoxyribonukleosiden, Desoxyribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleosiden und basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleotiden; und
R² ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten. R¹ besitzt wenigstens eine Hydroxygruppe, die nach Modifikation eine Etherbindung ist. Bei einer Ausführungsform umfasst R² außerdem eine Markergruppe. Die Markergruppe kann jede Art Markergruppe sein, einschließlich fluoreszierender Markergruppen, die ausgewählt sein können aus der Gruppe bestehend aus Bodipy^TM, Dansyl^TM, Fluorescein, Rhodamin, Texas Red^TM, Cy 2^TM, Cy 4^TM und Cy 6^TM. R¹ kann mehr als eine Hydroxygruppe besitzen, und mehr als eine der Hydroxygruppen kann mit einer Dithiomethylfunktion modifiziert sein. Bei Ausführungsformen mit Nukleotiden kann sich die Dithiomethylmodifikation an der 2'- und/oder 3'- und/oder 5'-Hydroxyposition des R¹-OH befinden.
Bei einer weiteren Ausführungsform enthält R² eine Funktion, die die Elektronendichte der Dithiofunktion modifiziert, wodurch die Stabilität des Dithiols modifiziert wird. Eine solche Funktion kann durch eine chemische Gruppe bereitgestellt werden, die Elemente enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Silicium.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine dithiomethylmodifizierte Verbindung der Formel
oder ein Salz davon bereit, wobei R⁵ H, eine Schutzgruppe, Phosphat, Diphosphat, Triphosphat oder ein Rest einer Nukleinsäure ist, R² eine Nukleobase ist, R³ H, OH oder eine geschützte Form von OH ist; und R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander H, Hydrocarbyl oder ein Rest eines festen Trägers sind. Geeignete Hydrocarbyle für R⁶, R⁷ und R⁸ umfassen Methyl, Ethyl, Isopropyl und tert.-Butyl. Bei einer Ausführungsform umfassen R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander außerdem eine Markergruppe und/oder eine Elektronendonorfunktion oder eine die Elektronendichte modifizierende Funktion. Die die Elektronendichte modifizierende Funktion kann ein Heteroatom sein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Silicium.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der Formel
oder ein Salz davon bereit, wobei R¹ H, eine Schutzgruppe, ein Phosphat, Diphosphat oder Triphosphat oder ein Rest einer Nukleinsäure ist, R² eine Nukleobase ist, R³ oder H oder OH oder eine geschützte Form von OH ist, und R⁹ H oder ein organisches Radikal mit einem direkt an den Rest des Moleküls gebundenen Kohlenstoffatom ist, ausgewählt aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthaltende Kohlenwasserstoffe. Bei einer Ausführungsform ist R⁹ mit einer Markergruppe modifiziert. Bei anderen Ausführungsformen umfasst R⁹ eine derivatisierbare Funktion, oder R⁹ enthält Stickstoff, oder R⁹ ist kovalent an einen festen Träger gebunden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Modifizieren eines Nukleosids bereit, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen eines Nukleosids, das wenigstens eine halogenmethylmodifizierte Hydroxygruppe aufweist, mit einer Thiosulfonatverbindung unter Bildung eines thiosulfonierten Nukleosids; und b) In-Kontakt-Bringen des thiosulfonierten Nukleosids mit einer Hydrocarbylthiolverbindung unter Bildung eines dithiomethylmodifizierten Nukleosids. Geeignete Thiosulfonatverbindungen umfassen Alkylthiosulfonat und Arylthiosulfonat.
Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Markierens des dithiomethylmodifizierten Nukleosids.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure bereit, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen einer Targetnukleinsäure mit einem Primer, wobei wenigstens ein Teil des Primers zu einem Teil der Targetnukleinsäure komplementär ist; b) Einbau eines dithiomethylmodifizierten Nukleotids in den Primer; und c) Nachweis des Einbaus des dithiomethylmodifizierten Nukleotids, wobei das dithiomethylmodifizierte Nukleotid an der Einbaustelle des dithiomethylmodifizierten Nukleotids zu der Targetnukleinsäure komplementär ist. Bei einer Ausführungsform wird der Einbauschritt durch eine DNA-Polymerase katalysiert. Geeignete Sequenzierverfahren, bei denen das oben offenbarte Verfahren verwendet werden kann, umfassen Minisequenzierung und Sequenzierung durch Synthese, sei es dass diese isoliert durchgeführt wird oder als ein Sequenzierungsarray.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure bereit, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen einer Targetnukleinsäure mit einem Primer, wobei wenigstens ein Teil des Primers zu einem Teil der Targetnukleinsäure komplementär ist; b) Einbau eines ersten dithiomethylmodifizierten Nukleotids in den Primer; c) Nachweis des Einbaus des ersten dithiomethylmodifizierten Nukleotids; d) Entfernen der Dithiomethylgruppe von dem ersten eingebauten dithiomethylmodifizierten Nukleotid unter Bildung eines ersten verlängerten Primers mit einer freien Hydroxygruppe; e) Einbau eines zweiten dithiomethylmodifizierten Nukleotids in den ersten verlängerten Primer; und f) Nachweis des zweiten dithiomethylmodifizierten Nukleotids, wobei das erste dithiomethylmodifizierte Nukleotid und das zweite dithiomethylmodifizierte Nukleotid an der jeweiligen Einbaustelle des Nukleotids zu der Targetnukleinsäure komplementär sind. Einmaliges Durchführen der Schritte des Sequenzierverfahrens identifiziert die Sequenz einer Nukleobase der Targetnukleinsäure. Wiederholen der Schritte kann die Bestimmung der Sequenz von mehr als einer Nukleobase der Targetnukleinsäure erleichtern. Die Bedingungen des Sequenzierverfahrens sollten so sein, dass der Primer sequenzspezifisch an die Targetnukleinsäure anlagert oder hybridisiert. Bei einigen Ausführungsformen werden die Nachweisschritte durchgeführt, bevor die Dithiomethylgruppe entfernt wird, während die Nachweisschritte bei anderen Ausführungsformen nach Entfernen der Dithiomethylgruppe erfolgen. Bei einigen Ausführungsformen ist das Verfahren zur Implementierung des Verfahrens in einem Sequenzierungsarray optimiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der Formel
bereit, wobei R⁵ H, eine Schutzgruppe, ein Phosphat, Diphosphat oder Triphosphat oder ein Rest einer Nukleinsäure ist, R⁴ eine Nukleobase ist; R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander H oder ein organisches Radikal mit einem direkt an den Rest des Moleküls gebundenen Kohlenstoffatom sind, ausgewählt aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthaltende Kohlenwasserstoffe; und R¹⁰ H, H-Phosphonat oder Phosphoramidit ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Träger zur Oligonukleotidsynthese der Formel
bereit, wobei R⁵ H, Phosphat, Diphosphat, Triphosphat oder eine Schutzgruppe ist, R⁴ eine Nukleobase ist, R³ H, OH oder eine geschützte Form von OH ist und Z eine zur kovalenten Bindung an einen festen Träger geeignete Gruppe ist, wobei der feste Träger zur Befestigung eines Oligonukleotids während der Oligonukleotidsynthese in der Lage ist. Bei einigen Ausführungsformen ist Z ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino, Amido, Ester und Ether.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids bereit, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines 5'-geschützten ersten Nukleosids, das über einen Linker an einem festen Träger befestigt ist; b) Entschützen des ersten Nukleosids an dessen 5'-Position; c) kovalentes Binden eines weiteren 5'-geschützten Nukleosids an das erste Nukleotid an der 5'-Position des ersten Nukleosids; d) Entschützen des weiteren Nukleosids an dessen 5'-Position; und e) Wiederholen der Schritte c) und d) zum Einbau weiterer geschützter Nukleoside. Für diesen Aspekt der Erfindung befestigt der Linker das erste Nukleotid über eine Dithiomethylbindung an dem festen Träger. Dieses Syntheseverfahren kann zur Herstellung von Oligonukleotidarrays optimiert werden.
Bei einigen Ausführungsformen ist das Oligonukleotidsyntheseverfahren zum Invertieren des Oligonukleotids ausgelegt, wodurch ein Oligonukleotid gebildet wird, das ein freies 3'-Hydroxyl besitzt und über eine andere Position an einem festen Träger befestigt ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines Oligoribonukleotids bereit, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines ersten geschützten Ribonukleosids, das kovalent an einen festen Träger gebunden ist; b) kovalentes Binden wenigstens eines dithiomethylmodifizierten Ribonukleosids an das erste Ribonukleosid unter Bildung eines Oligoribonukleotids; c) partielles Entschützen des Oligoribonukleotids unter sauren oder basischen Bedingungen; und d) In-Kontakt- Bringen des Oligoribonukleotids mit einem Reduktionsmittel unter neutralen Bedingungen und dadurch vollständig Entschützen des Oligoribonukleotids, wobei das dithiomethylmodifizierte Ribonukleosid eine an die 2'-Position des dithiomethylmodifizierten Ribonukleosids gebundene Gruppe enthält. Ein solches Verfahren verhindert effektiv die Spaltung oder Migration von Internukleotidphosphatbindungen bei der Entschützung und invertiert auch das Oligoribonukleotid effektiv, wodurch ein an eine feste Phase gebundenes Oligonukleotid mit einem freien 3'-Hydroxyl gebildet wird. Bei einigen Ausführungsformen ist der pH neutral und kann etwa 7 betragen oder zwischen etwa 5 und etwa 9 liegen. Bei anderen Ausführungsformen ist das erste geschützte Ribonukleosid über eine Dithiomethylbindung an dem festen Träger befestigt oder kovalent an diesen gebunden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure bereit, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Primerarrays, der eine Vielzahl von Sequenzierprimern umfasst; b) In-Kontakt-Bringen einer Targetnukleinsäure mit dem Primerarray, wodurch Target-Primer-Komplexe zwischen komplementären Teilen der Sequenzierprimer und der Targetnukleinsäure gebildet werden; c) Einbau eines ersten dithiomethylmodifizierten Nukleotids in wenigstens einen Sequenzierprimerteil der Target-Primer-Komplexe, wobei das erste dithiomethylmodifizierte Nukleotid zu der Targetnukleinsäure komplementär ist; und d) Nachweis des Einbaus des ersten dithiomethylmodifizierten Nukleotids, wobei das erste dithiomethylmodifizierte Nukleotid an der Einbaustelle des ersten dithiomethylmodifizierten Nukleotids zu der Targetsequenz komplementär ist. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner die Schritte: e) Entfernen der Dithiomethylgruppe von dem ersten eingebauten dithiomethylmodifizierten Nukleotid unter Bildung eines ersten verlängerten Target-Primer-Komplexes mit einer freien 3'-Hydroxygruppe; f) Einbau eines zweiten dithiomethylmodifizierten Nukleotids in den ersten verlängerten Target-Primer-Komplex; und g) Nachweis des zweiten dithiomethylmodifizierten Nukleotids, wobei das zweite dithiomethylmodifizierte Nukleotid an der Einbaustelle des zweiten dithiomethylmodifizierten Nukleotids zu der Targetsequenz komplementär ist. Wie bei anderen hier beschriebenen Verfahren kann der Nachweisschritt vor oder nach Entfernen einer Dithiomethylfunktion erfolgen. Mit diesem Sequenzierverfahren lässt sich effektiv eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen produzieren, wobei die Nukleotidsequenzen überlappenden Nukleotidsequenzen der Targetnukleinsäure entsprechen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure bereit, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Targetnukleinsäurearrays, der eine Vielzahl von Targetnukleinsäuren umfasst; b) In-Kontakt-Bringen eines Sequenzierprimers mit den Targetnukleinsäuren, wodurch Target-Primer-Komplexe zwischen komplementären Teilen der Sequenzierprimer und der Targetnukleinsäuren gebildet werden; c) Einbau eines ersten dithiomethylmodifizierten Nukleotids in wenigstens einen Sequenzierprimerteil der Target-Primer-Komplexe, wobei das erste dithiomethylmodifizierte Nukleotid zu der Targetnukleinsäure komplementär ist; und d) Nachweis des Einbaus des ersten dithiomethylmodifizierten Nukleotids, wobei das erste dithiomethylmodifizierte Nukleotid an der Einbaustelle des ersten dithiomethylmodifizierten Nukleotids zu der Targetsequenz komplementär ist. Wie bei anderen hier beschriebenen Verfahren kann der Nachweisschritt vor oder nach Entfernen einer Dithiomethylfunktion erfolgen. Mit diesem Sequenzierverfahren lässt sich effektiv eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen produzieren, wobei die Nukleotidsequenzen überlappenden Nukleotidsequenzen der Targetnukleinsäure entsprechen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids bereit, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines 5'-geschützten ersten Nukleosids, das durch einen dithiomethylhaltigen Linker kovalent an einen festen Träger gebunden ist; b) Entschützen des ersten Nukleosids an dessen 5'-Position; c) kovalentes Binden eines weiteren 5'-geschützten Nukleosids an das erste Nukleosid an der 5'-Position des ersten Nukleosids; d) Entschützen dieses weiteren Nukleosids an dessen 5'-Position; e) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte c) und d) zum Anhängen weiterer geschützter Nukleoside unter Bildung eines Oligonukleotids; f) gegebenenfalls selektives Abspalten einer Schutzgruppe von dem Oligonukleotid, wodurch ein partiell entschütztes Oligonukleotid gebildet wird; g) selektives Abspalten des dithiomethylhaltigen Linkers; und h) Isolieren des partiell entschützten Oligonukleotids. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Modifizierens des 3'-Endes mit einer reaktiven oder nachweisbaren Funktion. Bei einer weiteren Ausführungsform enthält wenigstens eines der 5'-geschützten Nukleoside eine Dithiomethylfunktion.
Vorteile der Erfindung beinhalten das Einführen temporärer oder reversibler Mutationen in Proteine, das Erleichtern kontinuierlicher Sequenzierverfahren, das Blockieren reaktiver Spezies bei chemischen Synthesen, das Maskieren chemischer Gruppen für Produktionszwecke, die Verwendung von Hydroxygruppen, um Markergruppen in organische Moleküle einzuführen, und andere ähnliche Verwendungsmöglichkeiten. Es versteht sich, dass besondere Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung mit anderen Ausführungsformen der Erfindung vertauscht werden können.
Falls nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet dieser Erfindung geläufige Bedeutung. Obwohl zur Durchführung der Erfindung Verfahren und Materialien verwendet werden können, die den hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, sind nachfolgend geeignete Verfahren und Materialien beschrieben. Im Fall von Widersprüchen gilt die vorliegende Beschreibung einschließlich Definitionen. Darüber hinaus dienen die Materialien, Verfahren und Beispiele lediglich der Veranschaulichung und sollen keine Einschränkung darstellen.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und den Ansprüchen.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft dithiomethylmodifizierte Verbindungen mit modifizierten und/oder geschützten Hydroxygruppen, Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen und Verfahren für ihre Verwendung. Die allgemeine Formel für die hydroxymodifizierende Funktion enthält ein Dithiol. Das Dithiol ist so gestaltet, dass modifizierte Hydroxyle unter neutralen Bedingungen mit milden Reduktionsmitteln entschützt werden können.
Eine dithiomethylmodifizierte Verbindung ist in Formel 1 gezeigt: R¹-O-CH₂-S-S-R² (Formel 1)wobei R¹ ein organisches Molekül darstellt, das vor der Modifikation mit Dithiomethyl wenigstens eine freie Hydroxygruppe aufweist. In Formel 1 ist "O" das Sauerstoffatom der Hydroxygruppe, die nun in einer Etherbindung geschützt ist. Beispielsweise kann R¹ vor der Modifikation eine modifizierte oder unmodifizierte Aminosäure oder ein Analog davon, ein Oligonukleotid, ein Peptid, ein Protein, ein Kohlenhydrat, ein Desoxyribonukleosid, ein Desoxyribonukleotid, eine Ribonukleosid, ein Ribonukleotid, ein basen- und/oder zuckermodifiziertes Ribonukleosid, ein basen- und/oder zuckermodifiziertes Desoxyribonukleosid, ein basen- und/oder zuckermodifiziertes Nukleotid, ein Sterin oder ein Steroid sein, solange das gewählte organische Molekül wenigstens eine Hydroxygruppe besitzt, die mit Dithiomethyl modifiziert werden kann. Unter Oligonukleotiden wird hier jedes Nukleotidpolymer verstanden, einschließlich Polymeren von Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden, Nukleotidanaloga und Mischungen davon.
Wenn R¹-O ein organisches Molekül mit mehr als einer freien Hydroxygruppe ist, kann eine beliebige Anzahl der freien Hydroxyle mit einer Dithiomethylfunktion modifiziert sein. Alternativ können ein oder mehrere der zusätzlichen Hydroxygruppen mit anderen bekannten hydroxymodifizierenden Verbindungen modifiziert und/oder geschützt sein oder unmodifiziert bleiben. Zum Schutz unterschiedlicher Hydroxygruppen können unterschiedliche Schutzgruppen verwendet werden. Andere geeignete Schutzgruppen als die hier beschriebenen Gruppen auf Dithiomethylbasis und Verfahren für deren Verwendung sind dem Fachmann bekannt und umfassen Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), 4-(Anisyl)diphenylmethyltrityl (MMTr), Dimethoxytrityl (DMTr), Monomethoxytrityl, Trityl (Tr), Benzoyl (Bz), Isobutyryl (ib), Pixyl (pi), tert.-Butyldimethylsilyl (TBMS) und 1-(2-Fluorphenyl)-4-methoxypiperidin-4-yl (FPMP). Siehe z. B. Greene, TW, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley-Interscience (1981); Beaucage & Iyer, "Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach", Tetrahedron, 48(12): 2223–2311 (1992); Beaucage & Iyer, "The Synthesis of Specific Ribonucleotides and Unrelated Phosphorylated Biomolecules by the Phosphoramidite Method", Tetrahedron, 49(46): 10441–10488 (1993); und Scaringe et al.; "Novel RNA Synthesis Method Using 5'-O-silyl-2'-O-orthoester Protecting Groups", J. Am. Chem. Soc., 120: 11820–21 (1998). Die Wahl der Schutzgruppe kann durch den Typ des zu schützenden organischen Moleküls und die angewandten Verfahren vorgegeben sein. Deshalb können bei unterschiedlichen organischen Molekülen wie Peptiden, Oligonukleotiden, Kohlenhydraten und Steroiden jeweils unterschiedliche Schutzgruppen verwendet werden. Ein Hydroxyl mit einer daran gebundenen bekannten Schutzgruppe oder Dithiomethylfunktion kann als eine geschützte Form des Hydroxyls bezeichnet werden.
In Formel 1 stellt R² eine Hydrocarbylgruppe dar. Der Begriff Hydrocarbylgruppen, wie er hier verwendet wird, umfasst jedes organische Radikal mit einem direkt an den Rest des Moleküls gebundenen Kohlenstoffatom, z. B. gesättigte und ungesättigte Kohlenwasserstoffe, gerad- und verzweigtkettige aliphatische Kohlenwasserstoffe, cyclische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, heterocyclische Kohlenwasserstoffe, heteroaromatische Kohlenwasserstoffe und substituierte Kohlenwasserstoffe, wie Kohlenwasserstoffe, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten. Die Hydrocarbylgruppe kann kovalent an einen festen Träger (nachfolgend beschrieben), eine Markergruppe oder ein anderes organisches Molekül gebunden sein.
Geeignete Kohlenwasserstoffe umfassen Alkyle (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl und Heptadecyl); Alkoxy; Alkenyl; C_3-8-Alkenyloxy; Alkinyl; Alkinyloxy; C_3-20-Cycloalkyl (z. B. Cyclopropyl, Cyclobutyl oder Cyclopentyl), wobei das Cycloalkyl mit ein oder mehreren Hydrocarbylgruppen oder Heteroatomen substituiert sein kann; C_3-8-Cycloalkoxy (z. B. Cyclopentoxy); C_4-8-Cycloalkenyloxy (z. B. Cyclopenten-3-yloxy); Aryl (z. B. Phenyl) oder Aralkyl (z. B. Benzyl), wobei das Aryl mit ein oder mehreren C_1-4-Alkylgruppen, Halogenatomen, Hydroxygruppen, C_1-4-Alkoxygruppen, Amino- oder Nitrogruppen substituiert sein kann; Aryloxy (z. B. Phenoxy); Arylalkoxy (z. B. Benzyloxy), wobei das Aryl mit ein oder mehreren C_1-4-Alkylgruppen, Halogenatomen, Hydroxygruppen, C_1-4-Alkoxygruppen, Amino- oder Nitrogruppen substituiert sein kann; C_1-6-Hydroxyalkyl (z. B. Hydroxyethyl); und C_1-6-Alkoxyalkyl (z. B. Methoxyethyl). Des Weiteren sind alle iso-, sec- und tert.-Isomere der aliphatischen Kohlenwasserstoffe umfasst, wie Isopropyl und tert.-Butyl.
Substituierte Kohlenwasserstoffgruppen sind Kohlenwasserstoffe, die Nichtkohlenwasserstoffsubstituenten enthalten. Zweckmäßige Substituenten umfassen Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Halogene (z. B. Brom, Chlor, Iod und Fluor), Hydroxy, Carbalkoxy (insbesondere niederes Carbalkoxy) und Alkoxy (insbesondere Niederalkoxy), wobei der Begriff "nieder" Gruppen bezeichnet, die 7 oder weniger Kohlenstoffatome enthalten.
Andere funktionelle modifizierende Gruppen, die die Reaktivität oder Labilität der Disulfidbindung senken können oder die Synthese von Verbindungen der Formel 1 erleichtern, lassen sich in R² einbauen. Geeignete funktionelle modifizierende Gruppen sind bekannt und beinhalten Heteroatome wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Halogene. Funktionelle modifizierende Gruppen umfassen ferner Heterogruppen wie Amino, Nitro und Cyano. Diese Gruppen können als elektronenziehende oder -schiebende Gruppen wirken. Der Fachmann weiß, ob elektronenziehende oder -schiebende Gruppen zweckmäßig sind.
R² kann ferner eine Markergruppe beinhalten. Geeignete Markergruppen sind dem Fachmann bekannt und beinhalten radioaktiv markierte Gruppen, lumineszierende Gruppen, elektrolumineszierende Gruppen, fluoreszierende Gruppen und Gruppen, die sichtbares Licht oder Infrarotlicht absorbieren. Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarker beinhalten Bodipy^TM, Dansyl^TM, Fluorescein, Rhodamin, Texas Red^TM, Cy 2^TM, Cy 4^TM und Cy 6^TM. Weitere geeignete Marker sind im "Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals" von Richard P. Haugland und in "Nonisotopic DNA Probe Techniques", Hrsg. Larry J. Kricka (Academic Press, Inc. 1992) zu finden.
Dithiomethylmodifizierte Verbindungen lassen sich aus gängigen Verbindungen mit dem folgenden beispielhaften Verfahren herstellen. Ein freies Hydroxyl an einem hydroxyhaltigen Molekül wird zu einem Methylthiomethylether modifiziert. Der Methylthiomethylether kann durch Umsetzen des Hydroxyls mit einer Mischung aus Acetanhydrid, Essigsäure und Dimethylsulfoxid (DMSO) gebildet werden. Siehe Hovinen et al., "Synthesis of 3'-O-(ω-Aminoalkoxymethyl)thymidine 5'-Triphosphates, Terminators of DNA synthesis that Enable 3'-Labeling", J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, S. 211–217 (1994). Wenn das zu modifizierende Molekül mehr als eine Hydroxygruppe enthält, kann es selbstverständlich erforderlich sein, zuerst ein oder mehrere Hydroxygruppen zu schützen oder zu blockieren, die nicht dithiomethylmodifiziert werden sollen.
Die Methylthiomethylether-derivatisierte Verbindung wird dann in eine reaktivere Spezies wie einen halogenierten Methylether überführt. Geeignete Halogene umfassen Brom, Chlor und Iod. Der Halogenierungsschritt lässt sich mit jedem Verfahren durchführen, einschließlich der Behandlung des Methylthiomethylethers mit N-Bromsuccinimid (NBS), oder Br₂ in trockenem Chlorethan, oder SOCl₂ oder N-Iodsuccinimid (NIS).
Die halogenierte Methyletherverbindung wird dann in ein Hydrocarbylthiosulfonatreagens überführt, indem man es mit einem Alkylhydrocarbylthiosulfonat behandelt. Siehe Bruice & Kenyon, "Novel Alkyl Alkanethiolsulfonate Sulfhydryl reagents, Modification of Derivatives of L-Cysteine", J. Protein Chem., 1(1): 47–58 (1982) und Plettner et al., "A Combinatorial Approach to Chemical Modification of Subtilisin Bacillus lentus", Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 8, S. 2291–96 (1998).
Das In-Kontakt-Bringen des Hydrocarbylthiosulfonatreagens mit einem unsubstituierten oder substituierten Thiol kann zur Verdrängung der Sulfonylfunktion führen, wodurch eine dithiomethylmodifizierte Verbindung gebildet wird. Geeignete Thiole umfassen verzweigt- und geradkettige aliphatische Thiole, aromatische Thiole, heteroaromatische Thiole, substituierte aliphatische Thiole, funktionell modifizierte Thiole und mit einem Fluorophor markierte Thiole. Funktionell modifizierte Thiole beinhalten Thiole, die an einem Kohlenstoffatom mit einem Atom oder einer Gruppe substituiert sind, die die Reaktivität einer Dithiofunktion verändern können, eine anschließende Markierung erleichtern können oder die Immobilisierung der modifizierten Verbindung erleichtern können. Geeignete Beispiele modifizierender Gruppen umfassen Amino, Amido, Hydroxy, Silyl, Cyano, Carbonsäureester oder andere Carboxysubstitutionen.
Die Verwendung der Verbindungen der Formel 1 kann besonders nützlich sein, wenn R¹ eine Nukleobase enthält. Der Begriff Nukleobase, wie er hier verwendet wird, umfasst jede natürliche Nukleobase, synthetische Nukleobase und/oder Analoge davon. Natürliche Nukleobasen umfassen Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, Xanthin, Hypoxanthin und 2-Aminopurin. Synthetische Nukleobasen werden üblicherweise chemisch synthetisiert und sind Analoge der natürlichen Nukleobasen. Synthetische Nukleobasen sind in der Lage, mit anderen Nukleobasen zu interagieren oder Wasserstoffbrücken zu bilden. Nukleobasen enthaltende Verbindungen können sowohl Nukleoside als auch Nukleotide beinhalten. Nukleoside und Nukleotide können an den 5'-, 3'- und/oder 2'-Hydroxypositionen modifiziert sein. Bekannte Verfahren zum Schützen der 5'-, 3'- und/oder 2'-Positionen können in Verbindung mit den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, um individuelle Hydroxypositionen zu modifizieren.
Beispielsweise kann die in Formel 2 gezeigte Verbindung
(Formel 2) oder ein Salz davon mit den hier beschriebenen Verfahren synthetisiert werden. In Formel 2 ist R⁵ H, eine Schutzgruppe, Phosphat, Diphosphat, Triphosphat oder ein Rest einer Nukleinsäure; R⁴ ist eine Nukleobase; R³ ist H, OH oder eine geschützte Form von OH; R⁶, R⁷ und R⁸ sind gleichzeitig oder unabhängig voneinander H, Hydrocarbyl oder ein Rest eines festen Trägers. R⁶, R⁷ und R umfassen beispielsweise gleichzeitig oder unabhängig voneinander H, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert.-Butyl, Phenyl oder Benzyl. Es kann zweckmäßig sein, an den Positionen R⁶, R⁷ und R⁸ einen substituierten Kohlenwasserstoff mit einer die Elektronendichte modifizierenden Gruppe einzuschließen, die ein Heteroatom enthält, oder eine andere funktionelle modifizierende Gruppe. R⁶, R⁷ oder R⁸ könnten beispielsweise Methylenamin oder Ethylenamin sein oder eine Aminogruppe enthalten. Gegebenenfalls können R⁶, R⁷ oder R⁸ mit einer Markergruppe modifiziert sein.
Ein weiteres Anschauungsbeispiel für geeignete dithiomethylmodifizierte Verbindungen beinhaltet die Verbindungen der Formel 3
(Formel 3) oder ein Salz davon, wobei R⁵ H, eine Schutzgruppe, eine Phosphatgruppe, eine Diphosphatgruppe oder eine Triphosphatgruppe ist; R⁴ eine Nukleobase ist; R³ H oder OH oder eine geschützte Form von OH ist; und R⁹ H, ein Heteroatom, eine Heterogruppe, ein organisches Radikal mit einem direkt an den Rest des Moleküls gebundenen Kohlenstoffatom, ausgewählt aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten, oder ein markermodifiziertes Hydrocarbyl ist. R⁹ kann verwendet werden, um die Verbindung der Formel 3 an einen festen Träger zu binden.
Eine dithiomethylmodifizierte Verbindung, die eine Nukleobase enthält, kann mit den hier beschriebenen Verfahren chemisch synthetisiert werden. Zum Beispiel:
Verbindung A (in der R¹ eine geeignete Schutzgruppe ist, R² eine Nukleobase ist und R³ entweder ein geschütztes Hydroxyl oder H ist) wird mit einer Mischung aus DMSO, Essigsäure und Acetanhydrid zu einem Methylthiomethylether (Verbindung B) umgesetzt.
Der Methylthiomethylether (Verbindung B) wird in eine reaktivere halogenierte Spezies (Verbindung C) überführt, in der X Br, Cl oder I ist.
Verbindung C wird zur Herstellung von Verbindung D mit einem Alkyl- oder Arylthiosulfonat wie Methylphenylthiosulfonat (MePhSO₂SH) behandelt.
Verbindung D wird mit einer Hydrocarbylthiolverbindung wie 2-Thioaminoethan zu einer dithiomethylmodifizierten Nukleobase (Verbindung E) umgesetzt. In einigen Fällen kann Verbindung E das Endprodukt sein.
Wenn das zur Bildung von Verbindung E verwendete Thiol einen modifizierbaren Substituenten enthält, kann Verbindung E wie unten gezeigt weiter modifiziert oder markiert werden. Verbindung E kann unter bekannten Bedingungen mit einer Isothiocyanatform eines geeigneten Fluorophors (beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat) zu Verbindung F umgesetzt werden. Verbindung F kann weiter modifiziert werden. Beispielsweise kann R¹ durch eine Mono-, Di- oder Triphosphatgruppe ersetzt werden. Die Bildung eines Triphosphats kann die Verwendung der Nukleobase enthaltenden Verbindungen bei enzymatischen und templatabhängigen DNA- oder RNA-Synthesereaktionen erleichtern.
Dithiomethylmodifizierte Nukleotidtriphosphate, die an der 3'-Position geschützt sind (wie oben beschrieben), eignen sich für jedes Sequenzierverfahren. 3'-dithiomethylmodifizierte Nukleotidtriphosphate können die Verlängerung der Primersequenz abbrechen, wenn sie bei einem DNA-Polymerase-vermittelten Sequenzierverfahren verwendet werden. Anders als bei den meisten herkömmlichen Didesoxyverfahren, bei denen der Einbau des Didesoxynukleotids permanent ist, ist der Abbruch bei Verwendung eines dithiomethylmodifizierten Nukleotids jedoch reversibel. Einer der Vorteile bei der Verwendung eines dithiomethylmodifizierten Nukleotids zur Sequenzierung besteht daher darin, dass die Sequenzierungsreaktion gestoppt und gestartet werden kann, indem man die labile Natur der Schutzgruppe nutzt. Das heißt, die Dithiomethylfunktion kann durch Reduktion der Disulfidbindung der Schutzgruppe entfernt werden. Die Reduktion des Disulfids führt zu einem instabilen Intermediat, das spontan unter Bildung eines freien 3'-Hydroxyls zerfällt, das zum Anhängen eines weiteren Nukleotids verwendet werden kann. Das Disulfid der Dithiomethylfunktion kann mit irgendeinem Reduktionsmittel reduziert werden. Geeignete Reduktionsmittel umfassen Dithiothreitol (DTT), Mercaptoethanol, Dithionit, reduziertes Glutathion, reduziertes Glutaredoxin, reduziertes Thioredoxin und jedes andere Reduktionsmittel auf Peptidbasis oder organischer Basis, oder andere dem Fachmann bekannte Reagenzien. Die Reduktion kann unter neutralen Bedingungen erfolgen. Es versteht sich, dass der Reduktionsschritt, der zur spontanen Aufspaltung des Intermediats führt, für alle dithiomethylmodifizierten Verbindungen anwendbar ist. Dementsprechend kann es erforderlich sein, die Bedingungen herkömmlicher Sequenzierungsreaktionen mit DNA-Polymeraseenzymen, die reduziertes Thioredoxin verwenden, so anzupassen, dass keine freien Thiole vorhanden sind, wenn die dithiomethylmodifizierten Nukleotide zugesetzt werden.
Die Verbindungen der Formeln 1–3 eignen sich als Reagenzien bei nahezu allen Verfahren zum Sequenzieren eines Nukleinsäuremoleküls. Allgemeine Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren sind bekannt und umfassen Didesoxy-Sequenzierverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 5463–5467 (1977), chemische Abbauverfahren (Maxam & Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 560–64 (1977), Minisequenzierverfahren (Syvänen et al., Genomics, 8: 684–92 (1990) und Sequenzieren durch Synthese (d. h. mehrfaches Wiederholen des Minisequenzierverfahrens). Bei diesen Verfahren ist es allgemein üblich, das 3'-Hydroxyl einiger der Nukleotide zu blockieren. Außerdem erfordert das Sequenzierverfahren durch Synthese die Verfügbarkeit von Nukleotiden mit einem reversibel blockierten 3'-Hydroxyl.
Ein Sequenzierverfahren kann beispielsweise ablaufen, indem man eine Targetnukleinsäure mit einem Primer in Kontakt bringt. Die Targetnukleinsäure kann jedes beliebige Nukleinsäuremolekül sein. Der Primer sollte ebenfalls ein Nukleinsäuremolekül sein. Üblicherweise ist der Primer kürzer als die zu sequenzierende Nukleinsäure. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren zum Sequenzieren und zur Produktion und Herstellung von Primersequenzen, die bei einer Sequenzierungsreaktion verwendet werden sollen, sind bekannt. Vorteilhaft wird der Primer so konstruiert, dass wenigstens ein Teil des Primers zu einem Teil der Targetnukleinsäure komplementär ist. Ferner wird der Primer vorteilhaft so konstruiert, dass der ganze Primer zu einem Teil der Targetnukleinsäure komplementär ist.
Bei einer Sequenzierungsreaktion werden die Primer- und die Targetnukleinsäuresequenzen so kombiniert, dass der Primer sequenzspezifisch an die Targetnukleinsäure anlagert oder hybridisiert. Dann wird ein DNA-Polymeraseenzym verwendet, um weitere Nukleotide sequenzspezifisch oder templatabhängig so in den Primer einzubauen, dass das in den Primer eingebaute Nukleotid zu der Targetnukleinsäure komplementär ist. Beispielsweise wird der Sequenzierungsreaktion ein 3'-dithiomethylmodifiziertes Nukleotid oder eine Mischung von Nukleotiden in ausreichender Konzentration zugesetzt, so dass die DNA-Polymerase ein einziges dithiomethylmodifiziertes Nukleotid in den Primer einbaut, das zu der Targetsequenz komplementär ist. Der Einbau des dithiomethylmodifizierten Nukleotids kann mit jedem bekannten Verfahren nachgewiesen werden, das für den verwendeten Markertyp geeignet ist.
Ein zweiter oder anschließender Einbauzyklus für das dithiomethylmodifizierte Nukleotid kann nach Inkubieren des Primer-Targetsequenz-Komplexes mit einem geeigneten Reduktionsmittel erfolgen. Ferner kann jeder Einbauzyklus abgeschlossen werden, ohne die Hybridisierung zwischen Primer und Targetsequenz zu zerstören. Nach Reduktion des Disulfids wird das 3'-OH unblockiert und für einen weiteren Zyklus des Nukleotideinbaus zugänglich. Die Einbau- und Reduktionsschritte können so oft wiederholt werden, wie es zur vollständigen Sequenzierung der Targetsequenz erforderlich ist. Auf diese Weise kann es vorteilhaft sein, die einzelnen Nukleotide unterschiedlich zu markieren, so dass Einbau unterschiedlicher Nukleotide nachgewiesen werden kann. Ein solches Verfahren kann bei Einzelsequenzierungsreaktionen, automatisierten Sequenzierungsreaktionen und arraybasierten Sequenzierungsreaktionen verwendet werden.
Dithiomethylmodifizierte Desoxyribonukleotide und Ribonukleotide können ebenfalls zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden. Die chemische Synthese von Oligoribonukleotiden ist aufgrund des 2'-OH in Ribonukleosiden im Vergleich mit Oligodesoxyribonukleotiden zusätzlich komplex. Das 2'-OH muss während der Synthese geschützt sein. Außerdem muss die blockierende Gruppe beim abschließenden Deblockieren entfernbar sein. Die zum Deblockieren herkömmlicher Schutzgruppen verwendeten Bedingungen können Spaltung und/oder Migration von Internukleotidbindungen begünstigen, d. h. die 5'-3'-Bindung des Oligonukleotids kann wandern und eine 5'-2'-Bindung bilden. Diese Spaltung ist sowohl säure- als auch basekatalysiert, während die Migration säurekatalysiert ist. Als solches ist die Blockierung des 2'-OH mit einer Dithiomethylfunktion vorteilhaft, weil die Bindung: 1) unter herkömmlichen/üblichen sauren und basischen Bedingungen stabil ist, während andere blockierte Regionen des Oligoribonukleotids entschützt werden, und 2) die Dithiomethylfunktion unter neutralen Bedingungen mit einem einfachen Reduktionsmittel entfernt werden kann.
Ein Verfahren zur Synthese eines Oligoribonukleotids mit Ribonukleosiden, die an der 2'-OH-Position mit einer Dithiomethylfunktion modifiziert sind, kann wie folgt ablaufen. Ein erstes Nukleosid wird mit bekannten Verfahren an einen festen Träger gebunden. Siehe z. B. Pon, R. T. "Chapter 19 Solid-phase Supports for Oligonucleotide Synthesis", Methods in Molecular Biology Vol. 20 Protocols for Oligonucleotides and Analogs, 465–497, Hrsg. S. Agrawal, Humana Press Inc., Towata, NJ (1993). Die 2'-OH-modifizierende Funktion kann eine Dithiomethylfunktion oder irgendeine andere bekannte Schutzgruppe (z. B. Ester) sein. Alternativ wird das erste Ribonukleosidmonomer mit bekannten Verfahren an einen festen Träger gebunden, aber auch mit einem Linker wie in Formel 6 gezeigt (nachfolgend beschrieben). Es versteht sich, dass das 5'-OH und das 3'-OH ebenfalls nach Bedarf mit bekannten Verfahren oder den hier beschriebenen Verfahren geschützt werden. Nachdem das Anfangsnukleosid an den festen Träger gebunden ist, werden weitere dithiomethylmodifizierte Ribonukleosidmonomere mit jeder beliebigen bekannten Strategie zur Bildung von Internukleotidbindungen an das wachsende Oligoribonukleotid angehängt. Das vollständige Oligoribonukleotid wird dann mit Ammoniak an allen Positionen außer der 2'-O-Position deblockiert. Das partiell deblockierte Oligoribonukleotid wird dann zur endgültigen Entschützung unter neutralen Bedingungen mit einem Reduktionsmittel in Kontakt gebracht. Neutrale Bedingungen sind Bedingungen, die die Migration von Internukleotidbindungen nicht fördern. Bedingungen mit einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 9 und beliebigen Werten dazwischen, z. B. 7, werden als neutral angesehen.
Ein Ribonukleosid, das zur Verwendung bei einer chemischen Oligonukleotidsynthesereaktion mit einem dithiomethylmodifizierten Ribonukleosidmonomer geeignet ist, ist in Formel 4 gezeigt,
(Formel 4) wobei R¹ H oder eine Schutzgruppe ist, R² eine Nukleobase ist, R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander H oder ein organisches Radikal mit einem direkt an den Rest des Moleküls gebundenen Kohlenstoffatom sind, ausgewählt aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten. R¹⁰ kann H, H-Phosphonat oder Phosphoramidit sein.
Ein Beispiel für Formel 4 ist in Formel 5 gezeigt
(Formel 5) wobei R⁴ eine Nukleobase ist, R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander H oder ein organisches Radikal mit einem direkt an den Rest des Moleküls gebundenen Kohlenstoffatom sind, ausgewählt aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten.
Alternativ können auch andere blockierende Gruppen verwendet werden, um das Nukleosid an den 5'-OH- und 3'-OH-Positionen entsprechend dem Bedarf des Fachmanns zu blockieren.
Geeignete Ribonukleoside (wie oben beschrieben) zum Anhängen einer Dithiomethylfunktion an ein Nukleosid lassen sich mit bekannten Verfahren und/oder den hier beschriebenen Verfahren herstellen.
Chemische Syntheseverfahren unter Verwendung der hier beschriebenen Oligodesoxyribonukleotide und Oligoribonukleotide können Verfahren zum Invertieren der Orientierung der Oligonukleotide an dem festen Träger beinhalten. Die Internationale Anmeldung WO 98/51698 mit dem Titel "Synthesis of Oligonucleotides" offenbart Verfahren zur Herstellung immobilisierter Oligonukleotide und ihre anschließende Inversion zur Herstellung von Oligonukleotiden mit einem freien 3'-OH. Diese Verfahren können zusammen mit den hier beschriebenen Verbindungen und Verfahren verwendet werden, um Oligonukleotidarrays herzustellen. Die Arrays eignen sich für Bindungs- und Sequenzierungsreaktionen, insbesondere automatisierte Sequenzierungsreaktionen.
Chemische Syntheseverfahren mit den hier beschriebenen Oligodesoxyribonukleotiden und Oligoribonukleotiden können Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden mit unterschiedlichen hydrophoben Eigenschaften beinhalten. Oligonukleotide können mehr oder weniger hydrophob gestaltet werden, indem man selektiv abspaltbare Schutzgruppen verwendet. Um den hydrophoben Charakter des Nukleotids zu verändern, wird nach Synthese des Oligonukleotids ein Teil der Schutzgruppen entfernt. Durch Änderung des Verhältnisses von Schutzgruppen, die an das fertige Oligonukleotid gebunden sind, zur Anzahl von entfernten Schutzgruppen lässt sich die Hydrophobie des fertigen Oligonukleotids steuern. Diese Oligonukleotidtypen können als Pro-Oligonukleotide bei Behandlungsverfahren mit Antisense-Wirkstoffen für zahlreiche Krankheitszustände von Nutzen sein. Der Artikel von Tosquellas et al., "The Pro-Oligonucleotide Approach: Solid Phase Synthesis And Preliminary Evaluation Of Model Pro-Dodecathymidylates", Nucleic Acids Res., 26: 9, 2069–74 (1998) liefert ein Beispiel für solche Pro-Oligonukleotide.
Oligonukleotide mit veränderter Hydrophobie lassen sich entsprechend den hier beschriebenen Verfahren synthetisieren. Beispielsweise wird ein erstes geschütztes Nukleosid kovalent an einen festen Träger gebunden. Zum Zusammenbau eines Oligonukleotids werden entsprechend den hier beschriebenen Verfahren weitere geschützte Nukleoside angehängt. Die zusätzlichen Nukleoside können jeweils unterschiedliche Schutzgruppen haben. Ein Teil der Schutzgruppen kann entfernt werden. Nach Reduktion der Dithiobindung wird das Oligonukleotid von der festen Phase abgespalten, gewaschen und aufgefangen. Dieses Verfahren ermöglicht die Isolierung eines nahezu vollständig geschützten Oligonukleotids. Das 3'-Ende des Oligonukleotids kann mit einer reaktiven oder nachweisbaren Funktion modifiziert sein. Die an der 3'-Position aktivierten Oligonukleotidfragmente können zur Konstruktion von größeren Nukleotiden oder von synthetischen Genen verwendet werden. Sie können auch bei einem Verfahren zur kombinatorischen Synthese von Genvarianten verwendet werden, denen unerwünschte Stoppcodons fehlen.
Dithiomethylmodifizierte Verbindungen können auch verwendet werden, um Moleküle an einen festen Träger zu binden. Insbesondere kann es vorteilhaft sein, dithiomethylmodifizierte Verbindungen zur chemischen Synthese von organischen Molekülen wie Oligonukleotiden, Peptiden und Kohlenhydraten zu verwenden. Zur Kupplung organischer Moleküle an feste Träger sind verschiedene Verfahren bekannt. Siehe z. B. Pon, R. T., "Chapter 19 Solid-phase Supports for Oligonucleotide Synthesis", Methods in Molecular Biology Vol. 20 Protocols for Oligonucleotides and Analogs, 465–497, Hrsg. S. Agrawal, Humana Press Inc., Towata, NJ (1993). Nur wenige Verfahren ergeben jedoch Bindungen, die unter sauren und basischen Bedingungen inert sind, und liefern nach Spaltung der Bindung eine freie Hydroxygruppe. Beispielsweise sind fotochemisch empfindliche o-Nitrobenzyletherbindungen, Siloxylbindungen und Bindungen vom Disiloxyltyp, die mit Fluoridanionen spaltbar sind, sowohl unter sauren als auch unter basischen Bedingungen inert und liefern nach Spaltung der Bindung eine freie Hydroxygruppe. Die Verwendung der obigen Bindungen ist manchmal unpraktisch oder mit unerwünschten Nebenreaktionen verbunden. Die hier beschriebenen dithiomethylmodifizierten Bindungen sind unter neutralen Bedingungen spaltbar.
Dementsprechend kann ein Träger für die Oligonukleotidsynthese das in Formel 6 gezeigte Molekül umfassen
(Formel 6) wobei R⁵ H, Phosphat, Diphosphat, Triphosphat oder eine 5'-Schutzgruppe ist, R⁴ eine Nukleobase ist, R³ H, OH oder eine geschützte Form von OH ist, und Z eine zur kovalenten Bindung an einen festen Träger geeignete Gruppe ist. Beispiele für Z umfassen Amido, Ether und beliebige andere dem Fachmann bekannte Gruppen mit Linkerfunktion. Ein solcher Linker, der an einen festen Träger gekuppelt werden kann, eignet sich zur Befestigung eines Oligonukleotids bei der Oligonukleotidsynthese.
Ein Beispiel für einen in Formel 6 beschriebenen Linker ist in Formel 7 gezeigt,
Formel 7 wobei R⁴ eine Nukleobase ist, R³ H, OH oder eine geschützte Form von OH ist.
Die chemische Synthese eines Oligonukleotids kann erfolgen, indem ein erstes Nukleosidmonomer an einen festen Träger gebunden wird. Es kann jeder bekannte feste Träger verwendet werden, einschließlich nichtporöser und poröser fester Träger und organischer und anorganischer fester Träger. Geeignete feste Träger umfassen Polystyrole, vernetzte Polystyrole, Polypropylen, Polyethylen, Teflon, Polysaccharide, vernetzte Polysaccharide, Silica und verschiedene Gläser. In manchen Fällen vertragen sich bestimmte feste Träger nicht vollständig mit chemischen Aspekten der Oligonukleotidsynthese. Beispielsweise können stark alkalische Bedingungen bei erhöhten Temperaturen, die zum Entschützen synthetischer Oligonukleotide verwendet werden, oder Fluoridanionen, wie sie Tetrabutylammoniumfluorid liefert, nicht bei Silica- oder Glasträgern verwendet werden. Übliche Linker und Verfahren zur Bindung von Monomeren oder Oligonukleotiden an einen festen Träger sind bekannt. Siehe Beaucage & Iyer, Tetrahedron, 48(12): 2223–2311 (1992).
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben, die die Erfindung, wie sie in den Ansprüchen erläutert wird, nicht einschränken.
Beispiel 1. Synthese von 5'-O-FMOC-Thymidin.
Thymidin (10 mmol) wurde durch Koverdampfung mit trockenem Pyridin (2 × 30 ml) getrocknet, erneut in trockenem Pyridin (50 ml) gelöst und mit einem Aceton/Trockeneis-Bad auf eine Temperatur von –20°C gekühlt. Die Thymidinlösung wurde mit einem Magnetrührer gerührt, und über 60 Minuten wurde eine Dichlormethanlösung von FMOC-Cl (12 mmol, 1,2 Äq. in 20 ml DCM) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 60 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zwischen gesättigtem Natriumhydrogencarbonat (250 ml) und Dichlormethan (3 × 100 ml) partitioniert. Die organische Phase wurde aufbewahrt, vereinigt, eingedampft und durch Koverdampfung mit Toluol (2 × 50 ml) unter Bildung eines öligen Rückstands getrocknet. Ein reines Produkt wurde mit Dichlormethan (30 ml) und Benzol (50 ml) als Lösungsmittel aus dem öligen Rückstand kristallisiert. Ausbeute 76% – weiße Kristalle.
Beispiel 2. Synthese von 5'-O-FMOC-3'-O-methylthiomethylthymidin.
Das Produkt von Beispiel 1 (5'-O-FMOC-Thymidin (7,0 mmol)) wurde in 50 ml einer Lösung von Essigsäure:Acetanhydrid:DMSO (11:35:54, v/v) bei 20°C gelöst (Zavgorodny et al. (1991), Tetrahedron Lett., 32: 7593–7596). Die Lösung wurde vier Tage bei 20°C gerührt, was zu einer vollständigen Umwandlung des Ausgangsmaterials in das Methylthiomethyletherderivat führte, wie durch Dünnschichtchromatografie (TLC) verfolgt wurde. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer bei 50°C unter Hochvakuum (Ölpumpe) abgedampft. Der Rückstand wurde in Ethanol (30 ml) gelöst und in kräftig gerührtes Wasser (500 ml) gegossen. Ein festes Material fiel aus und wurde abfiltriert. Der Niederschlag wurde dann in Dichlormethan gelöst, mit Toluol koverdampft (2 × 50 ml) und mit Dichlormethan:Chloroform (1:1, v/v) als Lösungsmittel flashchromatografiert, was das Endprodukt als Öl lieferte. Ausbeute 72%.
Beispiel 3. Synthese von 5'-O-FMOC-3'-O-(4-Methylphenylthiosulfonatmethyl)thymidin.
Das Produkt von Beispiel 2 (5'-O-FMOC-3'-O-Methylthiomethylthymidin (4,0 mmol)) wurde in einer Dichlormethanlösung (20 ml) gelöst, und bei 20°C wurde Brom (Br₂) (226 μl) zugegeben. Nach 10 Minuten Inkubation wurden ein in trockenem DMF (10 ml) gelöstes p-Toluolthiosulfonsäure-Kaliumsalz (10,0 mmol) und Lutidin (1,5 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde weitere 120 Minuten gerührt, durch Zugabe von gesättigtem NaHCO₃ gequencht und mit Dichlormethan (3 × 50 ml) extrahiert. Die resultierende organische Phse wurde eingedampft, mit Toluol koverdampft und mit Chloroform als abschließendem Lösungsmittel flashchromatografiert. Das Endprodukt wurde als Öl isoliert. Ausbeute 58%.
Beispiel 4. Synthese von 3'-O-Hydrocarbyldithiomethylthymidin-Derivaten.
Das Produkt von Beispiel 3 (1 mmol) wird in Pyridin (5,0 ml) gelöst und es wird ein geeignetes Thiol, beispielsweise in Pyridin (2,0 ml) gelöstes reduziertes Cystamin ("R"SH, d. h. Hydrocarbylthiol) (1,1 mmol) zugegeben.
Die Mischung wird 60 Minuten bei 20°C gerührt und dann mit üblichen Bicarbonatextraktionsverfahren extrahiert und durch Flashchromatografie gereinigt. In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, das Syntheseverfahren durch Zugabe von trockenem Triethylamin (4,0 mmol) fortzuführen, um die 5'-O-FMOC-Schutzgruppe zu entfernen. Nach 45 Minuten wird das Lösungsmittel abgedampft, und das 5'-OH-Derivat wird nach üblicher Aufarbeitung mit wässrigem NaHCO₂ und Dichlormethan und Eindampfen der organischen Extrakte durch Chromatografie isoliert.
Beispiel 5. Synthese von 3'-O-(2-N-Dansylethyldithiomethyl)thymidin.
Es wird das allgemeine Verfahren von Beispiel 4 unter Verwendung von N-Dansylethanthiol als Thiol durchgeführt. N-Dansylethanthiol wird durch Umsetzen von Cystamindihydrochlorid mit Dansylchlorid und anschließender Reduktion des Disulfids mit Natriumborhydrid hergestellt. N-Dansylethanthiol wird durch rasche Silicagelreinigung isoliert.
Nach Bildung der gewünschten 2-N-Dansylethyldithiomethylbindung wird die 5'-FMOC-Gruppe mit bekannten Verfahren entfernt.
Beispiel 6. Synthese von 3'-O-(2-N-Dansylethyldithiomethyl)thymidin-5'-triphosphattetralithiumsalz.
Das Produkt von Beispiel 5 (3'-O-(2-N-Dansylethyldithiomethyl)thymidin (0,1 mmol)) wird durch Koverdampfung mit trockenem Pyridin (2 × 5 ml) getrocknet und in trockenem Acetonitril (2,0 ml) gelöst. Phosphortristriazolid (0,1 M) in trockenem Acetonitril wird wie bei Kraszewski & Stawinski, Tetrahedron Lett., 21: 2935–2936 (1980) beschrieben aus Phosphoroxychlorid und Triazol hergestellt. Das Phosphortristriazolid (1,5 ml, 1,5 Äq.) wird bei Raumtemperatur oder 20°C zu dem 3'-O-(2N-Dansylethyldithiomethyl)thymidin gegeben. Die Mischung wird 5 Minuten gerührt, und dann wird n-Butylammoniumpyrophosphat in trockenem DMF (0,2 M, 1,5 ml, 2,0 Äq.) zugegeben. Die Mischung wird über Nacht bei 20°C gerührt. Anschließend wird Wasser (2 ml) zugegeben und es erfolgt die Hydrolyse der Phosphate (180 min). Das Nukleotidtriphosphat wird auf eine mit Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) (0,01 M) äquilibrierte Mono Q^TM-Anionenaustauschersäule (Pharmacia Biotech., Schweden) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten von TEAB (0,85 M):Acetonitril (33%, v/v) von der Mono Q^TM-Säule eluiert. Die isolierte 3'-O-(2-N-Dansylethyldithiomethyl)thymidin-5'-triphosphattetralithiumsalz-Fraktion wird eingedampft, mit Wasser koverdampft und durch eine Dowex 50W × 8 (BDH) in Lithiumform laufen gelassen, um das Triethylammonium gegen Lithiumionen auszutauschen. Zu diesem Zeitpunkt ist das dithiomethylmodifizierte Nukleotid gebrauchsfertig.
Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen liegen im Umfang der folgenden Ansprüche.

Claims

Dithiomethylmodifizierte Verbindung umfassend die Formel: R¹-O-CH₂-S-S-R² oder ein Salz davon, wobei R¹ ausgewählt ist aus modifizierten oder unmodifizierten Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Sterinen, Steroiden, Ribonukleosiden, Ribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleosiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleotiden, Desoxyribonukleosiden, Desoxyribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleosiden und basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleotiden; und R² ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹
ist, R²
ist, R³ H, OH oder eine geschützte Form von OH ist; R⁴ eine Nukleobase ist; R⁵ H, eine Schutzgruppe, ein Phosphat, ein Diphosphat, ein Triphosphat oder ein Rest einer Nukleinsäure ist und R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander H, eine Gruppe, ausgewählt aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten, oder ein Rest eines festen Trägers sind.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹
ist, R² -CH₂-CH₂-R⁹ ist, R³ H, OH oder eine geschützte Form von OH ist; R⁴ eine Nukleobase ist; R⁵ H, eine Schutzgruppe, ein Phosphat, ein Diphosphat, ein Triphosphat oder ein Rest einer Nukleinsäure ist, und R⁹ H oder eine Gruppe ist, die ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2 und 3, wobei R¹ ferner wenigstens eine Hydroxygruppe umfasst, die nicht dithiomethylmodifiziert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei sich die Dithiomethylmodifikation an einer 3'-Hydroxyposition von R¹ befindet.
Verbindung nach Anspruch 5, wobei sich die Dithiomethylmodifikation an einer 5'-Hydroxyposition von R¹ befindet.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² eine fluoreszierende Markergruppe umfasst.
Verbindung nach Anspruch 7, wobei die fluoreszierende Markergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bodipy^TM, Dansyl^TM, Fluorescein, Rhodamin, Texas Red^TM, Cy 2^TM, Cy 4^TM und Cy 6^TM.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² eine Markergruppe umfasst.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander außerdem eine Markergruppe umfassen.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander H, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert.-Butyl, Phenyl oder Benzyl sind, und wobei entweder R⁴, R⁵ oder R⁶ mit einer Markergruppe modifiziert ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R⁹ mit einer Markergruppe modifiziert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ribonukleosiden, Ribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleosiden und basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleotiden, und wobei sich die Dithiomethylmodifikation an einer 2'-Hydroxyposition von R¹ befindet.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R² ferner eine elektronenschiebende oder -ziehende Funktion umfasst.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander eine elektronenschiebende oder -ziehende Funktion umfassen.
Verbindung nach Anspruch 14 und 15, wobei die elektronenschiebende oder -ziehende Funktion ein Heteroatom enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Silicium.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R⁹ Stickstoff umfasst.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R⁹ kovalent an einen festen Träger gebunden ist.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 3 und 18, wobei R⁹
ist, wobei Z eine zur kovalenten Bindung an einen festen Träger geeignete Gruppe ist, wobei der feste Träger zur kovalenten Bindung eines Oligonukleotids während einer Oligonukleotidsynthese in der Lage ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amino, Amid, Ester und Ether.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹
ist, wobei R²
ist, wobei R⁴ eine Nukleobase ist; R⁵ H, eine Schutzgruppe, ein Phosphat, ein Diphosphat oder ein Triphosphat oder ein Rest einer Nukleinsäure ist; R⁶, R⁷ und R⁸ gleichzeitig oder unabhängig voneinander H oder eine Gruppe sind, die ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten; und R¹⁰ H, H-Phosphonat oder Phosphoramidit ist.
Verfahren zum Modifizieren eines Nukleosids, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen eines Nukleosids, das wenigstens eine halogenmethylmodifizierte Hydroxygruppe aufweist, mit einer Thiosulfonatverbindung unter Bildung eines thiosulfonierten Nukleosids; und b) In-Kontakt-Bringen dieses thiosulfonierten Nukleosids mit einer Thiolverbindung unter Bildung eines dithiomethylmodifizierten Nukleosids der Formel R¹-O-CH₂-S-S-R² wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ribonukleosiden, Ribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleosiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleotiden, Desoxyribonukleosiden, Desoxyribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleosiden und basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleotiden; und R² ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Thiosulfonatverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkylthiosulfonat und Arylthiosulfonat.
Verfahren nach Anspruch 22, ferner umfassend den Schritt des Markierens dieses dithiomethylmodifizierten Nukleosids.
Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen einer Targetnukleinsäure mit einem Primer unter Bedingungen, bei denen der Primer sequenzspezifisch an die Targetnukleinsäure hybridisiert, und wobei wenigstens ein Teil des Primers zu einem Teil der Targetnukleinsäure komplementär ist; b) Einbau eines dithiomethylmodifizierten Nukleotids der Formel R¹-O-CH₂-S-S-R² wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ribonukleosiden, Ribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleosiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleotiden, Desoxyribonukleosiden, Desoxyribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleosiden und basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleotiden; und R² ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten, in den Primer; und c) Nachweis des Einbaus dieses dithiomethylmodifizierten Nukleotids, wobei das dithiomethylmodifizierte Nukleotid an der Einbaustelle des dithiomethylmodifizierten Nukleotids zu der Targetnukleinsäure komplementär ist, womit die Sequenz einer Nukleobase der Targetnukleinsäure bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Einbauschritt durch eine DNA-Polymerase katalysiert wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Sequenzierverfahren ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Minisequenzierung und Sequenzierung durch Synthese.
Verfahren nach Anspruch 25, umfassend die Schritte des Einbaus eines ersten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotids in den Primer in Schritt b); c) Nachweis des Einbaus dieses ersten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotids, womit die Sequenz einer Nukleobase der Targetnukleinsäure bestimmt wird; d) Entfernen der Dithiomethylgruppe von dem ersten eingebauten dithiomethylmodifizierten Nukleotid unter Bildung eines ersten verlängerten Primers mit einer freien Hydroxygruppe; e) Einbau eines zweiten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotids in den ersten verlängerten Primer; und f) Nachweis des zweiten dithiomethylmodifizierten Nukleotids, womit die Sequenz einer weiteren Nukleobase der Targetnukleinsäure bestimmt wird, wobei das erste 3'-dithiomethylmodifizierte Nukleotid und das zweite 3'-dithiomethylmodifizierte Nukleotid an jeder der Einbaustellen dieser Nukleotide zu der Targetnukleinsäure komplementär sind.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Nachweisschritte nach Entfernen der Dithiomethylgruppe durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 25 und 28, wobei das Verfahren zur Verwendung bei einem Sequenzierungsarray geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 25, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Primerarrays, der eine Vielzahl Sequenzierprimer umfasst; b) In-Kontakt-Bringen einer Targetnukleinsäure mit dem Primerarray unter Bedingungen, bei denen die Sequenzierprimer sequenzspezifisch an die Targetnukleinsäure hybridisieren und dadurch Target-Primer-Komplexe zwischen komplementären Teilen der Sequenzierprimer und der Targetnukleinsäure bilden; c) Einbau eines ersten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotids in wenigstens einen Sequenzierprimerteil der Target-Primer-Komplexe, wobei das erste 3'-dithiomethylmodifizierte Nukleotid zu der Targetnukleinsäure komplementär ist; und d) Nachweis des Einbaus des ersten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotids, wobei das erste 3'-dithiomethylmodifizierte Nukleotid an der Einbaustelle des ersten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotids zu der Targetsequenz komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 31, ferner umfassend die Schritte: e) Entfernen der Dithiomethylgruppe von dem ersten eingebauten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotid unter Bildung eines ersten verlängerten Target-Primer-Komplexes mit einer freien 3'-Hydroxygruppe; f) Einbau eines zweiten dithiomethylmodifizierten Nukleotids in den ersten verlängerten Target-Primer-Komplex; und g) Nachweis des zweiten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotids, wobei das zweite 3'-dithiomethylmodifizierte Nukleotid an der Einbaustelle des zweiten 3'-dithiomethylmodifizierten Nukleotids zu der Targetsequenz komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 25 und 31, wobei die Nachweisschritte vor Entfernen der Dithiomethylgruppe durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Nachweisschritte nach Entfernen der Dithiomethylgruppe durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Schritte a), b), c), d), e) und f) unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Hybridisierung des Primers an die Targetnukleinsäure nicht stören.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei sich das Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Nukleotidsequenzen eignet, wobei die Nukleotidsequenzen überlappenden Nukleotidsequenzen der Targetnukleinsäure entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei Schritt e) unter Bedingungen durchgeführt wird, die die Target-Primer-Komplexe nicht zerstören.
Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines 5'-geschützten ersten Nukleosids, das über einen Linker kovalent an einen festen Träger gebunden ist; b) Entschützen des ersten Nukleosids an dessen 5'-Position. c) kovalentes Binden eines weiteren 5'-geschützten Nukleosids an das erste Nukleotid an der 5'-Position des ersten Nukleosids; d) Entschützen dieses weiteren Nukleosids an dessen 5'-Position; und e) Wiederholen der Schritte c) und d) zum Anhängen weiterer geschützter Nukleoside, wobei der Linker das erste Nukleotid über eine Dithiomethylbindung an dem festen Träger befestigt, wobei eine Verbindung der Formel R¹-O-CH₂-S-S-R² gebildet wird, in der R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Desoxyribonukleosiden, Desoxyribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleosiden und basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleotiden, und R² ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Linker ein Linker ist, der Dithiomethyl enthält, und nach Schritt d) die folgenden Schritte durchgeführt werden: e) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte c) und d) zum Anhängen weiterer geschützter Nukleoside, womit ein Oligonukleotid gebildet wird; f) gegebenenfalls selektives Abspalten einer Schutzgruppe von dem Oligonukleotid, womit ein partiell entschützten Oligonukleotid gebildet wird; g) selektives Abspalten des Dithiomethyl enthaltenden Linkers; und h) Isolieren des partiell entschützten Oligonukleotids.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei das Verfahren zum Invertieren des Oligonukleotids geeignet ist, womit ein Oligonukleotid gebildet wird, das eine freie 3'-Hydroxygruppe besitzt und kovalent an einen festen Träger gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 38 und 40, wobei das Verfahren zur Verwendung bei einem Array optimiert ist.
Verfahren nach Anspruch 38, ferner umfassend den Schritt des Abspaltens des Oligonukleotids von dem festen Träger.
Verfahren nach Anspruch 39, ferner umfassend den Schritt des Modifizierens des 3'-Terminus dieses Oligonukleotids mit einer reaktiven oder nachweisbaren Funktion.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei wenigstens eines der 5'-geschützten Nukleoside eine Dithiomethylfunktion umfasst.
Verfahren zur Synthese eines Oligoribonukleotids, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines ersten geschützten Ribonukleosids, das kovalent an einen festen Träger gebunden ist; b) kovalentes Binden wenigstens eines 2'-dithiomethylmodifizierten Ribonukleosids der Formel R¹-O-CH₂-S-S-R² wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ribonukleosiden, Ribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleosiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleotiden, und R² ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten; an das erste Ribonukleosid unter Bildung eines Oligoribonukleotids; c) partielles Entschützen des Oligoribonukleotids unter sauren oder basischen Bedingungen; und d) In-Kontakt-Bringen des Oligoribonukleotids mit einem Reduktionsmittel unter neutralen Bedingungen und dadurch Entschützen des 2'-dithiomethylmodifizierten Ribonukleosids in dem Oligoribonukleotid.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei das 2'-dithiomethylmodifizierte Ribonukleosid in dem Oligoribonukleotid vollständig entschützt wird.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei der pH der neutralen Bedingungen im Bereich von etwa 5 bis etwa 9 liegt.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei der pH etwa 7 ist.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei das Verfahren zum Invertieren des Oligoribonukleotids geeignet ist, womit ein festphasengebundenes Oligoribonukleotid mit einem freien 3'-Hydroxy gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei das erste geschützte Ribonukleosid über eine Dithiomethylbindung an dem festen Träger befestigt ist.
Verwendung einer dithiomethylmodifizierten Verbindung umfassend die Formel R¹-O-CH₂-S-S-R² oder eines Salzes davon, wobei R¹ ausgewählt ist aus modifizierten oder unmodifizierten Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Sterinen, Steroiden, Ribonukleosiden, Ribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleosiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Ribonukleotiden, Desoxyribonukleosiden, Desoxyribonukleotiden, basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleosiden und basen- und/oder zuckermodifizierten Desoxyribonukleotiden; und R² ausgewählt ist aus gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffen, gerad- und verzweigtkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, cyclischen Kohlenwasserstoffen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, heterocyclischen Kohlenwasserstoffen, heteroaromatischen Kohlenwasserstoffen und substituierten Kohlenwasserstoffen, wie Kohlenwasserstoffen, die Heteroatome und/oder andere funktionelle modifizierende Gruppen enthalten, zum Sequenzieren von Nukleinsäuren.