CN110506121A - 含硫羟基的切割试剂和氧化洗涤剂 - Google Patents

含硫羟基的切割试剂和氧化洗涤剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了使用这样的脱氧核苷三磷酸的方法、组合物、混合物和试剂盒，所述脱氧核苷三磷酸包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3'‑O位置和可逆地联接至所述脱氧核苷的核碱基的可检测标记物。另外，描述了含硫羟基的化合物和含硫羟基的化合物的清除剂。此类化合物为未来的测序技术(包括但不限于边合成边测序(Sequencing by Synthesis))提供了新的可能性。

Description

含硫羟基的切割试剂和氧化洗涤剂
相关申请的交叉引用
本申请是2016年11月4日提交的美国专利申请号15/343,279的部分继续申请，并且要求2015年11月6日提交的美国临时专利申请号62/251,884和2016年4月26日提交的美国临时专利申请号62/327,555(其通过提及而合并入本文)的权益。
发明领域
本发明提供了使用这样的脱氧核苷三磷酸的方法、组合物、混合物和试剂盒，所述脱氧核苷三磷酸包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3'-O位置和可逆地联接至所述脱氧核苷的核碱基的可检测标记物。此类化合物为未来的测序技术(包括但不限于边合成边测序(Sequencing by Synthesis))提供了新的可能性。本发明还提供了这样的方法、组合物、混合物和试剂盒，其使用含硫羟基的化合物或衍生物(备选地，缩硫醇类似物)作为基于二硫化物的连接体和核苷酸的3`-二硫化物加帽基团的切割试剂，这与其中二硫化物还原或切割步骤是必需的DNA测序技术(和其他技术例如蛋白质工程)有关。在一个实施方案中，将所述切割试剂作为固体粉末添加物进行配备，消费者将会按照测序工作流程说明书将其添加至切割预混缓冲液。此外，本发明提供了其中用氧化洗涤步骤来清除所述含硫羟基的化合物的实施方案。此类化合物为在未来的测序技术(包括但不限于边合成边测序(SBS)，包括在流动池中的自动化SBS)中使用提供了可能性。
发明背景
DNA测序是现代生物技术中最重要的分析方法之一。关于目前的测序技术的详细综述提供在M.L.Metzker,Nature Reviews 2010,11,31[1]，和C.W.Fuller等人,NatureBiotechnology 2009,27,1013[2]中。
一种众所周知的测序方法是边合成边测序(Sequencing-by-Synthesis；SBS)方法。按照该方法，通过3’OH-保护基团(特别是酯和醚)来可逆地封阻核苷三磷酸。关于酯的例子为链烷酸酯例如乙酰基、磷酸酯和碳酸酯。所述核苷三磷酸通常在碱基处包含标记物。
由Hiatt和Rose(美国专利号5,990,300)[3]描述了通过使用3’OH可逆地被封阻的核苷三磷酸以分步方式酶促合成预先确定序列的多核苷酸的方法。除了酯、醚、腈、磷酸酯、磷酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、硼酸酯、糖、氨基磷酸酯、苯基次磺酸酯、硫酸酯和砜外，他们还公开了硝酸酯作为可切割的3’OH保护基团。去保护可以通过化学或酶促手段来进行。对于硝酸酯基团，既没有公开合成程序也没有公开去保护条件和酶促掺入数据。所要求保护的去封阻溶液优选地包含二价阳离子例如Co2+和生物学缓冲液例如Tris。没有公开包含标记物的3’OH-封阻的核苷三磷酸。
Buzby(US 2007-0117104)[4]公开了用于SBS的核苷三磷酸，其在3’-羟基基团处被可逆地保护并且在碱基处携带标记物。所述标记物通过可切割的连接体例如二硫化物连接体或光可切割的连接体进行联接。所述连接体由多至大约25个原子组成。除了羟胺、醛、烯丙基胺、烯烃、炔烃、醇、胺、芳基、酯、醚、腈、磷酸酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硼酸酯、糖、氨基磷酸酯、苯基次磺酸酯、硫酸酯、砜和杂环外，所述3’OH保护基团还可以为硝酸酯。
为了在核酸测序中取得更长的读长和更好的准确度而需要的是这样的核苷酸类似物，其具有在切割后不留下反应性残基的可切割的保护基团和可切割的连接体[5]。
发明概述
本发明提供了使用这样的脱氧核苷三磷酸的方法、组合物、混合物和试剂盒，所述脱氧核苷三磷酸包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3'-O位置和可逆地联接至所述脱氧核苷的核碱基的可检测标记物。在一个实施方案中，本发明考虑了这样的核苷酸类似物，其具有包含亚甲基二硫化物的可逆的保护基团和在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体。本发明还提供了这样的方法、组合物、混合物和试剂盒，其使用硫羟基衍生物(备选地，缩硫醇类似物)作为基于二硫化物的连接体和核苷酸的3`-二硫化物加帽基团的切割试剂，这与其中二硫化物还原或切割步骤是必需的DNA测序技术(和其他技术例如蛋白质工程)有关。在一个实施方案中，将所述切割试剂作为固体粉末添加物进行配备，消费者将会按照测序工作流程说明书将其添加至切割预混缓冲液。此外，本发明提供了其中用氧化洗涤步骤来清除所述含硫羟基的化合物的实施方案。此类化合物为在未来的测序技术(包括但不限于边合成边测序(SBS)，包括在流动池中的自动化SBS)中使用提供了可能性。
关于混合物，本发明在一个实施方案中考虑了在具有一种或多种另外的测序试剂(包括但不限于缓冲液、聚合酶、引物、模板等)的混合物中的这样的脱氧核苷三磷酸，其包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体和通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O位置。关于试剂盒，本发明在一个实施方案中考虑了这样的测序试剂盒，其中在分开的容器中一起(或者以混合物)提供测序试剂，包括包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O位置的脱氧核苷三磷酸，连同(任选地)关于在测序中使用此类试剂的说明书。并不意欲的是，本发明受到在试剂盒中的测序试剂的数目或性质的限制。在一个实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种另外的测序试剂，包括但不限于缓冲液、聚合酶、引物等。
并不意欲的是，本发明局限于任何特定的聚合酶。本发明考虑了具有增强的核苷酸衍生物掺入的经改造的(例如经突变的)聚合酶。例如，Tabor,S.和Richardson,C.C.((1995)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)92:6339[6])描述了在水生栖热菌(T.aquaticus)DNA聚合酶中用酪氨酸替代苯丙氨酸667和这对于由该DNA聚合酶区别双脱氧核苷酸所具有的影响。在一个实施方案中，本发明考虑了缺乏3'-5'外切核酸酶活性的聚合酶(称为exo-)。例如9°N聚合酶的exo-变体由Perler等人,1998US 5756334[7]和由Southworth等人,1996Proc.Natl Acad.Sci USA 93:5281[8]进行了描述。另一个聚合酶例子为Pfu DNA聚合酶的A486Y变体(Evans等人,2000.Nucl.Acids.Res.28:1059[9])。另一个例子为Tsp JDF-3DNA聚合酶的A485T变体(Arezi等人,2002.J.Mol.Biol.322:719[10])。WO 2005/024010A1涉及基元A区域的修饰和9°N DNA聚合酶，其特此通过提及而合并[11]。
关于方法，本发明考虑了用于合成包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体和通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O位置的脱氧核苷三磷酸的方法，以及用于使用包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O位置的脱氧核苷三磷酸的方法。
在一个实施方案中，本发明考虑了用于检测在DNA序列中的经标记的核苷酸的方法，其包括下列步骤：a)提供核酸模板和能够与所述模板杂交的引物以便形成引物/模板杂交复合物(和在一些实施方案中，在它实际上已杂交在一起的情形下提供它)，以及包含含硫羟基的化合物的切割试剂；b)向所述引物和模板添加DNA聚合酶和第一脱氧核苷三磷酸以便产生反应混合物，所述第一脱氧核苷三磷酸包含核碱基和糖，所述糖在3‘-O上包含可切割的保护基团，其中所述可切割的保护基团包含亚甲基二硫化物，其中所述脱氧核苷三磷酸进一步包含通过可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体附着至所述核碱基的第一可检测标记物；c)使所述反应混合物经历使得由DNA聚合酶催化的引物延伸反应成为可能的条件，以便产生经修饰的引物/模板杂交复合物，其中所述第一脱氧核苷三磷酸被掺入(到所述引物中以便延伸所述引物)；d)检测在所述经修饰的引物/模板杂交复合物中的所述脱氧核苷三磷酸的所述第一可检测标记物(例如，成像)；和e)在条件下引入所述切割试剂，以便从所述经修饰的引物/模板杂交复合物中去除所述可切割的保护基团(例如，通过切割它)和(任选地)所述可检测标记物(例如，通过切割所述连接体)。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤b)的重复期间添加第二脱氧核苷三磷酸，其中所述第二脱氧核苷三磷酸包含第二可检测标记物。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物为基于邻位二硫羟基的化合物。在一个实施方案中，所述基于邻位二硫羟基的化合物为二巯基丙磺酸或其盐。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物包含第一和第二硫羟基基团。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被至少一个烃原子隔开。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被烃间隔物隔开。在一个实施方案中，所述烃间隔物包含至少一个官能团。在一个实施方案中，所述至少一个官能团选自由下列各项组成的组：卤素、胺、磷酸盐或酯、膦酸盐或酯、磷酸、羧酸、亚砜和羟基。在一个实施方案中，所述第二脱氧核苷三磷酸的核碱基不同于所述第一脱氧核苷三磷酸的核碱基。在一个实施方案中，在步骤b)中使用多于一种经标记的核苷酸，例如至少4种表示A、G、C和T或U的类似物的、不同地进行标记的、3‘-O经亚甲基二硫化物加帽的脱氧核苷三磷酸化合物的混合物。在一个优选的实施方案中，所述检测允许测定所述所掺入的第一脱氧核苷三磷酸的核碱基。
本发明考虑了用于检测在DNA序列中的经标记的核苷酸的方法的另一个实施方案，所述方法包括下列步骤：a)提供核酸模板和能够与所述模板杂交的引物以便形成引物/模板杂交复合物(和在一些实施方案中，在它实际上杂交在一起的情形下提供它)，包含含硫羟基的化合物的切割试剂，以及切割清除剂试剂；b)向所述引物和模板添加DNA聚合酶和第一脱氧核苷三磷酸以便产生反应混合物，所述第一脱氧核苷三磷酸包含核碱基和糖，所述糖在3‘-O上包含可切割的保护基团，其中所述可切割的保护基团包含亚甲基二硫化物，其中所述脱氧核苷三磷酸进一步包含通过可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体附着至所述核碱基的第一可检测标记物；c)使所述反应混合物经历使得由DNA聚合酶催化的引物延伸反应成为可能的条件，以便产生经修饰的引物/模板杂交复合物，其中所述第一脱氧核苷三磷酸被掺入(例如到所述引物中以便延伸所述引物)；d)检测在所述经修饰的引物/模板杂交复合物中的所述脱氧核苷三磷酸的所述第一可检测标记物(例如，通过成像)；e)在条件下引入所述切割试剂，以便从所述经修饰的引物/模板杂交复合物中去除所述可切割的保护基团(通过切割)和(任选地)所述可检测标记物(通过切割所述连接体)；和f)引入所述切割清除剂试剂(例如，以清除任何残留的切割试剂)。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物包含第一和第二硫羟基基团。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被至少一个烃原子隔开。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被烃间隔物隔开。在一个实施方案中，所述烃间隔物包含至少一个官能团。在一个实施方案中，所述至少一个官能团选自由下列各项组成的组：卤素、胺、磷酸盐或酯、膦酸盐或酯、磷酸、羧酸、亚砜和羟基。在一个实施方案中，所述切割试剂包含二巯基丙磺酸或其盐。在一个实施方案中，所述二巯基丙磺酸或其盐在缓冲液中。在一个实施方案中，所述缓冲液为CHES。在一个实施方案中，所述切割试剂的pH在9.0和10.0之间。在一个优选的实施方案中，所述切割试剂的所述pH为9.5。在一个实施方案中，所述切割清除剂为氧化清除剂。在一个实施方案中，所述氧化清除剂为过氧化氢。在一个实施方案中，所述氧化清除剂为叔丁基过氧化物。在一个实施方案中，所述过氧化氢在缓冲液中。在一个实施方案中，所述缓冲液为TRIS。在一个实施方案中，所述TRIS缓冲液处于在8.5和9.0之间的pH。在一个优选的实施方案中，所述TRIS缓冲液处于8.8的pH。在一个优选的实施方案中，步骤b)的所述反应混合物在流动池中。在一个实施方案中，所述流动池被安置在移动支持物上。在一个实施方案中，所述移动支持物为旋转载物台。在一个实施方案中，所述流动池的至少一部分是透明的。在一个实施方案中，所述流动池被整合在仪器内。在一个实施方案中，重复所述方法的步骤。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤b)的重复期间添加第二脱氧核苷三磷酸，其中所述第二脱氧核苷三磷酸包含通过第二可切割的氧亚甲基二硫化物连接体而附着的第二可检测标记物，其中所述第二可检测标记物不同于所述第一可检测标记物。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物为基于邻位二硫羟基的化合物。在一个实施方案中，所述第二脱氧核苷三磷酸的核碱基不同于所述第一脱氧核苷三磷酸的核碱基。在一个实施方案中，在步骤b)中使用至少4种表示A、G、C和T或U的类似物的、不同地进行标记的、3‘-O经亚甲基二硫化物加帽的脱氧核苷三磷酸化合物的混合物。在一个优选的实施方案中，所述检测允许测定所述所掺入的第一脱氧核苷三磷酸的核碱基。
在另外一个实施方案中，本发明考虑了用于检测在DNA序列中的经标记的核苷酸的方法，其包括下列步骤：a)提供核酸模板和能够与所述模板杂交的引物以便形成引物/模板杂交复合物(和在一些实施方案中，在它实际上杂交的情形下提供它)，以及流动池，所述流动池与包含有包含含硫羟基的化合物的切割试剂的第一储器和包含有氧化洗涤剂的第二储器处于流体联通(例如，通过管道)；b)在所述流动池中向所述引物和模板添加DNA聚合酶和第一脱氧核苷三磷酸以便产生反应混合物，所述第一脱氧核苷三磷酸包含核碱基和糖，所述糖在3‘-O上包含可切割的保护基团，其中所述可切割的保护基团包含亚甲基二硫化物，其中所述脱氧核苷三磷酸进一步包含通过可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体附着至所述核碱基的第一可检测标记物；c)使所述反应混合物经历使得由DNA聚合酶催化的引物延伸反应成为可能的条件，以便产生经修饰的引物/模板杂交复合物，其中所述第一脱氧核苷三磷酸被掺入(例如到所述引物中以便延伸所述引物)；d)检测在所述经修饰的引物/模板杂交复合物中的所述脱氧核苷三磷酸的所述第一可检测标记物(例如，通过成像)；e)在条件下将所述切割试剂从所述第一储器引入到所述流动池中，以便从所述经修饰的引物/模板杂交复合物中去除所述可切割的保护基团(通过切割)和(任选地)所述可检测标记物(通过切割所述连接体)；和f)将所述氧化洗涤剂从所述第二储器引入到所述流动池中(以便去除或失活任何残留的切割试剂)。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物包含第一和第二硫羟基基团。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被至少一个烃原子隔开。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被烃间隔物隔开。在一个实施方案中，所述烃间隔物包含至少一个官能团。在一个实施方案中，所述至少一个官能团选自由下列各项组成的组：卤素、胺、磷酸盐或酯、膦酸盐或酯、磷酸、羧酸、亚砜和羟基。在一个实施方案中，所述切割试剂包含二巯基丙磺酸或其盐(例如，在溶液中)。在一个实施方案中，所述二巯基丙磺酸或其盐在缓冲液中。在一个实施方案中，所述缓冲液为CHES。在一个实施方案中，所述切割试剂的pH在9.0和10.0之间。在一个实施方案中，所述切割试剂的所述pH为9.5。在一个实施方案中，所述氧化洗涤剂包含过氧化氢。在一个实施方案中，所述氧化洗涤剂包含叔丁基过氧化物。在一个实施方案中，所述过氧化氢在缓冲液中。在一个实施方案中，所述缓冲液为TRIS。
本发明还考虑了试剂盒。在一个实施方案中，本发明考虑了试剂盒，其包含一种或多种DNA测序试剂、说明书和切割试剂，所述切割试剂包含含硫羟基的化合物。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物包含第一和第二硫羟基基团。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被至少一个烃原子隔开。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被烃间隔物隔开。在一个实施方案中，所述烃间隔物包含至少一个官能团。在一个实施方案中，所述至少一个官能团选自由下列各项组成的组：卤素、胺、磷酸盐或酯、膦酸盐或酯、磷酸、羧酸、亚砜和羟基。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物选自由下列各项组成的组：2,3-二巯基丙磺酸、2,3-二巯基-1-丙醇和2,3-二巯基丙烷膦酸(或其盐)。在一个优选的实施方案中，所述含硫羟基的化合物为二巯基丙磺酸或其盐。在一个实施方案中，所述二巯基丙磺酸或其盐在缓冲液中。所述含硫羟基的化合物可以以各种不同的形式。在一个实施方案中，所述二巯基丙磺酸或其盐在所述试剂盒中以固体形式(例如，作为在管、小瓶或其他容器中的粉末)。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含缓冲液(例如，在管、小瓶或其他容器中)。在一个实施方案中，所述缓冲液为CHES。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含切割清除剂。在一个优选的实施方案中，所述切割清除剂为氧化清除剂。在一个实施方案中，所述氧化清除剂为过氧化氢。在一个实施方案中，所述氧化清除剂为叔丁基过氧化物。在一个实施方案中，所述一种或多种DNA测序试剂选自包括下列各项的组：聚合酶、引物、模板和核苷酸。
本发明还考虑了组合物，包括混合物。在一个实施方案中，本发明考虑了组合物，其包含在溶液中的与模板杂交的引物，所述溶液包含含硫羟基的化合物。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物包含第一和第二硫羟基基团。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被至少一个烃原子隔开。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被烃间隔物隔开。在一个实施方案中，所述烃间隔物包含至少一个官能团。在一个实施方案中，所述至少一个官能团选自由下列各项组成的组：卤素、胺、磷酸盐或酯、膦酸盐或酯、磷酸、羧酸、亚砜和羟基。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物选自由下列各项组成的组：2,3-二巯基丙磺酸或其盐、2,3-二巯基-1-丙醇和2,3-二巯基丙烷膦酸或其盐。在一个实施方案中，所述经杂交的引物和模板被固定化。在一个实施方案中，所述经杂交的引物和模板在流动池中。
本发明还考虑了包含溶液和混合物的流动池(flow cell)。在一个实施方案中，本发明考虑了流动池，其包含在溶液中的与模板杂交的引物，所述溶液包含含硫羟基的化合物和氧化清除剂。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物包含第一和第二硫羟基基团。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被至少一个烃原子隔开。在一个实施方案中，所述第一和第二硫羟基基团被烃间隔物隔开。在一个实施方案中，所述烃间隔物包含至少一个官能团。在一个实施方案中，所述至少一个官能团选自由下列各项组成的组：卤素、胺、磷酸盐或酯、膦酸盐或酯、磷酸、羧酸、亚砜和羟基。在一个实施方案中，所述含硫羟基的化合物选自由下列各项组成的组：2,3-二巯基丙磺酸或其盐、2,3-二巯基-1-丙醇和2,3-二巯基丙烷膦酸或其盐。在一个实施方案中，所述经杂交的引物和模板被固定化。在一个实施方案中，所述氧化清除剂为过氧化氢。在一个实施方案中，所述氧化清除剂为叔丁基过氧化物。
在一个实施方案中，本发明涉及(a)具有通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团(例如，通式-CH2-SS-R的)进行加帽的3‘-O的核苷三磷酸；和(b)其经标记的类似物，其中标记物通过可切割的氧亚甲基二硫化物连接体(-OCH2-SS-)附着至核碱基(虽然连接体可以包含另外的基团)。此类核苷酸可以用在核酸的边合成边测序(SBS)技术中。在一个实施方案中，本发明涉及具有通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团(例如，-CH2-SS-R)进行加帽的3‘-O的核苷酸的合成、去保护条件或酶促掺入。
在一个实施方案中，本发明涉及这样的脱氧核苷三磷酸，其包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体和通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O。在一个实施方案中，所述核苷的核碱基是非天然的。在一个实施方案中，所述核苷的非天然核碱基选自包括下列各项的组：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。在一个实施方案中，所述包含亚甲基二硫化物的基团为-CH2-SS-R，其中R选自包括下列各项的组：烷基和经取代的烷基基团。在一个实施方案中，所述可检测标记物通过可切割的氧亚甲基二硫化物连接体(例如，式-OCH2-SS-的)附着至所述核碱基。在一个实施方案中，所述可检测标记物为荧光标记物。在一个实施方案中，在式(-CH2-S-S-R)中的R可以为烷基或烯丙基。
在一个实施方案中，本发明涉及依照下述结构的脱氧核苷三磷酸：
其中B为核碱基，并且R选自包括烷基和经取代的烷基基团的组。在一个实施方案中，所述核碱基为天然核碱基(胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)。在一个实施方案中，所述核碱基为从包括下列各项的组中选择的非天然核碱基：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。在类似物的情况下，所述可检测标记物还可以在所述核碱基和所述可检测标记物之间包括连接体部分。
在一个实施方案中，本发明涉及依照下述结构的经标记的脱氧核苷三磷酸：
其中B为核碱基，R选自包括烷基和经取代的烷基基团的组，并且L1和L2为联接基团。在一个实施方案中，所述核碱基为天然核碱基类似物。在一个实施方案中，所述核碱基为从包括下列各项的组中选择的非天然核碱基类似物：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。在类似物的情况下，所述可检测标记物还可以在所述核碱基和所述可检测标记物之间包括连接体部分。在一个实施方案中，L1和L2独立地选自包括下列各项的组：-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-ON和-N＝N-、烷基、芳基、支化烷基、支化芳基或其组合。优选的是，L2不是“-S-”。在一个实施方案中，本发明考虑了，L1为在碱基上的胺或者在碱基上的羟基。在一个实施方案中，所述标记物选自由下列各项组成的组：荧光团染料、能量转移染料、质量标签、生物素和半抗原。在一个实施方案中，所述标记物为可检测标记物。
在一个实施方案中，本发明涉及依照下述结构的经标记的脱氧核苷三磷酸：
其中D选自由烯丙基二硫和经二硫化物取代的烯丙基基团组成的组；B为核碱基；A为附着基团；C为可切割的位点核心；L1和L2为联接基团；并且Label为标记物(例如，可检测的部分)。
在一个实施方案中，本发明涉及依照下述结构的经标记的脱氧核苷三磷酸：
其中D选自由叠氮化物、烷基二硫、经二硫化物取代的烷基基团组成的组；B为核碱基；A为附着基团；C为可切割的位点核心；L1和L2为联接基团；并且Label为标记物。在一个实施方案中，所述核碱基为从由下列各项组成的组中选择的非天然核碱基类似物：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。在一个实施方案中，所述附着基团A为从由下列各项组成的组中选择的化学基团：炔丙基、羟甲基、环外胺、炔丙胺和炔丙基羟基。在一个实施方案中，所述可切割的位点核心选自由下列各项组成的组：其中R1和R2独立地选自烷基基团。在一个实施方案中，L1选自由下列各项组成的组：-CONH(CH2)x-、-CO-O(CH2)x-、-CONH-(OCH2CH2O)x-、-CO-O(CH2CH2O)x-和-CO(CH2)x-，其中x为0-10，但更优选地1-6。在一个实施方案中，L2选自由下列各项组成的组：-NH-、-(CH2)x-NH-、-C(Me)2(CH2)xNH-、-CH(Me)(CH2)xNH-、-C(Me)2(CH2)xCO-、-CH(Me)(CH2)xCO-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-、-(CH2)xCONH(CH2CH2O)y(CH2)zNH-和-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x、y和z各自独立地选自0-10，但更优选地1-6。在一个实施方案中，所述标记物选自由下列各项组成的组：荧光团染料、能量转移染料、质量标签、生物素和半抗原。在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：其中所述标记物为染料。在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，本发明涉及依照下述结构的脱氧核苷三磷酸：其中B为核碱基。
在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含一种或多种测序试剂(例如，DNA聚合酶)和至少一种脱氧核苷三磷酸，所述脱氧核苷三磷酸包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体、通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O。在一个实施方案中，所述核碱基为天然核碱基类似物。在一个实施方案中，所述核苷的核碱基为非天然的。在一个实施方案中，所述核苷的非天然核碱基选自包括下列各项的组：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。
本发明还考虑了混合物，即在具有一种或多种另外的试剂的混合物(无论是干的还是在溶液中)中的至少一种脱氧核苷三磷酸，所述脱氧核苷三磷酸包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体、通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O。在一个实施方案中，本发明涉及包含核酸模板及与所述模板杂交的引物、DNA聚合酶和至少一种脱氧核苷三磷酸的反应混合物，所述脱氧核苷三磷酸包含核碱基、标记物和糖、在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体，所述糖包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O，其中所述核苷进一步包含共价结合至所述核苷的核碱基的可检测标记物。
在一个实施方案中，本发明涉及施行DNA合成反应的方法，其包括下列步骤：a)提供包含核酸模板及与所述模板杂交的引物、DNA聚合酶、至少一种脱氧核苷三磷酸的反应混合物，所述脱氧核苷三磷酸包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体，以及通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O；和b)使所述反应混合物经历使得由DNA聚合酶催化的引物延伸反应成为可能的条件。这允许至少一种脱氧核苷三磷酸(其包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体，以及通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O)掺入到所结合的引物中。在一个实施方案中，所述由DNA聚合酶催化的引物延伸反应是测序反应(例如，SBS)的一部分。在一个实施方案中，通过暴露于还原试剂来从所述核碱基上去除所述可检测标记物。并不意欲的是，本发明局限于一种类型的还原试剂。可以使用任何合适的能够还原二硫键的还原试剂来实践本发明。在一个实施方案中，所述还原试剂为膦[12]，例如，三苯基膦、三丁基膦、三羟甲基膦、三羟丙基膦、三羧乙基膦(TCEP)[13,14]。在一个实施方案中，所述还原试剂为TCEP。在一个实施方案中，通过暴露于携带硫羟基基团的化合物[15]以便进行基于联硫基的连接体和封端(保护)基团的切割来从所述核碱基上去除所述可检测标记物和3’-OCH2-SS-R基团，此类含硫羟基的化合物包括(但不限于)半胱氨酸、半胱胺、二硫琥珀酸、二硫苏糖醇、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠盐、二硫丁胺[16]、间-2,5-二巯基-N,N,N’,N’-四甲基己二酰二胺、2-巯基-乙磺酸或其盐和N,N’-二甲基-N,N’-双(巯基乙酰基)-肼[17]。可以通过包括硒醇[18]来进一步催化反应。另外，为此目的还可以使用氢硼化物，例如氢硼化钠[19]，以及抗坏血酸[20]。另外，用于二硫键切割的酶促方法也是已知的，例如二硫化物和硫还原酶，并且可以与本发明的化合物一起使用[21]。
在一个实施方案中，本发明涉及用于分析DNA序列的方法，其包括下列步骤：a)提供包含核酸模板及与所述模板杂交的引物的反应混合物，从而形成引物/模板杂交复合物；b)添加DNA聚合酶和第一脱氧核苷三磷酸，所述第一脱氧核苷三磷酸包含核碱基、在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体以及通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O；c)使所述反应混合物经历使得由DNA聚合酶催化的引物延伸反应成为可能的条件，以便产生经修饰的引物/模板杂交复合物；和d)检测在所述经修饰的引物/模板杂交复合物中的所述脱氧核苷三磷酸的所述第一可检测标记物。在一个实施方案中，所述检测允许人们确定哪种类型的类似物(A、T、G、C或U)已被掺入。在一个实施方案中，所述方法进一步包括下列步骤：e)从所述经修饰的引物/模板杂交复合物中去除所述可切割的保护基团和任选地所述可检测标记物；和f)重复步骤b)至e)至少一次(和典型地，重复这些步骤许多次，例如10-200次)。在一个实施方案中，所述可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体是疏水的，并且具有大于0的logP值。在一个实施方案中，所述可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体是疏水的，并且具有大于0.1的logP值。在一个实施方案中，所述可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体是疏水的，并且具有大于1.0的logP值。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤b)的重复期间添加第二脱氧核苷三磷酸，其中所述第二脱氧核苷三磷酸包含第二可检测标记物，其中所述第二可检测标记物不同于所述第一可检测标记物。在一个实施方案中，所述第二脱氧核苷三磷酸的核碱基不同于所述第一脱氧核苷三磷酸的核碱基。在一个实施方案中，在步骤b)中使用至少4种表示A、G、C和T或U的类似物的、不同地进行标记的、3‘-O经亚甲基二硫化物加帽的脱氧核苷三磷酸化合物的混合物。在一个实施方案中，在步骤b)中使用具有下列结构的至少4种不同地进行标记的、3‘-O经亚甲基二硫化物加帽的脱氧核苷三磷酸化合物的所述混合物：
在一个实施方案中，所述混合物进一步包含也在步骤b)中使用的未标记的、3‘-O经亚甲基二硫化物加帽的脱氧核苷三磷酸化合物，例如具有下列结构的那些： 在一些实施方案中，通过将所述经修饰的引物/模板杂交复合物暴露于还原试剂来进行步骤e)。在一个实施方案中，所述还原试剂为TCEP。在一个实施方案中，通过暴露于携带硫羟基基团的化合物以便进行基于联硫基的连接体和封端(保护)基团的切割来从所述核碱基上去除所述可检测标记物，此类含硫羟基的化合物包括(但不限于)半胱氨酸、半胱胺、二硫琥珀酸、二硫苏糖醇、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠盐、二硫丁胺、间-2,5-二巯基-N,N,N’,N’-四甲基己二酰二胺、2-巯基-乙磺酸或其盐和N,N’-二甲基-N,N’-双(巯基乙酰基)-肼。
并不意欲的是，本发明局限于特定的测序平台。但是，优选的仪器为QIAGEN的GeneReader DNA测序系统(GR)。在一个实施方案中，通过边合成边测序(SBS)的方法来测定DNA序列。在一个实施方案中，测序的每个循环由八个步骤组成：延伸1、延伸2、洗涤1、添加成像溶液、成像、洗涤2、切割和洗涤3。通过分析软件来处理在成像循环期间收集的数据，从而产生错误率、通量值和应用相位校正值(applied phasing correction value)。在另一个实施方案中，在切割步骤后使用氧化洗涤剂(洗涤11)(参见图93)。
考虑到了，相同或相似的方法可以改善一般来说其他SBS平台(即，任何在相似条件下运作的边合成边测序方法)以及特别的SBS平台(例如来自Illumina的HiSeq和miSeq平台；Roche 454；Ion Torrent PGM和Proton平台；和PacificBio平台)的性能。
并不意欲的是，本发明局限于仅一种类型的测序。在一个实施方案中，可以在焦磷酸测序(pyrosequencing)中使用所述脱氧核苷三磷酸(其包含核碱基、标记物和糖、在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体，所述糖包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O)。
在一个实施方案中，本发明涉及这样的脱氧核苷三磷酸，其包含核碱基和糖，所述核碱基包含通过可切割的氧亚甲基二硫化物连接体而附着的可检测标记物，所述糖包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物基团的基团进行加帽的3‘-O。在一个实施方案中，所述核苷在具有聚合酶(或一些其他测序试剂)的混合物中。在一个实施方案中，所述核苷的核碱基是非天然的。在一个实施方案中，所述核苷的所述非天然核碱基选自包括下列各项的组：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。在一个实施方案中，所述包含亚甲基二硫化物基团的基团具有式-CH2-SS-R，其中R选自包括下列各项的组：烷基和经取代的烷基基团。在一个实施方案中，所述混合物进一步包含引物。在一个实施方案中，所述引物与核酸模板杂交。在一个实施方案中，所述可检测标记物为荧光标记物。在一个实施方案中，所述核酸模板被固定化(例如，在孔、通道或其他结构中，或者备选地在珠粒上)。
在一个实施方案中，本发明涉及制备3’-O-(甲硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷的方法，其包括：a)提供i)5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷，其中所述5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷包含核碱基和糖，和ii)甲硫基甲基供体；和b)在条件下处理所述5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷，以便产生3’-O-(甲硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷。在一个实施方案中，所述甲硫基甲基供体为DMSO。在一个实施方案中，所述条件包括酸性条件。在一个实施方案中，所述5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷在所述核苷的核碱基上包含保护基团。在一个实施方案中，将所述3’-O-(甲硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷用柱色谱法进行纯化。
在一个实施方案中，本发明涉及制备3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷的方法，其包括：a)提供i)3’-O-(甲硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷，和ii)R-SH，其中R包含烷基或经取代的烷基；和b)在条件下处理所述3’-O-(甲硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷，以便产生3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷。在一个实施方案中，所述R-SH为乙硫醇。在一个实施方案中，所述条件包括碱性条件。
在一个实施方案中，本发明涉及制备3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-2’-脱氧核苷的方法，其包括：a)提供3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷；和b)在条件下处理所述3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧核苷，以便产生3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-2’-脱氧核苷。在一个实施方案中，所述条件包括将所述3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-2’-脱氧核苷暴露于NH4F。
在一个实施方案中，本发明涉及制备3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-2’-脱氧核苷的三磷酸酯的方法，其包括：a)提供3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-2’-脱氧核苷；和b)在条件下处理所述3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-2’-脱氧核苷，以便产生3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-2’-脱氧核苷的三磷酸酯。在一个实施方案中，所述条件包括将所述3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-2’-脱氧核苷暴露于具有POCl3和Bu3N的(MeO)3PO。在一个实施方案中，所述方法进一步包括步骤c)所述核碱基保护基团的去除。在一个实施方案中，所述保护基团包含N-三氟乙酰基-氨基炔丙基保护基团。在一个实施方案中，通过溶剂解来去除所述N-三氟乙酰基-氨基炔丙基保护基团，从而产生5’-O-(三磷酸)-3’-O-(经R取代的联硫基甲基)-5-(氨基炔丙基)-2’-脱氧核苷。
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及其中结构如下的化合物：
在一个实施方案中，本发明涉及依照下述结构的经标记的脱氧核苷三磷酸：其中R选自由烷基、经取代的烷基基团、烯丙基、经取代的烯丙基组成的组；B为核碱基；A为附着基团；C为可切割的位点核心；L1和L2为联接基团；并且Label为标记物。在一个实施方案中，所述核碱基为从由下列各项组成的组中选择的非天然核碱基类似物：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。在一个实施方案中，所述附着基团A为从由下列各项组成的组中选择的化学基团：炔丙基、羟甲基、环外胺、炔丙胺和炔丙基羟基。在一个实施方案中，所述可切割的位点核心选自由下列各项组成的组： 其中R1和R2独立地选自烷基基团。在一个实施方案中，L1选自由下列各项组成的组：-CONH(CH2)x-、-COO(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x为0-10，但更优选地1-6。在一个实施方案中，L2选自由下列各项组成的组：-NH-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)yO(CH2)zNH-、-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x、y和z各自独立地选自0-10，但更优选地1-6。在一个实施方案中，所述标记物选自由下列各项组成的组：荧光团染料、能量转移染料、质量标签、生物素和半抗原。在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：其中所述标记物为染料，并且其中R选自由烷基、经取代的烷基基团、烯丙基、经取代的烯丙基组成的组。在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：其中所述标记物为染料。
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：
在一个实施方案中，本发明涉及依照下述结构的经标记的脱氧核苷三磷酸：其中D选自由叠氮化物(-N3)、烷基二硫(-SS-R)和经二硫化物取代的烷基基团组成的组；B为核碱基；A为附着基团；C为可切割的位点核心；L1和L2为联接基团；并且Label为标记物。在一个实施方案中，所述核碱基为天然核碱基。在一个实施方案中，所述核碱基为从由下列各项组成的组中选择的非天然核碱基类似物：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。在一个实施方案中，所述附着基团(A)为从由下列各项组成的组中选择的化学基团：炔丙基、羟甲基、环外胺、炔丙胺和炔丙基羟基。在一个实施方案中，所述可切割的(C)位点核心选自由下列各项组成的组：其中R1和R2独立地选自烷基基团。在一个实施方案中，所述可切割的位点核心选自由下列各项组成的组： 其中R1和R2独立地选自烷基基团。在一个实施方案中，L1选自由下列各项组成的组：-CONH(CH2)x-、-CO-O(CH2)x-、-CONH-(OCH2CH2O)x-、-CO-O(CH2CH2O)x-和-CO(CH2)x-，其中x为0-100。在一些实施方案中，x为0-10，但更优选地1-6。在一个实施方案中，L2选自由下列各项组成的组：-NH-、-(CH2)x-NH-、-C(Me)2(CH2)xNH-、-CH(Me)(CH2)xNH-、-C(Me)2(CH2)xCO-、-CH(Me)(CH2)xCO-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-、-(CH2)xCONH(CH2CH2O)y(CH2)zNH-和-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x、y和z各自独立地选自0-10，但更优选地1-6。在一个实施方案中，L2选自由下列各项组成的组：-NH-、-(CH2)x-NH-、-C(Me)2(CH2)xNH-、-CH(Me)(CH2)xNH-、-C(Me)2(CH2)xCO-、-CH(Me)(CH2)xCO-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-和-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x、y和z各自独立地选自0-100。在一个实施方案中，x、y和z各自独立地选自0-10，但更优选地1-6。在一个实施方案中，所述标记物选自由下列各项组成的组：荧光团染料、能量转移染料、质量标签、生物素和半抗原。在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(尽管下面显示了特定的核碱基和标记物，但是考虑了其他类似的核苷酸对应物，即在说明书和附图中的各种不同标记物之中的任何一个可以被替换，并且核碱基可以是不同的)：
在一个实施方案中，本发明考虑了未标记的化合物。在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：其中R选自由烷基、经取代的烷基基团、烯丙基、经取代的烯丙基组成的组；并且B为核碱基。在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构(再次，B为核碱基)：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述化合物具有下述结构：在一个实施方案中，所述核碱基为从由下列各项组成的组中选择的非天然核碱基类似物：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。
在一个实施方案中，本发明涉及在图43中所显示的通过使用3’-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇核苷作为中间体和使用DMTSF和二甲基二硫醚作为硫源来合成3’-OCH2-SSMe核苷酸类似物的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及依照下述结构的经标记的脱氧核苷三磷酸：其中D选自由叠氮化物、烷基二硫、经二硫化物取代的烷基基团、烯丙基二硫和经二硫化物取代的烯丙基基团组成的组；B为核碱基；Linker包含可切割的含氧亚甲基二硫化物的位点核心。在一个实施方案中，所述可切割的位点核心选自由下列各项组成的组： 其中R1和R2独立地选自烷基基团；并且Label为标记物。在一个实施方案中，所述连接体是疏水的。在一个实施方案中，所述连接体具有大于0的logP值。在一个实施方案中，所述连接体具有大于0.1的logP值。在一个实施方案中，所述连接体具有大于0.5的logP值。在一个实施方案中，所述连接体具有大于1.0的logP值。
定义
为了有助于理解本发明，下面定义了许多术语。在本文中所定义的术语具有在与本发明有关的领域中的普通技术人员通常所理解的含义。诸如“a”、“an”和“the”的术语并不意欲仅指单数实体，而是包括其中的具体实例可以用于举例说明的一般性类别。在本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但其使用并不限制本发明，除非在权利要求书中进行了概述。
如在本文中所使用的，“氢”意指-H，“羟基”意指-OH；“氧代”意指＝O；“卤素”独立地意指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”意指-NH2(参见下面关于包含术语氨基的基团例如烷基氨基的定义)；“羟氨基”意指-NHOH；“硝基”意指-NO2；“亚氨基”意指＝NH(参见下面关于包含术语亚氨基的基团例如烷基亚氨基的定义)；“氰基”意指-CN；“叠氮基”意指-N3；“巯基”意指-SH；“硫代”意指＝S；“亚磺酰氨基”意指-NHS(O)2-(参见下面关于包含术语亚磺酰氨基的基团例如烷基亚磺酰氨基的定义)；“磺酰基”意指-S(O)2-(参见下面关于包含术语磺酰基的基团例如烷基磺酰基的定义)；和“甲硅烷基”意指-SiH3(参见下面关于包含术语甲硅烷基的基团例如烷基甲硅烷基的定义)。
如在本文中所使用的，“亚甲基”意指其中碳原子与两个氢原子相键合的化学种类。-CH2-基团被认为是标准的亚甲基基团。在链或环中的亚甲基基团对于其大小和亲脂性做出贡献。在该情景下，双脱氧也涉及亚甲基基团。特别地，2,3-双脱氧化合物与2,3-亚甲基是相同的(2,3-亚甲基-糖苷＝2,3-双脱氧-糖苷)。
对于下面的基团，下面的作为插入成分的下标进一步如下定义了所述基团：“(Cn)”定义了在所述基团中的碳原子的准确数目(n)；“(C≤n)”定义了可以在所述基团中的碳原子的最大数目(n)；(Cn-n′)定义了在所述基团中的碳原子的最小数目(n)和最大数目(n′)两者。例如，“烷氧基(C≤10)”指明了具有1至10个碳原子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，或者其中可推导出的任何范围(例如，3-10个碳原子))的那些烷氧基基团。相似地，“烷基(C2-10)”指明了具有2至10个碳原子(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，或者其中可推导出的任何范围(例如，3-10个碳原子))的那些烷基基团。
当在没有“经取代的”这一修饰语的情况下使用时，术语“烷基”是指这样的非芳族一价基团，其具有饱和碳原子作为附着点，具有线性或支化的，环状、有环或无环的结构，没有碳-碳双键或三键，并且没有除了碳和氢之外的其他原子。-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr)、-CH(CH3)2(iso-Pr或i-Pr)、-CH(CH2)2(环丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基或sec-Bu)、-CH2CH(CH3)2(异丁基或i-Bu)、-C(CH3)3(叔丁基或t-Bu)、-CH2C(CH3)3(新戊基)、环丁基、环戊基、环己基、环己基甲基这些基团是烷基基团的非限制性例子。术语“经取代的烷基”是指这样的非芳族一价基团，其具有饱和碳原子作为附着点，具有线性或支化的，环状、有环或无环的结构，没有碳-碳双键或三键，并且具有至少一个独立地从由下列各项组成的组中选择的原子：N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。下面的基团是经取代的烷基基团的非限制性例子：-CH2OH、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2SH、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)H、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)NHCH3、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OCH2CF3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2CH2Cl、-CH2CH2OH、-CH2CF3、-CH2CH2OC(O)CH3、-CH2CH2NHCO2C(CH3)3和-CH2Si(CH3)3。
术语“可切割的氧亚甲基二硫化物连接体”和“可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体”意在表明所述连接体包含氧亚甲基二硫化物基团，并不是被认为局限于仅氧亚甲基二硫化物基团，而是意指可以包含不仅仅该基团的连接体，例如如在图25中的化合物中所看到的。相似地，术语“氧亚甲基二硫化物位点核心”和“含氧亚甲基二硫化物的位点核心”意在表明所述位点核心包含氧亚甲基二硫化物基团，并不是被认为局限于仅氧亚甲基二硫化物基团，而是意指可以包含不仅仅该基团的位点核心。
术语“核酸”通常是指DNA或RNA两者，不论它是扩增产物，是合成产生的，是RNA的逆转录的产物，还是天然出现的。典型地，核酸是单链或双链分子并且由天然出现的核苷酸构成。双链核酸分子可以具有3′-或5′-突出端，并且如此不被要求或假定在其整个长度上是完全双链的。进一步地，核酸可以由非天然出现的核苷酸和/或对天然出现的核苷酸的修饰构成。例子在本文中列出，但不限于：用于分别允许进行连接或者阻止外切核酸酶降解/聚合酶延伸的5′或3′核苷酸的磷酸化；用于共价和近共价附着的氨基、硫羟基、炔烃或生物素基修饰；荧光团和猝灭剂；用于阻止降解的在核苷酸之间的硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和磷酸三酯键；甲基化；以及经修饰的碱基或核苷，例如脱氧肌苷、5-溴-dU、2′-脱氧尿苷、2-氨基嘌呤、2′,3′-双脱氧-胞苷、5-甲基-dC、锁定核酸(LNA)、iso-dC和-dG碱基、2′-O-甲基RNA碱基和经氟修饰的核苷。
在本文中所考虑的方法中的一些之中，引物与待测序的模板的至少一部分是至少部分地互补的。术语“互补(的)”通常是指在合适的温度和离子缓冲条件下在两个核苷酸的碱基(例如，A与T)之间形成有利的热动力学稳定性和特异性配对的能力。该配对依赖于每个核苷酸的氢键键合特性。关于这的最基本的例子为在胸腺嘧啶/腺嘌呤和胞嘧啶/鸟嘌呤之间的氢键对。在本发明中，用于扩增靶核酸的引物可以在其整个长度上与靶核酸分子完全互补或者“半互补”，其中所述引物包含最低程度地能够或不能够与所述靶核酸杂交的额外的、非互补的序列。
术语“杂交”通常是指与其核苷酸序列相一致的在不同核酸分子之间的碱基配对。术语“杂交”和“退火”可以互换使用。
术语“寡核苷酸”通常是指典型地被设计成单链DNA且长度小于75个核苷酸的核酸序列。
术语“引物”通常是指这样的寡核苷酸，其能够与核酸序列退火或杂交，并且在足够的条件(缓冲液、dNTPs、聚合酶、一价和二价盐、温度等)下允许所述引物所与其互补的核酸的延伸。
术语“模板核酸”、“模板分子”、“靶核酸”和“靶分子”可以互换使用，并且是指作为扩增反应的对象的核酸分子，其可以任选地通过测序反应进行询问以便推导出其序列信息。模板核酸可以是这样的核酸，其已通过克隆扩增方法产生，并且可以被固定化在固体表面上，即固定化在珠粒或阵列上。
术语“核苷”是指由与糖(例如核糖或脱氧核糖)的C-1′碳相连接的碱基组成的化合物。核苷的碱基部分通常为杂环碱基，例如嘌呤或嘧啶。
术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，作为单体单元或在多核苷酸内。“核苷5′-三磷酸”是指具有附着至糖5′-碳位置的三磷酸酯基团的核苷酸，并且有时被称为“NTP”、“dNTP”(2′-脱氧核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸)和“ddNTP”(2′,3′-双脱氧核苷三磷酸或双脱氧核苷三磷酸)。“核苷5′-四磷酸”是指具有附着至糖5′-碳位置的四磷酸酯基团的备选的经活化的核苷酸。PA-核苷酸是指炔丙基类似物。
如该术语在说明书和/或权利要求书中所使用的，术语“保护基团”在常规化学意义上被用作这样的基团，其在所希望的反应的某些条件下可逆地使得官能团变成非反应性的，并且被理解为不是H。在所希望的反应后，可以去除保护基团以对所保护的官能团进行去保护。在一个优选的实施方案中，所有保护基团都应当是在不降解重大比例的正在合成的分子的条件下可去除的(和因此，不稳定的)。保护基团也可以被称为“加帽基团”或“封阻基团”或“可切割的保护基团”。应当注意的是，为了方便起见，由保护基团所保护的官能度也可以被显示或提及为所述保护基团的一部分。在本文中所描述的核苷酸衍生物的情景下，在3’位置上使用保护基团。并不意欲的是，本发明受到在测序中所使用的可逆地进行封端的核苷酸上的该保护基团的性质或化学的限制。为此目的，考虑了各种各样的保护基团，包括但不限于：3'-O-叠氮基甲基核苷酸，3'-O-氨氧基核苷酸，3'-O-烯丙基核苷酸；和二硫化物核苷酸，3'-O-叠氮基烷基，3'-O-联硫基甲基烷基，3'-O-联硫基甲基芳基，3’-O-乙酰基，3'-O-肼基甲酸酯，3’-O-烷基醚，3’-O-烷基酯，3’-O-醛肟(-O-N＝CH-R)，3’-O-酮肟(-O-N＝C(R,R’))。
本发明的一个实施方案考虑了通过保护基团的官能化将标志物直接附着在核苷酸的3’-OH官能团上。
术语“标记物”或“可检测标记物”以其最广的意义是指任何这样的部分或特性，其是可检测的或者允许与它相关联的部分或特性的检测。例如，包含标记物的核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸是可检测的。理想地，经标记的寡核苷酸或多核苷酸允许杂交复合物的检测，特别是在经标记的核苷酸已通过酶促手段被掺入到所述引物和模板核酸的杂交复合物中之后。标记物可以共价地或非共价地附着至核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。在各种不同的方面，标记物可以备选地或相组合地：(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记物相互作用以更改由所述第二标记物所提供的可检测的信号，例如FRET；(iii)使杂交稳定化，例如双链体形成；(iv)赋予捕获功能，例如疏水亲和性、抗体/抗原、离子络合；或(v)改变物理特性，例如电泳迁移率、疏水性、亲水性、可溶性或色谱行为。标记物在其结构和其作用机制方面变化很大。标记物的例子包括但不限于：荧光标记物、非荧光标记物、比色标记物、化学发光标记物、生物发光标记物、放射性标记物、质量修饰基团、抗体、抗原、生物素、半抗原、酶(包括，例如过氧化物酶、磷酸酶等)等。为了进一步举例说明，荧光标记物可以包括：荧光素家族的染料，罗丹明家族的染料，花青家族的染料，或香豆素，噁嗪，硼二氮杂引达省，或其任何衍生物。荧光素家族的染料包括例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括例如德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA是从例如Perkin-Elmer,Inc.(Wellesley,Mass.,USA)商购可得的，德克萨斯红是从例如Life Technologies(Molecular Probes,Inc.)(Grand Island,N.Y.)商购可得的。花青家族的染料包括例如CY2、CY3、CY5、CY5.5和CY7，并且是从例如GE Healthcare LifeSciences(Piscataway,N.J.,USA)商购可得的。
如在本文中所使用的，术语“不同地进行标记的”是指为不同的标记物的可检测标记物，而不是在经标记的核苷核碱基上的不同位置处发现的标记物。
术语“A、G、C和T或U的类似物”是指经修饰的脱氧核苷三磷酸化合物，其中所述脱氧核苷的核碱基与相应的核苷脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和胸苷或脱氧尿苷非常相似。在可检测的经标记的脱氧核苷三磷酸化合物的情况下，A或脱氧腺苷的类似物将会被表示为虽然优选的是在核碱基和标记物之间存在连接体。在可检测的经标记的脱氧核苷三磷酸化合物的情况下，G或脱氧鸟苷的类似物将会被表示为虽然优选的是在核碱基和标记物之间存在连接体。在可检测的经标记的脱氧核苷三磷酸化合物的情况下，C或脱氧胞苷的类似物将会被表示为虽然优选的是在核碱基和标记物之间存在连接体。在可检测的经标记的脱氧核苷三磷酸化合物的情况下，T或U或者胸苷或脱氧尿苷的类似物将会被表示为虽然优选的是在核碱基和标记物之间存在连接体。另外的核碱基可以包括从由下列各项组成的组中选择的非天然核碱基：7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-氨基-7-脱氮腺嘌呤和2-氨基腺嘌呤。在类似物的情况下，所述可检测标记物还可以在所述核碱基和所述可检测标记物之间包括连接体部分。
术语“TCEP”或“三(2-羧基乙基)膦”是指在生物化学和分子生物学应用中经常使用的还原试剂。它常常作为盐酸盐(TCEP-HCl)进行制备和使用，具有286.65g/mol的分子量。它在水中是可溶的并且在中性pH下作为经稳定化的溶液是可得的，并且被固定化在琼脂糖支持物上以有助于该还原试剂的去除。并不意欲的是，本发明局限于一种类型的还原试剂。可以使用任何合适的能够还原二硫键的还原试剂来实践本发明。在一个实施方案中，所述还原试剂为膦[12]，例如，三苯基膦、三丁基膦、三羟甲基膦、三羟丙基膦、三羧乙基膦(TCEP)[13,14]。并不意欲的是，本发明局限于TCEP的使用。在一个实施方案中，所述还原试剂为TCEP。在一个实施方案中，通过暴露于携带硫羟基基团的化合物以便进行基于联硫基的连接体和封端(保护)基团的切割来从所述核碱基上去除所述可检测标记物和3’-OCH2-SS-R基团，此类含硫羟基的化合物包括(但不限于)半胱氨酸、半胱胺、二硫琥珀酸、二硫苏糖醇、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠盐、二硫丁胺、间-2,5-二巯基-N,N,N’,N’-四甲基己二酰二胺、2-巯基-乙磺酸或其盐和N,N’-二甲基-N,N’-双(巯基乙酰基)-肼[17]。可以通过包括硒醇[18]来进一步催化反应。另外，为此目的还可以使用氢硼化物，例如氢硼化钠[19]，以及抗坏血酸[20]。另外，用于二硫键切割的酶促方法也是众所周知的，例如二硫化物和硫还原酶，并且可以与本发明的化合物一起使用[21]。
N-环己基-2-氨基乙磺酸(也称为CHES)是一种缓冲试剂。
高pH被定义为在9.0-10.0的范围内的pH，例如pH 9.5。低pH被定义为8.5和更低。
在FFPE样品类型上的ATP被标示为ATPf(“f”代表FFPE)
在液体活组织检查样品类型上的ATP被标示为ATPp(“p”代表血浆)。
“Acrometrix”是指所使用的商购可得的DNA样品类型。
反应可以在各种各样的地方(例如，孔、通道、玻片、流动池等)发生。流动池可以具有通道，如在美国专利号8,940,481(其特此通过提及而合并)中所描述的。流动池可以是在仪器内的移动支持物上，如在美国专利号8,900,810(其特此通过提及而合并)中所描述的。
附图描述
合并入说明书中并构成说明书的一部分的附图图解说明了本发明的几个实施方案，并且与说明一起用于解释本发明的原理。所述附图仅是为了图解说明本发明的优选实施方案的目的，而不被解释为限制了本发明。
图1显示了具有通过包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O的核苷三磷酸的例子，其中R表示烷基基团例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、正丁基，或者其具有包含杂原子例如O、N、S等的取代基基团的类似物。
图2显示了经标记的具有3‘-O含亚甲基二硫化物的保护基团的核苷三磷酸的类似物，其中标记物通过可切割的氧亚甲基二硫化物连接体(-OCH2-SS-)附着至核碱基。所述类似物(从左上角开始顺时针)关于脱氧腺苷、胸苷或脱氧尿苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷。
图3显示了用还原试剂例如TCEP来使3‘-O保护基团去保护的分步机制。
图4显示了经传统的硫化物和氧亚甲基硫化物连接的经标记的核苷酸的切割反应产物。
图5显示了经标记的核苷酸的例子，其中所述可切割的连接体的间隔物包括炔丙基醚连接体。所述类似物(从左上角开始顺时针)关于脱氧腺苷、胸苷或脱氧尿苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷。
图6显示了经标记的核苷酸的例子，其中所述可切割的连接体的间隔物包括炔丙胺连接体。所述类似物(从左上角开始顺时针)关于脱氧腺苷、胸苷或脱氧尿苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷。
图7显示了经标记的核苷酸的例子，其中所述可切割的连接体的间隔物包括在5-位置处(对于嘧啶)和在7-脱氮-碳处(对于嘌呤)直接附着至核碱基的亚甲基(-(CH2)n-)。该连接体可以是亚甲基(n＝1)或多亚甲基(n>1)，其中在切割后，所述连接体在核碱基上的附着点处产生-(CH2)nOH基团，并且其中L1和L2表示间隔物，并且取代基R1、R2、R3和R4是向所述可切割的连接体提供稳定性的原子团，如前面所描述的。所述类似物(从左上角开始顺时针)关于脱氧腺苷、胸苷或脱氧尿苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷。
图8显示了未标记的dT类似物(化合物5)的合成。
图9显示了3’-O-(乙基联硫基甲基)-dCTP(10)的合成。
图10显示了对于经标记的dT中间体来说特异的经标记的核苷酸的合成路线。
图11显示了从1,4-丁二醇开始的可切割的连接体合成。
图12显示了可切割的连接体的另一种变体，其中将稳定化偕二甲基基团附着至所述可切割的连接体的α-碳。
图13显示了可切割的连接体的合成，其中所述二硫化物的侧翼为偕二甲基基团并且被附着至柔韧的乙二醇连接体(PEG)。所述连接体通过氨基甲酸酯基团(-NH-C(＝O)O-)附着至所述PA-核苷酸。所得的核苷酸类似物在这种情况下可以是如在化合物35(dUTP类似物)中那样。
图14显示了关于dATP类似物的可切割的连接体的合成，其中所述可切割的二硫化物的侧翼为偕二甲基基团并且所述连接体通过脲基团(-NH(C＝O)NH-)附着至PA-核苷酸。对于其他核苷酸类似物(例如，对于dCTP、dGTP、dUTP的类似物)，可以通过在该反应顺次程序的最后一步中用合适的PA-类似物替代42而类似地合成它们。
图15显示了可切割的连接体化合物45的合成，其中所述连接体通过脲官能度而系缚至PA-核苷酸并且所述二硫化物通过二碳连接体而联接至所述染料。所得的核苷酸类似物在这种情况下可以是如在化合物49(dGTP类似物)中那样。其他核苷酸类似物(例如，dATP、dUTP、dCTP的类似物)可以通过在该反应顺次程序的第三步中用合适的PA-类似物替代核苷酸46而类似地合成。
图16显示了当将经标记的核苷酸50在65℃下暴露于10当量的TCEP时，它产生许多副产物(包括化合物52)，连同所期望的产物51一起。
图17A和B显示了在5分钟暴露后所分析的在292nm(图17B)和524nm(图17A)处提取的化合物50的TCEP暴露产物的LC-MS描记线，其中在11.08分钟处的峰相应于化合物51，在10.88分钟处的峰相应于化合物52，和其他峰相应于副产物。
图18A和B显示了在15分钟暴露后所分析的在292nm(图18B)和524nm(图18A)处提取的化合物50的TCEP暴露产物的LC-MS描记线，其中在11.32分钟处的峰相应于化合物51和其他峰相应于副产物。
图19显示，在相同的切割条件下，经氧亚甲基二硫化物连接的核苷酸35干净地产生所希望的切割产物，化合物53和54。在二硫化合物基团的切割后，所述连接体的亚甲基硫羟基区段(-CH2SH)被从核苷酸中完全消除。
图20A和B显示了在5分钟暴露后所分析的在292nm(图20B)和524nm(图20A)处提取的化合物35的TCEP暴露产物的LC-MS描记线，其中在11.24分钟处的峰相应于化合物53和在34.70分钟处的峰相应于化合物54。
图21A和B显示了在15分钟暴露后所分析的在292nm(图21B)和524nm(图21A)处提取的化合物35的TCEP暴露产物的LC-MS描记线，其中在11.25分钟处的峰相应于化合物53和在34.70分钟处的峰相应于化合物54。
图22显示了在适当的步骤处通过用甲硫醇或甲硫醇钠替代巯基乙醇(EtSH)来合成3’-OCH2-SS-Me类似物，其不同于3’-OCH2-SS-Et的合成(图10)。
图23显示了通过使用经活化的连接体32将PA-核苷酸(例如，57)与合适的可切割的-OCH2-SS-连接体相偶联，并最终与荧光团染料相偶联。
图24显示了所取得的具有不同连接体的核苷酸类似物，化合物60和61。
图25显示了通过不同的荧光团报告基团进行标记的4-核苷酸类似物的结构，其中R＝Me-或Et-。
图26显示了通过不同的荧光团报告基团进行标记的4-核苷酸类似物的结构，其中R＝Me-或Et-基团。
图27显示了通过不同的荧光团报告基团进行标记的4-核苷酸类似物的结构，其中R＝Me-或Et-基团。
图28显示了包含本发明的新型可切割的连接体的一般性通用建造单元结构。PG＝保护基团，L1、L2–连接体(脂族的、芳族的、混合极性直链或支化的)。RG＝反应性基团。在本发明的一个实施方案中，此类建造单元在所述连接体的一个末端处携带Fmoc保护基团和在另一个末端处携带反应性NHS碳酸酯或氨基甲酸酯。该优选的组合在包含新型可切割的连接体的经改进的核苷酸合成中是特别有用的。保护基团在与核酸/核苷酸化学相容的条件下应当是可去除的，并且反应性基团应当是选择性的。在所述连接体上的活性NHS基团与以胺封端的核苷酸进行反应后，可以通过使用碱例如哌啶或氨容易地去除Fmoc基团，因此使在所述连接体的末端处的胺基团暴露以用于可切割的标志物的附着。以这种方式可以非常快速地构建包含各种各样的标志物的化合物文库。
图29显示了携带通过本发明的新型连接体而附着的可切割的标志物的核苷酸的一般性结构。S＝糖(即核糖、脱氧核糖)，B＝核碱基，R＝H或可逆地封端的基团(保护基团)。优选的可逆地封端的基团包括但不限于：叠氮基甲基(-CH2N3)、联硫基烷基(-CH2-SS-R)、氨氧基(-ONH2)。
图30显示了关于携带通过本发明的可切割的连接体而附着的可切割的标志物的核苷酸的另一种一般性结构，其中D选自包括叠氮化合物、烷基二硫和经二硫化物取代的烷基基团的组，B为核碱基，A为附着基团，C为可切割的位点核心，L1和L2为联接基团，并且Label为标记物(在具有标记物的化合物中)。
图31显示了在图32A-C中所测试的化合物(L-系列(96)、B-系列(97)、A-系列(98)和G-系列(99)家族)的化学结构。
图32A显示了具有各种基于二硫化物的可切割的连接体的经Alexa488标记的3’-O-叠氮基甲基核苷酸类似物(L-系列(96)、B-系列(97)、A-系列(98)和G-系列(99)家族)的掺入的时间过程。
图32B显示了关于具有各种基于二硫化物的可切割的连接体的经Alexa488标记的3’-O-叠氮基甲基核苷酸类似物(L-系列(96)、B-系列(97)、A-系列(98)和G-系列(99)家族)的掺入的反应速率。
图32C显示了关于具有各种基于二硫化物的可切割的连接体的经Alexa488标记的3’-O-叠氮基甲基核苷酸类似物(L-系列(96)、B-系列(97)、A-系列(98)和G-系列(99)家族)的掺入的反应速率，与核苷酸的浓度相对。
图33A显示了dA 3’-可逆地封端的核苷酸：-CH2-N3、-CH2-SS-Et、-CH2-SS-Me。
图33B显示了在100nM的浓度下关于dA 3’-可逆地封端的核苷酸(-CH2-N3、-CH2-SS-Et、-CH2-SS-Me)的掺入动力学。
图33C显示了在250nM的浓度下关于dA 3’-可逆地封端的核苷酸(-CH2-N3、-CH2-SS-Et、-CH2-SS-Me)的掺入动力学。
图33D显示了在500nM的浓度下关于dA 3’-可逆地封端的核苷酸(-CH2-N3、-CH2-SS-Et、-CH2-SS-Me)的掺入动力学。
图33E显示了在1000nM的浓度下关于dA 3’-可逆地封端的核苷酸(-CH2-N3、-CH2-SS-Et、-CH2-SS-Me)的掺入动力学。
图34显示了用3种不同的DNA聚合酶(T9、J5和J8)的具有3’–O-CH2-SS-Et封端基团的dC 3’-可逆地封端的核苷酸的掺入动力学。
图35显示了在GR测序仪上在Extend A反应中所使用的核苷酸的经优化的浓度[nM]。
图36显示了通过原始错误率所测量的A-系列(98)核苷酸的测序性能。
图37显示了通过完好(无错误)读取百分比所测量的A-系列(98)核苷酸的测序性能。
图38显示了通过各种各样的测序度量所测量的A-系列(98)核苷酸的测序性能。
图39显示了通过原始错误率所测量的G-系列(99)核苷酸的测序性能。
图40显示了通过完好(无错误)读取百分比所测量的G-系列(99)核苷酸的测序性能。
图41A显示了来自在ExtB中包含3’-O-CH2-SS-Et核苷酸的测序运行的多重条形码的鉴定(BC1)。
图41B显示了来自在ExtB中包含3’-O-CH2-SS-Et核苷酸的测序运行的多重条形码的鉴定(BC6)。
图41C显示了来自在ExtB和A两者中包含3’-O-CH2-SS-Et核苷酸的测序运行的多重条形码的鉴定(BC1)。
图41D显示了来自在ExtB和A两者中包含3’-O-CH2-SS-Et核苷酸的测序运行的多重条形码的鉴定(BC6)。
图42显示了在Extend A缓冲液中在升高的温度下具有各种可切割的连接体的、经标记的、可逆地封端的dC的稳定性的比较：B＝B-系列(97、116、117和118)，G＝G-系列(99、103、104和105)，A＝A-系列(98、100、101和102)，和SS＝L-系列(96、50、106和115)。
图43显示了合成流程图，其图解说明了从化合物62合成化合物63-67。在实施例33、实施例34和实施例35中描述了所述合成。
图44显示了合成流程图，其图解说明了从化合物68合成化合物69-71和119-120。在实施例36、实施例37和实施例38中描述了所述合成。
图45显示了四种经标记的核苷酸的完整化学结构，其从上至下相应于dCTP、dTTP、dATP和dGTP(A-系列，98、100、101和102)。
图46显示了四种经标记的核苷酸的完整化学结构，其从上至下相应于dCTP、dTTP、dATP和dGTP(G-系列，99、103、104和105)。
图47显示了四种经标记的核苷酸的完整化学结构，其从上至下相应于dCTP、dTTP、dATP和dGTP(L-系列，96、50、106和115)。
图48显示了四种经标记的核苷酸的完整化学结构，其从上至下相应于dCTP、dTTP、dATP和dGTP(B-系列，97、116、117和118)。
图49显示了在GR仪器上的测序中所使用的核苷酸的示例性浓度：经标记的(化合物72、74、76、78)和未标记的(化合物120、126、132、138)，所有都在其3’上携带-CH2-SS-Me作为可逆地封端基团。
图50显示了使用新型核苷酸(如对于图49所描述的，经标记的和未标记的，所有都携带-CH2-SS-Me)在GR上的测序运行中所产生的强度的例子。
图51显示了具有通过包含亚甲基二硫化物甲基的基团进行加帽的3‘-O的核苷三磷酸的一系列非连接体例子。
图52显示了具有通过包含亚甲基二硫化物甲基的基团进行加帽的3‘-O的、通过不同的荧光团报告基团进行标记的4-核苷酸类似物的结构。
图53为示意图，其显示了普通连接体的NHS经活化的形式的合成的一个实施方案。
图54为示意图，其显示了MeSSdATP的合成的一个实施方案。
图55为示意图，其显示了MeSSdCTP的合成的一个实施方案。
图56为示意图，其显示了MeSSdGTP的合成的一个实施方案。
图57为示意图，其显示了MeSSdTTP的合成的一个实施方案。
图58为示意图，其显示了MeSSdATP-PA的合成的一个实施方案。
图59为示意图，其显示了76的合成的一个实施方案。
图60为示意图，其显示了MeSSdCTP-PA的合成的一个实施方案。
图61为示意图，其显示了72的合成的一个实施方案。
图62为示意图，其显示了MeSSdGTP-PA的合成的一个实施方案。
图63为示意图，其显示了MeSSdGTP-ARA-Cy5的合成的一个实施方案。
图64为示意图，其显示了MeSSdUTP-PA的合成的一个实施方案。
图65为示意图，其显示了74的合成的一个实施方案。
图66为示意图，其显示了3’-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTPs的结构。
图67为示意图，其显示了从3’-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTPs合成3’-(OCH2SSMe)-dNTPs的一个实施方案。
图68显示了关于3’-(OCH2SSMe)-dNTP-PAs的合成的关键中间体。
图69为示意图，其显示了从3’-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP-PAs合成3’-(OCH2SSMe)-dNTP-PA的一个实施方案。
图70为示意图，其显示了连接体安装和荧光染料缀合。
图71显示了可以用于附着本发明的连接体和封端基团的羟甲基衍生物核碱基衍生物的结构。R＝可逆地封端基团，CL＝本发明的可切割的连接体。
图72显示了在已进行了切割后羟甲基衍生物核碱基衍生物的结构。
图73A-73I显示了携带硫羟基(可以用于进行本发明的基于联硫基的连接体和封端基团的切割的官能团)的化合物的例子：73A)–半胱胺，73B)–二硫琥珀酸，73C)–半胱胺，73D)–二硫苏糖醇，73E)–2,3-二巯基-1-丙磺酸钠盐，73F)–二硫丁胺，73G)–间-2,5-二巯基-N,N,N’,N’-四甲基己二酰二胺，73H)–2-巯基乙磺酸或其盐，73I)–N,N’-二甲基-N,N’-双(巯基乙酰基)-肼。
图74A-74C显示了连接体和3’-保护基团的选择性且分步切割的例子–化学结构和反应流程图。
图75A-75C显示了连接体的选择性且分步切割的例子–与切割的每个步骤相关联的色谱图。
图76A-E显示了连接体的选择性且分步切割的例子–从相应于选择性切割反应的所有步骤的峰中提取的吸收光谱。
图77显示了关于携带在3’上的联硫基保护基团和基于联硫基的连接体的核苷酸的切割反应流程图。
图78A显示了起始材料和切割反应混合物(其是在与下列切割试剂温育10分钟后通过RP-HPLC进行分析的)的色谱图：二硫琥珀酸、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇(DTT)和半胱胺。
图78B显示了通过RP-HPLC进行分析的反应混合物的组成。
图79A-79C呈现了在邻位处或被至少一个烃隔开的和备选地附着至具有阴离子官能团(R)的烃间隔物的示例性二硫醇化合物。
图80呈现了在邻近的烃处包含官能团的示例性硫醇化合物。
图81呈现了通过2,3-二巯基丙磺酸或其盐(DMPS)进行的二硫键还原的示例性机制。
图82A-82C呈现了本发明的一个实施方案，其显示了通过基于硫羟基的切割试剂来切割具有附着的二硫化物连接体的3`-(MeSSCH2)加帽的核苷酸(关于化合物A、B和C的LC-MS数据显示在图84A-F中)。
图83呈现了在表1中所呈现的切割研究中所使用的各种基于硫羟基的切割试剂的代表性结构。
图84A呈现了化合物A变体的切割研究的示例性LC-MS数据，其中采用MeSSdUTPARA NH3；15.8分钟为化合物A，14.0分钟为化合物B，和7.10分钟为化合物C。
图84B呈现了化合物A变体的切割研究的示例性LC-MS数据，其中采用MeSSdUTPARA NH2_DISHsucd；15.8分钟为化合物A，14.0分钟为化合物B，和7.10分钟为化合物C。
图84C呈现了化合物A变体的切割研究的示例性LC-MS数据，其中采用MeSSdUTPARA NH2_DISHPropaneSulf；15.8分钟为化合物A，14.0分钟为化合物B，和7.10分钟为化合物C。
图84D呈现了化合物A变体的切割研究的示例性LC-MS数据，其中采用MeSSdUTPARA NH2_L-半胱氨酸；15.8分钟为化合物A，14.0分钟为化合物B，和7.10分钟为化合物C。
图84E呈现了化合物A变体的切割研究的示例性LC-MS数据，其中采用MeSSdUTPARA NH2_DTT；15.8分钟为化合物A，14.0分钟为化合物B，和7.10分钟为化合物C。
图84F呈现了化合物A变体的切割研究的示例性LC-MS数据，其中采用MeSSdUTPARA NH2_半胱胺；15.8分钟为化合物A，14.0分钟为化合物B，和7.10分钟为化合物C。
图85呈现了按照实施例84来合成3'-O-(甲基亚甲基二硫化物)-5-(N-三氟乙酰基-氨基炔丙基)-dU(MeSSdU-PA(COCF3)，7)的一个实施方案。
图86A呈现了按照实施例85来合成3'-O-(甲基亚甲基二硫化物)-5-(氨基炔丙基)-2'-脱氧尿苷(MeSSdUTPPA，8)的一个实施方案，其显示了从化合物7至化合物10的合成流程图。
图86B呈现了按照实施例85来合成3'-O-(甲基亚甲基二硫化物)-5-(氨基炔丙基)-2'-脱氧尿苷(MeSSdUTPPA，8)的一个实施方案，其显示了从化合物10至化合物11的合成流程图。
图87A-87D呈现了包含在本文中所公开的用于进行SBS测序的试剂的试剂盒的一个实施方案的示意图。
图87A：示例性盒1A，其包含延伸预混物和切割碱缓冲液的容器。
图87B：示例性盒1B，其包含碱洗涤预混物和洗涤缓冲液的容器。
图87C：示例性盒2，其包含延伸添加物试剂、DNA聚合酶和成像试剂的容器。
图87D：示例性盒3，其包含洗涤添加物试剂和切割固体添加物试剂的容器。
图88呈现了示例性数据，其显示了DMPS CHES高pH切割试剂对于SBS测序方法的原始错误率的剂量响应。
图89A-89C呈现了示例性SBS测序数据，其显示了使用DMPS TRIS高pH切割试剂和DMPS CHES试剂的超前/滞后(lead/lag)比较。
图89A：高pH DMPS TRIS切割试剂。
图89B：DMPS CHES基线b128。
图89C：TCEP基线SBS测序方法。
图90呈现了示例性数据，其显示了在DMPS基线b128和TCEP基线切割试剂之间的Q得分比较。
图91A-C呈现了示例性数据，其比较了两种DMPS浓度(75vs 50mM)与TECP标准以证明在超前/滞后方面的改善。
图92呈现了示例性数据，其比较了两种DMPS浓度(75vs 50mM)与TECP标准以证明在平均错误率方面的改善。
图93A-93C显示了测序工作流程的一个实施方案。图93A显示了关于引物杂交的工作流程的一个实施方案。图93B显示了关于流动池制备的工作流程的一个实施方案。图93C显示了关于边合成边测序(SBS)的自动化工作流程的一个实施方案，其中在切割步骤后使用氧化洗涤(洗涤11)。
图94A显示了当在氧化洗涤(洗涤11)中使用叔丁基过氧化物时的超前/滞后结果，相比于当过氧化氢在(图94B)或不在(图94C)所述氧化洗涤中时的超前/滞后结果而言。作为循环的函数的超前需要是线性函数以便该算法能够测量准确数目。图94C显示了当所述洗涤不包含过氧化氢时的非线性超前结果。但是，当通过在所述氧化洗涤中包括过氧化氢(图94B)或叔丁基过氧化物(图94A)来正确地优化所述化学时，取得了线性函数并且通过该算法提供了可靠的关于超前的值。
发明描述
本发明提供了使用这样的脱氧核苷三磷酸的方法、组合物、混合物和试剂盒，所述脱氧核苷三磷酸包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3'-O位置和可逆地联接至所述脱氧核苷的核碱基的可检测标记物。此类化合物为未来的测序技术(包括但不限于边合成边测序(SBS)，特别是在流动池中的自动化SBS)提供了新的可能性。作为物质的组合物，本发明考虑了在说明书和附图的主体中所显示的各种结构。这些组合物可以用在反应(包括但不限于引物延伸反应)中。这些组合物可以以混合物形式。例如，经标记的核苷酸(例如，在图25中所显示的那些)中的一种或多种可以在与一种或多种未标记的核苷酸(例如，在图51中所显示的那些)的混合物中(并且以混合物进行使用)。它们可以与其他试剂(例如，缓冲液、聚合酶、引物等)一起在试剂盒中。
在一个实施方案中，本发明的经标记的核苷酸需要几个合成步骤并且涉及将各种各样的染料连接至不同的碱基。所希望的是能够以模块化方式而不是以逐步过程来进行连接体和染料附着。所述模块化方法涉及在一端上具有保护基团和在另一端上具有经活化的基团的连接体部分的预建造。然后，此类预建造出的连接体可以用于偶联至炔丙胺核苷酸；然后可以使被掩蔽的氨基团去保护，和然后偶联经活化的染料。相比于逐步合成而言，这具有步骤更少和产率更高的优点。
在一个实施方案中，本发明的经标记的核苷酸用在DNA测序中。DNA测序是生物学中的一个基本工具。在基础研究、生物医学、诊断学和法医应用中，以及在基础和应用研究的许多其他领域中，它是广泛使用的方法。新一代DNA测序技术正在改变生物学研究常规进行所采用的方式。它已准备好在未来几年中在精准医学、伴随诊断学等的领域中发挥关键作用。
边合成边测序(SBS)是革命性的下一代测序(next-generation sequencing；NGS)技术，其中数百万个DNA分子(单个的或其簇)可以同时进行测序。该技术的基础是使用称为可切割的核苷酸终止物的经修饰的核苷酸，其允许在固体表面上DNA分子的仅仅单个碱基延伸和检测，从而允许在DNA测序中的大规模并行(关于全面的综述：Cheng-Yao,Chen,Frontiers in Microbiology,2014,5,1[22]；Fei Chen等人,Genomics ProteomicsBioinformatics,2013,11,34-40[5]；C.W.Fuller等人,Nature Biotechnology,2009,27,1013[2]；M.L.Metzker,Nature Reviews,2010,11,31[1])——其全部特此通过提及而合并。
具有通过可切割的保护基团(其在掺入到DNA引物中和随后的检测后可以通过化学反应来去除)进行封阻的3‘-OH位置的经修饰的核苷酸是SBS化学成功的关键(Ju等人,US7,883,869,2011[23]；Ju等人,US 8,088,575,2012[24]；Ju等人,US 8,796,432,2014[25]；Balasubramanian,US 6,833,246,2004[26]；Balasubramanian等人,US 7785796B2,2010[27]；Milton等人,US 7,414,116 B2,2008[28]；Metzker,M.L.等人,Nucleic Acids Res,1994,22:4259-4267[29]；Ju等人,Proc.Nat.Acad,Sci.USA,103(52),19635,2006[30]；Ruparel等人,Proc.Nat.Acad,Sci.USA,102(17),5932,2005[31]；Bergmann等人,US 2015/0140561 A1[32]；Kwiatkowski,US 2002/0015961 A1[33])——其全部特此通过提及而合并。
还已进行了尝试以开发称为虚拟终止物(virtual terminator)的核苷酸类似物，其中3’-OH是未保护的，但是碱基以这样的方式进行修饰，从而使得修饰性基团在单个碱基掺入至DNA模板后阻止进一步的延伸，从而迫使链终止事件发生(Andrew F.Gardner等人,Nucleic Acids Res 40(15),7404-7415 2012[34]；Litosh等人,Nuc.Acids,Res.,2011,第39卷,第6期,e39[35]；Bowers等人,Nat.Methods,2009,6,593[36])——其全部特此通过提及而合并。
还公开了核糖核苷酸类似物，其中2’-OH通过可去除的基团进行保护，所述可去除的基团阻止邻近的3’-OH基团参与链延伸反应，由此在单个碱基延伸后停止(Zhao等人,US8,399,188 B2,2013[37]，其通过提及而合并)。
在另一个方面，Zon提出了使用二核苷酸终止物，其包含具有通过可去除的基团进行封阻的3’-OH的核苷酸之一(Gerald Zon,US 8,017,338 B2,2011[38]，其通过提及而合并)。
以前已经使用可切割的二硫化物连接体(-SS-)来在经标记的核苷酸中附着荧光染料，以用于在GeneReader测序中使用。认为在切割步骤后在正在生长的DNA链上留下的-SH疤痕引起许多副反应，其限制实现较长的读长。
已知-SH残基可以在切割步骤中所使用的TCEP存在下经历自由基反应，从而产生不希望的官能团，并且它潜在地可以损害DNA分子(Desulfurization of Cysteine-Containing Peptides Resulting from Sample Preparation for ProteinCharacterization by MS,Zhouxi Wang等人,Rapid Commun Mass Spectrom,2010,24(3),267-275[39])。
-SH疤痕还可以与在流动池之内的新进来的核苷酸相互作用，过早地切割3‘OH保护基团，从而引起进一步的链延长，并且由此它可以引起信号相位偏移。
-SH的有害副反应的最终结果是读长减小和在测序运行中错误率增加。
发明详述
本发明提供了使用这样的脱氧核苷三磷酸的方法、组合物、混合物和试剂盒，所述脱氧核苷三磷酸包含通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3'-O位置和可逆地联接至所述脱氧核苷的核碱基的可检测标记物。本发明还提供了这样的方法、组合物、混合物和试剂盒，其使用硫醇衍生物(备选地，缩硫醇类似物)作为基于二硫化物的连接体和核苷酸的3`-二硫化物加帽基团的切割试剂，这与其中二硫化物还原或切割步骤是必需的DNA测序技术(和其他技术例如蛋白质工程)有关。在一个实施方案中，将所述切割试剂作为固体粉末添加物进行配备，消费者将会按照测序工作流程说明书将其添加至切割预混缓冲液。此外，本发明提供了其中用氧化洗涤步骤来清除所述含硫羟基的化合物的实施方案。此类化合物为在未来的测序技术(包括但不限于边合成边测序(SBS)，包括在流动池中的自动化SBS)中使用提供了可能性。
在一个实施方案中，本发明涉及在DNA测序(例如，边合成边测序)中经标记的核苷三磷酸的合成和使用，所述核苷三磷酸包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体以及作为保护基团的包含亚甲基二硫化物的3‘-O基团，所述包含亚甲基二硫化物的3‘-O基团具有式-CH2-SS-R，其中R表示烷基基团例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、正丁基，或者其具有包含杂原子例如O、N、S等的取代基基团的类似物(参见图1)。在一个实施方案中，所述R基团可以包含这样的官能团，其可以调节3‘-O加帽基团的稳定性和可切割性，而同时对于DNA聚合酶来说是可接受的。
在另一个方面，本发明涉及经标记的核苷三磷酸，所述核苷三磷酸包含在标记物和核碱基之间的可切割的氧亚甲基二硫化物连接体以及通过包含亚甲基二硫化物的基团进行加帽的3‘-O位置，其中所述核碱基可以是天然的或非天然的碱基，其可以通过与DNA模板的天然核碱基的氢键相互作用而形成DNA双链体，并且可以是dG和dA的7-脱氮类似物，和2-氨基-dA。dA和dG的7-脱氮类似物可以由于缺乏7-N原子而减少DNA三级结构的形成。预想到，在一个实施方案中，此类核苷可以通过增强DNA模板与聚合酶相互作用而潜在地改善DNA测序读长。也可能的是，2-氨基-dA由于其与其互补碱基形成更稳定的3个氢键(而不是在天然状态下的2个键)的能力而可以增加DNA双链体稳定性，因此它可以降低在测序运行期间丢失DNA引物的风险(A Jung等人,Mol.Pathol.,2002,55(1),55-57[40]；2-氨基-dATP:Igor V.Kutyavin,Biochemistry,2008,47(51),13666-73[41])。
在另一个实施方案中，所述核苷酸可以具有可检测的报告分子，例如通过可切割的连接体–OCH2SS-连接至核碱基的荧光染料。其中–OCH2-SS-基团直接附着至核碱基的经标记的核苷酸以及其作为可切割的连接体的用途在现有技术中是未知的。与传统的、广泛使用的二硫化物连接体(-SS-)相反，该类别的可切割的连接体(–OCH2-SS-)不在DNA分子上留下硫痕迹，其中通过在还原切割后快速水解所得的中间体-OCH2-SH而将它干净地转化为-OH基团。因为这一点，此类连接体可以是对于传统的二硫化物连接体的更好的备选。在传统的基于二硫化物的连接体(-SS-)中，当通过还原试剂例如TCEP进行切割时，所得的硫羟基基团(-SH)可以经历副反应，如在下面的图4中所呈现的(参考：Desulfurization ofCysteine-Containing Peptides Resulting from Sample Preparation for ProteinCharacterization by MS,Zhouxi Wang等人,Rapid Commun Mass Spectrom,2010,24(3),267-275[39])。
在另一个实施方案中，报告基团可以在5-C位置处附着至嘧啶碱基(dT，dC)和在天然碱基的7-N或脱氮类似物的7-C处附着至嘌呤碱基(dA，dG)。
在另一个实施方案中，经标记的核苷酸的结构可以是如在图5中所显示的，其中所述可切割的连接体的间隔物包括炔丙基醚连接体。具有炔丙基醚的核碱基可以按照化学合成的现有技术来合成。L1和L2表示化学间隔物，并且取代基R1、R2、R3和R4是调节所述可切割的连接体的稳定性和可切割性的原子团。它们可以是氢原子，偕二甲基，或者任何烷基、苯基或经取代的烷基基团，例如甲基、乙基、正丁基、苯基等。它们还可以包含具有-O、＝O,NH、-N＝N、酸、酰胺、聚乙二醇链(PEG)等的烃链。在所述核苷酸上的标记物可以为荧光染料、能量转移染料、放射性标记物、化学发光探针、半抗原和允许通过化学或物理方法进行检测的其他标记物形式。
在另一个实施方案中，经标记的核苷酸的结构可以是如在图6中所显示的。所述可切割的连接体的间隔物包括炔丙胺连接体。再次，L1和L2表示化学间隔物，并且取代基R1、R2、R3和R4是提供稳定性和调节所述连接体的可切割性的原子团，如前面所描述的。它们可以是氢原子，烷基基团例如甲基、乙基，和其他经取代的基团，或者其盐。在所述可切割的二硫化物连接体(例如，按照下述结构的偕二甲基类似物：)的α-碳上的偕二烷基基团为所述连接体提供了更好的稳定性，从而允许调节经标记的核苷酸的模块化合成。据推测它阻止在基于二硫化物的有机化合物之中普遍存在的歧化反应。它还向所述连接体添加更大的疏水性，这有助于经标记的核苷酸类似物的合成和纯化[42-44]。在所述连接体中存在的偕二甲基官能度被认为不仅用于在电子上使二硫键稳定，而且还阻止在分子间和在分子内出现二硫化物交换，这可能是通过位阻效应来进行的。已证明，在半胱胺存在下，在终止物上的二硫化物官能度参与二硫化物交换，而配备有偕二甲基基团的连接体则不是这样。在图42中的连接体研究比较了具有和没有偕二甲基基团的连接体。如从该研究可以看出的，没有偕二甲基基团的连接体G和L快速地与半胱胺交换，从而导致产物的降解。如所期望的，用我们的所选择的连接体A未观察到该现象，用类似的连接体B也未观察到该现象。另外，由于经标记的核苷酸包含两个二硫化物，一个在终止物上，和一个在该分子的连接体部分上，因而认为该稳定化效应阻止在染料和终止物之间出现混乱。该稳定性对于我们的核苷酸在测序中的性能来说是重要的。
在另一个实施方案中，经标记的核苷酸的结构可以是如在图7中那样。所述可切割的连接体的间隔物包括直接附着至核碱基(对于嘧啶在5-位置处，和对于嘌呤在7-脱氮-碳处)的亚甲基(-(CH2)n-)。该连接体可以是亚甲基(n＝1)或多亚甲基(n>1)，其中在切割后，所述连接体在核碱基上的附着点处产生-(CH2)nOH基团，并且其中L1和L2表示间隔物，并且取代基R1、R2、R3和R4是为所述可切割的连接体提供稳定性的原子团，如前面所描述的。
在另一个实施方案中，本发明涉及关于所要求保护的核苷酸的合成方法。加帽基团和连接体可以通过修改所描述的现有技术来进行合成。例如，未标记的dT类似物(化合物5)可以如在图8中所显示的那样来进行合成。
在一个实施方案中，本发明涉及：(a)具有通过作为可切割的保护基团的包含亚甲基二硫化物的基团(例如，式-CH2-SS-R的)进行加帽的3‘-O的核苷三磷酸(参见图1)；和(b)其经标记的类似物(参见图2)，其中标记物通过可切割的氧亚甲基二硫化物连接体(-OCH2-SS-)附着至核碱基。此类核苷酸可以用在核酸的边合成边测序(SBS)技术中。还描述了用于合成所要求保护的核苷酸的一般性方法。
在一个实施方案中，如在图1中所显示的，未标记的核苷酸的一般性结构具有通过包含亚甲基二硫化物的基团(具有共同结构-CH2-SS-R)进行保护的3‘-O基团，其中R可以是常规烷基或经取代的烷基基团，例如-Me、-Et、-nBu、-tBu、-CH2CH2NH2、-CH2CH2NMe等，并且B可以是天然或非天然核碱基。非天然核碱基的一些具体例子为7-脱氮dG和dA、2-氨基-dA等。
在图2中，显示了经标记的类似物的一般性结构，具有通过包含亚甲基二硫化物的基团进行保护的3‘-O(如在图1中所显示的)，此外可检测报告物(标记物)例如荧光团通过具有一般性结构-L1-OCH2-SS-L2-的可切割的连接体附着至核碱基。分别地，L1表示将核碱基与可切割的连接体隔开的分子间隔物，而L2表示在可切割的连接体和标记物之间的分子间隔物。L1和L2都可以具有用于联接至各自的化学实体的合适的官能团，例如-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-C＝N、-N＝N-等。所述标记物可以为荧光团染料、能量转移染料、质量标签、生物素、半抗原等。所述标记物在不同的核苷酸上可以是不同的以用于同时检测多种碱基，或者是相同的以用于分步检测在空间上隔开的寡核苷酸或其在固体表面上的经扩增的克隆。
在一个实施方案中，本发明涉及新型类别的核苷酸，其具有用-CH2-SS-R基团进行加帽的3‘-O和通过具有一般性结构-O-CH2-SS-的可切割的连接体附着至核碱基的标记物。这样的加帽基团和连接体可以通过用TCEP或相关化学品进行的单次处理而同时干净地被切割，而不在DNA分子上留下硫痕迹。
该类别的核苷酸可以是足够稳定的以便忍耐对于由热活性聚合酶所催化的向DNA模板上的核苷酸掺入来说必需的相对高的温度(～65℃)，但又是足够不稳定的以便在DNA相容条件(例如用TCEP进行还原)下被切割。在一些实施方案中，切割可以通过暴露于二硫苏糖醇来完成。
当暴露于还原试剂例如TCEP时，所述核苷酸通过在图3中所显示的分步机制来使3‘-O保护基团脱帽，因而恢复了3‘-OH基团的天然状态。已知TCEP及其类似物对于生物分子是温和的，这对于在SBS中的应用来说是一个先决条件。
在一个实施方案中，本发明涉及在图28中所显示的包含新型可切割的连接体的一般性通用建造单元结构。PG＝保护基团，L1、L2–连接体(脂族的、芳族的、混合极性直链或支化的)。RG＝反应性基团。在本发明的一个实施方案中，此类建造单元在所述连接体的一个末端处携带Fmoc保护基团和在另一个末端处携带反应性NHS碳酸酯或氨基甲酸酯。该优选的组合在包含新型可切割的连接体的经改进的核苷酸合成中是特别有用的。保护基团在与核酸/核苷酸化学相容的条件下应当是可去除的，并且反应性基团应当是选择性的。在所述连接体上的活性NHS基团与以胺封端的核苷酸进行反应后，可以通过使用碱例如哌啶或氨容易地去除Fmoc基团，因此使在所述连接体的末端处的胺基团暴露以用于可切割的标志物的附着。以这种方式可以非常快速地构建包含各种各样的标志物的化合物文库。
在一个实施方案中，本发明涉及在图29中所显示的携带通过新型连接体而附着的可切割的标志物的核苷酸的一般性结构。S＝糖(即核糖、脱氧核糖)，B＝核碱基，R＝H或可逆地封端的基团(保护基团)。优选的可逆地封端的基团包括但不限于：叠氮基甲基(-CH2N3)、联硫基烷基(-CH2-SS-R)、氨氧基(-ONH2)。
在一个实施方案中，本发明考虑了这样的硫醇试剂，其包含处于邻位的(例如，n1＝1)或被至少一个烃键隔开的(例如，n1＝>1)至少两个或更多个硫羟基基团，其进一步地用烃间隔物附着至阴离子官能团(R)(例如，n2＝>1)。参见图79A-79C。
在一个实施方案中，本发明考虑了具有邻近可以调节所述官能团的pKa的官能团(R1)(包括但不限于卤素、胺、磷酸盐或酯、膦酸盐或酯、磷酸、羧酸、亚砜和/或羟基等)的硫羟基基团(-SH)的化合物。参见图80。
DNA测序在现代生物技术中作为有用的分析工具而发挥作用。例如，新一代DNA测序(NGS)在遗传学研究、诊断学和基础生物医学研究中是革命性的。关于当前NGS技术的详细综述提供在M.L.Metzker,Nature Reviews 2010,11,31和C.W.Fuller等人,NatureBiotechnology 2009,27,1013中。
一种众所周知的测序方法是边合成边测序(SBS)，其中在DNA分子的互补链的酶促合成期间对许多包含核苷三磷酸的DNA模板同时进行测序。按照该方法，通过3'-OH-保护基团(包括但不限于乙酰基、磷酸酯、碳酸酯、叠氮基甲基、硝基等)可逆地封阻核苷三磷酸。在一个实施方案中，所述核苷三磷酸通过可切割的连接体在碱基处包含标记物。
虽然并不需要理解发明的机制，但是认为边合成边测序(SBS)在很大程度上依赖于取得较长的读长和较好的准确性的能力。还认为3'-OH加帽基团和可切割的连接体的使用可以在DNA相容条件下被去除。例如，本发明考虑了可逆的核苷酸终止物，其中3'-OH基团用烷基亚甲基二硫化物(例如，R-SS-CH2-)进行加帽，和具有相同官能部分的可切割的连接体(例如，-OCH2-SS-)。对于两者的同时切割，优选的是DNA相容的切割试剂。不幸的是，许多还原试剂对于DNA分子是有害的并且经常是对于流动池的固体表面来说过于严苛，并且难以从流动池中洗掉。
已知存在许多切割二硫键的还原试剂。例子包括但不限于TCEP、DTT、谷胱甘肽、硼氢化物等。这些还原试剂广泛用在蛋白质工程和抗体化学中。但是此类化合物也可以具有某些限制，这不仅是由于较慢的反应速率，而且还由于当应用于NGS时在洗涤步骤中难以从流动池中完全去除。进一步地，基于硫羟基的化合物的还原力依赖于介质的pH。已知，在较高pH下，硫羟基基团(RSH)经历离子化以形成硫醇根(RS-)，其可以将反应速率加速许多倍。但是，在较高pH下，DNA分子和表面可以经历水解损害，由此限制了其应用。因此，在一个实施方案中，可以在降低的pH下还原二硫化物的硫醇化合物(从而它与DNA和流动池表面两者都是相容的)对于在SBS化学中的应用来说是优选的。
虽然并不需要理解发明的机制，但是认为在图79A-79C和80中所显示的硫醇化合物由于邻近官能团(即，例如，邻近的-SH和吸电子的R1)的存在通过邻基参与而可以在相对低的pH下经历离子化以形成硫醇根。因此，它们可以在相对较低的pH下还原二硫键并且可以具有相比于标准硫醇而言增加的反应速率。进一步地，处于α-位置的硫羟基的邻基参与通过邻位促进可以由于分子内二硫键的形成而加速还原过程的第二个步骤。参见图81。如在图3中所显示的，该反应不被认为经历由另一个硫醇分子进行的亲核攻击以形成硫化物分子，如在本领域中目前所认为的(Rajeeva Singh和George M.Whitesides的“Thioldisulfide interchange,The Chemistry of Sulphur Containing FunctionalGroup”,第13章,第633-658页)。由于带负电荷的侧基(R＝磺酸根、膦酸根、羧酸根等)，因而认为分子被预期对于表面是非粘性的，由此使得它们可容易地从流动池中洗去。本文中的数据呈现了用基于硫羟基的化合物来进行的具有附着的二硫化物连接体的经加帽的3’二硫化物的切割研究，其显示了在65℃下在TRIS缓冲液(pH 8.5)中在少于十(10)分钟内加帽基团和连接体两者的完全切割。有趣的是，在二硫琥珀酸或其盐存在下未观察到完全切割。参见图82A-82C和表1。
表1：核苷的二硫醇化合物切割
显示了这些切割试剂的结构。参见图83。然后，通过液相色谱法/质谱法(LC/MS)来表征切割产物。参见图84A-F。在图82A-82C中显示了化合物A、B和C。
在一个实施方案中，本发明考虑了包括切割步骤的方法，所述切割步骤包括能够在高pH亲核条件下切割3’-OH经甲基-二硫化物保护的核苷酸的切割试剂。在一个实施方案中，所述切割试剂为二硫醇化合物。在一个实施方案中，所述切割步骤发生在边合成边测序(SBS)步骤中。在一个实施方案中，所述切割步骤之后是洗涤步骤，其包括氧化清除以有效地去除残留的切割试剂。
虽然并不需要理解发明的机制，但是认为这样的氧化清除开启了基于二硫醇的切割的效率并且使得具有良好性能的测序成为可能，特别是关于超前的减少和显著地经改善的原始错误率和更长的读长。进一步认为，这样的效应可以归因于例如：(1)由于更有反应性的亲核切割种类的形成而引起的在高pH条件(例如，9.0至10.0，和优选地9.5)下更有效的切割反应；和/或(2)可能通过表面吸附机制(例如，与含铁表面例如硅酸盐、二氧化钛、磁性珠粒铁氧体的螯合)而保留在流动池中的切割试剂的有效清除。例如，这样的切割残留物可以在流动池中累积，这导致延续到随后的延伸步骤中，因此引起3’-OH部分的过早去保护并损害单个碱基掺入，其中对于测序性能具有非常显著的伤害。在一个实施方案中，在本文中所公开的二硫醇种类可以是二硫醇丙磺酸或其盐(DMPS)，也称为二巯基丙磺酸或其盐。在一个实施方案中，二硫醇切割试剂可以包括但不限于2-巯基乙磺酸钠(MESNA)和/或谷胱甘肽。在一个实施方案中，DMPS具有下述结构：
在一个实施方案中，本发明考虑了包括切割和洗涤步骤的方法，所述切割和洗涤步骤与用包括但不限于DMPS、MESNA和/或谷胱甘肽的化合物进行的SBS测序相容。在一个实施方案中，所述切割步骤包括在处于pH 9.5的CHES缓冲液中的DMPS。在一个实施方案中，所述洗涤步骤包括在处于pH 8.5的TRIS缓冲液中的H2O2。在一个实施方案中，所述洗涤步骤可以进一步包括氧化清除试剂，其包括但不限于H2O2[45,46]、叔丁基过氧化物和/或NaBO3。
在一个实施方案中，30％和3％是进入添加物中的H2O2原液的浓度。在一个优选的实施方案中，在洗涤混合物中H2O2的最终浓度为H2O2 0.3％。
在一个实施方案中，本发明考虑了试剂盒，其包含至少一个容器和关于进行SBS测序的一套说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含延伸预混缓冲液的第一容器。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含切割碱缓冲液的第二容器。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含洗涤缓冲液预混物的第三容器。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含洗涤缓冲液的容器。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含延伸添加物试剂的容器。在一个实施方案中，所述延伸添加物试剂为A2(PMA)。在一个实施方案中，所述延伸添加物试剂为B2(PMB)。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含DNA聚合酶的容器。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含成像缓冲液的容器。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含洗涤添加物试剂的容器。在一个实施方案中，所述洗涤添加物试剂为过氧化氢(H2O2)。在一个实施方案中，所述过氧化氢在处于在百分之一和百分之五之间，和更优选地百分之三(3％)的浓度的储液中，其稍后被稀释至较低浓度以用于洗涤。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个包含切割固体添加物试剂的容器。在一个实施方案中，所述切割固体添加物试剂为二硫醇丙磺酸或其盐(DMPS)。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含处于pH 9.5的包含DMPS(75mM)、CHES(300mM)、NaCl(300mM)的切割试剂配制剂。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含切割1添加物和/或切割2添加物。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含经冷冻的液体(例如，-20℃)切割试剂添加物，其包含在H2O或H2O/NaCl中的浓缩的DMPS。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含固体切割试剂添加物，其包含DMPS+NaCl。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含液体(+2-8℃)切割试剂添加物，其包含作为纯试剂的DMPS。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含洗涤试剂配制剂，其包含处于pH 8.8的TRIS、H2O2(0.3％)和EDTA(1％)。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含液体(2-8℃)洗涤试剂添加物，其包含H2O2(3.0％)。在一个实施方案中，所述试剂盒提供了关于将这稀释至更低浓度(例如0.3％)的说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含稳定性经改善的液体(2-8℃)洗涤试剂添加物，包括但不限于TBHP、APS和/或NaBO3。
在一个实施方案中，本发明考虑了已被开发成在SBS测序条件下发挥作用的切割试剂。在一个实施方案中，这样的切割试剂为二硫醇丙磺酸或其盐。
如在本文中所描述的，所述切割试剂被设计成符合下面的SBS标准：i)大约85bp的平均读长；ii)大约百分之五(5％)的平均原始错误率；iii)大于百分之九十(>90％)的珠粒滞留；和/或iv)大约一倍和一点五倍(1.5X)的停留时间。就性能改善和优化指示物来评价这些标准，包括但不限于：i)缓冲液配制；ii)DMPS滴定；和/或切割和铁清除条件优化。下面所讨论的数据证明，至少一种切割试剂，即二巯基丙磺酸或其盐(DMPS)，符合和/或超过这些标准。虽然并不需要理解发明的机制，但是认为用基于DMPS的切割试剂进行的SBS测序通过下述方式而成为可能：在包含处于pH 9.5的CHES缓冲液的切割步骤处的亲核条件，随后为使用例如过氧化氢(H2O2)来进行的包含氧化清除条件的切割后洗涤步骤。
通过高效液相色谱法来筛选候选切割试剂，其包括但不限于二巯基试剂、单巯基试剂和/或螺旋(helico)试剂。筛选配置在GeneReader上进行，并且除了候选切割试剂之外，还包括诸如氧化清除剂、加帽试剂和/或螯合剂的试剂。使用SBS测试方法(包括诸如DMPS/MESNA、无机化合物和/或酶促化合物的试剂)，该筛选测定法观察到延伸和洗涤步骤的优化。另外，还进行了off-GeneReader测定法，包括但不限于清洁、活性和/或FC完整性。用于优化切割步骤的观察包括但不限于pH、浓度、缓冲液类型/抗衡离子、停留时间和/或温度。
对于107个循环，使用AIT，通过使用商购可得的DNA标准(Acrometrix)来构建DMPS基线。初步观察发现，在洗涤步骤中包括氧化清除剂显著地控制了超前，并且pH水平在介导总体切割效率中发挥作用。随后的验证研究鉴定出，优选的DMPS基线配置包括在CHES300mM pH 9.5中的DMPS切割试剂，随后为稀释的H2O2，其中对于切割，GeneReader在65℃下运作；1X停留(遵从TAT要求)和3X流体洗涤。参见表2。
表2：DMPS基线SBS测序配置(Acrometrix标准)
这些数据显示，处于pH 9.5的DMPS CHES 300mM提供了可测量的超前，并且原始错误率和平均读长符合上面所描述的标准。
在本文中所呈现的数据证明，原始错误率随配置演变而改善。参见图88。例如，在切割步骤中具有DMPS而在洗涤步骤中没有H2O2这样的情况不允许测序超过25个循环(数据未显示)。因此，这些数据暗示，具有DMPS和H2O2两者的SBS测序使得更好的性能成为可能，这是由于更高的pH，如当比较下列各项时所看到的：i)差的测序性能(pH 8.5；红色曲线)；ii)高质量性能(pH 9.5；蓝色曲线)；和iii)TCEP基准(benchmark)(绿色曲线)。图88。
在本文中所呈现的数据证明，当使用DMPS基线b128或TCEP基线SBS测序方法时，超前/滞后之比得到改善(当与8.5pH DMPS TRIS切割试剂相比较时)。参见图89A、图89B和图89C。可以看出，超前在高pH配置中是近似线性的并且是与TCEP早期访问基线(EarlyAccess Baseline)相当的。进一步地，Q得分分析显示，关于DMPS基线b128的平均值比TCEP早期访问基线低大约4个Q得分。参见图90。
二次分析基准化分析(benchmarking analysis)发现，关于0.5％AF呼叫(call)的平均FP为2，相比于关于TCEP早期访问的零而言。参见表3。
表3:二次分析基准化分析
配置 Q85 覆盖范围>200x TP FN FP@0.5％呼叫
b34(TCEP早期访问)
001146_MAN08_RA01.BC3.fastq 26 100％ 68 5(0) 0
001146_MAN08_RA01.BC4.fastq 26 100％ 68 5(0) 0
001154_MAN08_RA01.BC3.fastq 26 100％ 68 5(0) 0
001154_MAN08_RA01.BC4.fastq 26 100％ 68 5(0) 0
AVG FP＝0
b124
000215_man09_RA01.BC3 23 100％ 67 6(1) 4
000215_man09_RA01.BC4 23 100％ 67 6(1) 5
000879_Man08_clones_RA01.BC3 26 89％ 65 8(3) 35
000879_Man08_clones_RA01.BC4 22 100％ 67 6(1) 8
000965_man09_RA01.BC3 25 100％ 66 7(2) 38
000965_man09_RA01.BC4 22 100％ 67 6(1) 8
AVG FP＝16
b128(DMPS基线)
000243_Man11_RA01.BC3.fastq 24 100％ 67 6(1) 0
000243_Man11_RA01.BC4.fastq 24 100％ 67 6(1) 0
000988_MAN09_RA01.BC3.fastq 22 100％ 66 7(2) 1
000988_MAN09_RA01.BC4.fastq 22 100％ 66 7(2) 4
001038_Man11_RA01.BC3.fastq 24 100％ 67 6(1) 0
001038_Man11_RA01.BC4.fastq 24 100％ 67 6(1) 3
001039_MAN09_RA01.BC3.fastq 24 100％ 67 6(1) 1
001039_MAN09_RA01.BC4.fastq 24 100％ 67 6(1) 4
AVG FP＝2
在八(8)次SBS运行期间测试了DMPS基线可重现性，其中使用在CHES 300mM pH9.5中的DMPS，随后为稀释的含H2O2的洗涤剂，其以在65℃下的切割进行运作，遵从TAT要求的1X停留，和3X流体洗涤。参见表4。
表4：DMPS基线可重现性
所述数据显示出横跨所有KPI的相当的性能，其中具有大约1％的标准偏差。
进一步的数据证明了增加切割试剂pH至pH 10和/或降低DMPS浓度以进一步改善SBS测序方法的能力。观察到，处于pH 10的切割试剂不影响珠粒滞留(97％)；同时看起来对于性能没有显著影响(数据未显示)。将50mM浓度的DMPS(b132)与75mM浓度的DMPS(b128)进行了比较。参见表5。
表5：DMPS b132(50mM)与DMPS b128(75mM)的比较
所述数据显示降低的DMPS浓度提供了超前的值得注意的改善并且暗示了平均错误率和读长的改善。参见图91A-C和图92。还暗示，较低的DMPS浓度也将会支持更有利的COGS。
总之，上面的数据显示，高pH切割试剂，例如DMPS，提供了这样的SBS测序方法，其包括：i)大约85bp或更长的平均读长；ii)大约4％或更低的平均原始错误率；iii)大约97％或更大的珠粒滞留；和iv)1X停留时间。进一步地，所鉴定出的剩余的“至产物的间隙(gap-to-product)”要求证明了在大约4％至2.5％之间变动的平均原始错误率和在2至0之间变动的在0.5％呼叫下的FP。
制作了DMPS b132配置与TCEP配置的比较。参见表6。
表6：基于在AIT上的Acrometrix(107个循环)的
关于不同配置的性能比较
所述数据显示，DMPS b132配置(作为TECP替代物)显示出与使用第二代(“早期访问(Early Access)”)配置的TECP结果非常接近的KPI。
在一个实施方案中，本发明考虑了包括核酸序列的方法，其中用于测序的核酸模板源自组织活组织检查。在一个实施方案中，所述组织活组织检查包括液体组织活组织检查。虽然并不需要理解发明的机制，但是认为液体组织活组织检查与SBS测序方法是相容的，以便对在液体组织活组织检查内的核酸序列进行测序。参见表7。
表7：关于DMPS b132SBS配置的平台KPI
可以看出，关于DMPS b132的平台KPI是与TECP早期访问KPI非常接近的。显示了液体活组织检查测序运行的结果。参见表8。
表8：液体活组织检查小组规格
所述数据显示了在扩增子和变体洞察(insight)水平这两者上的出众的覆盖范围。
下面在一系列表格中显示了对在液体活组织检查样品中的核酸进行测序的准确度，所述一系列表格证明了当使用商购可得的肿瘤小组(例如，可执行洞察肿瘤小组(Actionable Insights Tumor Panel)，Qiagen)时的灵敏度和选择性。参见表9-11。
表9：概要：
使用BioX KPI，在0.5％频率截止值和AQ>20下的性能
表10：详细的：
在0.5％频率截止值和AQ>20下的性能
KPI是指关于覆盖范围(200X和500X)和变体呼叫(精确度、灵敏度、特异性)的二次分析规格。相比于第1代(“遗产(Legacy)”)核苷酸GR 1.0基线和第2代(“早期访问(EarlyAccess)”)配置而言，所有的b132运行(n＝8)具有更好的灵敏度、特异性和精确度。满足了关于10-重的所有KPI(灵敏度、特异性、精确度)和覆盖范围要求。
我们还在液体活组织检查(LB)样品池中对许多文库(八个)一起进行了多重化(plex)。
表11：在1％LB样品(n＝8)上的多重化程度
*值是在8个HD780 1％cfDNA条形码上的平均值。
实施例
提供了下面的实施例以便证明和进一步举例说明本发明的某些优选的实施方案和方面，并且不应被解释为限制了本发明的范围。
实施例1
3’-O-(甲硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧胸苷(2)的合成
将5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧胸苷(1)(2.0g，5.6mmol)溶解在处于250mL圆底烧瓶中的由DMSO(10.5mL)、乙酸(4.8mL)和乙酸酐(15.4mL)组成的混合物中，并且在室温下搅拌48小时。然后，通过添加饱和K2CO3溶液来猝灭混合物，直至气态CO2的放出停止。然后，通过使用分液漏斗用EtOAc(3X 100mL)来对混合物进行萃取。然后，在分配漏斗中用饱和NaHCO3溶液(2X 150mL)洗涤合并的有机萃取物，并且通过Na2SO4来干燥有机层。通过旋转蒸发来浓缩有机部分。最后，通过硅胶柱色谱法(Hex:EtOAc/7:3至1:1)来纯化反应混合物，参见图8。作为白色粉末而获得3’-O-(甲硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧胸苷(2)，以75％产率(1.75g，Rf＝0.6，hex:EtOAc/1:1)。1H-NMR(CDCl3):δH8.16(s,1H),7.48(s,1H),6.28(m,1H),4.62(m,2H),4.46(m,1H),4.10(m,1H),3.78-3.90(m,2H),2.39(m,1H),2.14,2.14(s,3H),1.97(m,1H),1.92(s,3H),0.93(s,9H),和0.13(s,3H)ppm。
实施例2
3’-O-(乙基联硫基甲基)-2’-脱氧胸苷(4)的合成
向溶解在20mL无水CH2Cl2中的在高真空中干燥过夜的化合物2(1.75g，4.08mmol)添加Et3N(0.54mL，3.87mmol)和5.0g分子筛-3A，并且在Ar气氛中搅拌30分钟。然后，将反应烧瓶放置在冰浴上以将温度带至零下，并且缓慢地向其添加在CH2Cl2(1.8mL)中的1.8当量1M SO2Cl2并在相同温度下搅拌1.0小时。然后，移去冰浴以将烧瓶带至室温，并且向其添加在4mL无水DMF中的硫代甲苯磺酸钾(1.5g)的溶液并在室温下搅拌0.5小时。
然后，添加2当量EtSH(0.6mL)并且搅拌额外的40分钟。然后，将混合物用50mLCH2Cl2进行稀释并且在漏斗中通过celite-S进行过滤。用足够量的CH2Cl2洗涤样品以确保过滤出产物。然后，浓缩CH2Cl2萃取物并且通过在硅胶柱上的色谱法(Hex:EtOAC/1:1至1:3，Rf＝0.3，在Hex:EtOAc/1:1中)来进行纯化。然后，用在20mL MeOH中的2.2g NH4F处理所得的粗产物。在36小时后，用20mL饱和NaHCO3猝灭反应并且通过分配用CH2Cl2进行萃取。将CH2Cl2部分通过Na2SO4进行干燥并且通过色谱法(Hex:EtOAc/1:1至1:2)来进行纯化，参见图8。作为白色粉末而获得经纯化的产物(4)，以18％产率(0.268g，Rf＝0.3，Hex:EtOAc/1:2)。
在CDCl3中的1H NMR:δH 11.25(1H,S),7.65(1H,S),6.1(1H,m),5.17(1H,m),4.80(2H,S),4.48(1H,m),3.96(1H,m),3.60(2H,m),3.26(3H,s),2.80(2H,m),2.20(2H,m)和1.14(3H,m)ppm。
实施例3
3’-O-(乙基联硫基甲基)-2’-脱氧胸苷(5)的合成
在配备有橡胶隔片的25mL烧瓶中，向化合物4(0.268g，0.769mmol)添加质子海绵(210mg)。将样品在高真空中干燥过夜。然后，将材料在氩气氛中溶解在2.6mL(MeO)3PO中。然后，将配备有Ar气供应的烧瓶放置在冰浴上，搅拌以将温度带至零下。然后，通过注射器一次添加1.5当量的POCl3并且在氩气氛中在相同温度下搅拌2小时。然后，移去冰浴，并且制备由在无水DMF(6mL)中的焦磷酸三丁基铵(1.6g)和Bu3N(1.45mL)组成的混合物。一次添加整个混合物并且搅拌10分钟。然后，用TEAB缓冲液(30mL，100mM)稀释反应混合物并且在室温下搅拌额外的3小时。粗产物通过旋转蒸发来进行浓缩，并且通过C18Prep HPLC(方法：0至5分钟100％A，随后为在72分钟内直至50％B的梯度，A＝50mM TEAB和B＝乙腈)来进行纯化。在冷冻干燥靶级分后，通过使用PL-SAX Prep柱的离子交换HPLC来进一步纯化半纯的产物(方法：0至5分钟100％A，然后在70分钟内直至70％B的梯度，其中A＝在水中的15％乙腈，B＝在15％乙腈中的0.85M TEAB缓冲液)。如上面所描述的那样通过C18Prep HPLC来进行最终的纯化，这导致～25％产率的化合物5，参见图8。
实施例4
N4-苯甲酰基-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3’-O-(甲硫基甲基)-2’-脱氧胞苷(7)的合成
按照图9实现3’-O-(乙基联硫基甲基)-dCTP(10)的合成。将N4-苯甲酰基-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧胞苷(6)(50.0g，112.2mmol)溶解在处于2L圆底烧瓶中的DMSO(210mL)中。向其顺次添加乙酸(210mL)和乙酸酐(96mL)，并且在室温下搅拌48小时。在该时间段期间，通过TLC观察到向产物的完全转化(关于产物，Rf＝0.6，EtOAc:hex/10:1)。
将混合物分开为两个相等的级分，并且将每一个转移至2000mL烧杯并通过缓慢地添加饱和K2CO3溶液来进行中和直至CO2气体放出停止(pH 8)。然后，在分液漏斗中用EtOAc萃取混合物。然后，用饱和NaHCO3溶液(2X 1L)和随后用蒸馏水(2X 1L)洗涤有机部分，然后通过Na2SO4来干燥有机部分。
然后，通过旋转蒸发来浓缩有机部分。然后，通过使用puriflash柱的硅胶快速柱色谱法(Hex:EtOAc/1:4至1:9，3次柱运行，在15um,HC 300g puriflash柱上)来纯化产物，从而作为灰色粉末而获得N4-苯甲酰基-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3’-O-(甲硫基甲基)-2’-脱氧胞苷(7)，以60％产率(34.0g，Rf＝0.6，EtOAc:hex/9:1)，参见图9。
化合物7的1H-NMR(CDCl3):δH 8.40(d,J＝7.1Hz,1H),7.93(m,2H),7.64(m,1H),7.54(m,3H),6.30(m,1H),4.62&4.70(2Xd,J＝11.59Hz,2H),4.50(m,1H),4.19(m,1H),3.84&3.99(2Xdd,J＝11.59&2.79Hz,2H),2.72(m,1H),2.21(m,1H),2.18(s,3H),0.99(s,9H),和0.16(s,6H)ppm。
实施例5
N4-苯甲酰基-3’-O-(乙基联硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧胞苷(8)
向溶解在无水CH2Cl2(35mL)中的N4-苯甲酰基-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3’-O-(甲硫基甲基)-2’-脱氧胞苷(7)(2.526g，5.0mmol)添加分子筛-3A(10g)。将混合物搅拌30分钟。然后，向其添加Et3N(5.5mmol)，并且在冰-盐-水浴上搅拌20分钟。然后，使用注射器向其缓慢地添加在CH2Cl2(7.5mL，7.5mmol)中的1M SO2Cl2并且在N2气氛中在相同温度下搅拌2小时。然后，添加在8mL无水DMF中的苯硫代磺酸钠盐(1.6g，8.0mmol)并且在室温下搅拌30分钟。最后，添加EtSH(0.74mL)并且在室温下搅拌额外的50分钟。通过celite-S来过滤反应混合物，并且用CH2Cl2洗出产物。在浓缩所得的CH2Cl2部分后，通过使用硅胶柱的快速色谱法(1:1至3:7/Hex:EtOAc)来纯化它，从而获得化合物8，以54.4％产率(1.5g)，参见图9。化合物8的1H-NMR(CDCl3):δH 8.40(m,1H),7.95(m,2H),7.64(m,1H),7.54(m,3H),6.25(m,1H),4.69&4.85(2Xd,J＝11.60Hz,2H),4.50(m,1H),4.21(m,1H),3.84&3.99(2Xdd,J＝11.59&2.79Hz,2H),2.75(m,3H),2.28(m,1H),1.26(m,3H),0.95(s,9H),和0.16(s,6H)ppm。
实施例6
N4-苯甲酰基-3’-O-(乙基联硫基甲基)-2’-脱氧胞苷(9)
将N4-苯甲酰基-3’-O-(乙基联硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧胞苷(8，1.50g，2.72mmol)溶解在50mL THF中。然后，在氮气氛中在冰冷温度下添加在THF(3.3mL)中的1M TBAF。将混合物在室温下搅拌1小时。然后，通过添加1mL MeOH来猝灭反应，并且在10分钟后通过旋转蒸发来去除溶剂。通过使用梯度1:1至1:9/Hex:EtOAc的硅胶快速色谱法来纯化产物，从而导致化合物9(0.78g，65％产率，Rf＝0.6，在1:9/Hex:EtOAc中)，参见图9。化合物9的1H-NMR(CDCl3):δH 8.41(m,1H),8.0(m,2H),7.64(m,2H),7.50(m,2H),6.15(m,1H),4.80&4.90(2Xd,J＝11.60Hz,2H),4.50(m,1H),4.21(m,1H),4.00&3.85(2Xdd,J＝11.59&2.79Hz,2H),2.80(m,2H),2.65(m,1H),2.40(m,1H),和1.3(s,3H)ppm。
最后，遵照在化合物5的合成中所描述的标准合成实验方案从化合物9实现化合物10的合成(参见图8)。
实施例7
经标记的核苷酸的合成可以遵照在图10和图11中所显示的合成路线来实现。图10对于经标记的dT中间体的合成来说是特异的，而其他类似物可以类似地合成。
5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-5-(N-三氟乙酰基-氨基炔丙基)-2’-脱氧尿苷(12)的合成
将5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-5-碘代-2’-脱氧尿苷(11，25.0g，53.4mmol)溶解在处于2-颈圆底烧瓶中的无水DMF(200mL)中。用充满Ar气的气球冲洗反应烧瓶。然后，向其添加刚刚打开的、经真空干燥的四(三苯基膦)钯(0)(6.16g，5.27mmol)和CuI(2.316g，12.16mmol)并且在氩气氛中在室温下搅拌10分钟。接着，顺次添加N-三氟乙酰基-炔丙胺(23.99g，157.8mmol，2.9当量)和Et3N(14.7mL，105.5mmol)。将混合物在室温下搅拌3.0小时并且通过TLC来确认反应完成(关于产物，Rf＝0.5，在EtOAc:Hex/3:2中)。
然后，通过旋转蒸发来去除溶剂。将所得的粗产物溶解在500mL EtOAc中并转移到分液漏斗中。然后，分别用饱和NaHCO3(2X 400mL)和饱和NaCl(2X 400mL)溶液来洗涤有机部分。然后，通过无水Na2SO4来干燥EtOAc部分。在过滤掉Na2SO4盐后，使用旋转蒸发器来浓缩过滤液。然后，在与3X40gm硅胶相结合后，通过硅胶快速色谱法(1:1Hex:EtOAc至2:3Hex:EtOAc，200g，15um HP puriflash柱，3次柱运行)来纯化它，这导致21.994g的12(83.88％产率)，参见图10。
化合物12中的1H-NMR(DMF-d7):δH 11.65(brs,1H),10.15(brs,1H),8.15(brs,1H,H6),6.37(t,J＝5.99Hz,1H,H1’),5.42(m,1H),4.41(m,1H),4.37(brs,2H,关于炔丙胺基团的NH-CH2),4.00(m,1H),3.84-3.97(m,2H),2.30(m,1H,H2’),2.20(m,1H,H2’),0.97(s,9H,3X-CH3,TBDMS)和0.19(s,6H,2X CH3,TBDMS)ppm。
实施例8
5’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3’-O-(甲硫基甲基)-5-(N-三氟乙酰基-氨基炔丙基)-2’-脱氧尿苷(13)的合成
将化合物12(21.99g，44.77mmol)溶解在处于1000mL圆底烧瓶中的DMSO(90mL)中。然后，向其顺次添加AcOH(40mL)和乙酸酐(132mL)并且在室温下搅拌48小时。通过TLC来确认反应完成(关于产物，Rf＝0.5；Hex:EtOAc/1:1)。
然后，将反应混合物转移至2,000mL烧杯，并且通过饱和K2CO3来进行中和直至CO2气体的放出停止(～pH 8.0)。然后，将混合物转移到分液漏斗中并进行萃取(2X 500mLCH2Cl2)。然后，将合并的有机部分用饱和NaHCO3(1X 500mL)进行洗涤并且通过Na2SO4进行干燥。在过滤掉Na2SO4后，将有机部分通过旋转蒸发来进行浓缩并且通过硅胶快速色谱法(Hex:EtOAc/7:3至1:1)来进行纯化，从而产生12.38g的化合物13(～50％产率)，参见图10。TLC：Rf＝0.5；Hex:EtOAc/1:1。化合物13的1H-NMR(DMSO-d6):δH 11.69(s,1H),10.01(s,1H),7.93(s,1H,H6),6.07(m,1H,H1’),4.69(m,2H),4.38(m,1H),4.19(m,2H),4.03(m,1H),3.75(m,2H),2.34(m,1H),2.14(m,1H),2.07(s,3H),0.86(s,9H)和0.08(s,6H)ppm。
化合物14、15和16的合成可以遵照对于化合物5和10所描述的相关步骤的合成实验方案来实现。其他N-三氟乙酰基-氨基炔丙基核碱基的合成描述在美国专利8,017,338[38](其通过提及而合并入本文)中。去除N-三氟乙酰基基团以产生氨基炔丙基核碱基可以通过在温和条件下的溶剂解来产生[47]。
另一方面，可切割的连接体合成可以如在图11中所显示的那样从1,4-丁二醇开始来实现，并且描述在实施例9中。
实施例9
4-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-丁烷-1-O-(甲硫基甲基)(18)的合成
在氮气氛中在冰浴上将溶解在处于1L烧瓶中的100mL无水吡啶中的18.3g 1,4-丁二醇(17)(18.3g，203.13mmol)带至零下温度。用注射器向其缓慢地添加叔丁基二苯基甲硅烷基氯(TBDPSCl，19.34g，70.4mmol)。通过移去冰浴并且在室温下继续搅拌过夜来允许反应烧瓶升温至室温。然后，通过旋转蒸发来去除溶剂并且通过使用硅胶柱的快速色谱法(7:3至1:1/Hex:EtOAc)来进行纯化，这导致4-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-丁烷-1-醇(13.7g，59.5％产率，Rf＝0.7，用1:1/Hex:EtOAc)。1H NMR(CDCl3):δH 7.70(4H,m),7.40(4H,m),3.75(2H,m),3.65(m,2H),3.70(4H,m)和1.09(9H,m)ppm。在所得的产物中，将6.07g(18.5mmol)溶解在90mL无水DMSO中，参见图11。然后，向其添加乙酸(15mL)和乙酸酐(50mL)。将混合物在室温下搅拌20小时。然后，将它转移至分液漏斗并且通过用相同体积的EtOAc进行分配用300mL蒸馏水进行洗涤。然后，将EtOAc部分转移至1,000mL烧杯并且用饱和K2CO3溶液进行中和。通过分配来去除水性部分，然后用蒸馏水(3X 300mL)进一步洗涤EtOAc部分并通过MgSO4进行干燥。然后，浓缩EtOAc部分并且通过在硅胶柱上的快速色谱法(Hex:EtOAc/97:3至90:10)来进行纯化，从而获得4-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-1-O-(甲硫基甲基)-丁烷(18)(5.15g，71.7％产率，Rf＝0.8，在9:1/Hex:EtOAc中)。1H NMR(CDCl3):δH 7.70(4H,m),7.40(6H,m),4.62(2H,s),3.70(2H,m),3.50(2H,m),2.15(2H,s),1.70(4H,m)和1.08(9H,m)ppm。
实施例10
化合物19的合成
将化合物18(2.0g，5.15mmol)溶解在40mL无水CH2Cl2中，并且向其添加10g分子筛-3A和0.78mL Et3N(5.66mmol)。将混合物在室温下在N2气体中搅拌30分钟。然后，将烧瓶放置在冰浴上以将温度带至零下。然后，向其缓慢地添加7.7mL的1M SO2Cl2/CH2Cl2溶液(7.7mmol)并且在N2中搅拌1小时。然后，移去冰浴并且添加在8mL DMF中的苯硫代磺酸钠盐(1.6g，8.24mmol)并在室温下搅拌30分钟。然后，添加在7mL无水DMF中的4-巯基苯基乙酸(1.73g，10.3mmol，2.0当量)并且搅拌2小时。然后，通过celite-S来过滤整个粗样品并且通过EtOAc来洗出产物。然后，将EtOAc萃取物通过旋转蒸发来进行浓缩并且在硅胶柱(1:1至3:7/Hex:EtOAc)上进行纯化，从而获得1.19g的化合物19，以43％产率，参见图11。Rf＝0.5Hex:EtOAc/3:7。1H NMR(CDCl3):7.65(4H,m),7.55(2H,m),7.45(6H,m),7.20(2H,s),4.80(2H,m),3.65(4H,m),3.50(2H,m),1.60(4H,m),和1.09(9H,s)ppm。
实施例11
化合物20的合成
在室温下用DSC(0.426g，1.5当量)和Et3N(0.23mL)处理溶解在20mL无水DMF中的化合物19(0.6g，1.11mmol)并且在氮气氛中搅拌1.5小时。然后，在5mL DMF中制备由11-叠氮基-3,6,9-三氧杂癸烷-1-胺(2.0当量)和Et3N(2.0当量)组成的混合物。将整个溶液一次添加至反应混合物并且搅拌1小时。然后，在真空中去除溶剂并且通过使用梯度0至10％CH2Cl2:MeOH的硅胶快速色谱法来进行纯化，从而获得化合物20，以36％产率(0.297g，Rf＝0.8，10％MeOH:CH2Cl2)，参见图11。1H NMR(MeOH-d4):δH 7.70(4H,m),7.55(2H,m),7.40(6H,m),7.45(2H,m),4.85(2H,s),3.65-3.30(22H,m),1.65(4H,m),和1.09(9H,m)ppm。
然后，将产物20(0.297g)溶解在处于烧瓶中的7mL无水THF中并且在氮气氛中放置在冰浴上以带至零下温度。然后，逐滴添加在THF中的0.6mL 1M TBAF并且在冰冷温度下搅拌3小时。用1mL MeOH来猝灭混合物并且通过旋转蒸发来去除挥发性物质，并且通过快速色谱法来进行纯化，从而获得165mg的产物21，参见图11。1H NMR(MeOH-d4):δH 7.55(2H,m),7.25(2H,m),4.85(2H,s),3.75-3.30(22H,m)和1.50(4H,m)ppm。可以将该产物通过使用点击化学(click chemistry)而偶联至经炔烃取代的染料和通过使用CDI作为活化试剂而偶联至核苷酸，从而导致化合物22。
可切割的连接体的另一种变体(其中稳定化偕二甲基基团附着至所述可切割的连接体的α-碳)可以遵照图12来实现。
实施例12
在另一个方面，所述可切割的连接体可以为化合物30，其中二硫化物的侧翼为偕二甲基基团并且被附着至柔韧的乙二醇连接体(PEG)。所述连接体通过氨基甲酸酯基团(-NH-C(＝O)O-)附着至所述PA-核苷酸(例如，化合物33)。所得的核苷酸类似物在这种情况下可以是如在化合物35(dUTP类似物)中那样，其可以按照图13来进行合成。其他核苷酸类似物(例如，dATP、dGTP、dCTP的类似物)可以通过在该反应顺次程序的最后一步中用合适的PA-核苷酸类似物替代PA-核苷酸33而类似地进行合成。
实施例13
化合物28的合成
将化合物18(15.53g，40mmol)(关于化合物18的合成，参见实施例9)溶解在处于圆底烧瓶中的450mL无水二氯甲烷中。添加分子筛(80g)和三乙胺(5.6mL)，并且将反应混合物在氮气氛中在0℃下搅拌0.5小时。接着，通过注射器缓慢地添加SO2Cl2(在DCM中1M，64mL)并且在0℃温度下搅拌1.0小时。然后，移去冰-水浴，并且一次添加在20mL无水DMF中的硫代甲苯磺酸钾(10.9g，48.1mmol)的溶液并在室温下搅拌20分钟。然后，将反应混合物倒入处于2L圆底烧瓶中的溶解在20mL DMF中的3-巯基-3-甲基丁烷-1-醇(4.4mL，36mmol)之中。将所得的混合物在室温下搅拌0.5小时，并且通过celite进行过滤。用乙酸乙酯萃取产物。在分液漏斗中用蒸馏水洗涤合并的有机萃取物，随后为通过旋转蒸发来浓缩粗产物。在通过使用EtOAc:己烷作为流动相的快速色谱法进行纯化后，获得产物(28)，以26％产率(5.6g)，参见图13。1H NMR(CDCl3):δH 7.67-7.70(m,4H),7.37-7.47(m,6H),4.81(s,2H),3.81(t,J＝6.73Hz,2H),3.70(t,J＝6.21Hz,2H),3.59(t,J＝6.55,2H),1.90(t,J＝6.95Hz,2H),1.58-1.77(m,4H),1.34(s,6H),和1.07(s,9H)ppm。
实施例14
化合物29的合成
将化合物28(5.1g，10.36mmol)溶解在处于500mL圆底烧瓶中的100mL无水吡啶中。向该溶液一次性添加1,1′-羰基二咪唑(CDI)(3.36g，20.7mmol)并且将该反应体系在氮气氛中在室温下搅拌1.0小时。然后，将反应混合物倒入由2,2’-(亚乙二氧基)双(乙胺)(7.6mL，51.8mmol)和无水吡啶(50mL)组成的溶液之中。将混合物在室温下搅拌1.0小时，并且通过旋转蒸发来去除挥发性物质。通过使用MeOH:CH2Cl2/9.5:0.5的硅胶快速色谱法来纯化所得的粗产物，从而提供纯的化合物29(4.4g，65％产率)，参见图13。1H NMR(CDCl3):δH7.63-7.68(m,4H),7.34-7.44(m,6H),4.76(s,2H),4.17(t,J＝7.07Hz,2H),3.65(t,J＝6.16Hz,2H),3.60(s,4H),3.49-3.51(m,6H),3.31-3.39(m,2H),2.88(m,2H),1.9(t,J＝7.06Hz,2H),1.57-1.73(m,4H),1.31(s,6H)和1.03(s,9H)ppm。
实施例15
化合物31的合成
在氮气氛中在0℃下将化合物29(0.94g，1.42mmol)溶解在40mL无水THF中并且用在THF(1.6mL，1.6mmol)中的1M TBAF进行处理。将反应混合物在0℃下搅拌2.0小时，在此时间期间LC-MS确认了TBDPS保护基团的完全去除。在通过旋转蒸发去除溶剂后，通过在C18Flash柱上的快速色谱法(梯度：在50分钟内0-100％B，其中A＝50mM TEAB和B＝乙腈)来纯化产物。合并靶级分并进行冻干，这导致纯的化合物30(0.284g，47％产率)。MS(ES+)：关于(M+H)计算出的，429.21，观测到的m/z，429.18。接着，在氮气氛中将化合物30(0.217g，0.51mmol)溶解在13mL无水乙腈中。在0℃温度下向该溶液添加DIPEA(97.7uL，0.56mmol)和Fmoc-NHS酯(273.6mg，0.81mmol)并且在相同温度下搅拌2.0小时。然后，通过硅胶快速色谱法(1:1至1:9/hex:EtOAc梯度)来纯化产物，这导致半纯的产物，将其通过使用2-5％/MeOH-CH2Cl2梯度来进一步进行纯化，从而获得化合物31(0.245g，74％产率)，参见图13。1H NMR(CDCl3):δH 7.70(2H,d,J＝7.3Hz),7.59(2H,d,J＝7.6Hz),7.32(2H,m),7.24(2H,m),4.69(2H,s),4.35(2H,m),4.16(1H,m),4.09(2H,m),3.60-3.45(12H,m),3.36-3.26(4H,m),1.82(2H,m),1.60(4H,m)和1.22(6H,s)ppm。
实施例16
化合物32的合成
将化合物31(93mg，0.143mmol)溶解在处于配备有磁力棒和氮气源的圆底烧瓶中的无水乙腈(12.0mL)中。向该溶液顺次添加DSC(56mg，0.21mmol)和DIPEA(37.4μL，0.21mmol)，并且将所得的混合物在室温下搅拌5.0小时。添加额外的DSC(48mg，0.18mmol)和DIPEA(37.4μL，0.21mmol)并且在室温下继续搅拌15.0小时，在该时间期间TLC显示了完全转化为经活化的NHS酯。在使用己烷-乙酸乙酯(3:7至1:9)梯度的硅胶快速色谱法纯化后作为粘稠的油而获得产物32(59mg，53％产率)并且将其用于下一个步骤，参见图13。1H NMR(CDCl3):δH 7.70(2H,d,J＝7.53Hz),7.53(2H,d,J＝7.3Hz),7.33(2H,m),7.24(2H,m),4.69(2H,s),4.34(2H,m),4.28(2H,m),4.16(1H,m),4.09(2H,m),3.57-3.46(10H,m),3.35-3.26(4H,m),2.75(4H,s),1.74(4H,m),1.62(2H,m)和1.23(6H,s)ppm。
实施例17
化合物34的合成
在15mL离心管中将化合物33(其是按照参考文献US2013/0137091A1来合成的)的等分试样(10μmol)冻干至干燥。然后，将它重悬浮在1.0mL的具有60μmol DIPEA的无水DMF中。在分开的管中，将化合物32(30μmol，3当量)溶解在3.33mL无水DMF中，并且一次全部添加。该反应体系通过用手剧烈摇动来充分混合并且在室温下放置在摇动器上12小时。接着，添加哌啶(0.33mL)并且在室温下继续摇动30分钟。然后，通过使用C18柱的HPLC(梯度：在40分钟内0-70％B，其中A＝50mM TEAB和B＝乙腈)来纯化产物。在冻干靶级分后获得产物34，以73.3％产率(7.33umol)，参见图13。
实施例18
化合物35的合成
将化合物34的等分试样(4.9μmol)溶解在处于15mL离心管中的1.0mL蒸馏水和0.5M Na2HPO4(0.49mL)中。在分开的管中，将10mg的5-CR6G-NHS酯(17.9μmol)溶解在0.9mL无水DMF中。然后，将该溶液一次全部添加至反应混合物并且在室温下搅拌6.0小时。然后，用50mM TEAB(25mL)稀释反应混合物。通过HPLC C18(梯度：在70分钟内0-60％B)来纯化产物。在冻干靶级分后获得化合物35(2.15μmol，44％产率，以～98％纯度，通过HPLC)，并且通过MS(ES+)来确认结构：关于(M-H)C58H76N10O25P3S2 -计算出的，1469.36，测得的m/z，1469.67，参见图13。
类似地，遵照对于化合物35所描述的相似程序来合成dATP、dCTP和dGTP的类似物，并且通过HPLC和LC-MS来进行表征，这导致全套的A-系列(98、100、101和102，图45)。对于dATP类似物，关于(M-H)C66H83N12O23P3S2计算出的，1,568.4348，测得的m/z，1,568.4400；对于dCTP类似物，关于(M-H)C52H65N11O30P3S4计算出的，1,545.2070，测得的m/z，1,545.2080；和对于dGTP类似物，关于(M-H)C66H93N12O27P3S4计算出的，1,706.4369，测得的m/z，1,706.4400。在另一个方面，本发明涉及如在关于dATP类似物的化合物43中那样具有可切割的连接体的核苷酸，其中所述可切割的二硫化物的侧翼为偕二甲基基团并且所述连接体通过脲基团(-NH(C＝O)NH-)附着至PA-核苷酸。所述化合物可以按照图14(关于dATP类似物)来进行合成。对于其他核苷酸类似物(例如，对于dCTP、dGTP、dUTP的类似物)，可以通过在该反应顺次程序的最后一步中用合适的PA-类似物替代42而类似地合成它们。
实施例19
化合物37的合成
在1L配备有搅拌棒的圆底烧瓶中，在室温下将5-(fmoc-氨基)-1-戊醇(36，20g，62mmol)溶解在DMSO(256mL)中。向该溶液顺次添加AcOH(43mL)和Ac2O(145mL)。将烧瓶用橡胶隔片封闭，放置在N2中，并且在室温下搅拌20小时。通过TLC来确认反应完成。然后，将反应混合物转移至3L烧杯并且用水洗涤烧瓶。将烧杯在冰浴中冷却并且用50％饱和K2CO3(400mL)来中和反应混合物30分钟。将混合物转移至分液漏斗并且用EtOAc(2x 700mL)进行萃取。然后，用50％饱和K2CO3(2x 400mL)洗涤有机相，通过Na2SO4进行干燥，过滤，并且在真空中进行浓缩。通过硅胶色谱法(在20分钟内0至20％B，A＝Hex，B＝EtOAc)来纯化粗油。级分的收集和浓缩产生作为白色固体的化合物37(17.77g，75％)，参见图14。1H NMR(CDCl3):δH 7.79(d,J＝7.33,2H),7.63(d,J＝7.83,2H),7.441(t,J＝7.33,2H),7.357(t,J＝7.58,2H),4.803(bs,1H),4.643(s,2H),4.43(d,J＝6.82,2H),4.24(t,J＝6.82,1H),3.54(t,J＝6.32,2H),3.251(m,1H),2.167(s,3H),1.657-1.550(m,4H),和1.446-1.441(m,2H)ppm。
实施例20
化合物38的合成
在N2中将化合物37(2.77g，7.2mmol)溶解在处于配备有搅拌棒和隔片的250mL圆底烧瓶中的DCM(60mL)中。向烧瓶添加三乙胺(3.0mL，21.6mL，3当量)和分子筛(28g)。将悬浮液在室温下搅拌10分钟，随后为在冰浴中30分钟。向烧瓶添加SO2Cl2(在DCM中的1M溶液，14.4mL，14.4mmol，2当量)并且将反应混合物在冰浴中搅拌1小时。经由TLC(1:1Hex:EtOAc)通过起始材料的消失来监测反应进程。一旦SO2Cl2活化完成，就快速地添加在DMF(60mL)中的硫代甲苯磺酸钾(2.45g，10.8mmol，1.5当量)的溶液。允许反应混合物缓慢地升温至室温1小时。然后，给烧瓶装载3-巯基-3-甲基丁醇(1.8mL，14.4mmol，2当量)并且在室温下搅拌1小时。将反应混合物过滤并且在40℃下在真空中进行浓缩。通过FCC(在30分钟内0至50％B，A＝Hex，B＝EtOAc)的纯化提供了作为黄色油的38(482mg，14％)，参见图14。1HNMR(CDCl3):δH 7.76(d,J＝7.81,2H),7.59(d,J＝7.32,2H),7.40(t,J＝7.32,2H),7.31(t,J＝7.32,2H),4.87(bs,1H),4.79(s,2H),4.40(d,J＝6.84,2H),4.21(t,J＝6.84 1H),3.78(t,J＝6.84,2H),3.57(t,J＝6.35,2H),3.20(m,2H),1.88(t,J＝6.84,2H),1.64-1.50(m,4H),1.42-1.39(m,2H)和1.32(s,6H)ppm。
实施例21
化合物39的合成
在50mL圆底烧瓶中将化合物38(135mg，0.275mmol)在真空中干燥2小时。去除真空并且将烧瓶放置在N2中。将化合物38溶解在DMF(3.1mL)中并且给烧瓶装载DIPEA(96μL，0.55mmol，2当量)。将溶液搅拌10分钟，然后作为固体以一剂方式添加DSC(120mg，0.468mmol，1.7当量)。允许反应混合物搅拌2小时并且通过TLC(1:1Hex:EtOAc)来验证完成。然后，将反应体系在35℃下在真空中进行浓缩并且在高真空中进一步干燥1小时。将粗油加载到硅胶上并且通过FCC(在14分钟内0至50％B，A＝hex，B＝EtOAc)来进行纯化。级分通过TLC来进行检查并进行浓缩，从而提供作为油的化合物39(133mg，76％)，其随时间而结晶，参见图14。1H NMR(CDCl3):δH 7.78(d,J＝7.58,2H),7.61(d,J＝7.58,2H),7.42(t,J＝7.58,2H),7.33(t,J＝7.58,2H),4.87(bs,1H),4.80(s,2H),4.48(t,J＝7.07,2H),4.44(d,J＝6.82,2H),4.24(t,J＝7.07,1H),3.58(t,J＝6.32,2H),3.22(m,2H),2.83(s,4H),2.08(m,2H),1.649-1.562(m,4H),1.443-1.390(m,2H)和1.366(s,6H)ppm。
实施例22
化合物40的合成
将2,2′-(亚乙二氧基)双(乙胺)(92μL，635μmol，10当量)和三乙胺(176μL，1270μmol，20当量)溶解在DMF(10mL)中。还制备了分开的在DMF(2.7mL)中的6-ROX,NHS酯(40mg，64umol，1当量)的溶液。向包含二胺的快速搅拌的溶液逐滴添加所述6-ROX,NHS酯溶液。将反应体系搅拌2小时并且通过C18HPLC-MS(在10分钟内0至100％B，A＝50mM TEAB，B＝MeCN)来监测进程。一旦完成，就通过制备型C18-HPLC(在50分钟内10至100％B，A＝50mM TEAB，B＝MeCN)来纯化反应体系。将级分合并并冻干，从而产生作为紫红色固体的化合物40(20mg，48％)，参见图14。MS(ES-)：关于(M-H)C39H45N4O6计算出的，664.33，测得的m/z，664.56。
实施例23
化合物41的合成
将化合物40(10mg，15μmol)溶解在DMF(1mL)中并装载DIPEA(8μL，45μmol，3当量)。分开地，将化合物39(28mg，45μmol，3当量)溶解在DMF(0.21mL)中。将化合物39的溶液快速地添加至具有化合物40的溶液。将反应体系放置在摇动器板上1.5小时，在该时间处，分析型C18-HPLC(在10分钟内0-100％B，A＝50mM乙酸盐缓冲液，pH 5.2，B＝MeCN)揭示出剩余的化合物40。添加额外的化合物39(13mg，21μmol，1.4当量)并且将反应体系放置在摇动器板上额外的一个小时。没有另外的分析法，添加哌啶(300μL)并允许反应10分钟。然后，将反应混合物直接注射到制备型C18-HPLC(在50分钟内10-100％B，A＝50mM TEAB，B＝MeCN)上。将级分收集并冻干，从而产生作为紫红色固体的化合物41(4.7mg，34％)，参见图14。MS(ES+)：关于(M+H)C51H68N5O9S2 +计算出的，959.45，测得的m/z，959.76。
实施例24
化合物43的合成
给5mL样品小瓶装载胺41(2mg，2μmol)、DSC(0.8mg，3μmol，1.5当量)、DIPEA(0.7μL，4μmol，2当量)和N,N-二甲基甲酰胺(1.7mL)。将反应混合物放置在摇动器上1小时。通过C18-HPLC(在10分钟内0至100％B，A＝50mM乙酸盐缓冲液，pH 5.2，B＝MeCN)来监测反应进程。随后，添加在0.1Na2HPO4(3.3mL)中的核苷酸42(6umol，3当量，参考文献US 2013/0137091A1)并且将反应混合物放置在摇动器上过夜。接着，将反应体系用水进行稀释并且通过制备型C18-HPLC(在70分钟内0至60％B，A＝50mM TEAB，B＝MeCN)来进行纯化，从而给出标题化合物43(0.5μmol，25％)，参见图14。MS(ES-)：关于(M-H)C67H87N13O22P3S2计算出的，1581.47，测得的m/z，1581.65。
实施例25
在另一个方面，所述可切割的连接体可以为化合物45，其中所述连接体通过脲官能度而系缚至PA-核苷酸并且所述二硫化物通过二碳连接体而联接至所述染料。所得的核苷酸类似物在这种情况下可以是如在化合物49(dGTP类似物)(其可以按照图15来合成)中那样。其他核苷酸类似物(例如，dATP、dUTP、dCTP的类似物)可以通过在该反应顺次程序的第三步中用合适的PA-类似物替代核苷酸46而类似地合成。
实施例26
化合物44的合成
给配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装载在CH2Cl2中的37(1.00g，2.59mmol)、分子筛和三乙胺(0.72mL，5.18mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟并冷却至0℃。缓慢地添加硫酰氯(4.40mL，4.40mmol)并且将所得的混合物在0℃下搅拌1小时。使用在己烷中的20％乙酸乙酯的TLC分析表明了起始材料的消失，并且在0℃下一次性添加在N’,N’-二甲基甲酰胺(5mL)中的苯硫代磺酸钠盐(648mg，3.89mmol)的溶液并且将反应混合物在室温下搅拌20分钟。接着，一次性添加N-(三氟乙酰氨基)乙硫醇(896mg，5.18mmol)并且将所得的混合物在室温下搅拌30分钟。过滤掉分子筛并且在减压下去除溶剂并且将残留物通过使用0-20％乙酸乙酯-己烷梯度的硅胶柱色谱法来进行纯化，从而给出作为微黄色油的标题化合物44(529mg，39％)，参见图15。1H NMR(CDCl3):δH 7.76(d,J＝7.52Hz,2H),7.57(d,J＝7.50Hz,2H),7.40-7.38(m,2H),7.30-7.25(m,2H),4.82(s,2H),4.42(d,2H),4.21-4.20(m,1H),3.70-3.67(m,2H),3.59-3.55(m,2H),3.17-3.16(m,2H)和1.64-1.40(m,6H)ppm。
实施例27
化合物45的合成
在室温下给配备有磁力搅拌棒的25mL圆底烧瓶装载氨基甲酸酯44(100mg，0.184mmol)和1mL的在N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶溶液。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后用乙腈(5mL)进行稀释并且通过使用0-30％乙腈-TEAB缓冲液梯度的反相制备型HPLC来进行纯化，从而给出作为清澈的油的标题化合物45(11mg，20％)，参见图15。1HNMR(400MHz,CD3OD)δH 4.90(s,2H),3.64-3.60(m,2H),3.32(s,2H),2.98-2.93(m,2H),2.86-2.82(m,2H),1.66-1.60(m,2H),1.50-1.48(m,2H)和1.33-1.30(m,2H)ppm。
实施例28
化合物47的合成
给5mL样品小瓶装载胺45(0.960mg，3.0μmol)、DSC(1.15mg，4.5μmol)和三乙胺(60μL，6.0μmol)并且在室温下摇动2小时。然后，添加由在N,N-二甲基甲酰胺中的以200μL的3当量的核苷酸46(参考文献：US 2013/0137091A1)组成的溶液。将反应混合物放置在摇动器上12小时。接着，将反应体系用TEAB缓冲液进行稀释并且通过使用0-30％乙腈:50mM TEAB缓冲液梯度的制备型反相HPLC来进行纯化，从而给出标题化合物47(以14％产率)，参见图15。MS(ES-)：关于(M-H)C26H37F3N10O16P3S2 -计算出的，959.10，测得的m/z，959.24。
实施例29
化合物48的合成
在室温下将核苷酸47(1μmol)溶解在TEAB缓冲液(200μL的50mM水溶液)中并且用200μL的氢氧化铵(30％水溶液)处理50分钟。然后，用TEAB缓冲液(1mL的1M溶液)和蒸馏水(5mL)稀释反应体系。通过C18-HPLC(0-30％乙腈:50mM TEAB缓冲液梯度)来纯化所得的混合物，从而提供标题化合物48(0.40μmol，90％)，参见图15。MS(ES-)：关于(M-H)C24H38N10O15P3S2 -计算出的，863.12，测得的m/z，863.45。
实施例30
化合物49的合成
将化合物48的等分试样(0.04μmol)溶解在处于3mL eppendorf管中的0.1mL蒸馏水和0.5M Na2HPO4(20μL)中。在分开的管中，将1mg的ROX-NHS酯(0.168μmol)溶解在48μL无水DMF中。然后，将该溶液一次全部添加至反应混合物并且在室温下搅拌6.0小时。然后，用50mM TEAB(5mL)稀释反应混合物。通过C18-HPLC(其使用0-60％B梯度，A＝50mM TEAB，B＝乙腈)来纯化产物。在冻干靶级分后获得化合物49(0.03μmol，30％产率)，参见图15。MS(ES-)：关于(M-H)C57H67N12O19P3S2 -计算出的，1380.33，测得的，1380.25。
与经常规二硫化物连接的核苷酸的切割比较
将在本文中所公开的包含可切割的氧亚甲基二硫化物(-OCH2-SS-)连接体的该新类别的核苷酸与经常规二硫化物(-SS-)连接的核苷酸(例如，核苷酸50，其描述在美国专利申请2013/0137091[48]中)在基于还原性膦的切割条件下进行比较。观察到在这两个类别的核苷酸之间的鲜明的差异。当将经标记的核苷酸50在65℃下暴露于10当量的TCEP时，它产生许多副产物，包括化合物52，连同所期望的产物51一起，其通过LC-MS来鉴定(图16，和图17A&B，5分钟暴露)。不想要的副产物的比例随时间而增加(图18A&B，15分钟暴露)。在相同的切割条件下，经氧亚甲基二硫化物连接的核苷酸35干净地产生所希望的切割产物，化合物53和54。在二硫化合物基团的切割后，所述连接体的亚甲基硫羟基区段(-CH2SH)被从核苷酸中完全消除(图20A&B和图21A&B，5分钟暴露)。另外，延长的对于TCEP的暴露不产生进一步的副产物，如通过LC-MS所揭示的(图22，15分钟暴露)。因此，该新类别的核苷酸可以通过消除对于硫羟基基团的存在来说固有的副反应而在DNA边合成边测序(SBS)的使用中提供显著的优点，如在图4中所显示的。
实施例31
化合物57的合成
在另一个实施方案中，可以用-CH2-SS-Et或-CH2-SS-Me来对核苷酸的3’-OH基团进行加帽，并且通过前面所描述的可切割的-OCH2-SS-连接体之一将荧光团染料附着至核碱基(例如，如在化合物35、43和49中)。
具有3’-OCH2-SS-Et和-OCH2-SS-Me的PA核苷酸的合成可以分别按照图10和图22来实现。3’-OCH2-SS-Me类似物的合成与3’-OCH2-SS-Et的合成(图10)的差异是在适当的步骤处用甲硫醇或甲硫醇钠替代巯基乙醇(EtSH)，如在图22中所显示的。在所有可能的3’-O-CH2-SS-R类似物中，-OCH2-SS-Me基团是最小的结构。因此，在酶促掺入率和通过还原试剂例如TCEP的可切割性方面，具有3’-OCH2-SS-Me加帽基团的核苷酸类似物应当比其他类似物的那些表现更好。
接着，如在图23中所显示的，可以通过使用经活化的连接体32将所得的PA-核苷酸(例如，57)与合适的可切割的-OCH2-SS-连接体相偶联，并最终与荧光团染料相偶联。并且，通过使用合适的PA-核苷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP的PA类似物)和经NHS活化的染料(Alexa488-NHS、ROX-NHS、Cy5-NHS酯等)，可以类似地合成具有不同染料的其他核苷酸，从而实现用不同荧光团报告基团进行标记的核苷酸类似物。
实施例32
可以遵照所描述的实验方案来实现具有不同连接体的核苷酸类似物，如在化合物60和61的合成中所显示的(图24)。
可以类似地合成具有可切割的连接体-OCH2-SS-但在链长和α-碳处的取代方面不同的多种多样的3’-OCH2-SS-Et和3’-OCH2-SS-Me核苷酸的组。所得的核苷酸类别显示在图25、图26和图27中。在图25中所显示的核苷酸之中，所述可切割的连接体的侧翼为附着至柔韧的乙二醇连接体的稳定化偕二甲基基团并且通过氨基甲酸酯官能团(-NH-C(C＝O)-O-)附着至PA-核碱基，而在图26中，氨基甲酸酯基团被脲基团(-NH-C(C＝O)-NH-)替代。在另一方面，在图27中所显示的核苷酸之中，所述二硫化物基团附着至伯碳链，并且通过脲官能团而系缚至PA-核碱基。
实施例33
化合物64的合成
给250mL圆底烧瓶装载化合物62(3.0g，4.58mmol)、25mL无水CH2Cl2、分子筛(5.0g)和环己烯(0.55mL，5.4mmol)。将所得的混合物在氮气氛中在室温下搅拌10分钟。然后，将反应烧瓶放置在冰浴上并且通过注射器缓慢地添加SO2Cl2(6.8mL，在CH2Cl2中1M，1.5当量)，并且在0℃下搅拌1小时。接着，添加额外的0.5当量的SO2Cl2以确保完全转化为化合物63。在将温度保持在接近10℃的同时，在真空中去除挥发性物质。将所得的固体重悬浮在20mL无水DMF中并保持在氮气氛中。
在分开的烧瓶中，将(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(2.45g，11.44mmol)在氮气氛中溶解在无水DMF(30mL)中，并且用NaH(274.5mg，在油中60％)进行处理，从而产生灰色浆状物。向此一次添加化合物63并且在氮气氛中在室温下搅拌3小时。然后，在漏斗中将反应混合物通过(20g)进行过滤，用EtOAc(100mL)洗脱出产物。然后，用蒸馏水(2X100mL)洗涤EtOAc溶液。将EtOAc萃取物通过Na2SO4进行干燥，通过旋转蒸发进行浓缩，并且通过快速色谱法(柱：120g RediSepRfGold，梯度：80％Hex至50Hex:EtOAc)来进行纯化。参见图43。作为白色固体而获得靶化合物(64)(1.2g，32％产率，Rf：0.4，Hex:EtOAc/3:2)。1HNMR(CDCl3):δH 8.13(m,3H),7.43(m,1H),7.32(m,2H),6.12(m,1H),6.00(s,2H),4.62(m,2H),4.31(m,3H),4.00(m,1H),3.82-3.60(m,13H),2.39(m,1H),1.84(m,1H),0.78(m,9H),和0.01(m,6H)ppm。
实施例34
化合物65的合成
将化合物64(1.2g，1.46mmol)在干燥器中在高真空中用P2O5干燥过夜并且溶解在处于配备有磁力搅拌器的100mL烧瓶中的30mL无水CH2Cl2中。向此添加二甲基二硫醚(0.657mL，7.3mmol)，并且将反应烧瓶放置在冰浴上。然后，添加四氟硼酸二甲基(甲硫基)锍(DMTSF，316mg，1.1当量)并且在0℃下搅拌1.5小时。将反应混合物转移至250mL分液漏斗并且用50mL的0.1M NaHCO3水溶液进行中和，并且用CH2Cl2(2X 50mL)进行萃取，参见图43。将有机部分通过Na2SO4进行干燥，并且通过旋转蒸发进行浓缩。使用梯度80-50％Hex-EtOAc在硅胶柱(80g RediSepRf gold)上纯化粗产物，从而导致0.82g的化合物65(82％产率，Rf＝0.5，Hex:EtOAc/3:2)。1H NMR(CDCl3):δH 8.15(m,3H),7.42(m,1H),7.35(m,2H),6.11(m,1H),4.80-4.65(m,2H),4.34(m,1H),4.28(m,2H),4.10(m,1H),3.83-3.67(m,2H),2.49(m,1H),2.34(s,3H),1.90(m,1H),0.78(m,9H),和0.10(m,6H)ppm。
实施例35
化合物66的合成
在氮气氛中给配备有磁力搅拌器的圆底烧瓶装载化合物65(0.309g，0.45mmol)和10.0mL无水CH2Cl2(10.0mL)并且放置在冰浴上。通过注射器缓慢地添加TBAF(0.72mL，0.72mmol，在1M溶液中)。将反应混合物在0℃下搅拌3小时。然后，将反应混合物转移至分液漏斗并且用0.5M NaHCO3溶液(50mL)进行猝灭。将所得的混合物用EtOAc(2X 100mL)进行萃取并且通过Na2SO4进行干燥。在使用梯度7:3至2:3Hex:EtOAc的在40g RediSepRf柱上的硅胶柱色谱法后，作为白色粉末而获得产物66，以76％产率(196mg，Rf＝0.3，Hex:EtOAc/1:1)。参见图43。1H NMR(CDCl3):δH 8.40(s,1H),8.25(m,2H),7.60(m,1H),7.52(m,2H),6.21(m,1H),4.90-80(m,2H),4.65(m,1H),4.40(m,2H),4.25(m,1H),4.05-3.85(m,2H),2.62(m,1H),2.50(s,3H)和2.31(m,1H)ppm。
通过标准的三磷酸酯合成方法(关于细节，参见化合物5的合成和参见图8)在使化合物66磷酸化后获得产物67(关于67，通过关于C14H23N4O13P3S2的LC-MS m/z(M-H)611.19来确认)。按照对于在图13、图14和图15中所呈现的化合物所描述的程序，将它进一步转化为经染料标记的产物。
实施例36
化合物70的合成
将化合物68(7.3g，13.8mmol)在干燥器中干燥过夜并且在N2气氛中溶解在处于配备有搅拌棒和橡胶隔片的干的500mL圆底烧瓶中的无水DCM(70mL)中。向反应混合物添加环己烯(1.54mL，15.2mmol，1.1当量)和无水分子筛(16.6g)并且将所得的悬浮液在冰-水浴中在0℃下搅拌20分钟。接着，添加SO2Cl2(在DCM中的1M溶液，32.7mL，2.36当量)并且将所得的混合物在0℃下搅拌1小时。经由TLC(100％EtOAc)通过起始材料的消失来监测反应进程。一旦SO2Cl2活化完成，就制备在DMF(120mL)中的(MeO)3BnSH(7.4g，34.5mmol，2.5当量)和NaH(1.32g，33.12mmol，在矿物油中60％)的混合物并且一次性快速地添加。允许反应体系缓慢地升温至室温并且搅拌1小时。将反应混合物过滤并且在40℃下在真空中进行浓缩。通过硅胶柱色谱法(用0至60％乙酸乙酯:己烷梯度洗脱15分钟，随后为60％乙酸乙酯:己烷45分钟)进行的纯化提供了作为清澈的油的所希望的化合物70(4.2g，43.7％产率)。参见图44。1H NMR(CDCl3):δH 8.72(s,1H),8.31(s,1H),7.94(m,2H),7.52(m,1H),7.44(m,2H),6.41(m,1H),6.03(s,2H),4.67(s,2H),4.50(m,1H),4.10(m,1H),3.73(m,13H),2.52(m,2H),0.81(s,9H)和0.002(d,6H)ppm。
实施例37
化合物71的合成
将化合物70(2g，2.87mmol)在N2气氛中溶解在处于配备有搅拌棒和橡胶隔片的200mL圆底烧瓶中的无水DCM(38mL)中并且在冰-水浴上进行冷却。向该混合物添加二甲基二硫醚(1.3mL，14.36mmol，5当量)，随后为一次性添加作为在DCM(20mL)中的溶液的DMTSF(620mg，3.15mmol，1.1当量)。允许所得的混合物缓慢地升温至室温，然后搅拌额外的4小时。将反应体系通过添加饱和NaHCO3水溶液(100mL)来进行猝灭，用DCM(150mL x 2)和EtOAc(200mL)进行萃取，通过Na2SO4进行干燥，并且在真空中进行浓缩。通过硅胶柱色谱法(用0至60％乙酸乙酯:己烷梯度洗脱15分钟，随后为60％乙酸乙酯:己烷45分钟)进行的纯化提供了作为白色粉末的所希望的化合物71(1g，62％产率)。参见图44。1H NMR(CDCl3):δH8.69(s,1H),8.24(s,1H),7.94(m,1H),7.51(m,1H),7.42(m,2H),6.41(m,1H),4.82(m,2H),4.57(m,1H),4.15(m,1H),3.77(m,2H),2.61(m,2H),2.40(s,3H),0.81(s,9H)和0.00(d,6H)ppm。
实施例38
化合物72的合成
将化合物71(562mg，1.25mmol)在N2气氛中溶解在处于配备有搅拌棒和橡胶隔片的100mL圆底烧瓶中的无水THF(30mL)中并且在冰-水浴上进行冷却。然后，逐滴添加TBAF(1.5mL的在THF中的1M溶液，1.5当量)并且在0℃下搅拌2小时。通过TLC(100％乙酸乙酯，关于化合物72的Rf＝0.205，关于化合物71的Rf＝0.627)来监测反应进程。在反应完成后添加甲醇(5mL)，在旋转蒸发器上浓缩反应体系，并且通过硅胶柱色谱法(用0至60％乙酸乙酯:己烷梯度洗脱15分钟，随后为60％乙酸乙酯:己烷45分钟)来纯化残留物，从而提供作为白色粉末的所希望的化合物72(280mg，62％产率)。参见图44。1H NMR(CDCl3):δH 8.69(s,1H),8.02(s,1H),7.95(m,2H),7.53(m,1H),7.44(m,2H),6.25(m,1H),4.83(m,2H),4.70(m,1H),4.29(m,1H),3.93(m,1H),3.74(m,1H),2.99(m,1H),2.43(s,3H)和2.41(m,1H)ppm。
然后，遵照前面所描述的标准三磷酸酯合成(参见图8中的化合物5的合成)将化合物72转化为三磷酸酯73。
实施例39
化合物108的合成
在氮气氛中给配备有搅拌棒的1L圆底烧瓶装载在100mL无水吡啶中的1,4-丁二醇(18.3g，203.13mmol)并且冷却至0℃。然后，通过注射器逐滴添加叔丁基二苯基甲硅烷基氯(13.8mL，70mmol)，允许反应体系逐渐升温至室温，并且在室温下继续搅拌12小时。通过旋转蒸发来去除挥发性物质并且将残留物吸收到80克的硅胶上。通过使用30至50％在己烷中的乙酸乙酯梯度的硅胶快速柱色谱法进行的纯化导致4-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-丁烷-1-醇，108(13.7g，59.5％产率，Rf＝0.7，以1:1/己烷:乙酸乙酯)。1H NMR(CDCl3):δH7.70(m,4H),7.40(m,6H),3.75(m,2H),3.65(2H,m),1.70(m,4H),1.09(m,9H,)ppm。在图53中图解说明了该合成。
实施例40
化合物109的合成
给配备有磁力搅拌棒的250mL圆底烧瓶装载化合物108(6.07g，18.5mmol)和90mL无水DMSO。顺次添加乙酸(15mL)和乙酸酐(50mL)，并且将反应体系在室温下搅拌20分钟，转移至分液漏斗，并在300mL蒸馏水和300mL乙酸乙酯之间进行分配。然后，将有机层转移至1L烧杯并且使用饱和K2CO3水溶液(500mL)进行中和。将有机层用蒸馏水(3x 300mL)进行洗涤并且通过MgSO4进行干燥。在减压下去除挥发性物质并且通过硅胶快速柱色谱法(己烷:乙酸乙酯/97:3至90:10)来纯化残留物，从而获得4-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-1-O-(甲硫基甲基)-丁烷，109(5.15g，71.7％产率，Rf＝0.8，在9:1/己烷:乙酸乙酯中)。1H NMR(CDCl3):δH 7.70(m,4H,),7.40(m,6H),4.62(s,2H),3.70(m,2H),3.50(m,2H,),2.15(s,2H),1.70(m,4H),1.08(m,9H)ppm。在图53中图解说明了该合成。
实施例41
化合物110的合成
给配备有磁力搅拌棒的1L圆底烧瓶装载化合物109(15.5g，40mmol)、无水二氯甲烷(450mL)、分子筛(80g)和三乙胺(5.6mL)并且将反应体系在氮气氛中在0℃下搅拌30分钟。接着，通过注射器缓慢地添加SO2Cl2(64mL的在二氯甲烷中的1M溶液)并且在0℃下搅拌1小时。然后，移去冰浴，并且一次添加在20mL无水DMF中的硫代甲苯磺酸钾(10.9g，48.1mmol)的溶液。将所得的混合物在室温下搅拌20分钟，一次添加至2L圆底烧瓶(其包含有在DMF(20mL)中的3-巯基-3-甲基丁烷-1-醇(4.4mL，36mmol)的溶液)。将反应体系在室温下搅拌30分钟，然后通过celite-S进行过滤。将产物在等量的乙酸乙酯和水之间进行分配。在分液漏斗中用蒸馏水洗涤有机萃取物，随后为通过旋转蒸发来浓缩粗产物。通过使用乙酸乙酯:己烷梯度的硅胶快速柱色谱法进行的纯化给出标题化合物110(5.6g，26％)。1HNMR(CDCl3):δH 7.67-7.70(m,4H),7.37-7.47(m,6H),4.81(s,2H),3.81(t,J＝6.73Hz,2H),3.70(t,J＝6.21Hz,2H),3.59(t,J＝6.55,2H),1.90(t,J＝6.95Hz,2H),1.58-1.77(m,4H),1.34(s,6H),和1.07(s,9H)ppm。在图53中图解说明了该合成。
实施例42
化合物111的合成
在氮气氛中给配备有磁力搅拌棒的500mL圆底烧瓶装载化合物110(5.1g，10.36mmol)、无水吡啶(100mL)和1,1′-羰基二咪唑(CDI)(3.36g，20.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时并且倒入在无水吡啶(50mL)中的2,2’-(亚乙二氧基)双(乙胺)(7.6mL，51.8mmol)的溶液之中。继续搅拌1小时并且通过旋转蒸发来去除挥发性物质。通过硅胶快速柱色谱法(其使用0-15％在CH2Cl2中的甲醇)来纯化所得的粗产物，从而提供化合物111(4.4g，65％产率)。1H NMR(CDCl3):δH 7.63-7.68(m,4H),7.34-7.44(m,6H),4.76(s,2H),4.17(t,J＝7.07Hz,2H),3.65(t,J＝6.16Hz,2H),3.60(s,4H),3.49-3.51(m,6H),3.31-3.39(m,2H),2.88(m,2H),1.9(t,J＝7.06Hz,2H),1.57-1.73(m,4H),1.31(s,6H)和1.03(s,9H)ppm。在图53中图解说明了该合成。
实施例43
化合物113的合成
在氮气氛中在0℃下给配备有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶装载化合物111(0.94g，1.42mmol)、无水THF(40mL)和TBAF(1.6mL的在THF中的1M溶液，1.6mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌2.0小时，在该时间期间LC-MS显示了TBDPS保护基团的完全去除。在旋转蒸发器上去除挥发性物质后，通过硅胶快速色谱法(0-5％在二氯甲烷中的甲醇梯度)来纯化产物，从而给出纯的化合物112(0.284g，47％产率)。MS(ES+)：关于(M+H)计算出的，429.21，观测到的m/z，429.18。
接着，将化合物112(0.217g，0.51mmol)在氮气氛中溶解在无水乙腈(13mL)中并冷却至0℃。添加DIPEA(97.7μL，0.56mmol)和Fmoc-NHS酯(273.6mg，0.81mmol)并且将反应体系在0℃下搅拌2小时。通过使用50至90％在己烷中的乙酸乙酯梯度的硅胶快速柱色谱法进行的纯化产生半纯的产物，其通过使用2-5％在CH2Cl2中的甲醇梯度的硅胶柱色谱法来进一步纯化，从而提供化合物113(0.245g，74％产率)。1H NMR(CDCl3):δH 7.70(2H,d,J＝7.3Hz),7.59(2H,d,J＝7.6Hz),7.32(2H,m),7.24(2H,m),4.69(2H,s),4.35(2H,m),4.16(1H,m),4.09(2H,m),3.60-3.45(12H,m),3.36-3.26(4H,m),1.82(2H,m),1.60(4H,m)和1.22(6H,s)ppm。在图53中图解说明了该合成。
实施例44
化合物114的合成
给配备有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶装载化合物7(170mg，0.26mmol)、无水乙腈(15mL)、DSC(100mg，0.39mmol)和DPIEA(68μL，0.39mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时并且添加额外的DSC(100mg，0.39mmol)和DIPEA(68μL，0.39mmol)。将所得的混合物在室温下搅拌12小时。通过TLC(关于起始材料的Rf＝0.4，产物Rf＝0.8，在9:1/乙酸乙酯:己烷中)来追踪反应进程。通过旋转蒸发来去除挥发性物质，并且通过3个连续的使用己烷-乙酸乙酯梯度的硅胶柱来纯化剩余的残留物，从而给出化合物114(121mg，59％产率)。1H NMR(CDCl3):δH 7.81(m,2H),7.63(m,2H),7.42(m,2H),7.33(m,2H),4.78(s,2H),4.43(m,2H),4.37(t,J＝7.65Hz,2H),4.25(m,2H),4.18(m,2H),3.67-3.55(m,10H),3.39(m,4H),2.84(s,4H),1.88(m,4H),1.73(m,4H),和1.32(s,6H)ppm。在图53中图解说明了该合成。
实施例45
化合物117的合成
给配备有磁力搅拌棒的500mL圆底烧瓶装载化合物68(7.3g，13.8mmol，在干燥器中预干燥过夜)、无水二氯甲烷(70mL)、环己烯(1.54mL，15.2mmol)和分子筛(16.6g)并且将所得的悬浮液在氮气氛中在0℃下搅拌20分钟。接着，添加SO2Cl2(在二氯甲烷中的1M溶液，32.7mL，2.36当量)并且将所得的混合物在0℃下搅拌1小时。通过TLC(100％乙酸乙酯)就起始材料的消失来监测反应进程。一旦SO2Cl2活化完成，就制备在DMF(120mL)中的(MeO)3BnSH(7.4g，34.5mmol，2.5当量)和NaH(1.32g，33.12mmol，在矿物油中60％)的混合物并且一次性快速地添加。允许反应体系缓慢地升温至室温并且搅拌1小时。将反应混合物过滤并且在40℃下在真空中进行浓缩。通过使用0至60％在己烷中的乙酸乙酯梯度的硅胶柱色谱法进行的纯化提供了作为清澈的油的所希望的化合物70(4.2g，43.7％产率)。1HNMR(CDCl3):δH 8.72(s,1H),8.31(s,1H),7.94(m,2H),7.52(m,1H),7.44(m,2H),6.41(m,1H),6.03(s,2H),4.67(s,2H),4.50(m,1H),4.10(m,1H),3.73(m,13H),2.52(m,2H),0.81(s,9H)和0.002(d,6H)ppm。在图54中图解说明了该合成。
实施例46
化合物71的合成
在N2气氛中给配备有磁力搅拌棒的200mL圆底烧瓶装载化合物117(2.0g，2.87mmol)和二氯甲烷(38mL)并且在冰-水浴上进行冷却。向该混合物添加二甲基二硫醚(1.3mL，14.36mmol，5当量)，随后为添加作为在二氯甲烷(20mL)中的溶液的DMTSF(620mg，3.15mmol，1.1当量)。允许所得的混合物缓慢地升温至室温并且搅拌额外的4小时。然后，将反应体系通过添加饱和NaHCO3水溶液(100mL)来进行猝灭，用二氯甲烷(150mL x 2)和乙酸乙酯(200mL)进行萃取，通过Na2SO4进行干燥，并且在真空中进行浓缩。通过硅胶柱色谱法(用0至60％在己烷中的乙酸乙酯梯度进行洗脱)进行的纯化给出作为白色粉末的所希望的化合物71(1.0g，62％)。1H NMR(CDCl3):δH 8.69(s,1H),8.24(s,1H),7.94(m,1H),7.51(m,1H),7.42(m,2H),6.41(m,1H),4.82(m,2H),4.57(m,1H),4.15(m,1H),3.77(m,2H),2.61(m,2H),2.40(s,3H),0.81(s,9H)和0.00(d,6H)ppm。在图54中图解说明了该合成。
实施例47
化合物119的合成
将化合物71(562mg，1.25mmol)在N2气氛中溶解在处于配备有搅拌棒和橡胶隔片的圆底烧瓶中的无水THF(30mL)中并且在冰-水浴上进行冷却。然后，逐滴添加TBAF(1.5mL的在THF中的1M溶液，1.5当量)并且在0℃下搅拌2小时。通过TLC(100％乙酸乙酯，关于化合物119的Rf＝0.2，关于化合物71的Rf＝0.6)来监测反应进程。在反应完成后，添加甲烷(5mL)，将反应体系在旋转蒸发器上进行浓缩，并且通过硅胶柱色谱法(用0至60％乙酸乙酯:己烷梯度洗脱15分钟，随后为60％在己烷中的乙酸乙酯45分钟)来纯化残留物，从而提供作为白色粉末的所希望的化合物119(280mg，62％产率)。1H NMR(CDCl3):δH 8.69(s,1H),8.02(s,1H),7.95(m,2H),7.53(m,1H),7.44(m,2H),6.25(m,1H),4.83(m,2H),4.70(m,1H),4.29(m,1H),3.93(m,1H),3.74(m,1H),2.99(m,1H),2.43(s,3H)和2.41(m,1H)ppm。
然后，通过使用标准的三磷酸酯合成方法(见下文)将化合物119转化为三磷酸酯120，除了通过用10％NH4OH在室温下处理5小时来进行去保护(以使-SSMe切割最小化)外。产率25％；HRMS-ES+：关于C12H20N5O12P3S2计算出的，582.976，观测到的m/z，582.975。在图54中图解说明了该合成。
实施例48
化合物123的合成
将化合物121(2.5g，4.94mmol)在干燥器中干燥过夜并且在N2气氛中溶解在处于配备有搅拌棒和橡胶隔片的干的圆底烧瓶中的无水二氯甲烷(25mL)中。向反应混合物添加环己烯(0.55mL，1.1当量)和无水分子筛(6.0g)并且将所得的悬浮液在室温下搅拌20分钟。然后，将反应烧瓶放置在冰-盐-水浴上以将温度带至零下，并且用注射器缓慢地添加SO2Cl2(7.4mL，在二氯甲烷中的1M溶液)。将所得的混合物在0℃下搅拌1小时，随后为添加0.5当量的SO2Cl2以使反应完成。经由TLC通过起始材料的消失来监测反应进程。接着，在分开的烧瓶中制备在DMF(40mL)中的(MeO)3BnSH(2.65g，12.35mmol，2.5当量)和NaH(0.472g，11.85mmol，在矿物油中60％)的悬浮液。将反应混合物合并并且缓慢地升温至室温并搅拌1小时。然后，通过玻璃烧结漏斗来过滤反应混合物以去除MS，将过滤液通过添加50mMNaH2PO4水溶液(50mL)来进行猝灭，并且用二氯甲烷进行萃取。将合并的有机物通过Na2SO4进行干燥并且在真空中进行浓缩。通过使用己烷:乙酸乙酯梯度的硅胶柱色谱法进行的纯化给出所希望的化合物123(1.4g，42.2％产率)。1H NMR(CDCl3):δH 8.29(m,1H),7.77(m,2H),7.48(m,1H),7.38(m,2H),6.15(m,1H),5.99(m,2H),4.55(m,2H),4.32(m,1H),4.00(m,1H),3.80(m,1H),3.75(m,1H),3.69(m,9H),2.52(m,1H),1.97(m,1H),0.80(m,9H)和0.01(m,6H)ppm。在图55中图解说明了该合成。
实施例49
化合物124的合成
将化合物123(1.4g，2.08mmol)在N2气氛中溶解在处于配备有搅拌棒和橡胶隔片的200mL圆底烧瓶中的无水二氯甲烷(42mL)中并且冷却至0℃。向该混合物添加二甲基二硫醚(0.93mL，10.4mmol，5当量)，随后为添加DMTSF(450mg，2.28mmol，1.1当量)。将所得的混合物在0℃下搅拌2小时。将反应体系通过添加50mM NaHCO3(100mL)来进行猝灭，用二氯甲烷(100mL x 2)进行萃取，并且通过Na2SO4进行干燥并在真空中进行浓缩。通过硅胶柱色谱法(用0至30％在二氯甲烷中的乙酸乙酯梯度进行洗脱)来纯化产物，从而提供作为白色粉末的所希望的化合物124(0.93g，83.1％)。1H NMR(CDCl3):δH 8.48(m,1H),7.93(m,2H),7.56(m,1H),7.47(m,1H),7.37(m,2H)6.00(m,1H),4.73(m,2H),4.34(m,1H),4.07(m,1H),3.84(m,1H),3.73(m,1H),2.44(m,1H),2.33(m,3H),2.25(m,1H),0.76(m,9H)和0.01(m,6H)ppm。在图55中图解说明了该合成。
实施例50
化合物125的合成
将化合物124(930mg，1.73mmol)在N2气氛中溶解在处于配备有搅拌棒和橡胶隔片的100mL圆底烧瓶中的无水THF(52mL)中并且在冰-水浴上冷却至0℃。然后，逐滴添加TBAF(3.5mL的在THF中的1M溶液，1.5当量)并且在0℃下搅拌4小时。在反应完成后，添加甲醇(5mL)以猝灭反应，在减压下去除挥发性物质，并且通过硅胶柱色谱法(0至75％在己烷中的乙酸乙酯梯度)来纯化残留物，从而提供作为白色粉末的所希望的化合物125(425mg，58％产率)。1H-NMR(CDCl3):δH 8.24(m,1H),7.81(m,1H),7.51-7.42(m,2H),7.41(m,2H),6.09(m,1H),4.80(m,2H),4.50(m,1H),4.17(m,1H),3.94(m,1H),3.80(m,1H),2.58(m,1H),2.40(m,3H)和2.41(m,1H)ppm。在图55中图解说明了该合成。
实施例51
化合物126的合成
然后，通过使用标准的三磷酸酯合成程序(见下文)将化合物125转化为三磷酸酯126；最终的去保护步骤通过用10％NH4OH在室温下处理2小时来进行(以使-SSMe切割最小化)。30％产率；HR MS-ES+：关于C11H20N3O13P3S2计算出的，558.965，观测到的m/z，558.964。在图55中图解说明了该合成。
实施例52
化合物130的合成
给配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装载127(2.0g，2.8mmol)并且在干燥器中在高真空中通过P2O5干燥12小时。在N2中添加二氯甲烷(40mL)并且将所得的溶液在盐-冰浴上冷却15分钟。添加环己烯(0.34mL，3.4mmol)，随后为逐滴添加SO2Cl2(3.4mL，在二氯甲烷中的1M溶液，3.4mmol)。将所得的混合物搅拌30分钟，并且通过TLC(乙酸乙酯:己烷/1:1，127Rf＝0.5，128Rf＝0.15，关于-CH2Cl分解的产物)来监测反应进程。逐滴添加额外的SO2Cl2(3.1mL，在二氯甲烷中的1M溶液，3.1mmol)并且将反应混合物搅拌另外的40分钟以确保完全转化为化合物128。然后，将该混合物在高真空中在0℃下进行浓缩。
然后，在N2中向残留物添加无水二氯甲烷(40mL)并且将混合物在0℃下进行搅拌直至所有固体溶解。缓慢地添加在DMF(8mL)中的对甲苯硫代磺酸钾(0.96g，425mmol)的溶液并且将所得的反应混合物在0℃下搅拌1小时。将混合物首先在0℃下在减压下进行浓缩，然后在室温下。通过使用0至100％在己烷中的乙酸乙酯梯度的在硅胶柱上的快速柱色谱法来纯化残留物，从而给出作为奶油状固体的化合物130(1.1g，51％；TLC Rf:0.35，乙酸乙酯:己烷2:1)。MS(ES)m/z:733[M+1+]。1H NMR(CDCl3,400MHz):δH 8.02(br.s,1H),7.94(s,1H),7.88(d,J＝8.3Hz,2H),7.45(m,4H),7.38(m,6H),7.27(m,2H),6.01(t,J＝6.6Hz 1H),5.46&5.38(AB,JAB＝12.1Hz,2H),4.97(m,1H),3.86(m,1H),3.74(dd,J＝12.5,2.8Hz,1H),3.55(dd,J＝12.5,2.9Hz,1H),2.87(m,1H),2.65(m,1H),2.43(s,3H),2.17(m,1H),1.26(d,J＝6.8Hz,3H),1.25(d,J＝6.9Hz,3H)ppm。在图56中图解说明了该合成。
实施例53
化合物131的合成
在N2下向在冰-水浴上冷却的在二氯甲烷(无水，40mL)中的130(1.1g，1.5mmol)的溶液添加二甲基二硫醚(0.66mL，7.5mmol)。将所得的混合物搅拌15分钟并且一次性添加NaSMe(0.23g，3.3mmol)。将所得的反应混合物在0℃下搅拌4小时(通过TLC(乙酸乙酯:己烷/2:1，130Rf＝0.35，131Rf＝0.45)来监测反应进程)。将混合物通过Celite-S进行过滤并且在减压下进行浓缩。在用在己烷中的乙酸乙酯(0～100％)进行洗脱的硅胶柱上纯化残留物，从而提供作为白色固体的化合物131(0.68g，75％；TLC Rf:0.45，乙酸乙酯:己烷/2:1)。MS(ES)m/z:625[M+1+]。1H NMR(CDCl3):δH 8.02(s,1H),8.00(br.s,1H),7.45(m,4H),7.39(m,4H),7.28(m,2H),6.24(t,J＝6.2Hz,1H),5.05(m,1H),4.99&4.94(AB,JAB＝11.4Hz,2H),4.27(m,1H),3.99(dd,J＝12.5,2.3Hz,1H),3.86(dd,J＝12.5,2.3Hz,1H),3.12(m,1H),2.74(m,1H),2.52(s,3H),2.50(m,1H),1.30(d,J＝6.6Hz,3H)和1.29(m,3H)ppm。在图56中图解说明了该合成。
实施例54
化合物132的合成
然后，通过在标准方法部分中所描述的标准的三磷酸酯合成方法将化合物131转化为三磷酸酯132。25％产率；HRMS-ES+：关于C12H20N5O13P3S2计算出的，598.971，观测到的m/z，598.970。在图56中图解说明了该合成。
实施例55
化合物134的合成
使化合物133(4.47g，10.7mmol)和(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(TMPM-SH)在高真空中干燥2小时，然后放置在具有P2O5的干燥器中12小时。将化合物133溶解在无水CH2Cl2(50.0mL)中并且添加环己烯(10mL，96.6mmol)。将所得的混合物在氮气氛中在-10℃下搅拌15分钟。接着，通过另外的漏斗逐滴添加新鲜制备的在CH2Cl2(25mL，26.75mmol)中的1MSO2Cl2的溶液，并且将所得的混合物在-10℃下搅拌1小时。在将浴温保持在10℃的同时，在真空中去除挥发性物质。然后，将残留物溶解在无水DMF(52mL)中并且保持在氮气氛中。
在分开的烧瓶中，将(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(4g，18.7mmol)在氮气氛中溶解在无水DMF(48mL)中并冷却至0℃。然后，添加NaH(1.1g，26.8mmol，在矿物油中60％)并且将所得的灰色浆状物在0℃下搅拌15分钟。将它一次性添加至前一个溶液中并且将反应体系在室温下搅拌1小时。然后，将反应混合物在分液漏斗中进行分配(150:300mL/盐水:乙酸乙酯)。然后，用盐水(2x 150mL)洗涤有机层。对水性层进行反萃取(4x 50mL乙酸乙酯)。将合并的有机层通过无水硫酸钠进行干燥。去除溶剂并且通过在硅胶柱上的快速色谱法(柱：120g RediSepRfGold-ISCO，梯度为0-100％在己烷中的乙酸乙酯)来纯化产物。作为白色固体而获得靶化合物134，以22％产率(1.35g)。1H NMR(CDCl3):δH 8.17(s,1H),7.39(d,1H),6.30(m,1H),6.12(s,2H),4.71(dd,2H),4.43(m,1H),4.04(m,1H),3.87(m,1H),3.83(m,9H),3.74(dd,1H),2.74(ddd,1H),2.34(ddd,1H),1.93(m,2H)1.53(s,3H),0.93(m,9H),0.11(m,6H)ppm。LCMS(ESI)[M-H+]：观测到的，581。Rf＝0.59(4:6/己烷-乙酸乙酯)。并且还作为副产物而分离出化合物135，以22.5％产率(1.13g)。1H NMR(CDCl3):δH 8.55(s,1H),7.41(m,1H),6.12(M,3H),4.76(dd,2H),4.47(m,1H),4.01(m,1H),3.90(m,1H),3.82(m,9H),3.75(m,1H),2.29(m,2H),2.04(s,3H)和1.91(m,2H)ppm。LCMS(ESI)[M-H+]：观测到的，467。在图57中图解说明了该合成。
实施例56
化合物136的合成
使在100mL圆底烧瓶中的化合物134(3.6g，6.2mmol)在高真空中干燥2小时，然后放置在具有P2O5的真空干燥器中12小时。添加无水CH2Cl2(96mL)和二甲基二硫醚(2.8mL，30.9mmol)，并且将反应体系冷却至0℃。然后，添加四氟硼酸二甲基(甲硫基)锍(DMTSF，1.34g，6.82mmol)并且将反应体系在0℃下搅拌1小时。接着，将反应混合物转移至250mL分液漏斗并且用90mL的0.1M NaHCO3水溶液进行中和，并且用乙酸乙酯(2x 200mL)进行萃取。将合并的有机层通过无水硫酸钠进行干燥并且在旋转蒸发器上进行浓缩。通过使用30-50％在己烷中的乙酸乙酯梯度的在硅胶柱上的快速色谱法来纯化残留物。作为白色固体而获得靶化合物136(2.1g，77％产率)。1H NMR(CDCl3):δH 7.99(s,1H),7.47(d,1H),6.29(dd,1H),4.87(dd,2H),4.49(m,1H),4.13(m,1H),3.88(m,2H),3.5(m,1H),2.47(s,3H),2.45(dd,1H),2.04(dd,1H)和1.54(s,2H),0.93(m,9H)和0.13(m,6H)ppm。LCMS(ESI)[M-H+]：观测到的，447.0。在图57中图解说明了该合成。
实施例57
化合物137的合成
将在高真空中干燥了2小时的在100mL圆底烧瓶中的化合物136(2.16g，4.8mmol)溶解在无水THF(40mL)中，随后为添加乙酸(1.2mL)和在THF中的TBAF(6.7mL的1M溶液，6.72mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌额外的2小时。在真空中去除挥发性物质并且通过使用0-8％在二氯甲烷中的甲醇梯度的在40g RediSepRf gold柱上的快速色谱法来纯化残留物。作为白色固体而获得靶化合物137(1.45g，90％产率)。1H NMR(CDCl3):δH8.12(s,1H),7.36(d,1H),6.11(t,1H),4.87(dd,2H),4.57(m,1H),4.14(q,1H),3.94(dd,1H),3.83(m,1H),2.50(s,3H),2.4(m,2H),1.93(s,3H)ppm。LCMS(ESI)[M-H+]：观测到的，333。在图57中图解说明了该合成。
实施例58
化合物138的合成
通过使用标准的三磷酸酯合成方法(见下文)，在使化合物137磷酸化后获得产物138。40％产率。HR LC-MS：关于C12H21N2O14P3S2计算出的，573.965，观测到的m/z，573.964。在图57中图解说明了该合成。
实施例59
化合物141的合成
给配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装载化合物139(2.23g，3.55mmol)、CH2Cl2(20mL)、分子筛(3.5g)和环己烯(0.60mL)。将所得的混合物在氮气氛中在室温下搅拌20分钟。将反应体系冷却至0℃并且通过注射器缓慢地添加SO2Cl2(5.4mL，在CH2Cl2中的1M，1.5当量)。将反应体系在0℃下搅拌1.5小时并且添加额外的1.8mL的SO2Cl2(在二氯甲烷中的1M溶液)并在0℃下继续搅拌40分钟以确保完全转化为化合物140。在将浴温保持在接近10℃的同时，在减压下去除挥发性物质。将所得的固体重悬浮在20mL无水DMF中并且保持在氮气氛中。
在分开的烧瓶中，将(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(1.98g，9.25mmol)溶解在无水DMF(15mL)中并且用NaH(247mg，在矿物油中60％，6.17mM)进行处理，从而产生深灰色浆状物。接着，一次性添加化合物140溶液并且将反应体系在室温下搅拌1小时。然后，将反应混合物在蒸馏水(150mL)和乙酸乙酯(150mL)之间进行分配。将有机层用蒸馏水(2x 150mL)进一步进行洗涤并且通过Na2SO4进行干燥。在减压下去除挥发性物质并且通过使用80至100％在己烷中的乙酸乙酯梯度的在硅胶柱上的快速柱色谱法来纯化残留物。作为白色固体而获得靶化合物141(798mg，28％)。1H NMR(CDCl3):δH8.33(s,1H),7.57(m,1H),6.53(m,2H),6.00(s,2H),4.62(m,2H),4.44(m,1H),4.32(m,2H),3.97(m,1H),3.80-3.60(m,11H),3.10(m,6H),2.36(m,1H),2.24(m,1H),0.80(m,9H)和0.01(m,6H)ppm。通过LC-MS进一步进行确认：观测到的m/z，795.25，关于(M-H)。在图58中图解说明了该合成。
实施例60
化合物142的合成
在氮气氛中给配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装载化合物141(0.779g，0.98mmol，通过P2O5真空干燥12小时)和无水THF(20.0mL)并且冷却至0℃。通过注射器缓慢地添加TBAF(1.17mL，在THF中的1M溶液，1.17mmol)并且将反应混合物在0℃下搅拌1.5小时。接着，添加额外的TBAF(1mL，在THF中的1M溶液，1mmol)并且在0℃下反应3小时。然后，将反应混合物转移至分液漏斗并且通过添加甲醇(5mL)来进行猝灭，添加蒸馏水(100mL)，并且将反应体系用乙酸乙酯(2x 100mL)进行萃取。将有机物通过Na2SO4进行干燥并且在真空中进行浓缩。使用80-100％在己烷中的乙酸乙酯梯度对残留物进行的硅胶柱色谱法提供了作为白色粉末的化合物142(525mg，79％)。1H NMR(甲醇-d4):δH 8.33(s,1H),7.19(m,1H),6.06(m,2H),6.03(m,1H),4.72(m,2H),4.64(m,1H),4.57(m,1H),4.35(m,2H),4.17(m,1H),3.75(m,9H),3.16(m,6H),2.80(m,1H)和2.28(m,1H)ppm。LC-MS：M-H，观测到的m/z，680.0。在图58中图解说明了该合成。
实施例61
化合物143的合成
通过在标准方法部分中所描述的标准的三磷酸酯合成程序，从化合物142合成化合物143。产率65％；LRMS-ES-：关于C25H33N5O15P3S-计算出的，768.09，观测到的m/z，768.54(M-H)。在图58中图解说明了该合成。
实施例62
化合物144的合成
给50mL锥形管装载化合物143(3.80mL的在HPLC级水中的5.25mM溶液，20μmol)和pH 4.65乙酸盐缓冲液(4.75mL)，并且与9.0mL的新鲜制备的在pH 4.65乙酸盐缓冲液中的DMTSF(80mM)溶液快速地合并。将所得的混合物在室温下摇动2小时并且通过添加饱和NaHCO3水溶液(2mL)来进行猝灭。将产物立即在制备型HPLC(柱：30x250mm C18Sunfire，方法：0至2.0分钟100％A，随后为在70分钟内50％B，流速：25mL/分钟，A＝50mM TEAB，B＝乙腈)上进行纯化。将合适的级分冻干并且在溶解于HPLC级水中之后进行合并，从而提供23.4umol的化合物144(73％产率)。LRMS-ES-：关于C16H23N5O12P3S2-计算出的，634.00，观测到的m/z，634.42，关于(M-H)。在图58中图解说明了该合成。
按照在标准方法部分中所描述的程序将化合物144转化为经染料标记的产物(76)(图59)。以两个步骤获得化合物146，以75％产率。LRMS-ES+：关于C34H59N7O19P3S4计算出的，1090.20，观测到的m/z，1090.24，关于(M+H)。从146获得化合物76，以50-70％产率。HRMS-ES-：关于C67H86N9O23P3S4计算出的，1605.393，观测到的m/z，1605.380，对于(M-H)。
实施例63
化合物150的合成
给250mL圆底烧瓶装载化合物148(3.0g，4.58mmol)、25mL无水CH2Cl2、分子筛(5.0g)和环己烯(0.55mL，5.4mmol)。将所得的混合物在氮气氛中在室温下搅拌10分钟。然后，将反应烧瓶放置在冰浴上，通过注射器缓慢地添加SO2Cl2(6.8mL，在CH2Cl2中的1M，1.5当量)，并且将反应体系在0℃下搅拌1小时。接着，添加额外的0.5当量的SO2Cl2以确保完全转化为化合物149。在将温度保持在接近10℃的同时，在真空中去除挥发性物质。将所得的固体重悬浮在20mL无水DMF中并且保持在氮气氛中。
在分开的烧瓶中，将(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(2.45g，11.44mmol)在氮气氛中溶解在无水DMF(30mL)中，并且用NaH(274.5mg，在硅油中60％)进行处理，从而产生灰色浆状物。向此一次添加化合物149并且将反应体系在氮气氛中在室温下搅拌3小时。然后，将反应化合物通过进行过滤，并且用乙酸乙酯(100mL)进行洗涤。用蒸馏水(2x100mL)洗涤乙酸乙酯溶液，将有机萃取物通过Na2SO4进行干燥，在真空中进行浓缩，并且通过使用20至50％在己烷中的乙酸乙酯梯度的在硅胶柱上的快速柱色谱法来进行纯化。作为白色固体而获得靶化合物150(1.2g，32％产率，Rf:0.4，己烷:乙酸乙酯/3:2)。1H NMR(CDCl3):δH 8.13(m,3H),7.43(m,1H),7.32(m,2H),6.12(m,1H),6.00(s,2H),4.62(m,2H),4.31(m,3H),4.00(m,1H),3.82-3.60(m,13H),2.39(m,1H),1.84(m,1H),0.78(m,9H),和0.01(m,6H)ppm。在图60中图解说明了该合成。
实施例64
化合物151的合成
将化合物150(1.2g，1.46mmol)在干燥器中在高真空中用P2O5干燥过夜并且溶解在处于配备有磁力搅拌棒的100mL烧瓶中的30mL无水CH2Cl2中。向此添加二甲基二硫醚(0.657mL，7.3mmol)，并且将反应烧瓶放置在冰浴上。添加四氟硼酸二甲基(甲硫基)锍(DMTSF，316mg，1.1当量)并且在0℃下搅拌1.5小时。将反应混合物转移至250mL分液漏斗并且用50mL的0.1M NaHCO3水溶液进行中和，并且用CH2Cl2(2x 50mL)进行萃取。将有机层通过Na2SO4进行干燥并且通过旋转蒸发进行浓缩。使用80-50％在己烷中的乙酸乙酯梯度这样的梯度在硅胶柱上纯化粗产物，从而导致0.82g的化合物151(82％产率，Rf＝0.5，己烷:乙酸乙酯/3:2)。1H NMR(CDCl3):δH 8.15(m,3H),7.42(m,1H),7.35(m,2H),6.11(m,1H),4.80-4.65(m,2H),4.34(m,1H),4.28(m,2H),4.10(m,1H),3.83-3.67(m,2H),2.49(m,1H),2.34(s,3H),1.90(m,1H),0.78(m,9H),和0.10(m,6H)ppm。在图60中图解说明了该合成。
实施例65
化合物152的合成
在氮气氛中给配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装载化合物151(0.309g，0.45mmol)和10.0mL无水THF(10.0mL)并且放置在冰浴上。通过注射器缓慢地添加TBAF(0.72mL，在THF中的1M溶液，0.72mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌3小时。然后，将反应混合物转移至分液漏斗并且用0.5M NaHCO3水溶液(50mL)进行猝灭。然后，将所得的混合物用乙酸乙酯(2x 100mL)进行萃取并且通过Na2SO4进行干燥。在使用梯度7:3至2:3己烷:乙酸乙酯的在硅胶柱上的硅胶柱色谱法后，作为白色粉末获得产物152，以76％产率(196mg，Rf＝0.3，己烷:乙酸乙酯/1:1)。1H NMR(CDCl3):δH8.40(s,1H),8.25(m,2H),7.60(m,1H),7.52(m,2H),6.21(m,1H),4.90-80(m,2H),4.65(m,1H),4.40(m,2H),4.25(m,1H),4.05-3.85(m,2H),2.62(m,1H),2.50(s,3H)和2.31(m,1H)ppm。在图60中图解说明了该合成。
实施例66
化合物153的合成
通过使用标准的三磷酸酯合成方法(见下文)，在使化合物152磷酸化后，以30％产率获得化合物153(LC-MS：关于C14H23N4O13P3S2计算出的，610.98，观测到的m/z，611.11(M-H))。按照在标准方法部分中所描述的程序将它进一步转化为经染料标记的产物(72)(图61)。以两个步骤以49％产率获得化合物155，和以60-85％产率获得化合物72。HRMS-ES-：关于C53H68N8O30P3S6 -计算出的，1581.156(M-H)，测得的m/z，1582.160。
实施例67
化合物159和160的合成
给配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装载化合物157(2.04g，2.39mmol)并且在高真空中干燥经过12小时。在用氩气冲洗反应容器后，顺次添加13mL无水CH2Cl2和环己烯(0.30mL，2.86mmol)。然后，将反应烧瓶放置在冰-水-盐浴上并且搅拌10分钟以将混合物带至低于0℃。在2分钟内通过注射器逐滴添加SO2Cl2(4.0mL，在CH2Cl2中的1M，4.0mmol)，并且将反应混合物在0℃下搅拌1小时。在1分钟内逐滴添加额外的0.8当量的SO2Cl2(2.0mL，2.0mmol)并且将反应体系在0℃下搅拌额外的半小时。接着，在将浴温保持在～10℃的同时，在真空中去除挥发性物质。将所得的固体重悬浮在15mL无水DMF中并且保持在氩气氛中。
在分开的100mL烧瓶中，将(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(TMPM-SH，1.27g，6.0mmol，经真空干燥过夜)在氩气氛中溶解在无水DMF(16mL)中并且用NaH(195mg，在油中60％，4.88mmol)进行处理，从而产生灰色浆状物TMPMT-SNa盐。搅拌混合物直至气体形成减弱(大约10分钟)。向此一次添加TMPMT-SNa盐并且将混合物在氩气氛中在室温下进行搅拌直至TLC(微量检查：二氯甲烷/水；溶剂：己烷:乙酸乙酯/1:1)确认了完全转化(1小时)。然后，将反应混合物在过滤漏斗中通过(10g)进行过滤，其中用二氯甲烷(100mL)洗脱出产物。然后，用水(3x 100mL)洗涤二氯甲烷溶液。将水性层用3x 100mL二氯甲烷进行萃取。将合并的二氯甲烷萃取物通过Na2SO4进行干燥并且通过旋转蒸发进行浓缩。然后，通过快速色谱法(柱：100g，梯度：25％-50％己烷:乙酸乙酯5CV，然后50％EE 10CV)来纯化它。作为白色泡沫而获得靶化合物160(1.22g，51％产率)。1H NMR(DMSO-d6):δH 10.63(s,1H),10.15(s,1H),7.95(s,1H),7.3-7.5(m,8H),7.20-7.3(m,2H),6.40(m,1H),6.15(m,1H),4.69(m,2H),4.50(dd,1H),4.30(m,2H),3.95(m,1H),3.81(m,11H),3.3(m,4H),2.7(m,1H),1.05(m,8H),0.8(m,9H)和0.11(m,6H)ppm。LCMS：1019.371Da。在图62中图解说明了该合成。
另外，作为副产物而获得TBDMS-去保护的产物159，以25％产率(0.48g)。Rf＝0.2，己烷:乙酸乙酯/1:1。1H NMR(DMSO-d6):δH10.63(s,1H),10.15(s,1H),7.95(s,1H),7.3-7.5(m,8H),7.20-7.3(m,2H),6.40(m,1H),6.15(m,1H),4.69(m,2H),4.50(dd,1H),4.30(m,2H),3.95(m,1H),3.81(m,11H),3.5(m,1H),3.3(m,4H),2.7(m,1H),和1.04(m,8H)ppm。LCMS：905.286Da。
实施例68
化合物161的合成
给配备有磁力搅拌棒和橡胶隔片的100mL圆底烧瓶装载化合物160(0.36g，0.35mmol)并且在高真空中干燥12小时。在用氩气冲洗后，添加7mL无水二氯甲烷和二甲基二硫醚(0.16mL，1.76mmol)。将反应烧瓶放置在冰浴上并且搅拌10分钟以将混合物带至0℃。然后，添加四氟硼酸二甲基(甲硫基)锍(DMTSF，80mg，0.4mmol)并且将反应体系在0℃下进行搅拌直至TLC(微量检查：二氯甲烷/水；溶剂：己烷:乙酸乙酯/1:1)。将反应混合物转移至250mL分液漏斗，用50mL的0.1M NaHCO3水溶液进行中和，并且用CH2Cl2(3x 50mL)进行萃取。将有机层通过Na2SO4进行干燥并且通过旋转蒸发进行浓缩。在硅胶柱上(柱：25g，梯度：10％-50％己烷:乙酸乙酯3CV，然后50％乙酸乙酯5CV)纯化粗产物。作为黄色泡沫而获得靶化合物161(0.23g，74％产率)。在图62中图解说明了该合成。
实施例69
化合物162的合成
在氩气氛中给配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装载溶解在7.0mL无水THF中的化合物161(0.18g，0.20mmol)并且放置在冰浴上。将混合物搅拌10分钟以将它带至0℃并且添加0.28mL乙酸。在1分钟内通过注射器逐滴添加TBAF(在THF中的1M，0.47mL，0.47mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后在室温下搅拌1小时。TLC(己烷:乙酸乙酯/1:1)仍然显示起始材料。在1分钟内通过注射器逐滴添加额外的TBAF(在THF中的1M，0.47mL，0.47mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌1小时。接着，将混合物用2mL甲醇进行猝灭并且在室温下搅拌10分钟。通过旋转蒸发来去除溶剂，并且通过硅胶柱色谱法(柱：10g，己烷:乙酸乙酯/1:1至100％，超过2CV，然后100％乙酸乙酯，超过20CV)来纯化粗产物，从而产生作为白色泡沫的化合物162(96mg，62％)。在图62中图解说明了该合成。
实施例70
化合物163的合成
通过使用标准的三磷酸酯合成方法(见下文)，在使化合物162磷酸化后获得化合物163；除了在去保护步骤中使用AMA或甲醇氨代替氢氧化铵外。按照下面的标准程序将它进一步转化为经染料标记的产物78。从化合物165以97％产率获得化合物78。HRMS-ES-：关于C67H96N9O27P3S6(M-H)计算出的，1743.395，测得的，1743.390。在图62中图解说明了该合成。
实施例71
化合物169的合成
给100mL圆底烧瓶装载化合物167(3.120g，5.66mmol)、30.0mL无水CH2Cl2、分子筛(5.0g)和环己烯(0.70mL，6.9mmol)。将所得的混合物在氮气氛中在室温下搅拌10分钟。然后，将反应烧瓶放置在冰浴上。通过注射器向此缓慢地添加SO2Cl2(8.5mL，在CH2Cl2中的1M，1.5当量)，并且在0℃下搅拌1小时。接着，添加额外的4.0mL的1M SO2Cl2并且搅拌40分钟以确保完全转化为化合物168。在将温度保持在接近10℃的同时，在真空中去除挥发性物质。将所得的固体重悬浮在20mL无水DMF中并且保持在氮气氛中。
在分开的烧瓶中，将(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(3.028g，14.15mmol)在氮气氛中溶解在无水DMF(40mL)中，并且用NaH(566mg，在油中60％，14.15mM)进行处理，从而产生灰色浆状物。向此一次添加化合物168溶液并且在氮气氛中在室温下搅拌2.5小时。然后，将反应混合物通过(20g)进行过滤，用乙酸乙酯(200mL)洗脱。然后，将乙酸乙酯溶液用蒸馏水(3x 200mL)进行洗涤并通过Na2SO4进行干燥，通过旋转蒸发进行浓缩，并且通过在120g RediSepRfGold上的快速色谱法(梯度：己烷:乙酸乙酯(7:3至3:7))来进行纯化。作为白色固体而获得靶化合物(169)(1.43g，35.5％产率，Rf:0.5，己烷:乙酸乙酯/1:1)。1HNMR(CDCl3):δH 7.98(m,1H),6.09(m,1H),6.00(m,2H),4.67-4.51(m,2H),4.30(m,1H),4.22(m,2H),4.00(m,1H),3.80-3.60(m,11H),2.31(m,1H),1.83(m,1H),0.80(m,9H)和0.01(m,6H)ppm。在图64中图解说明了该合成。
实施例72
化合物170的合成
将化合物169(1.43g，1.99mmol)在高真空中通过P2O5干燥12小时并且溶解在处于配备有磁力搅拌棒和氮气源的烧瓶中的无水CH2Cl2(25mL)中。向此添加二甲基二硫醚(0.89mL，9.88mmol)，并且在冰浴上搅拌反应烧瓶。然后，添加四氟硼酸二甲基(甲硫基)锍(DMTSF，430mg，2.19mmol)并且在0℃下搅拌1.0小时。将反应混合物转移至500mL分液漏斗并且用100mL的50mM NaHCO3水溶液进行猝灭，并且用CH2Cl2(2X 150mL)进行萃取。将有机部分通过Na2SO4进行干燥并且通过旋转蒸发进行浓缩。使用己烷-乙酸乙酯(8:2至3:7)梯度在硅胶柱(80g RediSepRf gold)上纯化粗产物，从而导致0.622g的化合物170(54％产率，Rf＝0.6，己烷:乙酸乙酯/1:1)。1H NMR(CDCl3):δH 7.99(brs,1H,NH),7.98(s,1H),6.12(m,1H),4.69(m,2H),4.35(m,1H),4.19(m,2H),4.06(m,1H),3.80(m,1H),3.60(m,2H),2.40(m,1H),2.33(s,3H),1.88(m,1H),0.78(m,9H),和0.10(m,6H)ppm。在图64中图解说明了该合成。
实施例73
化合物171的合成
在氮气氛中给配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶装载化合物170(0.623g，1.06mmol，通过P2O5真空干燥12小时)和无水THF(20.0mL)并且放置在冰浴上。通过注射器缓慢地添加TBAF(1.27mL，在THF中的1M溶液，1.27mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1.5小时，并且添加额外的0.9mL的在THF中的1M TBAF溶液并在0℃下搅拌总共4小时。然后，将反应混合物转移至分液漏斗并且用0.5M NaHCO3溶液(50mL)进行猝灭。将所得的混合物用乙酸乙酯(2X 100mL)进行萃取并且通过Na2SO4进行干燥。在使用7:3至3:7在己烷中的乙酸乙酯这样的梯度的在80g RediSepRf柱上的硅胶柱色谱法后，作为白色粉末而获得产物171，以63％产率(311mg)。1H NMR(甲醇-d4):δH 8.16(s,1H),6.06(m,1H),4.79(m,2H),4.69(m,1H),4.40(m,1H),4.14(m,2H),3.99(m,1H),3.63(m,2H),2.36(m,3H),2.32(m,1H),和2.08(m,1H)ppm。LRMS-ES-：M-H，观测到的m/z，468.0Da。在图64中图解说明了该合成。
实施例74
化合物172的合成
通过使用标准的三磷酸酯合成方法，在使化合物171磷酸化后以58％产率获得产物172。LRMS：关于C14H21N3O14P3S2 -(M-H)计算出的，611.97，测得的，612.15。按照在标准方法部分中所描述的标准程序(见下文)将化合物171进一步制作为经染料标记的产物(74)(图65)。以两个步骤获得化合物174，以74％产率(HRMS-ES-：关于C32H55N5O21P3S4 -(M-H)计算出的，1066.15，测得的，1066.42)。以62％产率获得化合物74(HRMS-ES-：关于C59H80N7O25P3S4 -(M-H)计算出的，1507.330，测得的，1507.325)。
实施例75
用于三磷酸酯合成的标准方法
将核苷酸(160μmol)和质子海绵(1.5当量)(其在高真空中通过P2O5进行预干燥)在N2-气氛中溶解在处于25mL梨形烧瓶中的磷酸三甲酯(0.8mL)中并且搅拌20分钟直至所有固体完全溶解。然后，将烧瓶放置在冰-水浴上以将反应体系带至(-5至0℃)。然后，通过注射器一次性添加POCl3(1.5当量)并且将反应体系搅拌1小时。
在15mL锥形管中制备焦磷酸正丁基铵(0.36g)、n-Bu3N(0.36mL)和无水DMF(1.3mL)的混合物，从而产生粘稠的浆状物。一旦完全溶解，就将它一次快速地添加至剧烈搅拌的混合物并且在室温下搅拌15分钟。
然后，将反应混合物倒入处于250mL圆底烧瓶中的100mL的0.1M TEAB缓冲液之中并且在室温下搅拌3小时。然后，将它在真空中浓缩至25mL并且用25mL氢氧化铵(28-30％NH3含量)在室温下处理8小时。在减压下去除大部分的挥发性物质后，将反应粗产物重悬浮在0.1M TEAB缓冲液(30mL)中并且通过C18制备型HPLC(30x250mm，C18Sunfire柱，方法：0至2分钟100％A，随后为在70分钟内50％B，流速：25mL/分钟；A＝50mM TEAB，B＝ACN)来进行纯化。将靶级分冻干，并且在溶解在HPLC级水(20mL)中之后合并。将该半纯的产物通过在PL-SAX Prep柱上的离子交换HPLC(方法：0至5分钟100％A，然后在70分钟内直至70％B的线性梯度，其中A＝15％在水中的乙腈，B＝在15％乙腈中的0.85M TEAB缓冲液)来进一步进行纯化。通过如上面所描述的C18Prep HPLC来进行最后的纯化。在冻干后获得核苷三磷酸，以20-65％产率。
实施例76
用于使用DMTSF将3’-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP转化为3’-(OCH2SSMe)-dNTP的标准方法
给50mL锥形管装载3’-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP(3.80mL的在HPLC级水中的5.25mM溶液，20μmol)和pH＝4.65乙酸盐缓冲液(5.20mL)，并且与9.0mL DMTSF(在pH＝4.65乙酸盐缓冲液中的80mM溶液)快速地合并。将所得的混合物在室温下摇动2小时并且用2.0mL饱和NaHCO3溶液来猝灭反应，并且立即通过在30X250mm C18Sunfire柱上的制备型HPLC(方法：0至2.0分钟100％A，随后为在70分钟内直至50％B的线性梯度，流速：25mL/分钟，A＝50mM TEAB，B＝乙腈)来进行纯化。将靶级分冻干并且在溶解在HPLC级水中之后合并，从而导致50-75％产率的3’-(OCH2SSMe)-dNTP，取决于核苷酸。在图66中图解说明了3’-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP的结构例子。
实施例77
用于缀合经NHS活化的连接体的标准方法
将溶解在HPLC级水(2mL)中的MeSSdNTP-PA(10ummol)用新鲜制备的0.5M Na2HPO4水溶液(1mL)进行稀释。在锥形管中，将经NHS活化的连接体(NHS-A-Fmoc，114，35mg，2.5当量)溶解在无水DMF(2.0mL)中。然后，将它一次添加至MeSSdNTP-PA/Na2HPO4溶液并且在室温下搅拌8小时。
然后，将反应体系用0.1M TEAB缓冲液(2.0mL)进行稀释并且用哌啶(0.6mL)进行处理。将混合物在室温下搅拌1小时，用0.1M TEAB(10mL)进一步进行稀释，并且通过在30X250mm C18Sunfire柱上的制备型HPLC(方法：0至2.0分钟100％A，随后为在70分钟内直至50％B的线性梯度，流速：25mL/分钟，A＝50mM TEAB，B＝乙腈)来快速地进行纯化。将靶级分冻干并且在溶解在HPLC级水中之后合并，从而导致45-75％产率的MeSSdNTP-A-NH2。
实施例78
用于用NHS染料进行标记的标准方法
在15mL锥形管中将在2.0mL HPLC级水中的MeSSdNTP-A-NH2(4.55μmol)用Na2HPO4(0.8mL的0.5M水溶液)进行稀释，并且与在1.4mL无水DMF中的经NHS活化的染料(2.5当量)合并。将反应混合物在室温下搅拌8小时，用0.1M TEAB缓冲液(40mL)进行稀释，并且通过在30X250mm C18Sunfire柱上的制备型HPLC(方法：0至5分钟100％A，随后为在70分钟内直至50％B的线性梯度，流速：25mL/分钟)来进行纯化。将靶级分冻干并且在溶解在HPLC级水中之后合并，从而导致50-80％产率的经标记的产物。
实施例79
将可切割的连接体和标志物附着至核碱基
用于附着可切割的连接体的优选部分之一是基于炔丙基或基于烯丙基的。还考虑了用于附着可切割的连接体和染料的其他手段。特别地，在染料切割后结果具有很少或没有残留的连接体的与碱基部分的附着是特别优选的。在切割后结果具有不携带电荷的残留的连接体的与碱基的附着也是优选的。这些特征对于确保在标记物/染料的切割后通过酶将核苷酸以有效方式掺入到核酸的正在生长的链中来说是重要的。由本发明所考虑的一个特别的实施方案包括使用经羟甲基修饰的碱基部分来附着可切割的染料。此类化合物的例子显示在图71中。图72显示了在染料和3’-O保护基团的切割后羟甲基衍生物的结构。
实施例80
可切割的连接体和3’-O保护基团的切割
可以使用各种各样的切割试剂来切割本发明的连接体和保护基团。例如，可以使用各种各样的携带硫羟基的化合物，如在("Thiol-Disulfide Interchange",Singh,R.和Whitesides,G.M.,Sulfur-Containing Functional Groups；Supplement S,Patai,S.,编者,J.Wiley and Sons,Ltd.,1993.p633-658)[15]中所描述的。特别地，具有降低的硫羟基基团pKa的化合物可以用于实现快速且有效的切割产率，例如二硫丁胺，DTBA(Lukesh等人,J.Am.Chem.Soc.,2012,134(9),第4057-4059页[16])。可以用于进行本发明的切割的携带硫羟基的化合物的例子显示在图73A-73I中。
适合于切割本发明的联硫基封端基团和连接体的另一类化合物为膦(Harpp等人,J.Am.Chem.Soc.1968,90(15),4181-4182[12]；Burns等人,J.Org.Chem.1991,56,2648-2650[13]；Getz等人,Analytical Biochemistry 273,73-80(1999)[14])。对于切割本发明的基于联硫基的保护基团和连接体来说有用的膦的例子包括：三苯基膦、三丁基膦、三羟甲基膦(THMP)、三羟丙基膦(THPP)、三羧乙基膦(TCEP)。在某些情况下，可以希望能够选择性地切割连接体或3’-保护基团。这可以通过设计保护基团和连接体以及选择切割试剂来实现。例如，携带3’-叠氮基甲基醚保护基团和二硫化物连接体的组合的核苷酸可以用于该目的。在这种情况下，二硫桥的选择性切割可以通过使用基于硫羟基的切割试剂来完成，而3’-叠氮基甲基醚保护基团的去除可以通过使用膦例如TCEP来实现。这样的程序的例子图解说明在图73A-74C、图74A-75C和图75中。图73A-74C显示了发生的化学反应的流程图和所形成的化合物的结构；图74A-75C显示在每个阶段收集的HPLC色谱图；和图75显示了从每个峰提取的吸收光谱。步骤A)经标记的、3’-O经保护的核苷酸显示出一个峰(1)以及在核苷酸(280nm；注意，关于炔丙基cpds的最大值向着280-290nm位移)和染料(575nm)两者处的吸收。步骤B)用DTT进行的处理产生具有染料的吸收峰(575nm)和更慢的迁移(更疏水的)的峰2以及具有(278nm)吸收和更快的迁移(由于更亲水的特征)的峰3。步骤C)用TCEP进行的另外处理产生具有在278处的最大吸收且没有染料的峰4，在更加低的保留时间处，这与3’-OH保护基团的失去相一致的。经切割的染料分裂成另外的峰(5、6)，但这两个峰具有相同的吸收。
在图76A-E和图77A-78B中显示了切割的另一个例子。图76A-E显示了关于使用携带在3’末端上的基于联硫基的保护基团和基于联硫基的连接体的核苷酸的切割反应的规划。如该图所显示的，切割反应可以作为一步或两步过程来进行。图77A-78B显示了通过使用各种各样的切割试剂来进行的切割实验的结果：二硫琥珀酸、L-半胱氨酸、DTT和半胱胺。图77A显示了对于起始材料以及在与切割试剂二硫琥珀酸、L-半胱氨酸、DTT和半胱胺一起温育后的反应混合物所产生的RP-HPLC色谱图。图77B显示了所鉴定出的反应混合物的组成，其表明了在L-半胱氨酸、DTT和半胱胺的情况下连接体和3’-保护基团这两者的完全切割，以及在二硫琥珀酸的情况下3’-O-保护基团的选择性切割。这表明，选择性可以通过选择连接体和保护基团的结构以及切割试剂的性质(即，具有变化的SH基团的pKa和位阻程度)来实现。除了这些，可以使用各种各样的合适的切割试剂，例如双(2-巯基乙基)砜(BMS)和N,N'-二甲基-N,N'-双(巯基乙酰基)肼(DMH)(Singh等人,Bioorg.Chem.,22,109-115(1994)[17])。反应可以通过包括硒醇来进一步进行催化(Singh等人,Anal Biochem.1995年11月20日,232(1):86-91[18])。硼氢化物例如硼氢化钠(Stahl等人,Anal.Chem.,1957,29(1),第154-155页[19])以及抗坏血酸(Nardai等人,J.Biol.Chem.276,8825-8828(2001)[20])也可以用于该目的。另外，用于切割二硫键的酶促方法也是众所周知的，例如二硫化物和硫还原酶，并且可以与本发明的化合物一起进行使用(Holmgren等人,Methods inEnzymology,第252卷,1995,第199-208页[21])。
实施例81
清除剂
根据所使用的切割试剂，本领域技术人员需要选择将会在切割反应完成后去除过量的切割试剂的清除剂试剂。例如，对于携带硫羟基的切割试剂，可以使用能够与游离SH基团反应的清除剂。例如，可以使用烷基化试剂，例如碘乙酰胺或马来酰亚胺衍生物(美国专利号8,623,598[49]，其通过提及而合并入本文)。对于硼氢化物，本领域技术人员可以使用携带酮的化合物，例如乙酰丙酸或类似的化合物。最后，还可以使用氧化试剂例如高碘酸盐来将过量的切割试剂氧化为非反应性种类(Molecules 2007,12(3),694-702[50])。
实施例82
模块化合成
本发明的经标记的核苷酸需要几个合成步骤并且涉及将各种各样的染料连接至不同的碱基。所希望的是能够以模块化方式而不是以逐步过程来进行连接体和染料附着。所述模块化方法涉及在一端上具有保护基团和在另一端上具有经活化的基团的连接体部分的预建造。然后，此类预建造出的连接体可以用于偶联至炔丙胺核苷酸，使被掩蔽的氨基团去保护，和然后偶联经活化的染料。相比于逐步合成而言，这具有步骤更少和产率更高的优点。例如，在图13中的化合物32是包含可切割的官能度的经预先活化的连接体的例子，具有经活化的反应性基团(二琥珀酰亚胺碳酸酯)和经掩蔽/保护的胺(Fmoc)。在偶联至在炔丙胺核苷酸上的游离胺后，保护基团可以例如通过用碱(氨水、哌啶)进行处理而方便地去除并且可以偶联至经活化(NHS)的染料分子。
实施例83
对本发明的连接体进行测试以测量其疏水性。化合物的logP值(这是在正辛醇和水之间的其分配系数的对数，log(c辛醇/c水))是化合物的亲水性(或其缺乏)的经充分建立的量度[51]。低的亲水性和因此高的logP值引起差的吸收或渗透。在这种情况下，使用预测软件来计算logP值，下面的表格显示了结果，其表明所述连接体(例如在图25中的那些)是疏水性连接体，而一些在商业上使用的连接体是亲水性的。
实施例84
该实施例显示了3'-O-(甲基亚甲基二硫化物)-5-(N-三氟乙酰基-氨基炔丙基)-dU(MeSSdU-PA(COCF3)，7)的合成。参见图85。
A.5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-5-(N-三氟乙酰基-氨基炔丙基)-2'-脱氧尿苷(2)的合成：
将5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-5-碘代-2'-脱氧尿苷(1，25.00g，53.37mmol)溶解在无水DMF(200mL)中并且在氩气氛中在室温下用四(三苯基膦)钯(0)(6.16g，5.27mmol)和CuI(2.316g，12.16mmol)处理10分钟。然后，顺次添加N-三氟乙酰基-炔丙胺(23.99g，157.8mmol)和Et3N(14.7mL，105.5mmol)并且在室温下搅拌3.0小时。然后，通过旋转蒸发来去除溶剂。将所得的粗产物溶解在500mL EtOAc中并转移到分液漏斗中。然后，分别用饱和NaHCO3(2X 400mL)和饱和NaCl(2X 400mL)溶液来洗涤有机部分。
然后，通过无水Na2SO4来干燥EtOAc部分。在过滤掉Na2SO4盐后，使用旋转蒸发器来浓缩过滤液乙酸乙酯部分。然后，通过硅胶快速色谱法(1:1Hex:EtOAc至2:3Hex:EtOAc，200g，15u HP puriflash柱，3X注射)(与3X40g硅胶相结合)来纯化它，这导致21.994g的2(83.88％产率)。HR-MS：观测到的，492.1773，关于C20H29F3N3O6Si[M+H]+计算出的，492.1699。在DMF-d7中的1H-NMR:δH 11.65(brs,1H,NH),10.15(brs,1H,NH),8.15(brs,1H),6.37(t,J＝5.99Hz),5.42(m,1H),4.41(m,1H),4.37(brs,2H,关于炔丙胺基团的NH-CH2),4.00(m,1H),3.84-3.97(m,2H),2.30(m,1H),2.20(m,1H),0.97(s,9H)和0.19(s,6H)ppm。
B.5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3'-O-(甲硫基甲基)-5-(N-三氟乙酰基氨基炔丙基)-2’-脱氧尿苷(3)的合成
将在前面的步骤中获得的化合物2(21.99g，44.77mmol)溶解在处于1000mL圆底烧瓶中的DMSO(90mL)中。然后，顺次添加AcOH(40mL)和乙酸酐(132mL)并且在室温下搅拌48小时。通过缓慢地添加饱和K2CO3来中和反应混合物，直至CO2气体的放出停止。然后，将混合物转移到分液漏斗中并进一步进行萃取(2X 500mL CH2Cl2)。然后，将合并的有机部分用饱和NaHCO3(1X 500mL)进行洗涤并且通过Na2SO4进行干燥。通过硅胶快速色谱法(Hex:EtOAc/7:3至1:1)来纯化有机部分，从而产生12.38g UtaisilfunitS4b§.03/n884。关于C22H33F3N3O6SSi(M+H)+计算出的，552.17。化合物3的1H-NMR(DMSO-d6):δH 11.69(s,1H),10.01(s,1H),7.93(s,1H),6.07(m,1H),4.69(m,2H),4.38(m,1H),4.19(m,2H),4.03(m,1H),3.75(m,2H),2.34(m,1H),2.14(m,1H),2.07(s,3H),0.86(s,9H)和0.08(s,6H)ppm。
C.3'-O-(TMPMT)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-5-(N-三氟乙酰基-氨基炔丙基)-2'-脱氧尿苷(5)的合成
给圆底烧瓶装载化合物3(3.120g，5.66mmol)、30.0mL无水CH2Cl2、分子筛(5.0g)和环己烯(0.70mL，6.9mmol)。然后，将反应烧瓶放置在冰浴上。通过注射器向此缓慢地添加SO2Cl2(8.5mL，在CH2Cl2中的1M，1.5当量)，并且在0℃下搅拌1小时。接着，添加额外的4.0mL的1M SO2Cl2并且搅拌额外的40分钟以确保完全转化为化合物4。在将温度保持在接近10℃的同时，在真空中去除挥发性物质。将所得的固体重悬浮在20mL无水DMF中并且保持在氮气氛中。
在分开的烧瓶中，将(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(3.0g，14.15mmol)在氮气氛中溶解在无水DMF(40mL)中，并且用NaH(566mg，在油中60％，14.15mM)进行处理，从而产生灰色浆状物。向此一次添加化合物4溶液并且在氮气氛中在室温下搅拌2.5小时。然后，在漏斗中将反应混合物通过(20g)进行过滤，用EtOAc(200mL)洗脱产物。然后，将EtOAc溶液用蒸馏水(3X 200mL)进行洗涤。将EtOAc萃取物通过Na2SO4进行干燥，通过旋转蒸发进行浓缩，并且通过快速色谱法(柱：120g RediSepRfGold，梯度：7:3Hex:EtOAc至3:7Hex:EtOAc)来进行纯化。作为白色固体而获得靶化合物(5)(1.43g，35.5％产率，Rf:0.5，Hex:EtOAc/1:1)。1H NMR(CDCl3):δH 7.98(m,1H),6.09(m,1H),6.00(m,2H),4.67-4.51(m,2H),4.30(m,1H),4.22(m,2H),4.00(m,1H),3.80-3.60(m,11H),2.31(m,1H),1.83(m,1H),0.80(m,9H)和0.01(m,6H)ppm。
D.3'-O-(甲基亚甲基二硫化物)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-5-(N-三氟乙酰基氨基炔丙基)-2'-脱氧尿苷(6)的合成
将化合物5(1.43g，1.99mmol)在干燥器中在高真空中用P2O5干燥过夜并且溶解在处于配备有磁力搅拌器和氮气源的烧瓶中的25mL无水CH2Cl2中。向此添加二甲基二硫醚(0.89mL，9.88mmol)，并且在冰浴上搅拌反应烧瓶。然后，添加四氟硼酸二甲基(甲硫基)锍(DMTSF，430mg，2.19mmol)并且在0℃下搅拌1.0小时。将反应混合物转移至500mL分液漏斗并且用100mL的50mM NaHCO3水溶液进行猝灭，并且用CH2Cl2(2X 150mL)进行萃取。将有机部分通过Na2SO4进行干燥并且通过旋转蒸发进行浓缩。使用梯度8:2/Hex:EtOAc至3:7/Hex-EtOAc在硅胶柱(80g RediSepRf gold)上纯化粗产物，从而导致0.622g的化合物6(54％产率，Rf＝0.6，Hex:EtOAc/1:1)。1H NMR(CDCl3):δH 7.99(brs,1H,NH),7.98(s,1H),6.12(m,1H),4.69(m,2H),4.35(m,1H),4.19(m,2H),4.06(m,1H),3.80(m,1H),3.60(m,2H),2.40(m,1H),2.33(s,3H),1.88(m,1H),0.78(m,9H),和0.10(m,6H)ppm。
E.3'-O-(甲基亚甲基二硫化物)-5-(N-三氟乙酰基-氨基-炔丙基)-2'-脱氧尿苷(7)的合成
在氮气氛中给配备有磁力搅拌器的圆底烧瓶装载化合物6(0.623g，1.06mmol，用P2O5真空干燥过夜)和无水THE(20.0mL)并且放置在冰浴上。通过注射器缓慢地添加TBAF(1.27mL，1.27mmol，在1M溶液中)。将反应混合物在0℃下搅拌1.5小时。然后，添加额外的0.9mL的1M TBAF并且在冰冷温度下搅拌总共4小时。然后，将反应混合物转移至分液漏斗并且用0.5M NaHCO3溶液(50mL)进行猝灭。将所得的混合物用EtOAc(2X 100mL)进行萃取并且通过Na2SO4进行干燥。在使用梯度7:3至3:7Hex:EtOAc的在80g RediSepRf柱上的硅胶柱色谱法后，作为白色粉末而获得产物7，以63％产率(311mg)。1H NMR(MeOH-d4):δH 8.16(s,1H),6.06(m,1H),4.79(m,2H),4.69(m,1H),4.40(m,1H),4.14(m,2H),3.99(m,1H),3.63(m,2H),2.36(m,3H),2.32(m,1H),和2.08(m,1H)ppm。通过LC-MS进一步确认：M-H，观测到的m/z，468.0。
实施例85
该实施例显示了3'-O-(甲基亚甲基二硫化物)-5-(氨基炔丙基)-2'-脱氧尿苷(MeSSdUTPPA，8)的合成。参见图86A&B。在Ar气氛中将化合物7的经真空干燥的样品(155mg，330nmol)和质子海绵(100mg)放置在包含磁力搅拌棒的25mL梨形烧瓶中。将固体悬浮在磷酸三甲酯(1.4mL)中并且在室温下搅拌30分钟直至所有固体完全溶解。然后，将烧瓶放置在冰-盐-水浴中并且搅拌10分钟以将烧瓶带至零下温度(-5至0℃)。然后，使用微量注射器一次添加POCl3(50μL，570nmol)。然后，将混合物在相同温度下搅拌1小时。接着，在15mL离心管中尽可能快地制备焦磷酸-Bu3N-DMF的预混物，从而产生粘稠的溶液(焦磷酸-Bu3NH+0.73g，Bu3N 0.73mL，无水DMF 2.6mL)。一旦完全溶解，就将混合物一次快速地添加至剧烈搅拌的反应混合物。将反应混合物在室温下搅拌15分钟。然后，将反应混合物倒入处于500mL圆底蒸发烧瓶中的200mL的0.1M TEAB缓冲液之中。将混合物在室温下搅拌3小时。然后，将反应混合物在室温下用60mL氢氧化铵(28-30％NH3含量)处理1小时。然后，将混合物通过旋转蒸发进行浓缩并且通过制备型HPLC(19X250mm，C18Sunfire,Waters，方法：0至2分钟100％A，随后为在70分钟内20％B，流速：14mL/分钟；A＝50mM TEAB，B＝ACN)来进行纯化。将靶级分(Rf＝32-37分钟)冻干并且在溶解在HPLC级水中之后合并，从而导致103nmol的MeSSdUTP-PA，8(58％产率)。通过LC-MS m/z(M-H)612.00来确认产物。
实施例86
该实施例显示了MeSSdUTP-ARA-NH2，11的合成。
将化合物MeSSdUTP-PA(8)分成等分试样装入15mL离心管中(2.16mL@6.92mM＝15.tmol)。将它用0.8mL HPLC级水和1.5mL的新鲜制备的在HPLC级水中的0.5M Na2HPO4进行稀释。在分开的管中，将35mg经活化的连接体NHS-ARA-Fmoc(10，44mmol)悬浮在3.0mL无水DMF中。将该溶液一次添加至MeSSdUTP-PA/Na2HPO4溶液并且用手轻轻摇动。然后，将它放置在摇动器上并允许在室温下反应过夜。次日，HPLC分析显示出定量转化为经缀合的产物(10)。将它用1.0mL的0.1M TEAB缓冲液进行稀释。向此添加0.7mL哌啶并且在室温下在摇动器上搅拌1小时。然后，立即通过在30X250mm C18Sunfire—Waters柱上的制备型HPLC(方法：0至2.0分钟100％A，随后为在70分钟内50％B，流速：25mL/分钟，A＝50mM TEAB，B＝乙腈，仅1次注射)来纯化产物。将靶级分(Rf＝46分钟)合并并冻干，并且将最终产物溶解在HPLC级水中并通过UV-分光光度测定法来测定浓度，从而导致6.8nmol的MeSSdUTPARA-NH2，11(45％产率，以两个步骤)。通过LR-LC-MS(观测到的m/z，1067)来进一步确认产物。
实施例87
该实施例呈现了在本文中所呈现的用于切割研究的一般性方法。
在15.0mL离心管中在1.0M TE缓冲液(pH 8.5，Sigma#T9285)中制备100mM切割试剂(参见表1)的储液。然后，将它的20μL(2,000nmol)的等分试样在1.0mL离心管中用76.9uL蒸馏水进行稀释并且向其添加3.07μL的6.5mM MeSSdUTP-ARA-NH2(11，20nmol)，从而获得100μL的总体积(最终浓度：20mM切割试剂，0.2mM核苷酸，200mM TE缓冲液)。在经预热的热循环仪上通过轻轻摇动来在65℃下加热混合物管。在10分钟后立即通过LC-MS来分析混合物。通过在280mu波长处提取的各自峰的相对峰面积来测定转化的％。
虽然已通过参考这些优选的实施方案而描述了本发明，但是其他实施方案可以实现相同的结果。本发明的变化和修饰对于本领域技术人员来说将会是显而易见的，并且旨在在所附的权利要求书中涵盖所有这样的修饰和等价物。上面所引用的所有申请、专利和出版物以及相应申请的整个公开内容特此通过提及而合并。
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Claims (39)

1.用于检测在DNA序列中的经标记的核苷酸的方法，其包括下列步骤：
a)提供核酸模板和能够与所述模板杂交的引物以便形成引物/模板杂交复合物，包含含硫羟基的化合物的切割试剂，以及切割清除剂试剂；
b)向所述引物和模板添加DNA聚合酶和第一脱氧核苷三磷酸以便产生反应混合物，所述第一脱氧核苷三磷酸包含核碱基和糖，所述糖在3‘-O上包含可切割的保护基团，其中所述可切割的保护基团包含亚甲基二硫化物，其中所述脱氧核苷三磷酸进一步包含通过可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体附着至所述核碱基的第一可检测标记物；
c)使所述反应混合物经历使得由DNA聚合酶催化的引物延伸反应成为可能的条件，以便产生经修饰的引物/模板杂交复合物，其中所述第一脱氧核苷三磷酸被掺入；
d)检测在所述经修饰的引物/模板杂交复合物中的所述脱氧核苷三磷酸的所述第一可检测标记物；
e)在条件下引入所述切割试剂，以便从所述经修饰的引物/模板杂交复合物中去除所述可切割的保护基团和所述可检测标记物；和
f)引入所述切割清除剂试剂。
2.权利要求1的方法，其中所述切割试剂包含二巯基丙磺酸或其盐。
3.权利要求2的方法，其中所述二巯基丙磺酸或其盐在缓冲液中。
4.权利要求3的方法，其中所述缓冲液为CHES。
5.权利要求4的方法，其中所述切割试剂的pH在9.0和10.0之间。
6.权利要求5的方法，其中所述切割试剂的所述pH为9.5。
7.权利要求1的方法，其中所述切割清除剂为氧化清除剂。
8.权利要求7的方法，其中所述氧化清除剂为过氧化氢。
9.权利要求8的方法，其中所述过氧化氢在缓冲液中。
10.权利要求9的方法，其中所述缓冲液为TRIS。
11.权利要求10的方法，其中所述TRIS缓冲液处于在8.5和9.0之间的pH。
12.权利要求11的方法，其中所述TRIS缓冲液处于8.8的pH。
13.权利要求7的方法，其中所述氧化清除剂为叔丁基过氧化物。
14.权利要求1的方法，其中步骤b)的所述反应混合物在流动池中。
15.权利要求14的方法，其中所述流动池被安置在移动支持物上。
16.权利要求15的方法，其中所述移动支持物为旋转载物台。
17.权利要求14的方法，其中所述流动池的至少一部分是透明的。
18.权利要求14的方法，其中所述流动池被整合在仪器内。
19.根据权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括在步骤b)的重复期间添加第二脱氧核苷三磷酸，其中所述第二脱氧核苷三磷酸包含通过第二可切割的氧亚甲基二硫化物连接体而附着的第二可检测标记物，其中所述第二可检测标记物不同于所述第一可检测标记物。
20.根据权利要求1的方法，其中所述含硫羟基的化合物为基于邻位二硫羟基的化合物。
21.权利要求20的方法，其中所述第二脱氧核苷三磷酸的核碱基不同于所述第一脱氧核苷三磷酸的核碱基。
22.权利要求1的方法，其中在步骤b)中使用至少4种表示A、G、C和T或U的类似物的、不同地进行标记的、3‘-O经亚甲基二硫化物加帽的脱氧核苷三磷酸化合物的混合物。
23.权利要求22的方法，其中所述检测允许测定所述所掺入的第一脱氧核苷三磷酸的核碱基。
24.用于检测在DNA序列中的经标记的核苷酸的方法，其包括下列步骤：
a)提供核酸模板和能够与所述模板杂交的引物以便形成引物/模板杂交复合物，以及流动池，所述流动池与包含有包含含硫羟基的化合物的切割试剂的第一储器和包含有氧化洗涤剂的第二储器处于流体联通；
b)在所述流动池中向所述引物和模板添加DNA聚合酶和第一脱氧核苷三磷酸以便产生反应混合物，所述第一脱氧核苷三磷酸包含核碱基和糖，所述糖在3‘-O上包含可切割的保护基团，其中所述可切割的保护基团包含亚甲基二硫化物，其中所述脱氧核苷三磷酸进一步包含通过可切割的含氧亚甲基二硫化物的连接体附着至所述核碱基的第一可检测标记物；
c)使所述反应混合物经历使得由DNA聚合酶催化的引物延伸反应成为可能的条件，以便产生经修饰的引物/模板杂交复合物，其中所述第一脱氧核苷三磷酸被掺入；
d)检测在所述经修饰的引物/模板杂交复合物中的所述脱氧核苷三磷酸的所述第一可检测标记物；
e)在条件下将所述切割试剂从所述第一储器引入到所述流动池中，以便从所述经修饰的引物/模板杂交复合物中去除所述可切割的保护基团和所述可检测标记物；和
f)将所述氧化洗涤剂从所述第二储器引入到所述流动池中。
25.权利要求24的方法，其中所述切割试剂包含二巯基丙磺酸或其盐。
26.权利要求25的方法，其中所述二巯基丙磺酸或其盐在缓冲液中。
27.权利要求26的方法，其中所述缓冲液为CHES。
28.权利要求24的方法，其中所述切割试剂的pH在9.0和10.0之间。
29.权利要求28的方法，其中所述切割试剂的所述pH为9.5。
30.权利要求24的方法，其中所述氧化洗涤剂包含过氧化氢。
31.权利要求30的方法，其中所述过氧化氢在缓冲液中。
32.权利要求31的方法，其中所述缓冲液为TRIS。
33.权利要求24的方法，其中所述氧化洗涤剂包含叔丁基过氧化物。
34.试剂盒，其包含一种或多种DNA测序试剂、说明书、氧化清除剂和切割试剂，所述切割试剂包含含硫羟基的化合物。
35.权利要求34的试剂盒，其中所述含硫羟基的化合物为二巯基丙磺酸或其盐。
36.权利要求34的试剂盒，其中所述氧化清除剂为过氧化氢。
37.权利要求34的试剂盒，其中所述氧化清除剂为叔丁基过氧化物。
38.权利要求34的试剂盒，其中所述一种或多种DNA测序试剂选自包括下列各项的组：聚合酶、引物、模板和核苷酸。
39.流动池，其包含在溶液中的与模板杂交的引物，所述溶液包含含硫羟基的化合物和氧化清除剂。
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