JP2019536448A - チオール含有切断試薬および酸化的洗浄液 - Google Patents

チオール含有切断試薬および酸化的洗浄液 Download PDF

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Abstract

本発明は、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシド三リン酸と、前記デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続した検出可能な標識を利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。さらに、チオール含有化合物およびチオ含有化合物のスカベンジャーが記載される。このような化合物は、これらに限定されないが、合成による配列決定を含む将来の配列決定技術に関する新たな可能性をもたらす。

Description

関連出願の引用
本願は、２０１６年１１月４日に出願された米国特許出願第１５／３４３，２７９号の一部継続出願であり、２０１５年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５１，８８４および２０１６年４月２６日に出願された米国仮特許出願６２／３２７，５５５号の利益を主張する。これらは、本明細書中に参考として援用される。
発明の分野
本発明は、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシド三リン酸と、前記デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続した検出可能な標識を利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。このような化合物は、これらに限定されないが、合成による配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む将来の配列決定技術に関する新たな可能性をもたらす。本発明はまた、ジスルフィド還元または切断ステップが必須であるＤＮＡ配列決定技術（およびタンパク質工学などの他の技術）に関するヌクレオチドのジスルフィド系リンカーと３’−ジスルフィドキャッピング基との切断剤としてのチオール含有化合物または誘導体（あるいは、メルカプトールアナログ）を利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。一実施形態では、切断剤は、利用者が配列決定ワークフロー使用説明書に従って切断プレミックス緩衝液に添加する固体粉末付加物としてキット化される。さらに、本発明は、チオール含有化合物が酸化的洗浄ステップで捕捉される実施形態を提供する。このような化合物は、これらに限定されないが、フローセルにおける自動化された合成による配列決定（ＳＢＳ）を含むＳＢＳを含む将来の配列決定技術における使用に関する可能性をもたらす。
発明の背景
ＤＮＡ配列決定は、現代のバイオテクノロジーにおいて、最も重要な解析方法の１つである。現行の配列決定技術に関する詳細な総説は、M. L. Metzker、Nature Reviews ２０１０年、１１巻、３１頁［１］およびC. W. Fullerら、Nature Biotechnology ２００９年、２７巻、１０１３頁［２］に提供される。
周知の配列決定方法は、合成による配列決定（ＳＢＳ）方法である。この方法によれば、ヌクレオシド三リン酸は、３’ＯＨ保護基、特に、エステルおよびエーテルによって可逆的に遮断される。エステルの例は、アセチルのようなアルカンエステル、リン酸エステルおよび炭酸エステルである。ヌクレオシド三リン酸は、通常、塩基に標識を含む。
可逆的に３’ＯＨ遮断されたヌクレオシド三リン酸を使用して段階的方式で所定配列のポリヌクレオチドを酵素的に合成する方法が、HiattおよびRose（米国特許第５，９９０，３００号）［３］に記載された。彼らは、切断可能な３’ＯＨ保護基として、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、ホスホルアミド、カーボネート、カルバメート、ボレート、糖、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート、スルフェートおよびスルホンの他に、さらにニトレートを開示する。脱保護は、化学的または酵素的手段によって行われ得る。合成的手順も脱保護条件も存在せず、ニトレート基について開示された酵素的組込みデータが存在する。特許請求された脱遮断溶液は、好ましくは、Ｃｏ２＋のような二価のカチオンとＴｒｉｓのような生体緩衝液を含有する。標識を含有する３’ＯＨ遮断されたヌクレオシド三リン酸は開示されていない。
Buzby（ＵＳ２００７−０１１７１０４）［４］は、３’−ヒドロキシル基で可逆的に保護され、塩基に標識を有するＳＢＳに関するヌクレオシド三リン酸を開示する。標識は、ジスルフィドリンカーまたは光切断可能なリンカーなどの切断可能なリンカーを介して接続される。リンカーは、最大約２５個の原子からなる。３’ＯＨ保護基は、ヒドロキシルアミン、アルデヒド、アリルアミン、アルケン、アルキン、アルコール、アミン、アリール、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ボレート、糖、ホスホルアミデート、フェニルスルファネート、スルフェート、スルホンおよび複素環の他に、さらにニトレートであり得る。
核酸配列決定においてより長いリード長およびより高い精度を達成するために必要とされるものは、切断可能な保護基および切断後に反応性残基を残さない切断可能なリンカーを有するヌクレオチドアナログである［５］。
米国特許第５，９９０，３００号明細書 米国特許出願公開第２００７／０１１７１０４号明細書
M. L. Metzker、Nature Reviews ２０１０年、１１巻、３１頁 C. W. Fullerら、Nature Biotechnology ２００９年、２７巻、１０１３頁
本発明は、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシド三リン酸と前記デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続した検出可能な標識を利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。一実施形態では、本発明は、メチレンジスルフィドを含む可逆的保護基と、標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを有するヌクレオチドアナログを企図する。本発明はまた、ジスルフィド還元または切断ステップが必須であるＤＮＡ配列決定技術（およびタンパク質工学などの他の技術）に関するヌクレオチドのジスルフィド系リンカーと３’−ジスルフィドキャッピング基との切断剤としてのチオール誘導体（あるいは、メルカプトールアナログ）を利用する方法、組成物、混合物およびキットも提供する。一実施形態では、切断剤は、利用者が配列決定ワークフロー使用説明書に従って切断プレミックス緩衝液に添加する固体粉末付加物としてキット化される。さらに、本発明は、チオール含有化合物が酸化的洗浄ステップで捕捉される実施形態を提供する。このような化合物は、これらに限定されないが、フローセルにおける自動化された合成による配列決定（ＳＢＳ）を含むＳＢＳを含む将来の配列決定技術における使用に関する可能性をもたらす。
混合物について、本発明は、一実施形態では、これらに限定されないが、緩衝液、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型などを含む１つまたは複数のさらなる配列決定試薬との混合物中に、標識と核酸塩基の間の切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーと、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシド三リン酸を企図する。キットについて、本発明は、一実施形態では、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシド三リン酸を含む配列決定試薬が、別個の容器中（または混合物中）に、（任意選択で）配列決定においてこのような試薬を使用するための使用説明書と一緒に、合わせて提供される配列決定キットを企図する。本発明は、キットにおける配列決定試薬の数または性質によって限定されることを意図するものではない。一実施形態では、キットは、これらに限定されないが、緩衝液、ポリメラーゼ、プライマーなどを含む１つまたは複数のさらなる配列決定試薬を含む。
本発明は、任意の特定のポリメラーゼに限定されることを意図するものではない。本発明は、ヌクレオチド誘導体の組込みが促進された操作された（例えば、突然変異した）ポリメラーゼを企図する。例えば、Tabor, S.およびRichardson, C.C.（（１９９５年） Proc. Natl. Acad. Sci (USA) ９２巻：６３３９頁［６］）は、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼにおけるフェニルアラニン６６７のチロシンによる置き換えと、このことがＤＮＡポリメラーゼによるジデオキシヌクレオチドの識別に関して有する作用について記載する。一実施形態では、本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ｅｘｏ−と示される）を欠くポリメラーゼを企図する。例えば、９°Ｎポリメラーゼのｅｘｏ−バリアントは、Perlerら、１９９８年のＵＳ５７５６３３４［７］およびSouthworthら、１９９６年 Proc. Natl Acad. Sci USA ９３巻：５２８１頁［８］に記載されている。別のポリメラーゼの例は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８６Ｙバリアントである（Evansら、２０００年 Nucl. Acids. Res. ２８巻：１０５９頁［９］）。別の例は、Ｔｓｐ ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５Ｔバリアントである（Areziら、２００２年 J. Mol. Biol. ３２２巻：７１９頁［１０］）。ＷＯ２００５／０２４０１０ Ａ１は、モチーフＡ領域の修飾および９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼに関し、参照により本明細書に組み込まれる［１１］。
方法について、本発明は、標識と核酸塩基の間の切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーと切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位とを含むデオキシヌクレオシド三リン酸を合成する方法、および切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシド三リン酸を利用する方法の両方を企図する。
一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ配列における標識ヌクレオチドを検出するための方法であって、ａ）核酸鋳型および前記鋳型にハイブリダイズしてプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なプライマー（一部の実施形態では、実際に、一緒にハイブリダイズしたプライマーを提供するステップ）、ならびにチオール含有化合物を含む切断試薬を提供するステップと；ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシド三リン酸を前記プライマーおよび鋳型に添加して反応混合物を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が核酸塩基および糖を含み、前記糖が３’−Ｏに切断可能な保護基を含み、前記切断可能な保護基がメチレンジスルフィドを含み、前記デオキシヌクレオシド三リン酸が切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して核酸塩基に結合した第１の検出可能な標識をさらに含む、ステップと；ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にして改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製する条件に供するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が組み込まれる（プライマーに組み込まれてプライマーを伸長する）、ステップと；ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記デオキシヌクレオシド三リン酸の前記第１の検出可能な標識を検出する（例えば、イメージングする）ステップと；ｅ）前記切断可能な保護基（例えば、前記切断可能な保護基を切断することによって）および（任意選択で）前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去する（例えば、リンカーを切断することによって）条件下で前記切断試薬を導入するステップとを含む、方法を企図する。一実施形態では、方法は、ステップｂ）の繰り返しの間に、第２のデオキシヌクレオシド三リン酸を添加するステップをさらに含み、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸は第２の検出可能な標識を含む。一実施形態では、チオール含有化合物は、ビシナルジチオール系化合物である。一実施形態では、ビシナルジチオール系化合物は、ジメルカプトプロパンスルホネートである。一実施形態では、前記チオール含有化合物は、第１および第２のチオール基を含む。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、少なくとも１つの炭化水素原子によって分離される。
一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、炭化水素スペーサーによって分離される。一実施形態では、炭化水素スペーサーは、少なくとも１つの官能基を含む。一実施形態では、前記少なくとも１つの官能基は、ハロゲン、アミン、ホスフェート、ホスホネート、リン酸、カルボン酸、スルホキシドおよびヒドロキシルからなる群から選択される。一実施形態では、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基は、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基と異なる。一実施形態では、１つより多い標識ヌクレオチドが使用され、例えば、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵのアナログを表す、少なくとも４種の異なって標識された、３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャップされたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物の混合物が、ステップｂ）で使用される。好ましい実施形態では、前記検出するステップは、前記組み込まれた第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基の決定を可能とする。
本発明は、ａ）核酸鋳型および前記鋳型にハイブリダイズしてプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なプライマー（一部の実施形態では、実際に、一緒にハイブリダイズしたプライマーを提供するステップ）、チオール含有化合物を含む切断試薬ならびに切断捕捉試薬を提供するステップと；ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシド三リン酸を前記プライマーおよび鋳型に添加して反応混合物を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が核酸塩基および糖を含み、前記糖が３’−Ｏに切断可能な保護基を含み、前記切断可能な保護基がメチレンジスルフィドを含み、前記デオキシヌクレオシド三リン酸が切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して核酸塩基に結合した第１の検出可能な標識をさらに含む、ステップと；ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にして改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製する条件に供するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が組み込まれる（例えば、プライマーに組み込まれてプライマーを伸長する）、ステップと；ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記デオキシヌクレオシド三リン酸の前記第１の検出可能な標識を検出する（例えば、イメージングすることによって）ステップと；ｅ）前記切断可能な保護基（例えば、切断することによって）および（任意選択で）前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去する（リンカーを切断することによって）条件下で前記切断試薬を導入するステップと；ｆ）前記切断スカベンジャー試薬を導入する（例えば、任意の残留する切断試薬を捕捉するために）ステップとを含む、ＤＮＡ配列における標識ヌクレオチドを検出するための方法の別の実施形態を企図する。一実施形態では、前記チオール含有化合物は、第１および第２のチオール基を含む。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、少なくとも１つの炭化水素原子によって分離される。
一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、炭化水素スペーサーによって分離される。一実施形態では、炭化水素スペーサーは、少なくとも１つの官能基を含む。一実施形態では、前記少なくとも１つの官能基は、ハロゲン、アミン、ホスフェート、ホスホネート、リン酸、カルボン酸、スルホキシドおよびヒドロキシルからなる群から選択される。一実施形態では、前記切断試薬はジメルカプトプロパンスルホネートを含む。一実施形態では、前記ジメルカプトプロパンスルホネートは緩衝液中にある。一実施形態では、前記緩衝液はＣＨＥＳである。一実施形態では、前記切断試薬のｐＨは９．０から１０．０の間である。好ましい実施形態では、前記切断試薬の前記ｐＨは９．５である。一実施形態では、前記切断スカベンジャーは酸化的スカベンジャーである。一実施形態では、前記酸化的スカベンジャーは過酸化水素である。一実施形態では、前記酸化的スカベンジャーはｔｅｒ−ブチルペルオキシドである。一実施形態では、前記過酸化水素は緩衝液中にある。一実施形態では、前記緩衝液はＴＲＩＳである。一実施形態では、前記ＴＲＩＳ緩衝液は８．５から９．０の間のｐＨである。好ましい実施形態では、前記ＴＲＩＳ緩衝液は８．８のｐＨである。好ましい実施形態では、ステップｂ）の前記反応混合物はフローセル中にある。一実施形態では、前記フローセルは移動支持体上に配置される。一実施形態では、前記移動支持体は回転ステージである。一実施形態では、前記フローセルの少なくとも一部は透明である。一実施形態では、前記フローセルは機器内に組み込まれる。一実施形態では、方法のステップは繰り返される。一実施形態では、方法は、ステップｂ）の繰り返しの間に、第２のデオキシヌクレオシド三リン酸を添加するステップをさらに含み、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸は第２の切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合した第２の検出可能な標識を含み、前記第２の検出可能な標識は前記第１の検出可能な標識と異なる。一実施形態では、チオール含有化合物はビシナルジチオール系化合物である。一実施形態では、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基は、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基と異なる。一実施形態では、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵのアナログを表す、少なくとも４種の異なって標識された、３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャップされたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物の混合物が、ステップｂ）で使用される。好ましい実施形態では、前記検出するステップが、前記組み込まれた第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基の決定を可能とする。
本発明は、また別の実施形態では、ＤＮＡ配列における標識ヌクレオチドを検出するための方法であって、ａ）核酸鋳型および前記鋳型にハイブリダイズしてプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なプライマー（一部の実施形態では、実際に、ハイブリダイズしたプライマーを提供するステップ）、ならびにフローセルを提供するステップであって、前記フローセルが、チオール含有化合物を含む切断試薬を含む第１のリザーバーおよび酸化的洗浄液を含む第２のリザーバーと流体連通する（例えば、チューブを介して）、ステップと；ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシド三リン酸を前記プライマーおよび鋳型に添加して前記フローセル中で反応混合物を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が核酸塩基および糖を含み、前記糖が３’−Ｏに切断可能な保護基を含み、前記切断可能な保護基がメチレンジスルフィドを含み、前記デオキシヌクレオシド三リン酸が切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して核酸塩基に結合した第１の検出可能な標識をさらに含む、ステップと；ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にして改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製する条件に供するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が組み込まれる（例えば、プライマーに組み込まれてプライマーを伸長する）、ステップと；ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記デオキシヌクレオシド三リン酸の前記第１の検出可能な標識を検出する（例えば、イメージングすることによって）ステップと；ｅ）前記切断可能な保護基（切断することによって）および（任意選択で）前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去する（リンカーを切断することによって）条件下で前記切断試薬を、前記第１のリザーバーから、前記フローセル中に導入するステップと；ｆ）前記酸化的洗浄液を、前記第２のリザーバーから、前記フローセル中に導入する（任意の残留する切断試薬を除去するかまたは不活性化するために）ステップとを含む、方法を企図する。一実施形態では、前記チオール含有化合物は、第１および第２のチオール基を含む。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、少なくとも１つの炭化水素原子によって分離される。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、炭化水素スペーサーによって分離される。一実施形態では、炭化水素スペーサーは、少なくとも１つの官能基を含む。一実施形態では、前記少なくとも１つの官能基は、ハロゲン、アミン、ホスフェート、ホスホネート、リン酸、カルボン酸、スルホキシドおよびヒドロキシルからなる群から選択される。一実施形態では、前記切断試薬はジメルカプトプロパンスルホネートを含む（例えば、溶液中に）。一実施形態では、前記ジメルカプトプロパンスルホネートは緩衝液中にある。一実施形態では、前記緩衝液はＣＨＥＳである。一実施形態では、前記切断試薬のｐＨは９．０から１０．０の間である。一実施形態では、前記切断試薬の前記ｐＨは９．５である。一実施形態では、前記酸化的洗浄液は過酸化水素を含む。一実施形態では、前記酸化的洗浄液はｔｅｒ−ブチルペルオキシドを含む。一実施形態では、前記過酸化水素は緩衝液中にある。一実施形態では、前記緩衝液はＴＲＩＳである。
本発明はまた、キットを企図する。一実施形態では、本発明は、１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬、使用説明書およびチオール含有化合物を含む切断試薬を含むキットを企図する。一実施形態では、前記チオール含有化合物は、第１および第２のチオール基を含む。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、少なくとも１つの炭化水素原子によって分離される。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、炭化水素スペーサーによって分離される。一実施形態では、炭化水素スペーサーは、少なくとも１つの官能基を含む。一実施形態では、前記少なくとも１つの官能基は、ハロゲン、アミン、ホスフェート、ホスホネート、リン酸、カルボン酸、スルホキシドおよびヒドロキシルからなる群から選択される。一実施形態では、チオール含有化合物は、２，３−ジメルカプトプロパンスルホネート、２，３−ジメルカプト−１−プロパノールおよび２，３−ジメルカプトプロパンホスホネート（またはこれらの塩）からなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記チオール含有化合物はジメルカプトプロパンスルホネートである。一実施形態では、前記ジメルカプトプロパンスルホネートは緩衝液中にある。チオール含有化合物は種々の形態であり得る。一実施形態では、前記ジメルカプトプロパンスルホネートは、前記キットにおいて、固体形態（例えば、チューブ、バイアルまたは他の容器内の粉末として）である。一実施形態では、キットは緩衝液（例えば、チューブ、バイアルまたは他の容器中に）をさらに含む。一実施形態では、前記緩衝液はＣＨＥＳである。一実施形態では、キットは切断スカベンジャーをさらに含む。好ましい実施形態では、前記切断スカベンジャーは酸化的スカベンジャーである。一実施形態では、前記酸化的スカベンジャーは過酸化水素である。一実施形態では、前記酸化的スカベンジャーはｔｅｒ−ブチルペルオキシドである。一実施形態では、前記１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬は、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型およびヌクレオチドを含む群から選択される。
本発明はまた、混合物を含む組成物を企図する。一実施形態では、本発明は、チオール含有化合物を含む溶液中で鋳型にハイブリダイズしたプライマーを含む組成物を企図する。一実施形態では、前記チオール含有化合物は、第１および第２のチオール基を含む。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、少なくとも１つの炭化水素原子によって分離される。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、炭化水素スペーサーによって分離される。一実施形態では、炭化水素スペーサーは、少なくとも１つの官能基を含む。一実施形態では、前記少なくとも１つの官能基は、ハロゲン、アミン、ホスフェート、ホスホネート、リン酸、カルボン酸、スルホキシドおよびヒドロキシルからなる群から選択される。一実施形態では、チオール含有化合物は、２，３−ジメルカプトプロパンスルホネート、２，３−ジメルカプト−１−プロパノールおよび２，３−ジメルカプトプロパンホスホネートからなる群から選択される。一実施形態では、前記ハイブリダイズしたプライマーおよび鋳型は固定されている。一実施形態では、前記ハイブリダイズしたプライマーおよび鋳型はフローセル中にある。
本発明はまた、溶液および混合物を含有するフローセルを企図する。一実施形態では、本発明は、チオール含有化合物および酸化的スカベンジャーを含む溶液中で鋳型にハイブリダイズしたプライマーを含むフローセルを企図する。一実施形態では、前記チオール含有化合物は、第１および第２のチオール基を含む。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、少なくとも１つの炭化水素原子によって分離される。一実施形態では、前記第１および第２のチオール基は、炭化水素スペーサーによって分離される。一実施形態では、炭化水素スペーサーは、少なくとも１つの官能基を含む。一実施形態では、前記少なくとも１つの官能基は、ハロゲン、アミン、ホスフェート、ホスホネート、リン酸、カルボン酸、スルホキシドおよびヒドロキシルからなる群から選択される。一実施形態では、チオール含有化合物は、２，３−ジメルカプトプロパンスルホネート、２，３−ジメルカプト−１−プロパノールおよび２，３−ジメルカプトプロパンホスホネートからなる群から選択される。一実施形態では、前記ハイブリダイズしたプライマーおよび鋳型は固定されている。一実施形態では、前記酸化的スカベンジャーは過酸化水素である。一実施形態では、前記酸化的スカベンジャーはｔｅｒ−ブチルペルオキシドである。
一実施形態では、本発明は、（ａ）切断可能な保護基としてメチレンジスルフィド（例えば、一般式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒの）を含む基によってキャップされた３’−Ｏを有するヌクレオシド三リン酸と；（ｂ）標識が、切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）（リンカーは、さらなる基を含有してもよいが）を介して核酸塩基に結合した、それらの標識アナログに関する。このようなヌクレオチドは、合成（ＳＢＳ）技術によって、核酸配列決定において使用することができる。一実施形態では、本発明は、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィド（例えば、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ）を含む基によって３’−Ｏでキャップされたヌクレオチドの合成、脱保護条件または酵素的組込みに関する。
一実施形態では、本発明は、標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーと、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏを含むデオキシヌクレオシド三リン酸に関する。一実施形態では、前記ヌクレオシドの核酸塩基は非天然である。一実施形態では、前記ヌクレオシドの非天然核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンを含む群から選択される。一実施形態では、メチレンジスルフィドを含む前記基は、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒであり、Ｒは、アルキル基および置換アルキル基を含む群から選択される。一実施形態では、前記検出可能な標識は、切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー（例えば、式−ＯＣＨ２−ＳＳ−の）を介して前記核酸塩基に結合している。一実施形態では、前記検出可能な標識は蛍光標識である。一実施形態では、式（−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−Ｒ）のＲは、アルキルまたはアリルであり得る。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
（式中、Ｂは核酸塩基であり、Ｒは、アルキル基および置換アルキル基を含む群から選択される）に記載のデオキシヌクレオシド三リン酸に関する。一実施形態では、前記核酸塩基は天然核酸塩基（シトシン、グアニン、アデニン、チミンおよびウラシル）である。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンを含む群から選択される非天然核酸塩基である。アナログの場合には、検出可能な標識は、核酸塩基と前記検出可能な標識の間のリンカーセクションも含んでもよい。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
（式中、Ｂは核酸塩基であり、Ｒは、アルキル基および置換アルキル基を含む群から選択され、Ｌ１およびＬ２は接続基である）に記載の標識デオキシヌクレオシド三リン酸に関する。一実施形態では、前記核酸塩基は天然核酸塩基アナログである。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンを含む群から選択される非天然核酸塩基アナログである。アナログの場合には、検出可能な標識は、核酸塩基と前記検出可能な標識の間のリンカーセクションも含んでもよい。一実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、独立して、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＮ、および−Ｎ＝Ｎ−、アルキル、アリール、分枝状アルキル、分枝状アリールまたはこれらの組合せを含む群から選択される。Ｌ２は「−Ｓ−」でないことが好ましい。一実施形態では、本発明は、Ｌ１が、塩基におけるアミンまたは塩基におけるヒドロキシルのいずれかであることを企図する。一実施形態では、前記標識は、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチン、およびハプテンからなる群から選択される。一実施形態では、前記標識は検出可能な標識である。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
［式中、Ｄは、ジスルフィドアリル基、およびジスルフィド置換アリル基からなる群から選択され；Ｂは核酸塩基であり；Ａは付着基であり；Ｃは、切断可能な部位のコアであり；Ｌ１およびＬ２は接続基であり；Ｌａｂｅｌは標識（例えば、検出可能な部位）である］に記載の標識デオキシヌクレオシド三リン酸に関する。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
（式中、Ｄは、アジド基、ジスルフィドアルキル基、ジスルフィド置換アルキル基からなる群から選択され；Ｂは核酸塩基であり；Ａは付着基であり；Ｃは、切断可能な部位のコアであり；Ｌ１およびＬ２は接続基であり；Ｌａｂｅｌは標識である）に記載の標識デオキシヌクレオシド三リン酸に関する。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基アナログである。一実施形態では、前記付着基Ａは、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミン、およびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される化学基である。一実施形態では、前記切断可能な部位のコアは、
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である）からなる群から選択される。一実施形態では、Ｌ１は、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＮＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、および−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−からなる群から選択され、ｘは０〜１０であるが、より好ましくは１〜６である。一実施形態では、Ｌ２は、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−からなる群から選択され、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して、０〜１０から選択されるが、より好ましくは１〜６から選択される。一実施形態では、前記標識は、蛍光色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチン、およびハプテンからなる群から選択される。一実施形態では、前記化合物は、構造：
（式中、前記標識は色素である）を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。
一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。
一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。
一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。
一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
（式中、Ｂは核酸塩基である）に記載のデオキシヌクレオシド三リン酸に関する。
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の配列決定試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）および標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によって３’−Ｏでキャップされた、少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸を含むキットに関する。一実施形態では、前記核酸塩基は天然核酸塩基アナログである。一実施形態では、前記ヌクレオシドの核酸塩基は非天然である。一実施形態では、前記ヌクレオシドの非天然核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンを含む群から選択される。
本発明はまた、混合物、すなわち、１つまたは複数のさらなる試薬（乾燥しているか溶液中にあるかにかかわらず）との混合物中の、標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によって３’−Ｏでキャップされた、少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸も企図する。一実施形態では、本発明は、核酸鋳型を、前記鋳型にハイブリダイズしたプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに核酸塩基、標識および糖、標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含む少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸と共に含む反応混合物であって、前記糖が、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏを含み、前記ヌクレオシドが、前記ヌクレオシドの核酸塩基に共有結合により結合した検出可能な標識をさらに含む、反応混合物に関する。
一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ合成反応を実施する方法であって、ａ）核酸鋳型を、前記鋳型にハイブリダイズしたプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏと共に含む少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸と共に含む反応混合物を提供するステップと、ｂ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供するステップとを含む、方法に関する。このことにより、少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸（標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏと共に含む）の結合プライマーへの組込みが可能となる。一実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応は、配列決定反応（例えば、ＳＢＳ）の部分である。一実施形態では、前記検出可能な標識は、還元剤への曝露によって、前記核酸塩基から除去される。本発明は、１つのタイプの還元剤に限定することを意図するものではない。ジスルフィド結合を還元することが可能である任意の適切な還元剤を使用して本発明を実践することができる。一実施形態では、還元剤は、ホスフィン［１２］、例えば、トリフェニルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリヒドロキシメチルホスフィン、トリヒドロキシプロピルホスフィン、トリスカルボエトキシホスフィン（ＴＣＥＰ）［１３、１４］である。一実施形態では、前記還元剤はＴＣＥＰである。一実施形態では、前記検出可能な標識および３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｒ基は、ジチオ系リンカーおよび終結（保護）基の切断を実施するために、チオール基を有する化合物への曝露によって前記核酸塩基から除去され［１５］、このようなチオール含有化合物は、（これらに限定されないが）システイン、システアミン、ジチオコハク酸、ジチオスレイトール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオブチルアミン［１６］、メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、２−メルカプト−エタンスルホネート、およびＮ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジン［１７］を含む。反応は、セレノールの包含によってさらに触媒され得る［１８］。さらに、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化ホウ素をこの目的のために使用することもできる［１９］（アスコルビン酸も同様［２０］）。さらに、ジスルフィドおよびチオレダクターゼなどの、ジスルフィド結合の切断のための酵素的方法もまた公知であり、本発明の化合物と共に使用することができる［２１］。
一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ配列を解析するための方法であって、ａ）核酸鋳型を、プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成する前記鋳型にハイブリダイズしたプライマーと共に含む反応混合物を提供するステップと、ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに核酸塩基、標識と核酸塩基の間の切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏと共に含む第１のデオキシヌクレオシド三リン酸を添加するステップと、ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にして改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製する条件に供するステップと、ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記デオキシヌクレオシド三リン酸の前記第１の検出可能な標識を検出するステップとを含む、方法に関する。一実施形態では、検出するステップは、どのタイプのアナログ（Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵ）が組み込まれたかを決定することを可能にする。一実施形態では、方法は、ｅ）前記切断可能な保護基および任意選択で前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去するステップと；ｆ）ステップｂ）からｅ）を少なくとも１回繰り返すステップ（典型的には、これらのステップを多数回、例えば、１０〜２００回繰り返すステップ）をさらに含む。一実施形態では、切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーは、疎水性であり、０より大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーは、疎水性であり、０．１より大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーは、疎水性であり、１．０より大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、方法は、ステップｂ）の繰り返しの間に、第２のデオキシヌクレオシド三リン酸を添加するステップをさらに含み、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸は第２の検出可能な標識を含み、前記第２の検出可能な標識は前記第１の検出可能な標識と異なる。一実施形態では、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基は、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基と異なる。一実施形態では、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵのアナログを表す、少なくとも４種の異なって標識された、３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャップされたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物の混合物は、ステップｂ）で使用される。一実施形態では、少なくとも４種の異なって標識された、３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャップされたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物の、構造：
との前記混合物は、ステップｂ）で使用される。一実施形態では、前記混合物は、ステップｂ）でも使用される構造：
を有するものなどの未標識３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャップされたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物をさらに含む。一実施形態では、ステップｅ）は、前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を還元剤に曝露することによって実施される。一実施形態では、前記還元剤はＴＣＥＰである。一実施形態では、前記検出可能な標識は、ジチオ系リンカーおよび終結（保護）基の切断を実施するために、チオール基を有する化合物への曝露によって前記核酸塩基から除去され、このようなチオール含有化合物は、（これらに限定されないが）システイン、システアミン、ジチオコハク酸、ジチオスレイトール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオブチルアミン、メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、２−メルカプト−エタンスルホネート、およびＮ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジンを含む。
本発明は、特定の配列決定プラットフォームに限定されることを意図しない。しかし、好ましい機器は、ＱＩＡＧＥＮ’ｓ ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ ＤＮＡ配列決定システム（ＧＲ）である。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、合成による配列決定法（ＳＢＳ）によって決定される。一実施形態では、配列決定の各サイクルは、８つのステップからなる：伸長１、伸長２、洗浄１、イメージングソリューションの添加、イメージング、洗浄２、切断、および洗浄３。イメージングサイクルの間に集めたデータは、誤り率、スループット値、および適用される位相補正値を与える解析ソフトウェアで処理される。別の実施形態では、酸化的洗浄液（Ｗａｓｈ １１）は切断ステップ後に使用される（図９３を参照のこと）。
同一または類似の方法により、一般的に、他のＳＢＳプラットフォーム（すなわち、同様の条件下で作動する任意の合成による配列決定法）、およびＩｌｌｕｍｉｎａからのＨｉＳｅｑおよびｍｉＳｅｑプラットフォーム；Ｒｏｃｈｅ ４５４；Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭおよびＰｒｏｔｏｎプラットフォーム；ならびにＰａｃｉｆｉｃＢｉｏプラットフォームなどの特異的ＳＢＳプラットフォームの性能を改良することができることを企図する。
本発明は、１つのタイプの配列決定のみに限定されることを意図するものではない。一実施形態では、前記デオキシヌクレオシド三リン酸（核酸塩基、標識および糖、標識と核酸塩基の間の切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、前記糖は、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏを含む）は、ピロシーケンスにおいて使用されてもよい。
一実施形態では、本発明は、核酸塩基と糖とを含むデオキシヌクレオシド三リン酸であって、前記核酸塩基が切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合した検出可能な標識を含み、前記糖が、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィド基を含む基によってキャップされた３’−Ｏを含む、デオキシヌクレオシド三リン酸に関する。一実施形態では、前記ヌクレオシドは、ポリメラーゼ（またはいくつかの他の配列決定試薬）との混合物中にある。一実施形態では、前記ヌクレオシドの核酸塩基は非天然である。一実施形態では、前記ヌクレオシドの非天然核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンを含む群から選択される。一実施形態では、メチレンジスルフィド基を含む前記基は、式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒのものであり、式中、Ｒは、アルキル基および置換アルキル基を含む群から選択される。一実施形態では、前記混合物はプライマーをさらに含む。一実施形態では、前記プライマーは核酸鋳型にハイブリダイズされる。一実施形態では、前記検出可能な標識は蛍光標識である。一実施形態では、前記核酸鋳型は固定されている（例えば、ウェル、チャネルまたは他の構造中に、あるいは代替的にビーズに）。
一実施形態では、本発明は、３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）核酸塩基および糖を含む５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシド、およびｉｉ）メチルチオメチルドナーを提供するステップと；ｂ）前記５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを作製する条件下で処理するステップとを含む、方法に関する。一実施形態では、前記メチルチオメチルドナーはＤＭＳＯである。一実施形態では、前記条件は酸性条件を含む。一実施形態では、前記５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドは、前記ヌクレオシドの核酸塩基に保護基を含む。一実施形態では、前記３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドは、カラムクロマトグラフィーで精製される。
一実施形態では、本発明は、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）ｉ）３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシド、およびｉｉ）Ｒ−ＳＨ（式中、Ｒは、アルキル基または置換アルキル基を含む）を提供するステップと；ｂ）前記３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを作製する条件下で処理するステップとを含む、方法に関する。一実施形態では、前記Ｒ−ＳＨはエタンチオールである。一実施形態では、前記条件は塩基性条件を含む。
一実施形態では、本発明は、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを提供するステップと；ｂ）前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを作製する条件下で処理するステップとを含む、方法に関する。一実施形態では、前記条件は、前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドをＮＨ４Ｆに曝露することを含む。
一実施形態では、本発明は、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドの三リン酸を調製する方法であって、ａ）３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを提供するステップと；ｂ）前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドの三リン酸を作製する条件下で処理するステップとを含む、方法に関する。一実施形態では、前記条件は、前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを、ＰＯＣｌ３およびＢｕ３Ｎをと共に（ＭｅＯ）３ＰＯに曝露することを含む。一実施形態では、前記方法は、前記核酸塩基保護基の除去であるステップｃ）をさらに含む。一実施形態では、前記保護基は、Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル保護基を含む。一実施形態では、前記Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル保護基を、加溶媒分解によって除去して、５’−Ｏ−（トリホスフェート）−３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５−（アミノプロパルギル）−２’−デオキシヌクレオシドを生成する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、構造が：
である化合物に関する。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
（式中、Ｒは、アルキル基、置換アルキル基、アリル、置換アリルからなる群から選択され；Ｂは核酸塩基であり；Ａは付着基であり；Ｃは、切断可能な部位のコアであり；Ｌ１およびＬ２は接続基であり；Ｌａｂｅｌは標識である）に記載の標識デオキシヌクレオシド三リン酸に関する。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基アナログである。一実施形態では、前記付着基Ａは、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミン、およびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される化学基である。一実施形態では、前記切断可能な部位のコアは、
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である）からなる群から選択される。一実施形態では、Ｌ１は、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−からなる群から選択され、ｘは０〜１０であるが、より好ましくは１〜６である。一実施形態では、Ｌ２は、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−からなる群から選択され、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して、０〜１０から選択されるが、より好ましくは１〜６から選択される。一実施形態では、前記標識は、蛍光色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチン、およびハプテンからなる群から選択される。一実施形態では、前記化合物は、構造：
（式中、前記標識は色素であり、Ｒは、アルキル基、置換アルキル基、アリル、置換アリルからなる群から選択される）を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
（式中、前記標識は色素である）を有する。
一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
［式中Ｄは、アジド（−Ｎ３）基、ジスルフィドアルキル（−ＳＳ−Ｒ）基およびジスルフィド置換アルキル基からなる群から選択され、Ｂは核酸塩基であり、Ａは付着基であり、Ｃは切断可能な部位のコアであり、Ｌ１およびＬ２は接続基であり；Ｌａｂｅｌは標識である］に記載の標識デオキシヌクレオシド三リン酸に関する。一実施形態では、前記核酸塩基は天然核酸塩基である。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基アナログである。一実施形態では、前記付着基（Ａ）は、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミン、およびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される化学基である。一実施形態では、前記切断可能な（Ｃ）部位のコアは、
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である）からなる群から選択される。一実施形態では、前記切断可能な部位のコアは、
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である）からなる群から選択される。一実施形態では、Ｌ１は、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＮＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、および−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−からなる群から選択され、ｘは、０〜１００である。一部の実施形態では、ｘは、０〜１０であるが、より好ましくは１〜６である。Ｌ２は、
、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−からなる群から選択され、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して、０〜１０から選択されるが、より好ましくは１〜６から選択される。一部の実施形態では、Ｌ２は、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−からなる群から選択され、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して、０〜１００から選択される。一部の実施形態では、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して、０〜１０から選択されるが、より好ましくは１〜６から選択される。一実施形態では、前記標識は、蛍光色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチン、およびハプテンからなる群から選択される。一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
を有する。
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、化合物は、以下の構造（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他のアナログヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図面における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
一実施形態では、本発明は、非標識化合物を企図する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
（式中、Ｒは、アルキル基、置換アルキル基、アリル、置換アリルからなる群から選択され；Ｂは核酸塩基である）を有する。一実施形態では、化合物は、構造（ここでも、Ｂは核酸塩基である）：
を有する。
一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記化合物は、構造：
を有する。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基アナログである。
一実施形態では、本発明は、図４３に示される、３’−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオールヌクレオシドを中間体として、ならびにＤＭＴＳＦおよびジメチルジスルフィドを硫黄源として使用して、３’−ＯＣＨ２−ＳＳＭｅヌクレオチドアナログを合成する方法に関する。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
［式中、Ｄは、アジド基、ジスルフィドアルキル基、ジスルフィド置換アルキル基、ジスルフィドアリル基、およびジスルフィド置換アリル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；リンカーは、切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有部位のコアを含む］
に記載の標識デオキシヌクレオシド三リン酸に関する。一実施形態では、前記切断可能な部位のコアは、
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基であり；Ｌａｂｅｌは、標識である）からなる群から選択される。一実施形態では、前記リンカーは疎水性である。一実施形態では、前記リンカーは、０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、前記リンカーは、０．１よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、前記リンカーは、０．５よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、前記リンカーは、１．０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下で定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の実体のみを指すことを意図しておらず、その具体例が例証に使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書における術語は、本発明の具体的な実施形態について記載するために使用されるが、それらの用法は、特許請求の範囲に概説されている場合を除き、本発明の限界を定めるものではない。
本明細書で使用される場合、「水素」は、−Ｈを意味し；「ヒドロキシ」は、−ＯＨを意味し；「オキソ」は、＝Ｏを意味し；「ハロ」は、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを意味し；「アミノ」は、−ＮＨ２（用語アミノを含有する基、例えば、アルキルアミノの定義については、以下を参照）を意味し；「ヒドロキシアミノ」は、−ＮＨＯＨを意味し；「ニトロ」は、−ＮＯ２を意味し；「イミノ」は、＝ＮＨ（用語イミノを含有する基、例えば、アルキルアミノの定義については、以下を参照）を意味し；「シアノ」は、−ＣＮを意味し；「アジド」は、−Ｎ３を意味し；「メルカプト」は、−ＳＨを意味し；「チオ」は、＝Ｓを意味し；「スルホンアミド」は、−ＮＨＳ（Ｏ）２−（用語スルホンアミドを含有する基、例えば、アルキルスルホンアミドの定義については、以下を参照）を意味し；「スルホニル」は、−Ｓ（Ｏ）２−（用語スルホニルを含有する基、例えば、アルキルスルホニルの定義については、以下を参照）を意味し；「シリル」は、−ＳｉＨ３（用語シリルを含有する基、例えば、アルキルシリルの定義については、以下を参照）を意味する。
本明細書で使用される場合、「メチレン」は、炭素原子が２つの水素原子と結合した化学種を意味する。−ＣＨ２−基は、標準的なメチレン基であると考えられる。鎖または環中のメチレン基は、そのサイズおよび親油性に寄与する。この文脈において、ジデオキシは、メチレン基も指す。特に、２，３−ジデオキシ化合物は、２，３−メチレン（２，３−メチレン−グリコシド＝２，３−ジデオキシ−グリコシド）と同じである。
以下の基について、以下の括弧付きの添字は、基を次のようにさらに定義する：「（Ｃｎ）」は、基中の炭素原子の正確な数（ｎ）を定義し；「（Ｃ≦ｎ）」は、基中にあり得る炭素原子の最大数（ｎ）を定義し；（Ｃｎ〜ｎ’）は、基中の炭素原子の最小数（ｎ）および最大数（ｎ’）の両方を定義する。例えば、「アルコキシ（Ｃ≦１０）」は、１から１０個までの炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個、またはその中から導出できる任意の範囲（例えば、３〜１０個の炭素原子））を有するアルコキシ基を指定する。同様に、「アルキル（Ｃ２〜１０）」は、２から１０個までの炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個、またはその中から導出できる任意の範囲（例えば、３〜１０個の炭素原子））を有するアルキル基を指定する。
用語「アルキル」は、「置換」という修飾句なしで使用される場合、結合点としての飽和炭素原子、直鎖状または分枝状、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素−炭素二重結合または三重結合を有さず、炭素および水素以外の原子を有さない、非芳香族一価の基を指す。基−ＣＨ３（Ｍｅ）、−ＣＨ２ＣＨ３（Ｅｔ）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ−Ｐｒ）、−ＣＨ（ＣＨ３）２（イソ−Ｐｒまたはｉ−Ｐｒ）、−ＣＨ（ＣＨ２）２（シクロプロピル）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ−Ｂｕ）、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（ｓｅｃ−ブチルまたはｓｅｃ−Ｂｕ）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（イソ−ブチルまたはｉ−Ｂｕ）、−Ｃ（ＣＨ３）３（ｔｅｒｔ−ブチルまたはｔ−Ｂｕ）、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３（ネオ−ペンチル）、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチルは、アルキル基の非限定例である。用語「置換アルキル」は、結合点としての飽和炭素原子、直鎖状または分枝状、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素−炭素二重結合または三重結合を有さず、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、Ｐ、およびＳからなる群から独立して選択される少なくとも１つの原子を有する、非芳香族一価の基を指す。以下の基は、置換アルキル基の非限定例である：−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３、および−ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３。
用語「切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー」および「切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカー」は、リンカーがオキシメチレンジスルフィド基を含むことを示すことを意味し、オキシメチレンジスルフィド基のみに限定されるのではなく、むしろ、例えば図２５の化合物に見られるような、まさにその基だけではないものを含有し得るリンカーであると考えられる。同様に、用語「オキシメチレンジスルフィド部位のコア」および「オキシメチレンジスルフィド含有部位のコア」は、部位のコアが、オキシメチレンジスルフィド基を含むことを示すことを意味し、オキシメチレンジスルフィド基のみに限定されるのではなく、むしろ、まさにその基だけではないものを含有し得る部位のコアであると考えられる。
用語「核酸」は、一般的に、増幅生成物、合成的により生じたＲＮＡの逆転写生成物、または天然に存在するもののいずれであるかにかかわらず、ＤＮＡまたはＲＮＡの両方を指す。典型的には、核酸は、一本鎖または二本鎖分子であり、天然に存在するヌクレオチドで構成される。二本鎖核酸分子は、３’−または５’−突出を有し得、そのため、その全長にわたって完全に二本鎖であることを要求も想定もされていない。さらに、核酸は、天然に存在しないヌクレオチドおよび／または天然に存在するヌクレオチドへの修飾で構成され得る。本明細書において列挙される例は、ライゲーションまたはエキソヌクレアーゼ分解／ポリメラーゼ伸長の防止をそれぞれ可能にするための、５’または３’ヌクレオチドのリン酸化；共有結合および共有結合に類似した結合のための、アミノ、チオール、アルキン、またはビオチニル修飾；フルオロフォアおよび消光剤；分解を防止するためのヌクレオチド間のホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデートおよびホスホトリエステル結合；メチル化；ならびに、デオキシ−イノシン、５−ブロモ−ｄＵ、２’−デオキシ−ウリジン、２−アミノプリン、２’，３’−ジデオキシ−シチジン、５−メチル−ｄＣ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、イソ−ｄＣおよび−ｄＧ塩基、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基ならびにフッ素修飾ヌクレオシドなどの、修飾塩基またはヌクレオシドであるがこれらに限定されない。
本明細書において企図される方法の一部では、プライマーは、配列決定される鋳型の少なくとも一部に対して少なくとも部分的に相補的である。用語「相補的」は、一般的に、適当な温度およびイオン性緩衝液条件で、２つのヌクレオチドの塩基（例えば、ＡとＴ）の間に、好適な熱力学的安定性および特異的な対合を形成する能力を指す。この対合は、各ヌクレオチドの水素結合特性に依存する。この最も基本的な例は、チミン／アデニンとシトシン／グアニン塩基の間の水素結合対である。本発明において、標的核酸の増幅のためのプライマーは、その全長にわたって標的核酸分子と完全相補的または「半相補的」の両方であってよく、ここで、プライマーは、標的核酸へのハイブリダイゼーションが最小限に可能であるかまたは不可能である、さらなる非相補的配列を含有する。
用語「ハイブリダイズする」は、一般的に、それらのヌクレオチド配列と一致する、異なる核酸分子間の塩基対合を指す。用語「ハイブリダイズする」および「アニールする」は、互換的に使用され得る。
用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、典型的には、一本鎖ＤＮＡかつ長さ７５ヌクレオチド未満となるように設計されている核酸配列を指す。
用語「プライマー」は、一般的に、核酸配列にアニールし、またはハイブリダイズし、十分条件下で（緩衝液、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、一価および二価の塩、温度など）、プライマーが相補的である核酸の伸長を可能にすることができるオリゴヌクレオチドを指す。
用語「鋳型核酸」、「鋳型分子」、「標的核酸」、および「標的分子」は、互換的に使用することができ、その配列情報を導出するために配列決定反応によって任意選択で問い合わせされ得る増幅反応の対象である核酸分子を指す。鋳型核酸は、クローン増幅法によって発生した、固体表面に固定され、すなわち、ビーズまたはアレイに固定化され得る、核酸であってもよい。
用語「ヌクレオシド」は、糖、例えば、リボースまたはデオキシリボースのＣ−１’炭素と連結している塩基からなる化合物を指す。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基、例えば、プリンまたはピリミジンである。
用語「ヌクレオチド」は、モノマー単位としての、またはポリヌクレオチド内の、ヌクレオシドのリン酸エステルを指す。「ヌクレオシド５’−三リン酸」は、三リン酸エステル基が糖５’−炭素位に結合したヌクレオチドを指し、「ＮＴＰ」、「ｄＮＴＰ」（２’−デオキシヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸）および「ｄｄＮＴＰ」（２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸またはジデオキシヌクレオシド三リン酸）として表記されることがある。「ヌクレオシド５’−四リン酸」は、四リン酸エステル基が糖５’−炭素位に結合した代替的な活性化ヌクレオチドを指す。ＰＡ−ヌクレオチドは、プロパルギルアナログを指す。
用語「保護基」は、この用語が本明細書および／または特許請求の範囲において使用される場合、所望の反応のある特定の条件下で官能基を可逆的に非反応性にする基として従来の化学的な意味で使用され、Ｈではないと理解されている。所望の反応後、保護基を除去して、保護された官能基を脱保護することができる。好ましい実施形態では、すべての保護基は、合成されている分子の実質的な割合を減少させない条件下で、除去可能（したがって、不安定）であるべきである。保護基は、「キャッピング基」または「遮断基」または「切断可能な保護基」とも称される場合がある。便宜上、保護基によって保護された官能基は、保護基の一部として示されるかまたは称されてもよいことに留意すべきである。本明細書で記載されるヌクレオチド誘導体の文脈において、保護基は、３’位において使用される。本発明が、配列決定において使用される可逆的終結ヌクレオチドにおけるこの保護基の性質または化学によって限定されることを意図するものではない。３’−Ｏ−アジドメチルヌクレオチド、３’−Ｏ−アミノキシヌクレオチド、３’−Ｏ−アリルヌクレオチド；およびジスルフィドヌクレオチド、３’−Ｏ−アジドアルキル、３’−Ｏ−ジチオメチルアルキル、３’−Ｏ−ジチオメチルアリール、３’−Ｏ−アセチル、３’−Ｏ−カルバゼート、３’−Ｏ−アルキルエーテル、３’−Ｏ−アルキルエステル、３’−Ｏ−アルドキシム（−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ）、３’−Ｏ−ケトキシム（−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ，Ｒ’））を含むがこれらに限定されない多様な保護基が、この目的のために企図される。
本発明の一実施形態は、ヌクレオチドの３’−ＯＨ官能基に、保護基の官能基化を介してマーカーを直接結合させることを企図する。
用語「標識」または「検出可能な標識」は、その最も広い意味において、検出可能である、またはそれに関連しているものの検出を可能にする任意の部分または特性を指す。例えば、標識を含むヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、検出可能である。理想的には、標識オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、特に、標識されたヌクレオチドが、酵素的手段によって、プライマーおよび鋳型核酸のハイブリダイゼーション複合体に組み込まれた後の、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする。標識は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに、共有結合的にまたは非共有結合的に結合してもよい。種々の態様では、標識は、代替的にまたは組み合わせて：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第２の標識、例えば、ＦＲＥＴによって提供される検出可能なシグナルを修飾する；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、例えば、二重鎖形成を安定させる；（ｉｖ）捕捉機能、例えば、疎水性親和性、抗体／抗原、イオン複合体形成を付与する、または（ｖ）電気泳動移動度、疎水性、親水性、溶解度、もしくはクロマトグラフ挙動などの物理的特性を変化させることができる。標識は、それらの構造およびそれらの作用機序において広く変化する。標識の例は、蛍光標識、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどを含む）などを含むがこれらに限定されない。さらに例証するために、蛍光標識は、フルオレセインファミリーの色素、ローダミンファミリーの色素、シアニンファミリーの色素、もしくはクマリン（coumarine）、オキサジン、ボラジアザインダセンまたはそれらの任意の誘導体を含んでよい。フルオレセインファミリーの色素は、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮおよびＺＯＥを含む。ローダミンファミリーの色素は、例えば、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡを含む。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）から市販されており、テキサスレッドは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）から市販されている。シアニンファミリーの色素は、例えば、ＣＹ２、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ５．５およびＣＹ７を含み、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）から市販されている。
用語「異なって標識された」は、本明細書で使用される場合、標識ヌクレオシドの核酸塩基上の異なる位置に標識が見出されるのではなく、検出可能な標識が異なる標識であることを指す。
用語「Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵのアナログ」は、修飾デオキシヌクレオシド三リン酸化合物を指し、ここで、前記デオキシヌクレオシドの核酸塩基は、対応するヌクレオシドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、およびチミジンまたはデオキシウリジンに非常に似ている。検出可能な標識デオキシヌクレオシド三リン酸化合物の場合には、Ａのアナログまたはデオキシアデノシンは、
として表され得るが、核酸塩基と標識の間にリンカーがあることが好ましい。検出可能な標識デオキシヌクレオシド三リン酸化合物の場合には、Ｇのアナログまたはデオキシグアノシンは、
として表され得るが、核酸塩基と標識の間にリンカーがあることが好ましい。検出可能な標識デオキシヌクレオシド三リン酸化合物の場合には、Ｃのアナログまたはデオキシシチジンは、
として表され得るが、核酸塩基と標識の間にリンカーがあることが好ましい。検出可能な標識デオキシヌクレオシド三リン酸化合物の場合には、ＴもしくはＵのアナログまたはチミジンもしくはデオキシウリジンは、
として表され得るが、核酸塩基と標識の間にリンカーがあることが好ましい。さらなる核酸塩基として、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ，７−デアザアデニン、および２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基を挙げることができる。アナログの場合には、検出可能な標識は、核酸塩基と前記検出可能な標識の間にリンカーセクションを含んでもよい。
用語「ＴＣＥＰ」または「トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）」は、生化学および分子生物学適用において頻繁に使用される還元剤を指す。これは、多くの場合、２８６．６５グラム／ｍｏｌの分子量を有する塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）として調製および使用される。これは、水溶性であり、中性ｐＨで安定化された溶液として利用可能であり、還元剤の除去を容易にするためにアガロース支持体上に固定される。本発明が、１種類の還元剤に限定されることを意図するものではない。ジスルフィド結合を還元することができる任意の適切な還元剤を、本発明を実践するために使用することができる。一実施形態では、還元剤は、ホスフィン［１２］、例えば、トリフェニルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリヒドロキシメチルホスフィン、トリヒドロキシプロピルホスフィン、トリスカルボエトキシ−ホスフィン（ＴＣＥＰ）［１３、１４］である。本発明が、ＴＣＥＰの使用に限定されることを意図するものではない。一実施形態では、前記検出可能な標識および３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｒ基は、ジチオ系リンカーおよび終結（保護）基の切断を実施するように、チオール基を有する化合物への曝露によって前記核酸塩基から除去され、このようなチオール含有化合物は、システイン、システアミン、ジチオ−コハク酸、ジチオスレイトール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオブチルアミン、メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、２−メルカプト−エタンスルホネート、およびＮ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジン［１７］を含む（がこれらに限定されない）。反応を、セレノールの包含によってさらに触媒することができる［１８］。さらに、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化ホウ素をこの目的のために使用することもできる［１９］（アスコルビン酸も同様［２０］）。さらに、ジスルフィドおよびチオレダクターゼなどの、ジスルフィド結合の切断のための酵素的方法も周知であり、本発明の化合物と共に使用することができる［２１］。
ＣＨＥＳとしても公知のＮ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸は緩衝剤である。
高ｐＨは９．０〜１０．０の範囲のｐＨ、例えば、ｐＨ９．５と定義される。低ｐＨは８．５およびそれより低いと定義される。
ＦＦＰＥ試料型のＡＴＰは、ＡＴＰｆ（ＦＦＰＥに対する「ｆ」）として示される。
液体生検試料型のＡＴＰは、ＡＴＰｐ（血漿（ｐｌａｓｍａ）に対する「ｐ」）として示される。
「Ａｃｒｏｍｅｔｒｉｘ」は、使用される市販のＤＮＡ試料型を指す。
反応は、様々は場所、例えば、ウェル、チャネル、スライド、フローセルなどで起こり得る。フローセルは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９４０，４８１号に記載されるチャネルを有することができる。フローセルは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９００，８１０号に記載される機器内の移動支持体上に存在し得る。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例証し、説明と共に本発明の原理を説明するために役立つ。図面は、本発明の好ましい実施形態を例証する目的のために限られ、本発明を制限すると解釈すべきではない。
図１は、メチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏを有するヌクレオシド三リン酸の例を示し、Ｒは、アルキル基、例えばメチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、またはＯ、Ｎ、Ｓ等などのヘテロ原子を含有する置換基を有するそのアナログを表す。
図２は、３’−Ｏメチレンジスルフィド含有保護基を有するヌクレオシド三リン酸の標識されたアナログを示し、標識は、切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）を介して核酸塩基に結合している。アナログは、（左上から時計回りに）デオキシアデノシン、チミジンまたはデオキシウリジン、デオキシシチジン、およびデオキシグアノシンである。
図３は、ＴＣＥＰなどの還元剤による３’−Ｏ保護基の脱保護の段階的機構を示す。
図４は、従来のスルフィドおよびオキシメチレンスルフィド連結された標識ヌクレオチドの切断反応生成物を示す。
図５は、切断可能リンカーのスペーサーがプロパルギルエーテルリンカーを含む、標識ヌクレオチドの例を示す。アナログは、（左上から時計回りに）デオキシアデノシン、チミジンまたはデオキシウリジン、デオキシシチジン、およびデオキシグアノシンである。
図６は、切断可能リンカーのスペーサーがプロパルギルアミンリンカーを含む、標識ヌクレオチドの例を示す。アナログは、（左上から時計回りに）デオキシアデノシン、チミジンまたはデオキシウリジン、デオキシシチジン、およびデオキシグアノシンである。
図７は、切断可能リンカーのスペーサーがピリミジンの５位およびプリンの７−デ−アザ炭素で核酸塩基に直接結合したメチレン（−（ＣＨ２）ｎ−を含む、標識ヌクレオチドの例を示す。このリンカーは、切断後に、リンカーが核酸塩基の結合点で−（ＣＨ２）ｎＯＨ基を生成し、Ｌ１およびＬ２がスペーサーを表し、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が先に記載した切断可能リンカーに安定性を提供する原子の群である、メチレン（ｎ＝１）またはポリメチレン（ｎ＞１）であり得る。アナログは、（左上から時計回りに）デオキシアデノシン、チミジンまたはデオキシウリジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンである。
図８は、非標識ｄＴアナログ（化合物５）の合成を示す。
図９は、３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−ｄＣＴＰ（１０）の合成を示す。
図１０は、標識ｄＴ中間体に対して特異的な標識ヌクレオチドの合成経路を示す。
図１１は、１，４−ブタンジオール（dutanediol）から出発する切断可能リンカーの合成を示す。
図１２は、安定化ｇｅｍ−ジメチル基が切断可能リンカーのα炭素に結合している、切断可能リンカーの別のバリアントを示す。
図１３は、ジスルフィドがｇｅｍ−ジメチル基に隣接し、フレキシブルエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）に結合している、切断可能リンカーの合成を示す。リンカーは、カルバメート基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）を介してＰＡ−ヌクレオチドに結合する。そのような場合に得られたヌクレオチドアナログは、化合物３５（ｄＵＴＰアナログ）と同様であり得る。
図１４は、切断可能なジスルフィドがｇｅｍ−ジメチル基に隣接し、リンカーがウレア基（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−）を介してＰＡ−ヌクレオチドに結合している、ｄＡＴＰアナログに関する切断可能リンカーの合成を示す。他のヌクレオチドアナログ（例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰのアナログ）に関しても、反応順序の最後のステップで４２を適切なＰＡ−アナログに置き換えることによって同様に合成することができる。
図１５は、リンカーがウレア官能基を介してＰＡ−ヌクレオチドに繋がれており、ジスルフィドが２炭素リンカーによって色素に接続している、切断可能リンカー化合物４５の合成を示す。そのような場合に得られたヌクレオチドアナログは、化合物４９（ｄＧＴＰアナログ）と同様であり得る。他のヌクレオチドアナログ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰのアナログ）も、反応順序の第３のステップでヌクレオチド４６を適切なＰＡ−ヌクレオチドアナログに置き換えることによって同様に合成することができる。
図１６は、標識ヌクレオチド５０を、１０当量のＴＣＥＰに６５℃で曝露すると、予想される生成物５１と共に、化合物５２を含む複数の副生成物を生成したことを示す。
図１７ＡおよびＢは、５分間の曝露後に分析した、２９２ｎｍ（図１７Ｂ）および５２４ｎｍ（図１７Ａ）で抽出した化合物５０のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、１１．０８分のピークは化合物５１に対応し、１０．８８分のピークは化合物５２に対応し、他のピークは副生成物に対応する。 図１７ＡおよびＢは、５分間の曝露後に分析した、２９２ｎｍ（図１７Ｂ）および５２４ｎｍ（図１７Ａ）で抽出した化合物５０のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、１１．０８分のピークは化合物５１に対応し、１０．８８分のピークは化合物５２に対応し、他のピークは副生成物に対応する。
図１８ＡおよびＢは、１５分間の曝露後に分析した、２９２ｎｍ（図１８Ｂ）および５２４ｎｍ（図１８Ａ）で抽出した化合物５０のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、１１．３２分のピークは化合物５１に対応し、他のピークは副生成物に対応する。 図１８ＡおよびＢは、１５分間の曝露後に分析した、２９２ｎｍ（図１８Ｂ）および５２４ｎｍ（図１８Ａ）で抽出した化合物５０のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、１１．３２分のピークは化合物５１に対応し、他のピークは副生成物に対応する。
図１９は、同一の切断条件下で、オキシメチレンジスルフィド連結ヌクレオチド３５が所望の切断生成物、化合物５３および５４をきれいに産生したことを示す。リンカーのメチレンチオール部分（−ＣＨ２ＳＨ）は、ジスルフィド基の切断時にヌクレオチドから完全に除去された。
図２０ＡおよびＢは、５分間曝露後に分析した、２９２ｎｍ（図２０Ｂ）および５２４ｎｍ（図２０Ａ）で抽出した化合物３５のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、１１．２４分のピークは化合物５３に対応し、３４．７０分のピークは、化合物５４に対応する。 図２０ＡおよびＢは、５分間曝露後に分析した、２９２ｎｍ（図２０Ｂ）および５２４ｎｍ（図２０Ａ）で抽出した化合物３５のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、１１．２４分のピークは化合物５３に対応し、３４．７０分のピークは、化合物５４に対応する。
図２１ＡおよびＢは、１５分間曝露後に分析した、２９２ｎｍ（図２１Ｂ）および５２４ｎｍ（図２１Ａ）で抽出した化合物３５のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、１１．２５分のピークは化合物５３に対応し、３４．７０分のピークは化合物５４に対応する。 図２１ＡおよびＢは、１５分間曝露後に分析した、２９２ｎｍ（図２１Ｂ）および５２４ｎｍ（図２１Ａ）で抽出した化合物３５のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、１１．２５分のピークは化合物５３に対応し、３４．７０分のピークは化合物５４に対応する。
図２２は、３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ（図１０）の合成とは異なる、適切なステップでメルカプトエタノール（ＥｔＳＨ）をメタンチオールまたはチオメトキシドナトリウムに置き換えることによる３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅアナログの合成を示す。
図２３は、活性化リンカー３２を使用した、適切な切断可能−ＯＣＨ２−ＳＳ−リンカーへの、および最終的にフルオロフォア色素へのＰＡ−ヌクレオチド（例えば、５７）のカップリングを示す。
図２４は、得られた異なるリンカーを有するヌクレオチドアナログ、化合物６０および６１を示す。
図２５は、ＲがＭｅ−またはＥｔ−である、異なるフルオロフォア報告基によって標識された４つのヌクレオチドアナログの構造を示す。
図２６は、ＲがＭｅ−基またはＥｔ−基である、異なるフルオロフォア報告基によって標識された４つのヌクレオチドアナログの構造を示す。
図２７は、ＲがＭｅ−基またはＥｔ−基である、異なるフルオロフォア報告基によって標識された４つのヌクレオチドアナログの構造を示す。
図２８は、本発明の新規切断可能リンカーを含む一般的な普遍的構築ブロック構造を示す。ＰＧ＝保護基、Ｌ１、Ｌ２＝リンカー（脂肪族、芳香族、混合極性の直鎖または分枝鎖）、ＲＧ＝反応性基。本発明の一実施形態では、そのような構築ブロックは、リンカーの一方の末端にＦｍｏｃ保護基を有し、他方の末端に反応性のＮＨＳカーボネートまたはカルバメートを有する。この好ましい組合せは、新規切断可能リンカーを含む改変ヌクレオチド合成において特に有用である。保護基は、核酸／ヌクレオチドケミストリーと適合性の条件下で除去可能であるべきであり、反応性基は選択的であるべきである。リンカー上の活性なＮＨＳ基と、アミン終結ヌクレオチドとの間の反応後、Ｆｍｏｃ基を、ピペリジンまたはアンモニアなどの塩基を使用して容易に除去することができ、それによってリンカーの末端で切断可能マーカーが結合するためのアミン基を露出する。多様なマーカーを含む化合物のライブラリーを、この方法で非常に迅速に構築することができる。
図２９は、本発明の新規リンカーを介して結合した切断可能マーカーを有するヌクレオチドの一般構造を示す。Ｓ＝糖（すなわち、リボース、デオキシリボース）、Ｂ＝核酸塩基、Ｒ＝Ｈ、または可逆的終結基（保護基）。好ましい可逆的終結基には、アジドメチル（−ＣＨ２Ｎ３）、ジチオ−アルキル（−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ）、アミノキシ（−ＯＮＨ２）が挙げられるがこれらに限定されない。
図３０は、本発明の切断可能リンカーを介して結合した切断可能マーカーを有するヌクレオチドの別の一般構造を示し、Ｄは、アジド、ジスルフィドアルキル、およびジスルフィド置換アルキル基を含む基から選択され、Ｂは、核酸塩基であり、Ａは、結合基であり、Ｃは、切断可能部位のコアであり、Ｌ１およびＬ２は接続基であり、Ｌａｂｅｌは標識（標識を有する化合物中の）である。
図３１は、図３２Ａ〜Ｃで試験した化合物（Ｌシリーズ（９６）、Ｂシリーズ（９７）、Ａシリーズ（９８）、およびＧシリーズ（９９）ファミリー）の化学構造を示す。
図３２Ａは、様々なジスルフィドベースの切断可能リンカーを有する３’−Ｏ−アジドメチルＡｌｅｘａ４８８標識ヌクレオチドアナログの取り込みの時間経過を示す：Ｌシリーズ（９６）、Ｂシリーズ（９７）、Ａシリーズ（９８）、およびＧシリーズ（９９）ファミリー。
図３２Ｂは、様々なジスルフィドベースの切断可能リンカーを有する３’−Ｏ−アジドメチルＡｌｅｘａ４８８標識ヌクレオチドアナログの取り込みの反応速度を示す：Ｌシリーズ（９６）、Ｂシリーズ（９７）、Ａシリーズ（９８）、およびＧシリーズ（９９）ファミリー。
図３２Ｃは、様々なジスルフィドベースの切断可能リンカーを有する３’−Ｏ−アジドメチルＡｌｅｘａ４８８標識ヌクレオチドアナログの取り込みの反応速度を示す：ヌクレオチド濃度に対するＬシリーズ（９６）、Ｂシリーズ（９７）、Ａシリーズ（９８）、およびＧシリーズ（９９）ファミリー対ヌクレオチドの濃度。
図３３Ａは、ｄＡ ３’−可逆的終結ヌクレオチド：−ＣＨ２−Ｎ３、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅを示す。
図３３Ｂは、ｄＡ ３’−可逆的終結ヌクレオチド：−ＣＨ２−Ｎ３、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅの１００ｎＭ濃度での取り込みの速度論を示す。
図３３Ｃは、ｄＡ ３’−可逆的終結ヌクレオチド：−ＣＨ２−Ｎ３、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅの２５０ｎＭ濃度での取り込みの速度論を示す。
図３３Ｄは、ｄＡ ３’−可逆的終結ヌクレオチド：−ＣＨ２−Ｎ３、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅの５００ｎＭ濃度での取り込みの速度論を示す。
図３３Ｅは、ｄＡ ３’−可逆的終結ヌクレオチド：−ＣＨ２−Ｎ３、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅの１０００ｎＭ濃度での取り込みの速度論を示す。
図３４は、３つの異なるＤＮＡポリメラーゼ：Ｔ９、Ｊ５、およびＪ８による３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ終結基を有するｄＣ ３’−可逆的終結ヌクレオチドの取り込みの速度論を示す。
図３５は、ＧＲシーケンサー［ｎＭ］上での伸長Ａ反応に使用したヌクレオチドの最適化濃度を示す。
図３６は、生誤り率によって測定したＡシリーズ（９８）ヌクレオチドの配列決定パフォーマンスを示す。
図３７は、完全な（エラーフリー）リードのパーセンテージによって測定したＡシリーズ（９８）ヌクレオチドの配列決定パフォーマンスを示す。
図３８は、多様な配列決定評価基準によって測定したＡシリーズ（９８）ヌクレオチドの配列決定パフォーマンスを示す。
図３９は、生誤り率によって測定したＧシリーズ（９９）ヌクレオチドの配列決定パフォーマンスを示す。
図４０は、完全な（エラーフリー）リードのパーセンテージによって測定したＧシリーズ（９９）ヌクレオチドの配列決定パフォーマンスを示す。
図４１Ａは、ＥｘｔＢ（ＢＣ１）における３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔヌクレオチドを含有する配列決定実行による多重バーコードの同定を示す。
図４１Ｂは、ＥｘｔＢ（ＢＣ６）における３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔヌクレオチドを含有する配列決定実行による多重バーコードの同定を示す。 図４１Ｃは、ＥｘｔＢおよびＡ（ＢＣ１）の両方における３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔヌクレオチドを含有する配列決定実行による多重バーコードの同定を示す。
図４１Ｄは、ＥｘｔＢおよびＡ（ＢＣ６）の両方における３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔヌクレオチドを含有する配列決定実行による多重バーコードの同定を示す。
図４２は、様々な切断可能リンカーを有する標識された可逆的に終結するｄＣの伸長Ａ緩衝液中の上昇した温度での安定性の比較を示す：Ｂ＝Ｂシリーズ（９７、１１６、１１７、および１１８）、Ｇ＝Ｇシリーズ（９９、１０３、１０４、および１０５）、Ａ＝Ａシリーズ（９８、１００、１０１、および１０２）、およびＳＳ＝Ｌシリーズ（９６、５０、１０６、および１１５）。
図４３は、化合物６２からの化合物６３〜６７の合成を例証する合成スキームを示す。合成を、実施例３３、実施例３４、および実施例３５に記載する。
図４４は、化合物６８からの化合物６９〜７１および１１９〜１２０の合成を例証する合成スキームを示す。合成を、実施例３６、実施例３７、および実施例３８に記載する。
図４５は、上から下にｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４つの標識ヌクレオチドの完全な化学構造を示す（Ａシリーズ、９８、１００、１０１、および１０２）。
図４６は、上から下にｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４つの標識ヌクレオチドの完全な化学構造を示す（Ｇシリーズ、９９、１０３、１０４、および１０５）。
図４７は、上から下にｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４つの標識ヌクレオチドの完全な化学構造を示す（Ｌシリーズ、９６、５０、１０６、および１１５）。
図４８は、上から下にｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４つの標識ヌクレオチドの完全な化学構造を示す（Ｂシリーズ：化合物９７、１１６、１１７、および１１８）。
図４９は、全てがその３’に可逆的終結基として−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅを有する、ＧＲ機器での配列決定に使用したヌクレオチド（標識、化合物７２、７４、７６、７８）および非標識（化合物１２０、１２６、１３２、１３８）の例としての濃度を示す。
図５０は、全てが−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅを有する新規ヌクレオチド（図４９に記載される標識および非標識）を使用するＧＲ上での配列決定実行時に生成された強度の例を示す。
図５１は、メチレンジスルフィドメチルを含む基によってキャップされた３’−Ｏを有するヌクレオシド三リン酸の一連の非リンカーの例を示す。
図５２は、メチレンジスルフィドメチルを含む基によってキャップされた３’−Ｏを有する異なるフルオロフォア報告基によって標識された４つのヌクレオチドアナログの構造を示す。
図５３は、一般的なリンカーのＮＨＳ活性化型の合成の一実施形態を示す概略図である。
図５４は、ＭｅＳＳｄＡＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
図５５は、ＭｅＳＳｄＣＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
図５６は、ＭｅＳＳｄＧＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
図５７は、ＭｅＳＳｄＴＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
図５８は、ＭｅＳＳｄＡＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
図５９は、７６の合成の一実施形態を示す概略図である。
図６０は、ＭｅＳＳｄＣＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
図６１は、７２の合成の一実施形態を示す概略図である。
図６２は、ＭｅＳＳｄＧＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
図６３は、ＭｅＳＳｄＧＴＰ−ＡＲＡ−Ｃｙ５の合成の一実施形態を示す概略図である。
図６４は、ＭｅＳＳｄＵＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
図６５は、７４の合成の一実施形態を示す概略図である。
図６６は、３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰの構造を示す概略図である。
図６７は、３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰからの３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
図６８は、３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰ−ＰＡの合成の重要な中間体を示す。
図６９は、３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰ−ＰＡからの３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
図７０は、リンカーの配置および蛍光色素のコンジュゲーションを示す概略図である。
図７１は、本発明のリンカーおよび終結基に結合させるために使用することができるヒドロキシメチル誘導体核酸塩基誘導体の構造を示す。Ｒ＝可逆的終結基、ＣＬ＝本発明の切断可能リンカー。
図７２は、切断が行われた後のヒドロキシメチル誘導体核酸塩基誘導体の構造を示す。
図７３Ａ〜７３Ｉは、本発明のジチオベースのリンカーおよび終結基の切断を実施するために使用することができるチオール官能基を有する化合物の例を示す：７３Ａ）−システアミン、７３Ｂ）−ジチオ−コハク酸、７３Ｃ）−システアミン、７３Ｄ）−ジチオスレイトール、７３Ｅ）−２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、７３Ｆ）−ジチオブチルアミン、７３Ｇ）−メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、７３Ｈ）２−メルカプトエタンスルホネート、７３Ｉ）−Ｎ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジン。
図７４Ａ〜７４Ｃは、リンカーおよび３’−保護基の選択的および段階的切断の例−化学構造および反応スキームを示す。
図７５Ａ〜７５Ｃは、リンカーの選択的および段階的切断の例−切断の各々のステップに関連するクロマトグラムを示す。
図７６Ａ〜Ｅは、リンカーの選択的および段階的切断の例−選択的切断反応の全てのステップに対応するピークから抽出した吸収スペクトルを示す。 図７６Ａ〜Ｅは、リンカーの選択的および段階的切断の例−選択的切断反応の全てのステップに対応するピークから抽出した吸収スペクトルを示す。 図７６Ａ〜Ｅは、リンカーの選択的および段階的切断の例−選択的切断反応の全てのステップに対応するピークから抽出した吸収スペクトルを示す。 図７６Ａ〜Ｅは、リンカーの選択的および段階的切断の例−選択的切断反応の全てのステップに対応するピークから抽出した吸収スペクトルを示す。 図７６Ａ〜Ｅは、リンカーの選択的および段階的切断の例−選択的切断反応の全てのステップに対応するピークから抽出した吸収スペクトルを示す。
図７７は、３’およびジチオベースのリンカー上のジチオ保護基を有するヌクレオチドの切断反応スキームを示す。
図７８Ａは、切断試薬との１０分間インキュベーション後にＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した出発材料および切断反応混合物：ジチオコハク酸、Ｌ−システイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、およびシステアミンのクロマトグラムを示す。図７８Ｂは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した反応混合物の組成を示す。
図７９Ａ〜７９Ｃは、ビシナル位置の、または少なくとも１つの炭化水素によって隔てられた、あるいはアニオン官能基（Ｒ）によって炭化水素スペーサーに結合した例示的なジチオール化合物を表す。
図８０は、隣接する炭化水素で官能基を含む例示的なチオール化合物を表す。
図８１は、２，３−ジメルカプトプロパンスルホネート（dulfonate）（ＤＭＰＳ）によるジスルフィド結合還元の例示的な機構を表す。
図８２Ａ〜８２Ｃは、チオールベースの切断試薬による、ジスルフィドリンカーが結合した３’−（ＭｅＳＳＣＨ２）キャップされたヌクレオチドの切断を示す本発明の一実施形態を表す（化合物Ａ、Ｂ、およびＣのＬＣ−ＭＳデータを図８４Ａ〜Ｆに示す）。
図８３は、表１に表した切断試験で使用した様々なチオールベースの切断試薬の代表的な構造を表す。
図８４Ａは、化合物Ａバリアントの切断試験の例示的なＬＣ−ＭＳデータＭｅＳＳｄＵＴＰ ＡＲＡ ＮＨ３を表す；化合物Ａ １５．８分、化合物Ｂ １４．０分、および化合物Ｃ ７．１０分。
図８４Ｂは、化合物Ａバリアントの切断試験の例示的なＬＣ−ＭＳデータＭｅＳＳｄＵＴＰ ＡＲＡ ＮＨ２＿ＤＩＳＨｓｕｃｄを表す；化合物Ａ １５．８分、化合物Ｂ １４．０分、および化合物Ｃ ７．１０分。
図８４Ｃは、化合物Ａバリアントの切断試験の例示的なＬＣ−ＭＳデータＭｅＳＳｄＵＴＰ ＡＲＡ ＮＨ２＿ＤＩＳＨＰｒｏｐａｎｅＳｕｌｆを表す；化合物Ａ １５．８分、化合物Ｂ １４．０分、および化合物Ｃ ７．１０分。
図８４Ｄは、化合物Ａバリアントの切断試験の例示的なＬＣ−ＭＳデータＭｅＳＳｄＵＴＰ ＡＲＡ ＮＨ２＿Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅを表す；化合物Ａ １５．８分、化合物Ｂ １４．０分、および化合物Ｃ ７．１０分。
図８４Ｅは、化合物Ａバリアントの切断試験の例示的なＬＣ−ＭＳデータＭｅＳＳｄＵＴＰ ＡＲＡ ＮＨ２＿ＤＴＴを表す；化合物Ａ １５．８分、化合物Ｂ １４．０分、および化合物Ｃ ７．１０分。
図８４Ｆは、化合物Ａバリアントの切断試験の例示的なＬＣ−ＭＳデータＭｅＳＳｄＵＴＰ ＡＲＡ ＮＨ２＿Ｃｙｓｔｅａｍｉｎを表す；化合物Ａ １５．８分、化合物Ｂ １４．０分、および化合物Ｃ ７．１０分。
図８５は、実施例８４に従って３’−０−（メチルメチレンジスルフィド）５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル）−ｄＵ（（ＭｅＳＳｄＵ−ＰＡ（ＣＯＣＦ３）、７）を合成する一実施形態を表す。
図８６Ａは、化合物７から化合物１０への合成スキームを示す実施例８５に従って、３’−Ｏ−（メチルメチレンジスルフィド）−５−（アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（3’-O-(methylinethylenedisulfide)-5-(aminopropargy1)-2’-deoxyuridine；ＭｅＳＳｄＵＴＰＰＡ、８）を合成する一実施形態を表す。
図８６Ｂは、化合物１０から化合物１１への合成スキームを示す実施例８５に従って、３’−Ｏ−（メチルメチレンジスルフィド）−５−（アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（3’-O-(methylinethylenedisulfide)-5-(aminopropargy1)-2’-deoxyuridine；ＭｅＳＳｄＵＴＰＰＡ、８）を合成する一実施形態を表す。
図８７Ａ〜８７Ｄは、ＳＢＳ配列決定を実施するために本明細書に開示した試薬を含むキットの一実施形態の概略図を表す。図８７Ａ：伸長プレミックスおよび切断基本緩衝液の容器を含む例示的なボックス１Ａ。図８７Ｂ：基本洗浄プレミックスおよび洗浄緩衝液の容器を含む例示的なボックス１Ｂ。 図８７Ａ〜８７Ｄは、ＳＢＳ配列決定を実施するために本明細書に開示した試薬を含むキットの一実施形態の概略図を表す。図８７Ｃ：伸長付加試薬、ＤＮＡポリメラーゼ、およびイメージング試薬の容器を含む例示的なボックス２。図８７Ｄ：洗浄付加試薬および固体切断付加試薬の容器を含む例示的なボックス３。
図８８は、ＳＢＳ配列決定方法の生誤り率に及ぼすＤＭＰＳ ＣＨＥＳ高ｐＨ切断試薬の用量反応を示す例示的なデータを表す。
図８９Ａ〜８９Ｃは、ＤＭＰＳ ＴＲＩＳ高ｐＨ切断試薬およびＤＭＰＳ ＣＨＥＳ試薬を使用する進相／遅相の比較を示す例示的なＳＢＳ配列決定データを表す。図８９Ａ；高ｐＨ ＤＭＰＳ ＴＲＩＳ切断試薬。
図８９Ａ〜８９Ｃは、ＤＭＰＳ ＴＲＩＳ高ｐＨ切断試薬およびＤＭＰＳ ＣＨＥＳ試薬を使用する進相／遅相の比較を示す例示的なＳＢＳ配列決定データを表す。図８９Ｂ：ＤＭＰＳ ＣＨＥＳベースラインｂ１２８。
図８９Ａ〜８９Ｃは、ＤＭＰＳ ＴＲＩＳ高ｐＨ切断試薬およびＤＭＰＳ ＣＨＥＳ試薬を使用する進相／遅相の比較を示す例示的なＳＢＳ配列決定データを表す。図８９Ｃ：ＴＣＥＰベースラインＳＢＳ配列決定方法。
図９０は、ＤＭＰＳベースラインｂ１２８とＴＣＥＰベースライン切断試薬の間のＱスコア比較を示す例示的なデータを表す。
図９１Ａ〜Ｃは、進相／遅相の改善を実証するために、ＴＥＣＰ標準に対して２つのＤＭＰＳ濃度（７５対５０ｍＭ）を比較する例示的なデータを表す。
図９１Ａ〜Ｃは、進相／遅相の改善を実証するために、ＴＥＣＰ標準に対して２つのＤＭＰＳ濃度（７５対５０ｍＭ）を比較する例示的なデータを表す。
図９１Ａ〜Ｃは、進相／遅相の改善を実証するために、ＴＥＣＰ標準に対して２つのＤＭＰＳ濃度（７５対５０ｍＭ）を比較する例示的なデータを表す。
図９２は、平均誤り率の改善を実証するために、ＴＥＣＰ標準に対して２つのＤＭＰＳ濃度（７５対５０ｍＭ）を比較する例示的なデータを表す。
図９３Ａ〜９３Ｃは、配列決定ワークフローの一実施形態を示す。図９３Ａは、プライマーハイブリダイゼーションのワークフローの一実施形態を示す。図９３Ｂは、フローセル調製のワークフローの一実施形態を示す。図９３Ｃは、酸化的洗浄液（洗浄液１１）を切断ステップ後に使用する、合成による配列決定（ＳＢＳ）の自動ワークフローの一実施形態を示す。
図９４Ａは、過酸化水素が酸化的洗浄液に存在する（図９４Ｂ）または存在しない（図９４Ｃ）場合の進相／遅相結果と比較した、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドを酸化的洗浄液（洗浄液１１）に使用する場合の進相／遅相結果を示す。サイクルの関数としての進相は、アルゴリズムが正確な数を測定することができるためには線形関数である必要がある。図９４Ｃは、洗浄液が過酸化水素を含有しない場合の非線形進相結果を示す。しかし、過酸化水素（図９４Ｂ）またはｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド（図９４Ａ）を酸化的洗浄液に含めることによってケミストリーを適切に最適化すると、線形関数が得られ、進相の信頼できる値がアルゴリズムによって提供された。 図９４Ａは、過酸化水素が酸化的洗浄液に存在する（図９４Ｂ）または存在しない（図９４Ｃ）場合の進相／遅相結果と比較した、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドを酸化的洗浄液（洗浄液１１）に使用する場合の進相／遅相結果を示す。サイクルの関数としての進相は、アルゴリズムが正確な数を測定することができるためには線形関数である必要がある。図９４Ｃは、洗浄液が過酸化水素を含有しない場合の非線形進相結果を示す。しかし、過酸化水素（図９４Ｂ）またはｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド（図９４Ａ）を酸化的洗浄液に含めることによってケミストリーを適切に最適化すると、線形関数が得られ、進相の信頼できる値がアルゴリズムによって提供された。
発明の説明
本発明は、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシド三リン酸と、前記デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続した検出可能な標識を利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。このような化合物は、合成による配列決定法（ＳＢＳ）およびフローセルにおける特定の自動化ＳＢＳを含むがこれに限定されない将来の配列決定技術に新たな可能性を提供する。本発明は、物の組成物として、本明細書の本文および図面に示す種々の構造を企図する。これらの組成物は、プライマー伸長反応を含むがこれに限定されない反応において使用され得る。これらの組成物は、混合物中にあってもよい。例えば、標識ヌクレオチド（例えば、図２５に示すものなど）の１つまたは複数は、１つまたは複数の非標識ヌクレオチド（例えば、図５１に示すものなど）との混合物中にあってもよい（および混合物中で使用されてもよい）。これらは、他の試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ、プライマーなど）と共にキット内にあってもよい。
一実施形態では、本発明の標識ヌクレオチドは、合成のいくつかのステップを必要とし、多様な色素を異なる塩基に連結することを伴う。段階的プロセスよりもモジュラー方式でリンカーおよび色素の結合を実施できることが望ましい。モジュラーアプローチは、一方の末端で保護基を有し、他方の末端で活性化基を有するリンカー部分を予め構築するステップを伴う。次いで、このような予め構築されたリンカーを使用して、プロパルギルアミン（apropargylamine）ヌクレオチドとカップリングし、次いで、マスクされたアミン基を脱保護し、次いで、活性化色素をカップリングすることができる。これは、段階的合成と比較して、ステップがより少なく収率がより高いという利点を有する。
一実施形態では、本発明の標識ヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定において使用される。ＤＮＡ配列決定は、生物学において基本的なツールである。これは、基礎研究、生物医学、診断的および法医学的適用において、ならびに基礎および応用研究の多くの他の分野において広く使用される方法である。新世代のＤＮＡ配列決定技術は、生物学における研究が日常的に行われる手法を変化させつつある。今後数年間で、精密医療、コンパニオン診断などの分野において重要な役割を果たすようになりつつある。
合成による配列決定（ＳＢＳ）は、数百万のＤＮＡ分子、単体またはそれらのクラスターを同時に配列決定することができる、革新的な次世代配列決定（ＮＧＳ）技術である。この技術の基礎は、ＤＮＡ配列決定において大規模な並列処理を可能にする固体表面でのＤＮＡ分子の単一塩基のみの伸長および検出を可能にする、切断可能なヌクレオチドターミネーターとして公知である修飾ヌクレオチドの使用である（包括的な総説については：Cheng-Yao, Chen、Frontiers in Microbiology、２０１４年、５巻、１頁［２２］；Fei Chenら、Genomics Proteomics Bioinformatics、２０１３年、１１巻、３４〜４０頁［５］；C.W. Fullerら、Nature Biotechnology、２００９年、２７巻、１０１３頁［２］；M.L. Metzker、Nature Reviews、２０１０年、１１巻、３１頁［１］）。これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
ＤＮＡプライマーへの組み込みおよびその後の検出後に、化学反応によって除去することができる切断可能な保護基によって３’−ＯＨ位が遮断された、修飾ヌクレオチドは、ＳＢＳ化学の成功への鍵である（Juら、ＵＳ７，８８３，８６９、２０１１年［２３］；Juら、ＵＳ８，０８８，５７５、２０１２年［２４］；Juら、ＵＳ８，７９６，４３２、２０１４年［２５］；Balasubramanian、ＵＳ６，８３３，２４６、２００４年［２６］；Balasubramanianら、ＵＳ７７８５７９６Ｂ２、２０１０年［２７］；Miltonら、ＵＳ７，４１４，１１６Ｂ２、２００８年［２８］；Metzker, M. L.ら、Nucleic Acids Res、１９９４年、２２巻：４２５９〜４２６７頁［２９］；Juら、Proc. Nat. Acad, Sci. USA、１０３巻（５２号）、１９６３５頁、２００６年［３０］；Ruparelら、Proc. Nat. Acad, Sci. USA、１０２巻（１７号）５９３２頁、２００５年［３１］；Bergmannら、ＵＳ２０１５／０１４０５６１Ａ１［３２］；Kwiatkowski、ＵＳ２００２／００１５９６１Ａ１［３３］）。これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
３’−ＯＨは保護されていないが、ＤＮＡ鋳型への単一塩基組み込み後に修飾基がさらなる伸長を防止し、鎖終結事象を発生させるような様式で塩基が修飾された、仮想ターミネーターとして公知であるヌクレオチドアナログを開発するための試みもなされてきた（Andrew F. Gardnerら、NucleicAcidsRes ４０巻（１５号）、７４０４〜７４１５頁、２０１２年［３４］、Litoshら、Nuc. Acids, Res.、２０１１年、３９巻、６号、ｅ３９頁［３５］、Bowersら、Nat. Methods、２００９年、６巻、５９３頁［３６］）。これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
近接する３’−ＯＨ基が鎖伸長反応に関わるのを防止し、それによって、単一塩基伸長後に停止する、除去可能な基によって２’−ＯＨが保護されている、リボ−ヌクレオチドアナログも開示されており（Zhaoら、ＵＳ８，３９９，１８８Ｂ２、２０１３年［３７］）、参照により組み込まれる。
他方で、Zonは、除去可能な基によって３’−ＯＨが遮断されたヌクレオチドの１つを含有するジヌクレオチドターミネーターの使用を提案しており（Gerald Zon、ＵＳ８，０１７，３３８Ｂ２、２０１１年［３８］）、参照により組み込まれる。
これまで、切断可能なジスルフィドリンカー（−ＳＳ−）は、ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ配列決定において使用するための標識ヌクレオチド中の蛍光色素に結合するために使用されてきた。切断ステップ後に成長中のＤＮＡ株に取り残された−ＳＨ痕は、より長いリード長の実現を制限するいくつかの副反応を引き起こすと考えられている。
−ＳＨ残基は、切断ステップにおいて使用されるＴＣＥＰの存在下で、フリーラジカル反応を経て、望ましくない官能基を生じさせる可能性があり、潜在的にＤＮＡ分子を損傷し得ることが公知である（MS, Zhouxi WangらによるDesulfurization of Cysteine-Containing Peptides Resulting from Sample Preparation for Protein Characterization、Rapid Commun Mass Spectrom、２０１０年、２４巻（３号）、２６７〜２７５頁［３９］）。
−ＳＨ痕は、３’ＯＨ保護基を切断するフローセル内部に入ってくるヌクレオチドと相互作用してさらなる鎖延長を時期尚早に引き起こすこともでき、それによって、シグナル位相の散逸を引き起こし得る。
−ＳＨの有害な副反応の最終結果は、リード長の低減および配列決定実行における誤り率の増加である。
発明の詳細な説明
本発明は、切断可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシド三リン酸と、前記デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続した検出可能な標識を利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。本発明はまた、ジスルフィド還元または切断ステップが必須であるＤＮＡ配列決定技術（およびタンパク質工学などの他の技術）に関する、ジスルフィド系リンカーの切断剤としてのチオール誘導体（あるいは、メルカプトールアナログ）およびヌクレオチドの３’−ジスルフィドキャッピング基を利用する方法、組成物、混合物およびキットも提供する。一実施形態では、切断剤は、利用者が配列決定ワークフロー使用説明書に従って切断プレミックス緩衝液に添加する固体粉末付加物としてキット化される。さらに、本発明は、チオール含有化合物が酸化的洗浄ステップで捕捉される実施形態を提供する。このような化合物は、これらに限定されないが、フローセルにおける自動化合成による配列決定法（ＳＢＳ）を含むＳＢＳを含む将来の配列決定技術における使用に対する可能性をもたらす。
本発明は、一実施形態では、標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、保護基としてメチレンジスルフィドを含む３’−Ｏ基を有し、式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒを有する、標識ヌクレオシド三リン酸の、ＤＮＡ配列決定（例えば、合成による配列決定）における合成および使用に関与し、ここで、Ｒは、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、またはこれらのアナログなどのアルキル基を表し、置換基群は、Ｏ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子を含有する（図１を参照のこと）。一実施形態では、Ｒ基は、３’−Ｏキャッピング基の安定性および切断性をモジュレートすることができ、一方、ＤＮＡポリメラーゼ酵素に許容される、官能基を含有してもよい。
別の態様では、本発明は、標識と核酸塩基の間に切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、メチレンジスルフィドを含む基によってキャップされた３’−Ｏ位を有する標識ヌクレオシド三リン酸であって、核酸塩基が、天然であっても、ＤＮＡ鋳型の天然核酸塩基との水素結合相互作用によりＤＮＡ二重鎖を形成し得、ｄＧおよびｄＡの７−デアザアナログならびに２−アミノ−ｄＡであり得る非天然塩基であってもよい、標識ヌクレオシド三リン酸に関する。ｄＡおよびｄＧの７−デアザアナログは、７−Ｎ原子の欠如により、ＤＮＡ三次構造の形成を低減させることができる。一実施形態では、このようなヌクレオシドが、ＤＮＡ鋳型およびポリメラーゼ相互作用を強化することにより、ＤＮＡ配列決定リード長を潜在的に改善し得ることが想定される。２−アミノ−ｄＡが、その相補的塩基との（天然状態における２つの結合よりも）より安定した３つの水素結合を形成するその能力により、ＤＮＡ二重鎖安定性を増大させることができることも可能な場合があり、したがって、配列決定実行中のＤＮＡプライマーを喪失するリスクを低減させることができる（A Jungら、Mol. Pathol.、２００２年、５５巻（１号）、５５〜５７頁［４０］；2-amino-dATP：Igor V. Kutyavin、Biochemistry、２００８年、４７巻（５１号）、１３６６６〜７３頁［４１］）。
別の実施形態では、前記ヌクレオチドは、切断可能なリンカーである−ＯＣＨ２ＳＳ−を介して核酸塩基と連結した蛍光色素などの検出可能なレポーター分子を有し得る。−ＯＣＨ２−ＳＳ−基が核酸塩基に直接結合した標識ヌクレオチドおよび切断可能なリンカーとしてのその使用は、先行技術において公知ではない。従来の広く使用されているジスルフィドリンカー（−ＳＳ−）とは逆に、このクラスの切断可能なリンカー（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）は、ＤＮＡ分子に硫黄トレースを残さず、それを、還元的切断後、得られた中間体−ＯＣＨ２−ＳＨの急速加水分解によって−ＯＨ基にきれいに変換する。このため、このようなリンカーは、従来のジスルフィドリンカーのより良好な代替物となり得る。従来のジスルフィド系リンカー（−ＳＳ−）において、得られたチオール基（−ＳＨ）は、以下の図４に提示される通り、ＴＣＥＰなどの還元試薬によって切断された場合、副反応を被り得る（参考文献：MS, Zhouxi WangらによるDesulfurization of Cysteine-Containing Peptides Resulting from Sample Preparation for Protein Characterization、Rapid Commun Mass Spectrom、２０１０年、２４巻（３号）、２６７〜２７５頁［３９］）。
別の実施形態では、レポーター基は、５−Ｃ位においてピリミジン塩基（ｄＴ、ｄＣ）に、および天然塩基の７−Ｎまたはデアザアナログの７−Ｃにおいてプリン塩基（ｄＡ、ｄＧ）に結合してもよい。
別の実施形態では、標識ヌクレオチドの構造は、図５に示される通りであってよく、ここで、切断可能なリンカーのスペーサーは、プロパルギルエーテルリンカーを含む。プロパルギルエーテルを有する核酸塩基は、化学合成の先行技術に従って合成することができる。Ｌ１およびＬ２は、化学的スペーサーを表し、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、切断可能なリンカーに対する安定性および切断性をモジュレートする原子の群である。これらは、水素原子、ジェミナルジメチル、または、メチル、エチル、ｎ−ブチル、フェニルなどの任意のアルキル、フェニルもしくは置換アルキル基であり得る。これらは、−Ｏ、＝Ｏ、ＮＨ、−Ｎ＝Ｎ、酸、アミド、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）などを有する炭化水素鎖も含有し得る。ヌクレオチドにおける標識は、蛍光色素、エネルギー移動色素、放射性標識、化学発光プローブ、ヘプタンおよび化学的または物理的方法による検出を可能にする他の形態の標識であってもよい。
別の実施形態では、標識ヌクレオチドの構造は、図６に示される通りであってもよい。切断可能なリンカーのスペーサーは、プロパルギルアミンリンカーを含む。ここでも、Ｌ１およびＬ２はスペーサーを表し、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、前述した通り、リンカーの安定性を提供し切断性をモジュレートする原子の群である。これらは、水素原子、メチル、エチルなどのアルキル基、および他の置換基またはそれらの塩であってもよい。切断可能なジスルフィドリンカーのα炭素におけるジェミナルジアルキル基（例えば、以下の構造：
に記載のジェミナルジメチルアナログ）は、より良好な安定性をリンカーに提供して、標識ヌクレオチドのモジュラー合成を可能にする。これは、ジスルフィド系有機化合物の間でよく見られる不均化反応を防止すると推測される。また、これは、標識ヌクレオチドアナログの合成および精製を支援する、より大きい疎水性をリンカーに付加する［４２〜４４］。リンカーに存在するｇｅｍジメチル官能基は、ジスルフィド結合を電子的に安定させる役割を果たすだけでなく、おそらく立体効果を介して、ジスルフィド交換が分子間および分子内の両方で発生するのを防止すると考えられる。シスタミンの存在下で、ターミネーターにおけるジスルフィド官能基はジスルフィド交換に関わり、一方、ｇｅｍジメチル基を装備したリンカーは関わらないことが実証されている。図４２におけるリンカー研究は、ｇｅｍジメチル基を有するおよび有さないリンカーを比較する。この研究から分かるように、ｇｅｍジメチル基を有さないリンカーＧおよびＬは、シスタミンと迅速に交換して、生成物の分解を生じさせる。予想通り、この現象は、本発明者らが選択したリンカーＡでもアナログリンカーＢでも観測されない。さらに、標識ヌクレオチドは、２つのジスルフィド、ターミネーターに１つおよび分子のリンカー部分に１つを含有するため、この安定化効果が、色素とターミネーターの間でスクランブリングが発生するのを防止すると考えられている。この安定性は、配列決定における本発明者らのヌクレオチドの性能にとって重要である。
別の実施形態では、標識ヌクレオチドの構造は、図７の通りであってもよい。切断可能なリンカーのスペーサーは、ピリミジンについては５位において、およびプリンについては７−デアザ炭素において、核酸塩基と直接結合したメチレン（−（ＣＨ２）ｎ−）を含む。このリンカーは、メチレン（ｎ＝１）またはポリメチレン（ｎ＞１）であってよく、ここで、切断後、リンカーは、核酸塩基の結合点において、−（ＣＨ２）ｎＯＨ基を生じさせ、Ｌ１およびＬ２はスペーサーを表し、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、前述した通りの切断可能なリンカーに安定性を提供する原子の群である。
別の実施形態では、本発明は、特許請求されているヌクレオチドの合成方法に関する。キャッピング基およびリンカーは、記載された先行技術を修正して合成されてもよい。例えば、非標識ｄＴアナログ（化合物５）は、図８に示される通りに合成することができる。
一実施形態では、本発明は、（ａ）切断可能な保護基として、メチレンジスルフィド（例えば、式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒの）を含む基によってキャップされた３’−Ｏを有するヌクレオシド三リン酸（図１を参照のこと）；および（ｂ）それらの標識アナログ（図２を参照のこと）に関与し、ここで、標識は、切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）を介して核酸塩基に結合している。このようなヌクレオチドは、核酸合成による配列決定（ＳＢＳ）技術において使用され得る。特許請求されているヌクレオチドの合成のための一般的方法も記載される。
一実施形態では、図１に示される通り、非標識ヌクレオチドの一般的構造は、共通の構造−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒを有するメチレンジスルフィドを含む基によって保護された３’−Ｏ基を有し、ここで、Ｒは、正規のアルキルまたは−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＢｕ、−ｔＢｕ、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅなどの置換アルキル基であってよく、Ｂは天然または非天然核酸塩基であってもよい。非天然核酸塩基の一部の具体例は、７−デアザｄＧおよびｄＡ、２−アミノ−ｄＡなどである。
図２において、標識アナログの一般的構造は、フルオロフォアなどの検出可能なレポーター（標識）が一般的構造−Ｌ１−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｌ２−を有する切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合していることに加えて、図１のようにメチレンジスルフィドを含む基によって保護された３’−Ｏと共に示される。Ｌ１は、核酸塩基を切断可能なリンカーから、一方、Ｌ２は、切断可能なリンカーと標識の間を分離する分子スペーサーをそれぞれ表す。Ｌ１およびＬ２はいずれも、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ＝Ｎ、−Ｎ＝Ｎ−などのそれぞれの化学的実体と接続するための適当な官能基を有し得る。標識は、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチン、ハプテンなどであってもよい。標識は、異なるヌクレオチドにおける複数の塩基を同時に検出するために異なっていてもよく、または固体表面での空間的に分離されたオリゴヌクレオチドもしくはそれらの増幅されたクローンの段階的検出のために同じであってもよい。
一実施形態では、本発明は、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ基でキャップされた３’−Ｏと、一般的構造−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−を有する切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した標識とを有する、新たなクラスのヌクレオチドに関する。このようなキャッピング基およびリンカーは、ＴＣＥＰまたは関連化学物質による単一処理によって同時にきれいに切断することができ、ＤＮＡ分子に硫黄トレースを残さない。
このクラスのヌクレオチドは、熱活性ポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ鋳型へのヌクレオチド組み込みに必要な比較的高い温度（約６５℃）に耐えるために十分安定であり得るが、ＴＣＥＰなどによる還元などのＤＮＡ適合条件下で切断されるために十分不安定であり得る。一部の実施形態では、切断は、ジチオスレイトールへの曝露によって遂行されてよい。
ヌクレオチドは、ＴＣＥＰなどの還元剤に曝露されると、図３に示される段階的機序を介して３’−Ｏ保護基を脱キャッピングし、したがって、３’−ＯＨ基の天然状態を修復する。ＴＣＥＰおよびそのアナログは、ＳＢＳにおける適用の前提条件である生体分子に対して無害であることが公知である。
一実施形態では、本発明は、図２８に示される、新たな切断可能なリンカーを含む一般的な普遍的構築ブロック構造に関する。ＰＧ＝保護基、Ｌ１、Ｌ２−リンカー（脂肪族、芳香族、混合極性直鎖または分枝鎖）。ＲＧ＝反応性基。本発明の一実施形態では、このような構築ブロックは、リンカーの一端にＦｍｏｃ保護基を、他端に反応性ＮＨＳカーボネートまたはカルバメートを有する。この好ましい組合せは、新たな切断可能なリンカーを含む修飾ヌクレオチド合成において特に有用である。保護基は、核酸／ヌクレオチド化学と適合する条件下で除去可能であるべきであり、反応性基は、選択的であるべきである。リンカーにおける活性ＮＨＳ基の、アミン終結ヌクレオチドとの反応後、Ｆｍｏｃ基は、ピペリジンまたはアンモニアなどの塩基を使用して容易に除去することができ、したがって、リンカーの末端におけるアミン基を、切断可能なマーカーの結合のために露出することができる。多様なマーカーを含む化合物のライブラリーを、このようにして非常に迅速に構築することができる。
一実施形態では、本発明は、図２９に示される、新規リンカーを介して結合した切断可能なマーカーを担持するヌクレオチドの一般的な構造に関する。Ｓ＝糖（すなわち、リボース、デオキシリボース）、Ｂ＝核酸塩基、Ｒ＝Ｈまたは可逆的終結基（保護基）。好ましい可逆的終結基は、アジドメチル（−ＣＨ２Ｎ３）、ジチオ−アルキル（−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ）、アミノキシ（−ＯＮＨ２）を含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、本発明は、ビシナル位においてか（例えば、ｎ１＝１）または少なくとも１つの炭化水素結合（例えば、ｎ１≧１）によって分離されたかのいずれかの少なくとも２つまたはそれより多いチオール基を含み、炭化水素スペーサー（例えば、ｎ２≧１）を有するアニオン性官能基（Ｒ）にさらに結合した、チオール試薬を企図する。図７９Ａ〜７９Ｃを参照のこと。
一実施形態では、本発明は、これらに限定されないが、ハロゲン、アミン、ホスフェート、ホスホネート、リン酸、カルボン酸、スルホキシドおよび／またはヒドロキシルなどを含む、官能基（Ｒ１）に近接し、官能基のｐＫａをモジュレートすることができる、チオール基（−ＳＨ）を有する化合物を企図する。図８０を参照のこと。
ＤＮＡ配列決定は、現代のバイオテクノロジーにおいて有用な解析ツールとしての役割を果たす。例えば、新世代のＤＮＡ配列決定（ＮＧＳ）は、遺伝学、診断的および基礎生物医学的研究において革新的である。現行のＮＧＳ技術に関する詳細な総説は、M. L. Metzker、Nature Reviews ２０１０年、１１巻、３１頁、およびC. W. Fullerら、Nature Biotechnology ２００９年、２７巻、１０１３頁において提供される。
１つの周知の配列決定方法は、ヌクレオシド三リン酸を含む多くのＤＮＡ鋳型が、ＤＮＡ分子の相補的株の酵素的合成の間に、同時に配列決定される合成による配列決定（ＳＢＳ）である。この方法によれば、ヌクレオシド三リン酸は、これらに限定されないが、アセチル、ホスフェート、カーボネート、アジドメチル、ニトロなどを含む３’−ＯＨ保護基によって可逆的に遮断される。一実施形態では、ヌクレオシド三リン酸は、切断可能なリンカーを介して、塩基に標識を含む。
本発明の機序を理解する必要はないが、合成による配列決定（ＳＢＳ）は、より長いリード長およびより高い精度を達成する能力に依存すると考えられる。３’−ＯＨキャッピング基および切断可能なリンカーの使用は、ＤＮＡ適合条件下で除去され得るとも考えられる。例えば、本発明は、３’−ＯＨ基がアルキルメチレンジスルフィド（例えば、Ｒ−ＳＳ−ＣＨ２−）でキャップされ、切断可能なリンカーが同一の官能性部分（例えば、−ＯＣＨ２−ＳＳ−）を有する、可逆的ヌクレオチドターミネーターを企図する。両方の同時切断のために、ＤＮＡ適合切断試薬が好ましい。残念ながら、多くの還元剤はＤＮＡ分子に対して有害であり、フローセルの固体表面に対してざらついており、フローセルから洗い流すことが困難である。
ジスルフィド結合を切断することが知られているいくつかの還元剤が存在する。例として、これらに限定されないが、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、グルタチオン、水素化ホウ素などが挙げられる。これらの還元剤は、タンパク質工学および抗体化学において幅広く使用される。しかし、このような化合物はまた、より遅い反応速度だけでなく、ＮＧＳに適用された場合に、フローセルからの洗浄ステップにおいて完全に除去することが困難であることによっても、ある特定の制限を有し得る。さらに、チオール系化合物の還元力は、媒体のｐＨに依存する。より高いｐＨでは、チオール基（ＲＳＨ）はイオン化を受けてチオレート（ＲＳ−）を形成し、これによって反応速度を何倍もスピードアップさせ得ることが公知である。しかし、より高いｐＨでは、ＤＮＡ分子および表面は加水分解による損傷を受ける場合があり、それによって、その適用は制限される。したがって、一実施形態では、ＤＮＡとフローセル表面の両方に適合するように、ｐＨを低下させてジスルフィドを還元することができるチオール化合物が、ＳＢＳ化学における適用には好ましい。
本発明の機序を理解する必要はないが、図７９Ａ〜７９Ｃおよび８０に示したチオール化合物は、イオン化を受けて、隣接基の関与によって近接する官能基（すなわち、例えば、近接する−ＳＨおよび電子求引性Ｒ１）の存在によって、比較的低ｐＨでチオレートを形成することができると考えられる。結果として、これらは、比較的低ｐＨでジスルフィド結合を低減することができ、標準的チオールのものより増加した反応速度を有することができる。さらに、隣接基補助によるα位におけるチオールの隣接基関与は、分子内ジスルフィド結合の形成による還元プロセスの第２のステップをスピードアップさせることができる。図３に示す通り、図８１を参照のこと。この反応は、当技術分野において現在考えられているように、別のチオール分子による求核攻撃を受けてスルフィド分子を形成するとは考えられない。（Rajeeva SinghおよびGeorge M. Whitesidesによる「Thioldisulfide interchange, The Chemistry of Sulphur Containing Functional Group」 第１３章、６３３〜６５８頁）。負に帯電したペンディング基（Ｒ＝スルホネート、ホスホネート、カルボキシレートなど）によって、分子は表面に対して非粘着性であることが期待され、それによって、分子をフローセルから容易に洗浄可能にすると考えられる。本明細書のデータは、ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中、６５℃にて１０分未満で、キャッピング基とリンカーの両方の完全な切断を示した、チオール系化合物と結合したジスルフィドリンカーでキャップされた３’ジスルフィドの切断研究を表す。興味深いことに、完全な切断は、ジチオサクシネートの存在下では観察されなかった。図８２Ａ〜８２Ｃおよび表１を参照のこと。
これらの切断剤の構造を示す。図８３を参照のこと。次いで、切断生成物を液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって特徴付けた。図８４Ａ〜Ｆを参照のこと。化合物Ａ、ＢおよびＣは、図８２Ａ〜８２Ｃに示す。
一実施形態では、本発明は、高ｐＨの求核条件で、メチル−ジスルフィド３’−ＯＨ保護ヌクレオチドを切断することができる切断剤を含む切断ステップを含む方法を企図する。一実施形態では、切断剤は、ジメルカプタン化合物である。一実施形態では、切断ステップは、合成（ＳＢＳ）ステップによる配列決定において起こる。一実施形態では、切断ステップに続いて、残留する切断剤を有効に除去するための酸化的捕捉を含む洗浄ステップを行う。
発明の機序を理解する必要はないが、このような酸化的捕捉は、ジメルカプタンに基づく切断の効率を解除し、特に、誘導の低減および有意に改善された生誤り率およびより長いリード長に関して、良好な性能の配列決定を可能とすると考えられる。このような効果は、例えば、（１）より反応性の求核切断種の形成による高ｐＨ条件（例えば、９．０から１０．０、好ましくは９．５）下でのより効率的な切断反応、および／または（２）おそらく、表面吸着機序（例えば、シリケート、チタニア、磁気ビーズフェライトなどの鉄含有表面へのキレート化）によってフローセル内に保持される切断試薬の有効な捕捉によるものであり得るとさらに考えられる。例えば、このような切断残渣は、フローセル中に構築され、次の伸長ステップへのキャリーオーバーを導き、したがって、３’−ＯＨ部分の時期尚早な脱保護を引き起こし、単一塩基の組込みを損ない、配列決定性能に対する非常に著しい損害を伴い得る。一実施形態では、本明細書に開示されるジメルカプタン種は、ジメルカプトプロパンスルホネートとも称されるジメルカプタンプロパンスルホネート（ＤＭＰＳ）であってもよい。他の実施形態では、ジメルカプタン切断剤は、これらに限定されないが、２−メルカプトエタンスルホネートナトリウム（ＭＥＳＮＡ）および／またはグルタチオンを含んでもよい。一実施形態では、ＤＭＰＳは、以下の構造：
を有する。
一実施形態では、本発明は、これらに限定されないが、ＤＭＰＳ、ＭＥＳＮＡおよび／またはグルタチオンを含む化合物を用いるＳＢＳ配列決定と適合する切断ステップと洗浄ステップとを含む方法を企図する。一実施形態では、切断ステップは、ｐＨ９．５のＣＨＥＳ緩衝液中にＤＭＰＳを含む。一実施形態では、洗浄ステップは、ｐＨ８．５のＴＲＩＳ緩衝液中にＨ２Ｏ２ストックを含む。一実施形態では、洗浄ステップは、これらに限定されないが、Ｈ２Ｏ２［４５、４６］、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドおよび／またはＮａＢＯ３を含む酸化的スカベンジャーをさらに含んでもよい。
一実施形態では、３０％および３％は、付加される予定のＨ２Ｏ２保存溶液の濃度である。好ましい実施形態では、洗浄ミックス中のＨ２Ｏ２の最終濃度は、Ｈ２Ｏ２が０．３％である。
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの容器とＳＢＳ配列決定を実施するための使用説明書のセットを含むキットを企図する。一実施形態では、キットは、伸長プレミックス緩衝液を含む少なくとも１つの第１の容器をさらに含む。一実施形態では、キットは、切断基本緩衝液を含む少なくとも１つの第２の容器をさらに含む。一実施形態では、キットは、洗浄緩衝液プレミックスを含む少なくとも１つの第３の容器をさらに含む。一実施形態では、キットは、洗浄緩衝液を含む少なくとも１つの容器をさらに含む。一実施形態では、キットは、伸長付加試薬を含む少なくとも１つの容器をさらに含む。一実施形態では、伸長付加試薬はＡ２（ＰＭＡ）である。一実施形態では、伸長付加試薬はＢ２（ＰＭＢ）である。一実施形態では、キットは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む少なくとも１つの容器をさらに含む。一実施形態では、キットは、イメージング緩衝液を含む少なくとも１つの容器をさらに含む。一実施形態では、キットは、洗浄付加試薬を含む少なくとも１つの容器をさらに含む。一実施形態では、洗浄付加試薬は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。一実施形態では、過酸化水素は、１パーセントから５パーセントの間、より好ましくは３パーセント（３％）の濃度の保存溶液中にあり、後に、洗浄用により低い濃度に希釈される。一実施形態では、キットは、切断−固体付加試薬を含む少なくとも１つの容器をさらに含む。一実施形態では、切断−固体付加試薬は、ジメルカプタンプロパンスルホネート（ＤＭＰＳ）である。
一実施形態では、キットは、ｐＨ９．５の、ＤＭＰＳ（７５ｍＭ）、ＣＨＥＳ（３００ｍＭ）、ＮａＣｌ（３００ｍＭ）を含む切断試薬製剤を含む。
一実施形態では、キットは、Ｃｌｅａｖｅ １ Ａｄｄ−ｏｎおよび／またはＣｌｅａｖｅ ２ Ａｄｄ−ｏｎを含む。
一実施形態では、キットは、Ｈ２ＯまたはＨ２Ｏ／ＮａＣｌ中に、濃縮ＤＭＰＳを含む凍結液（例えば、−２０℃）切断試薬付加物を含む。
一実施形態では、キットは、ＤＭＰＳ＋ＮａＣｌを含む固体切断試薬付加物を含む。
一実施形態では、キットは、ニート試薬としてＤＭＰＳを含む液体（＋２〜８℃）切断試薬付加物を含む。
一実施形態では、キットは、ｐＨ８．８のＴＲＩＳ、Ｈ２Ｏ２（０．３％）およびＥＤＴＡ（１％）を含む洗浄試薬製剤を含む。
一実施形態では、キットは、Ｈ２Ｏ２（３．０％）を含む液体（２〜８℃）洗浄試薬付加物を含む。一実施形態では、キットは、これをより低い濃度（例えば、０．３％）まで希釈する使用説明書を提供する。
一実施形態では、キットは、これらに限定されないが、ＴＢＨＰ、ＡＰＳおよび／またはＮａＢＯ３を含む、安定性の改善された液体（２〜８℃）洗浄試薬付加物を含む。
一実施形態では、本発明は、ＳＢＳ配列決定条件下で機能するために開発された切断試薬を企図する。一実施形態では、このような切断試薬は、ジメルカプタンプロパンスルホネートである。
本明細書で記載されるように、切断試薬は、以下のＳＢＳ基準に合致するように設計される：ｉ）およそ８５ｂｐの平均リード長；ｉｉ）およそ５パーセント（５％）の平均生誤り率；ｉｉｉ）９０パーセントを超える（＞９０％）ビーズの滞留；および／またはｉｖ）およそ１．５倍（１．５×）のドウェル時間。これらの基準は、これらに限定されないが、ｉ）緩衝液の配合；ｉｉ）ＤＭＰＳの用量設定；および／または切断および鉄捕捉条件の最適化を含む性能改善および最適化の指標について評価された。以下で議論されるデータは、少なくとも１つの切断試薬、ジメルカプトプロパンスルホネート（ＤＭＰＳ）が、これらの基準に合致するおよび／またはこれらの基準を超えることを実証する。発明の機序を理解する必要はないが、ＤＭＰＳ系切断試薬を用いるＳＢＳ配列決定は、ｐＨ９．５のＣＨＥＳ緩衝液を含む切断ステップと、それに続く、例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を使用する、酸化的捕捉条件を含む切断後洗浄ステップにおける求核条件によって可能になると考えられる。
これらに限定されないが、ジメルカプト試薬、モノメルカプト試薬および／またはヘリコ試薬を含む候補切断試薬を、高速液体クロマトグラフィーによってスクリーニングした。スクリーニング構成は、ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒで実施され、候補切断試薬は別として、酸化的スカベンジャー、キャッピング剤および／またはキレーターなどの試薬を含んだ。このスクリーニングアッセイは、ＤＭＰＳ／ＭＥＳＮＡ、無機化合物および／または酵素的化合物などの試薬を含むＳＢＳ配列決定方法を使用する伸長ステップおよび洗浄ステップの最適化を観察した。さらに、これらに限定されないが、クリアランス、活性および／またはＦＣ完全性を含むｏｆｆ−ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒアッセイも実施された。切断ステップを最適化するための観察は、これらに限定されないが、ｐＨ、濃度、緩衝液の種類／カウンタイオン、ドウェル時間および／または温度を含んだ。
ＡＩＴを１０７サイクル使用する、市販のＤＮＡ標準物質（Ａｃｒｏｍｅｔｒｉｘ）を使用して、ＤＭＰＳベースラインを構築した。予備の観察により、洗浄ステップに酸化的スカベンジャーを含むことが誘導を有意に制御し、ｐＨレベルが全体的な切断効率を媒介する役割を果たしたことが見出された。次の検証研究により、好ましいＤＭＰＳベースラインの構成は、ＣＨＥＳ ３００ｍＭ ｐＨ９．５中にＤＭＰＳ切断試薬、それに続いて、希釈Ｈ２Ｏ２を含み、ここで、ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒは、切断のために６５℃で作動する（１×ドウェル（ＴＡＴ要件の遵守）および３×の流体による洗浄）ことが特定された。表２を参照のこと。
これらのデータは、ｐＨ９．５のＤＭＰＳ ＣＨＥＳ ３００ｍＭが測定可能な誘導をもたらし、生誤り率および平均リード長が上述の基準に合致したことを示した。
本明細書に表したデータは、生誤り率が構成進展の関数として改善することを実証する。図８８を参照のこと。例えば、切断ステップでＤＭＰＳを有し、洗浄ステップでＨ２Ｏ２を有さないことにより、２５サイクルを超える配列決定が可能とならない（データは示さず）。結果として、データは、ＤＭＰＳとＨ２Ｏ２の両方を用いるＳＢＳ配列決定により、ｉ）乏しい配列決定の性能（ｐＨ８．５；赤い曲線）；ｉｉ）高品質の性能（ｐＨ９．５；青い曲線）；およびｉｉｉ）ＴＣＥＰベンチマーク（緑の曲線）を比較する場合に分かるように、より高いｐＨによって性能がより良くなることを示唆する。図８８。
本明細書に表したデータは、ＤＭＰＳベースライン ｂ１２８またはＴＣＥＰベースラインＳＢＳ配列決定方法のいずれかを使用する場合に、進相／遅相の比較が改善される（８．５のｐＨ ＤＭＰＳ ＴＲＩＳ切断試薬と比較した場合）ことを実証する。図８９Ａ、図８９Ｂおよび図８９Ｃを参照のこと。誘導は、高ｐＨの構成においてほぼ直線的であり、ＴＣＥＰ早期到達ベースラインに匹敵することが理解され得る。さらに、Ｑスコア分析は、ＤＭＰＳベースライン ｂ１２８に対するＡＶＧ値は、ＴＣＥＰ早期到達ベースラインよりも約４Ｑスコア低いことを示す。図９０を参照のこと。
二次的分析であるベンチマーク分析により、０．５％のＡＦコールに対する平均ＦＰは、ＴＣＥＰ早期到達のヌル値と比較して、２であることが見出された。表３を参照のこと。
ＤＭＰＳベースラインの再現性は、ＣＨＥＳ ３００ｍＭ ｐＨ９．５中のＤＭＰＳ、続いて、６５℃の切断で作用した希釈Ｈ２Ｏ２含有洗浄液、ＴＡＴ要件を遵守した１×ドウェル、および３×流体洗浄液を使用する８回のＳＢＳ実行中に試験された。表４を参照のこと。
データは、全ＫＰＩを通しておよそ１％の標準偏差を有する同等の性能を示す。
さらなるデータは、ＳＢＳ配列決定方法をさらに改善するための、切断試薬のｐＨをｐＨ１０まで増加させるかおよび／またはＤＭＰＳ濃度を低下させるかのいずれかの能力を実証した。ｐＨ１０での切断試薬はビーズの滞留（９７％）に影響を与えず；一方、性能に有意な影響は表れないことが観察された（データは示さず）。５０ｍＭの濃度のＤＭＰＳ（ｂ１３２）を７５ｍＭの濃度のＤＭＰＳ（ｂ１２８）と比較した。表５を参照のこと。
データは、ＤＭＰＳの濃度の低下により、誘導の注目に値する改善がもたらされることを示し、平均誤り率と平均リード長の改善を示唆する。図９１Ａ〜Ｃ、および図９２を参照のこと。より低いＤＭＰＳ濃度は、より有利なＣＯＧＳを支持することも示唆される。
まとめると、上記データは、ＤＭＰＳなどの高ｐＨ切断試薬は、ｉ）およそ８５ｂｐまたはそれより長い平均リード長；およびｉｉ）およそ４％またはそれより低い平均生誤り率；ｉｉｉ）およそ９７％またはそれを超えるビーズの滞留；およびｉｖ）１×ドウェル時間を含むＳＢＳ配列決定方法をもたらすことを示す。さらに、特定した生成物に対する残留ギャップの要件により、およそ４％から２．５％の間の範囲の生誤り率と２から０の間の範囲の０．５％コールにおけるＦＰが実証された。
ＤＭＰＳ ｂ１３２構成のＴＣＥＰ構成との比較を調製した。表６を参照のこと。
データは、ＤＭＰＳ ｂ１３２構成（ＴＥＣＰの置き換えとして）が、第２世代（「早期到達」）構成を使用するＴＥＣＰの結果に非常に近いＫＰＩを示すことを示す。
一実施形態では、本発明は、配列決定に使用される核酸鋳型が組織生検に由来する核酸配列を含む方法を企図する。一実施形態では、組織生検は液体組織生検を含む。発明の機序を理解する必要はないが、液体組織生検は、液体組織生検内の核酸配列を配列決定するためのＳＢＳ配列決定方法と適合すると考えられる。表７を参照のこと。
ＤＭＰＳ ｂ１３２に対するプラットフォームＫＰＩは、ＴＥＣＰ早期到達ＫＰＩと非常に近いことが理解され得る。液体生検配列決定実行の結果を示す。表８を参照のこと。
データは、アンプリコンとバリアントインサイトレベルの両方で顕著なカバレッジを示す。
液体生検試料中の核酸を配列決定する精度は、市販の腫瘍パネル（例えば、Ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｎｅｌ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用する場合、感度および選択性を実証する一連の表中で以下に示される。表９〜１１を参照のこと。
ＫＰＩは、カバレッジ（２００×および５００×）およびバリアントコール（精度、感度、特異性）に対する二次分析の仕様を指す。全ｂ１３２実行（ｎ＝８）は、世代１（「Ｌｅｇａｃｙ」）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＧＲ １．０ベースラインと世代２（「早期到達」）構成と比較して、より良好な感度、特異性および精度を有する。１０−プレックスについての全ＫＰＩ（感度、特異性、精度）およびカバレッジ要件が合致する。
本発明者らはまた、液体生検（ＬＢ）試料プール中にいくつかのライブラリー（８つ）を一緒にプレックスした。
以下の実施例は、本発明のある特定の好ましい実施形態および態様を実証し、さらに例証するために提供され、その範囲を制限すると解釈すべきではない。
（実施例１）
３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシチミジン（２）の合成
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシチミジン（１）（２．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）を、２５０ｍＬ丸底フラスコ中で、ＤＭＳＯ（１０．５ｍＬ）、酢酸（４．８ｍＬ）、および無水酢酸（１５．４ｍＬ）からなる混合物に溶解し、室温で４８時間撹拌した。次いで、飽和Ｋ２ＣＯ３溶液を、ＣＯ２ガスの発生が停止するまで添加することによって、混合物をクエンチした。次いで、分液漏斗を使用して混合物をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）によって抽出した。合わせた有機抽出物を、分液漏斗中でＮａＨＣＯ３飽和水溶液（２×１５０ｍＬ）によって洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させた。有機部分をロータリーエバポレーションによって濃縮した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／７：３〜１：１）によって最終的に精製した。図８を参照されたい。３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシチミジン（２）を白色の粉末として収率７５％で得た（１．７５ｇ、Ｒｆ＝０．６、ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１）。1H-NMR (CDCl3): δH 8.16 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 6.28 (m, 1H), 4.62 (m, 2H), 4.46 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.78-3.90 (m, 2H), 2.39 (m, 1H), 2.14, 2.14 (s, 3H), 1.97 (m, 1H), 1.92 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), and 0.13 (s, 3H) ppm.
（実施例２）
３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−２’−デオキシチミジン（４）の合成
高真空下で一晩乾燥させ、無水ＣＨ２Ｃｌ２ ２０ｍＬに溶解した化合物２（１．７５ｇ、４．０８ｍｍｏｌ）に、Ｅｔ３Ｎ（０．５４ｍＬ、３．８７ｍｍｏｌ）およびモレキュラーシーブ−３Ａ ５．０ｇを添加し、Ａｒ雰囲気下で３０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷浴に入れて温度を氷点下にし、ＣＨ２Ｃｌ２（１．８ｍＬ）中の１．８当量の１Ｍ ＳＯ２Ｃｌ２を徐々に添加して、同じ温度で１．０時間撹拌した。次いで、氷浴を外してフラスコを室温にし、無水ＤＭＦ ４ｍＬ中のチオトシル酸カリウム（１．５ｇ）の溶液を添加し、室温で０．５時間撹拌した。
次いで２当量のＥｔＳＨ（０．６ｍＬ）を添加し、さらに４０分間撹拌した。次いで、混合物をＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍＬによって希釈し、漏斗中のｃｅｌｉｔｅ−Ｓを通して濾過した。生成物が確実に濾し取られるように、試料を適量のＣＨ２Ｃｌ２によって洗浄した。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２抽出物を濃縮し、シリカゲルカラムによるクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡＣ／１：１〜１：３、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１中でＲｆ＝０．３）によって精製した。次いで、得られた粗生成物を、ＭｅＯＨ ２０ｍＬ中のＮＨ４Ｆ ２．２ｇによって処理した。３６時間後、反応物を飽和ＮａＨＣＯ３ ２０ｍＬによってクエンチし、分液することによってＣＨ２Ｃｌ２によって抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２部分を、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、クロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１〜１：２）によって精製した。図８を参照されたい。精製生成物（４）を、白色の粉末として収率１８％、０．２６８ｇ、Ｒｆ＝０．３、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：２で得た。
CDCl3中1H NMR: δH 11.25 (1H, S), 7.65 (1H,S), 6.1 (1H, m), 5.17 (1H, m), 4.80 (2H, S), 4.48 (1H, m), 3.96 (1H, m),3.60 (2H, m), 3.26 (3H, s), 2.80 (2H, m), 2.20 (2H, m) and 1.14 (3H, m) ppm.
（実施例３）
３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−２’−デオキシチミジンの三リン酸エステル（５）の合成
ゴム栓を備えた２５ｍＬフラスコ中で、化合物４（０．２６８ｇ、０．７６９ｍｍｏｌ）にプロトンスポンジ（２１０ｍｇ）を添加した。試料を高真空下で一晩乾燥させた。次いで、材料をアルゴン雰囲気下で（ＭｅＯ）３ＰＯ ２．６ｍＬに溶解した。次いで、Ａｒガス供給源を備えたフラスコを氷浴に入れ、撹拌して温度を氷点下にした。次いで、１．５当量のＰＯＣｌ３をシリンジによって一度に添加し、アルゴン雰囲気下、同じ温度で２時間撹拌した。次いで、氷浴を外し、無水ＤＭＦ（６ｍＬ）中のピロリン酸トリブチルアンモニウム（１．６ｇ）およびＢｕ３Ｎ（１．４５ｍＬ）からなる混合物を調製した。混合物全体を一度に添加し、１０分間撹拌した。次いで、反応混合物をＴＥＡＢ緩衝液（３０ｍＬ、１００ｍＭ）によって希釈し、室温でさらに３時間撹拌した。粗生成物をロータリーエバポレーションによって濃縮し、Ｃ１８分取ＨＰＬＣ（方法：１００％Ａで０〜５分の後に、５０％Ｂまでの勾配で７２分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢおよびＢ＝アセトニトリル）によって精製した。標的分画の凍結乾燥後、半純粋生成物を、ＰＬ−ＳＡＸ分取カラムを使用するイオン交換ＨＰＬＣ（方法：１００％Ａで０〜５分、次いで７０％Ｂまでの勾配で７０分、Ａ＝１５％アセトニトリル水溶液、Ｂ＝１５％アセトニトリル中の０．８５Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液）によってさらに精製した。最終精製を、上記のようにＣ１８分取ＨＰＬＣによって実施し、化合物５を収率約２５％で得た。図８を参照されたい。
（実施例４）
Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−２’デオキシシチジン（７）の合成
３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−ｄＣＴＰ（１０）の合成を、図９に従って行った。Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシシチジン（６）（５０．０ｇ、１１２．２ｍｍｏｌ）を、２Ｌ丸底フラスコ中でＤＭＳＯ（２１０ｍＬ）に溶解した。これに、酢酸（２１０ｍＬ）および無水酢酸（９６ｍＬ）を逐次添加し、室温で４８時間撹拌した。この期間中に、生成物への完全な変換がＴＬＣによって観察された（生成物に関してＲｆ＝０．６、ＥｔＯＡｃ：ｈｅｘ／１０：１）。
混合物を２つの等しい分画に分離し、各々を２０００ｍＬビーカーに移し、飽和Ｋ２ＣＯ３溶液をＣＯ２ガスの発生が停止するまで（ｐＨ８）徐々に添加することによって中和した。次いで、混合物を分液漏斗中でＥｔＯＡｃによって抽出した。有機部分をＮａＨＣＯ３（２×１Ｌ）の飽和水溶液によって洗浄した後、蒸留水（２×１Ｌ）によって洗浄し、次いで有機部分をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させた。
次いで、有機部分をロータリーエバポレーションによって濃縮した。次いで、生成物を、ｐｕｒｉｆｌａｓｈカラムを使用するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：４〜１：９、１５μｍ、ＨＣ ３００ｇ ｐｕｒｉｆｌａｓｈカラムにおいてカラム３本での実行）によって精製し、Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−２’−デオキシシチジン（７）を灰色の粉末として収率６０％で得た（３４．０ｇ、Ｒｆ＝０．６、ＥｔＯＡｃ：ｈｅｘ／９：１）。図９を参照されたい。
化合物７の1H-NMR(CDCl3): δH 8.40 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.93 (m, 2H), 7.64 (m, 1H), 7.54 (m, 3H), 6.30 (m, 1H), 4.62 & 4.70 (2Xd, J = 11.59 Hz, 2H), 4.50 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 3.84 & 3.99 (2Xdd, J = 11.59 & 2.79 Hz, 2H), 2.72 (m, 1H), 2.21 (m, 1H), 2.18 (s, 3H), 0.99 (s, 9H), and 0.16 (s, 6H) ppm.
（実施例５）
Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシシチジン（８）
無水ＣＨ２Ｃｌ２（３５ｍＬ）に溶解したＮ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−２’−デオキシシチジン（７）（２．５２６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に、モレキュラーシーブ−３Ａ（１０ｇ）を添加した。混合物を３０分間撹拌した。次いでＥｔ３Ｎ（５．５ｍｍｏｌ）を添加し、氷塩水浴で２０分間撹拌した。次いでこれに、ＣＨ２Ｃｌ２中の１Ｍ ＳＯ２Ｃｌ２（７．５ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）を、シリンジを使用して徐々に添加し、Ｎ２雰囲気下、同じ温度で２時間撹拌した。次いで、無水ＤＭＦ ８ｍＬ中のベンゼンチオスルホン酸ナトリウム塩（１．６ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。最後にＥｔＳＨ（０．７４ｍＬ）を添加し、室温でさらに５０分間撹拌した。反応混合物をｃｅｌｉｔｅ−Ｓを通して濾過し、生成物をＣＨ２Ｃｌ２によって洗浄した。得られたＣＨ２ＣＨ２部分を濃縮後、シリカゲルカラムを使用するフラッシュクロマトグラフィー（１：１〜３：７／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）によって精製し、化合物８を収率５４．４％（１．５ｇ）で得た。図９を参照されたい。化合物８の1H-NMR(CDCl3): δH 8.40 (m, 1H), 7.95 (m, 2H), 7.64 (m, 1H), 7.54 (m, 3H), 6.25 (m, 1H), 4.69 & 4.85 (2Xd, J = 11.60 Hz, 2H), 4.50 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.84 & 3.99 (2Xdd, J = 11.59 & 2.79 Hz, 2H), 2.75 (m, 3H), 2.28 (m, 1H), 1.26 (m, 3H), 0.95 (s, 9H), and 0.16 (s, 6H) ppm.
（実施例６）
Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−２’−デオキシシチジン（９）
Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシシチジン（８、１．５０ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ ５０ｍＬに溶解した。次いで、ＴＨＦ（３．３ｍＬ）中の１Ｍ ＴＢＡＦを、窒素雰囲気下、氷冷温度で添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ １ｍＬを添加することによって反応物をクエンチし、１０分後にロータリーエバポレーションによって溶媒を除去した。生成物を、１：１〜１：９／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃの勾配を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物９（０．７８ｇ、収率６５％、１：９／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ中でＲｆ＝０．６）を得た。図９を参照されたい。化合物９の1H-NMR(CDCl3): δH 8.41 (m, 1H), 8.0 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.50 (m, 2H), 6.15 (m, 1H), 4.80 & 4.90 (2Xd, J = 11.60 Hz, 2H), 4.50 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 4.00 & 3.85 (2Xdd, J = 11.59 & 2.79 Hz, 2H), 2.80 (m, 2H), 2.65 (m, 1H), 2.40 (m, 1H), and 1.3 (s, 3H) ppm.
最後に、化合物５の合成に記載される標準的な合成プロトコールに従って、化合物９から化合物１０の合成を行った（図８を参照されたい）。
（実施例７）
標識ヌクレオチドの合成は、図１０および図１１に示す合成経路に従って行うことができる。図１０は、標識ｄＴ中間体の合成に対して特異的であるが、他のアナログも同様に合成することができる。
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（１２）の合成
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１１、２５．０ｇ、５３．４ｍｍｏｌ）を、２頚丸底フラスコ中で無水ＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解した。反応フラスコにＡｒガスを充填したバルーンを流す。次いでこれに、新しく開封した真空乾燥テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６．１６ｇ、５．２７ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（２．３１６ｇ、１２．１６ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。次に、Ｎ−トリフルオロアセチル−プロパルギルアミン（２３．９９ｇ、１５７．８ｍｍｏｌ、２．９当量）およびＥｔ３Ｎ（１４．７ｍＬ、１０５．５ｍｍｏｌ）を逐次添加した。混合物を室温で３．０時間撹拌し、反応の終了をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ／３：２中で、生成物に関してＲｆ＝０．５）によって確認した。
次いで、溶媒をロータリーエバポレーションによって除去した。得られた粗生成物をＥｔＯＡｃ ５００ｍＬに溶解し、分液漏斗に移した。次いで有機部分を、飽和ＮａＨＣＯ３（２×４００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×４００ｍＬ）溶液によってそれぞれ洗浄した。次いでＥｔＯＡｃ部分を無水Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。Ｎａ２ＳＯ４塩を濾過によって除去した後、濾液を、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。次いでこれを、３本の４０ｇシリカゲルに結合させた後、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（１：１ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ〜２：３ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ、２００ｇ、１５μｍ ＨＰ ｐｕｒｉｆｌａｓｈカラム、カラム３本での実行）によって精製し、１２ ２１．９９４ｇ（収率８３．８８％）を得た。図１０を参照されたい。
化合物１２中の1H-NMR(DMF-d7): δH 11.65 (brs, 1H), 10.15 (brs, 1H), 8.15 (brs, 1H, H6), 6.37 (t, J = 5.99 Hz, 1H, H1’), 5.42 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.37 (brs, 2H, プロパルギルアミン基のＮＨ−ＣＨ２に関して), 4.00 (m, 1H), 3.84-3.97 (m, 2H), 2.30 (m, 1H, H2’), 2.20 (m, 1H, H2’), 0.97 (s, 9H, 3X-CH3, TBDMS) and 0.19 (s, 6H, 2X CH3, TBDMS) ppm.
（実施例８）
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（１３）の合成
化合物１２（２１．９９ｇ、４４．７７ｍｍｏｌ）を、１０００ｍＬ丸底フラスコ中でＤＭＳＯ（９０ｍＬ）に溶解した。次いでこれに、ＡｃＯＨ（４０ｍＬ）および無水酢酸（１３２ｍＬ）を逐次添加し、室温で４８時間撹拌した。反応の終了をＴＬＣ（生成物に関してＲｆ＝０．５；Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１）によって確認した。
次いで反応混合物を２，０００ｍＬビーカーに移し、ＣＯ２ガスの発生が停止するまで（約ｐＨ８．０）飽和Ｋ２ＣＯ３によって中和した。次いで、混合物を分液漏斗に移し、抽出した（２×５００ｍＬ ＣＨ２Ｃｌ２）。次いで、合わせた有機部分を、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５００ｍＬ）によって洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。Ｎａ２ＳＯ４を濾過によって除去した後、有機部分をロータリーエバポレーションによって濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／７：３〜１：１）によって精製し、化合物１３ １２．３８ｇ（収率約５０％）を産生した。図１０を参照されたい。TLC: Rf = 0.5; Hex:EtOAc/1:1, 化合物１３の1H-NMR(DMSO-d6): δH 11.69 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 7.93 (s, 1H, H6), 6.07 (m, 1H, H1’), 4.69 (m, 2H), 4.38 (m, 1H), 4.19 (m, 2H), 4.03 (m, 1H), 3.75 (m, 2H), 2.34 (m, 1H), 2.14 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 0.86 (s, 9H) and 0.08 (s, 6H) ppm.
化合物１４、１５、および１６の合成は、化合物５および１０に関して記載した関連ステップの合成プロトコールに従って行うことができる。他のＮ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル核酸塩基の合成は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０１７，３３８号［３８］に記載されている。アミノプロパルギル核酸塩基を産生するためのＮ−トリフルオロアセチル基の除去は、軽度の条件の加溶媒分解によって行われ得る［４７］。
一方、切断可能リンカーの合成は、１，４−ブタンジオールから出発して図１１に示すように行うことができ、これを実施例９に記載する。
（実施例９）
４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−ブタン−１−Ｏ−（メチルチオメチル）、１８の合成
１Ｌフラスコ中で無水ピリジン１００ｍＬに溶解した１，４−ブタンジオール、１７ １８．３ｇ（１８．３ｇ、２０３．１３ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、氷浴で氷点下の温度にした。これに、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（ＴＢＤＰＳＣｌ、１９．３４ｇ、７０．４ｍｍｏｌ）を、シリンジによって徐々に添加した。氷浴を外して、反応フラスコを室温まで加温し、室温で一晩撹拌を継続した。次いでロータリーエバポレーションによって溶媒を除去し、シリカゲルカラムを使用するフラッシュクロマトグラフィー（７：３〜１：１／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）によって精製し、４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−ブタン−１−オール（１３．７ｇ、収率５９．５％、１：１／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃでのＲｆ＝０．７）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.70 (4H, m), 7.40 (4H, m), 3.75 (2H, m), 3.65 (m, 2H), 3.70 (4H, m) and 1.09 (9H, m) ppm.得られた生成物のうち、６．０７ｇ（１８．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ ９０ｍＬに溶解した。図１１を参照されたい。次いでこれに、酢酸（１５ｍＬ）および無水酢酸（５０ｍＬ）を添加した。混合物を室温で２０時間撹拌した。次いで、これを分液漏斗に移し、蒸留水３００ｍＬによって洗浄し、等体積のＥｔＯＡｃによって分液した。次いで、ＥｔＯＡｃ部分を１，０００ｍＬビーカーに移し、飽和Ｋ２ＣＯ３溶液によって中和した。水性部分を、分液によって除去し、次いでＥｔＯＡｃ部分を蒸留水（３×３００ｍＬ）によってさらに洗浄し、ＭｇＳＯ４によって乾燥させた。次いでＥｔＯＡｃ部分を濃縮し、シリカゲルカラムによるフラッシュクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／９７：３〜９０：１０）によって精製し、４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−１−Ｏ−（メチルチオメチル）−ブタン、１８（５．１５ｇ、収率７１．７％、９：１／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ中でＲｆ＝０．８）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.70 (4H, m), 7.40 (6H, m), 4.62 (2H, s), 3.70 (2H, m), 3.50 (2H, m), 2.15 (2H, s), 1.70 (4H, m) and 1.08 (9H, m) ppm.
（実施例１０）
化合物１９の合成
化合物１８（２．０ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２ ４０ｍＬに溶解し、モレキュラーシーブ−３Ａ １０ｇおよびＥｔ３Ｎ ０．７８ｍＬ（５．６６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、Ｎ２ガス下、室温で３０分間撹拌した。次いでフラスコを氷浴に入れて、温度を氷点下にした、次いでこれに、１Ｍ ＳＯ２Ｃｌ２／ＣＨ２Ｃｌ２溶液７．７ｍＬ（７．７ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、Ｎ２下で１時間撹拌した。次いで氷浴を外し、ＤＭＦ ８ｍＬ中のベンゼンチオスルホン酸−Ｎａ塩（１．６ｇ、８．２４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。次いで、無水ＤＭＦ ７ｍＬ中の４−メルカプトフェニル酢酸（１．７３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加し、２時間撹拌した。次いで、粗試料全体を、ｃｅｌｉｔｅ−Ｓを通して濾過し、生成物をＥｔＯＡｃによって洗浄した。次いで、ＥｔＯＡｃ抽出物をロータリーエバポレーションによって濃縮し、シリカゲルカラム（１：１〜３：７／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）によって精製し、化合物１９ １．１９ｇを収率４３％で得た。図１１を参照されたい。Ｒｆ＝０．５ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／３：７。1H NMR (CDCl3): 7.65 (4H, m), 7.55 (2H, m), 7.45 (6H, m), 7.20 (2H, s), 4.80 (2H, m), 3.65 (4H, m), 3.50 (2H, m), 1.60 (4H, m), and 1.09 (9H, s) ppm.
（実施例１１）
化合物２０の合成
無水ＤＭＦ ２０ｍＬに溶解した化合物１９（０．６ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＳＣ（０．４２６ｇ、１．５当量）およびＥｔ３Ｎ（０．２３ｍＬ）によって室温で処理し、窒素雰囲気下で１．５時間撹拌した。次いで、１１−アジド−３，６，９−トリオキサデカン−１−アミン（２．０当量）およびＥｔ３Ｎ（２．０当量）からなる混合物を、ＤＭＦ ５ｍＬ中で調製した。溶液全体を反応混合物に一度に添加して、１時間撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、０〜１０％ ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨの勾配を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物２０を収率３６％（０．２９７ｇ、Ｒｆ＝０．８、１０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）で得た。図１１を参照されたい。1H NMR (MeOH-d4): δH 7.70 (4H, m), 7.55 (2H, m), 7.40 (6H, m), 7.45 (2H, m), 4.85 (2H, s), 3.65-3.30 (22H, m), 1.65 (4H, m), and 1.09 (9H, m) ppm.
次いで、生成物２０（０．２９７ｇ）を、フラスコ中で無水ＴＨＦ ７ｍＬに溶解し、氷浴に入れて窒素雰囲気下で氷点下の温度にした。次いで、ＴＨＦ中の１Ｍ ＴＢＡＦ ０．６ｍＬを滴下し、氷冷温度で３時間撹拌した。混合物をＭｅＯＨ １ｍＬによってクエンチし、揮発物をロータリーエバポレーションによって除去し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、生成物２１ １６５ｍｇを得た。図１１を参照されたい。1H NMR (MeOH-d4): δH 7.55 (2H, m), 7.25 (2H, m), 4.85 (2H, s), 3.75-3.30 (22H, m) and 1.50 (4H, m) ppm.この生成物を、クリックケミストリーを使用してアルキン置換色素に、および活性化剤としてＣＤＩを使用してヌクレオチドにカップリングさせ、化合物２２を得ることができる。
安定化ｇｅｍ−ジメチル基が切断可能リンカーのα炭素に結合している、切断可能リンカーの別のバリアントを、図１２に従って得ることができる。
（実施例１２）
別の態様では、切断可能リンカーは、ジスルフィドがｇｅｍ−ジメチル基に隣接し、フレキシブルなエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）に結合している、化合物３０であり得る。リンカーは、カルバメート基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）を介してＰＡ−ヌクレオチド（例えば、化合物３３）に結合する。そのような場合に得られるヌクレオチドアナログは、図１３に従って合成することができる化合物３５（ｄＵＴＰアナログ）と同様であり得る。他のヌクレオチドアナログ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰのアナログ）は、反応順序の最後のステップで、ＰＡ−ヌクレオチド３３を適切なＰＡ−ヌクレオチドアナログに置き換えることによって同様に合成することができる。
（実施例１３）
化合物２８の合成
化合物１８（１５．５３ｇ、４０ｍｍｏｌ）（化合物１８の合成に関しては実施例９を参照されたい）を、丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン４５０ｍＬに溶解した。モレキュラーシーブ（３Å、８０ｇ）およびトリエチルアミン（５．６ｍＬ）を添加し、反応混合物を窒素雰囲気下、０℃で０．５時間撹拌した。次に、ＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中で１Ｍ、６４ｍＬ）をシリンジによって徐々に添加し、温度０℃で１．０時間撹拌した。次いで、氷水浴を外し、無水ＤＭＦ ２０ｍＬ中のチオトシル酸カリウム（１０．９ｇ、４８．１ｍｍｏｌ）の溶液を一度に添加し、室温で２０分間撹拌した。次いで反応混合物を、２Ｌ丸底フラスコ中でＤＭＦ ２０ｍＬに溶解した３−メルカプト−３−メチルブタン−１−オール（４．４ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）に注いだ。得られた混合物を室温で０．５時間撹拌し、ｃｅｌｉｔｅを通して濾過した。生成物を酢酸エチルによって抽出した。合わせた有機抽出物を、分液漏斗中で蒸留水によって洗浄した後、ロータリーエバポレーションによって粗生成物を濃縮した。移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用するシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーによって精製後、生成物（２８）を収率２６％（５．６ｇ）で得た。図１３を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 7.67-7.70 (m, 4H), 7.37-7.47 (m, 6H), 4.81 (s, 2H), 3.81 (t, J = 6.73 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 6.21 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 6.55, 2H), 1.90 (t, J = 6.95 Hz, 2H), 1.58-1.77 (m, 4H), 1.34 (s, 6H), and 1.07 (s, 9H) ppm.
（実施例１４）
化合物２９の合成
化合物２８（５．１ｇ、１０．３６ｍｍｏｌ）を、５００ｍＬ丸底フラスコ中で無水ピリジン１００ｍＬに溶解した。この溶液に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（３．３６ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応物を窒素雰囲気下、室温で１．０時間撹拌した。次いで反応混合物を、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（７．６ｍＬ、５１．８ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５０ｍＬ）からなる溶液に注いだ。混合物を室温で１．０時間撹拌し、揮発物をロータリーエバポレーションによって除去した。得られた粗生成物を、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２／９．５：０．５を使用するシリカによるフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、純粋な化合物２９（４．４ｇ、収率６５％）を得た。図１３を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 7.63-7.68 (m, 4H), 7.34-7.44 (m, 6H), 4.76 (s, 2H), 4.17 (t, J = 7.07 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 6.16 Hz, 2H), 3.60 (s, 4H), 3.49-3.51 (m, 6H), 3.31-3.39 (m, 2H), 2.88 (m, 2H),1.9 (t, J = 7.06 Hz, 2H), 1.57-1.73 (m, 4H), 1.31 (s, 6H) and 1.03 (s, 9H) ppm.
（実施例１５）
化合物３１の合成
化合物２９（０．９４ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ ４０ｍＬに溶解し、ＴＨＦ中の１Ｍ ＴＢＡＦ（１．６ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）によって、窒素雰囲気下、０℃で処理した。反応混合物を０℃で２．０時間撹拌し、その間に、ＬＣ−ＭＳによってＴＢＤＰＳ保護基の完全な除去を確認した。ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去した後、生成物を、Ｃ１８フラッシュカラムによるフラッシュクロマトグラフィー（勾配：０〜１００％Ｂで５０分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢおよびＢ＝アセトニトリル）によって精製した。標的分画を合わせて、凍結乾燥し、純粋な化合物３０（０．２８４ｇ、収率４７％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）（Ｍ＋Ｈ）の計算値４２９．２１、ｍ／ｚの実測値４２９．１８。次に、化合物３０（０．２１７ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で無水アセトニトリル１３ｍＬに溶解した。この溶液に、ＤＩＰＥＡ（９７．７μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−ＮＨＳエステル（２７３．６ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を温度０℃で添加し、同じ温度で２．０時間撹拌した。次いで生成物を、シリカゲル、１：１〜１：９／ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃの勾配によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、半純粋生成物を得て、これを２〜５％／ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２の勾配を使用してさらに精製し、化合物３１（０．２４５ｇ、収率７４％）を得た。図１３を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 7.70 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J =7.6 Hz), 7.32 (2H, m), 7.24 (2H, m), 4.69 (2H, s), 4.35 (2H, m), 4.16 (1H, m), 4.09 (2H, m), 3.60-3.45 (12H, m), 3.36-3.26 (4H, m), 1.82 (2H, m), 1.60 (4H, m) and 1.22 (6H, s) ppm.
（実施例１６）
化合物３２の合成
化合物３１（９３ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌子および窒素ガス供給源を備えた丸底フラスコ中で、無水アセトニトリル（１２．０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＤＳＣ（５６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３７．４μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）を逐次添加し、得られた混合物を室温で５．０時間撹拌した。追加のＤＳＣ（４８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３７．４μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１５．０時間撹拌を継続し、その間にＴＬＣにより活性化ＮＨＳエステルへの完全な変換が示された。ヘキサン−酢酸エチル（３：７〜１：９）の勾配を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー精製後に、生成物３２を濃厚な油として得て（５９ｍｇ、収率５３％）、次のステップで使用した。図１３を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 7.70 (2H, d, J = 7.53 Hz), 7.53 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.33 (2H, m), 7.24 (2H, m), 4.69 (2H, s), 4.34 (2H, m), 4.28 (2H, m), 4.16 (1H, m), 4.09 (2H, m), 3.57-3.46 (10H, m), 3.35-3.26 (4H, m), 2.75 (4H,s), 1.74 (4H, m), 1.62 (2H, m) and 1.23 (6H, s) ppm.
（実施例１７）
化合物３４の合成
化合物３３のアリコート（１０μｍｏｌ）（参考文献のＵＳ２０１３／０１３７０９１ Ａ１に従って合成）を、１５ｍＬ遠心分離管中で乾固するまで凍結乾燥した。次いで、これをＤＩＰＥＡ ６０μｍｏｌを含む無水ＤＭＦ １．０ｍＬ中に再懸濁した。別の管において、化合物３２（３０μｍｏｌ、３当量）を無水ＤＭＦ ３．３３ｍＬに溶解し、全てを一度に添加した。手動で十分に振とうすることによって反応を十分に混合し、室温でシェーカーに１２時間置いた。次に、ピペリジン（０．３３ｍＬ）を添加し、振とうを室温で３０分間継続した。次いで、生成物を、Ｃ１８カラムを使用するＨＰＬＣ（勾配：０〜７０％Ｂで４０分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢおよびＢ＝アセトニトリル）によって精製した。標的分画の凍結乾燥後に、生成物３４を収率７３．３％（７．３３μｍｏｌ）で得た。図１３を参照されたい。
（実施例１８）
化合物３５の合成
化合物３４のアリコート（４．９μｍｏｌ）を、１５ｍＬ遠心分離管中で蒸留水１．０ｍＬおよび０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（０．４９ｍＬ）に溶解した。別の管において、５−ＣＲ６Ｇ−ＮＨＳエステル１０ｍｇ（１７．９μｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ ０．９ｍＬに溶解した。次いで、この溶液を反応混合物に全て一度に添加して、室温で６．０時間撹拌した。次いで反応混合物を５０ｍＭ ＴＥＡＢ（２５ｍＬ）によって希釈した。生成物をＨＰＬＣ Ｃ１８（勾配：０〜６０％Ｂで７０分）によって精製した。化合物３５を標的分画の凍結乾燥後に得て（２．１５μｍｏｌ、収率４４％、ＨＰＬＣにより純度は約９８％、構造を、ＭＳ（ＥＳ＋）によって確認した：（Ｍ−Ｈ）Ｃ５８Ｈ７６Ｎ１０Ｏ２５Ｐ３Ｓ２ −の計算値 １４６９．３６、ｍ／ｚの実測値 １４６９．６７、図１３を参照されたい。
同様に、化合物３５に関して記載された類似の手順に従って、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰのアナログを合成し、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けて、完全な一組のＡシリーズ（９８、１００、１０１、および１０２、図４５）を得た。ｄＡＴＰアナログに関して、（Ｍ−Ｈ）Ｃ６６Ｈ８３Ｎ１２Ｏ２３Ｐ３Ｓ２の計算値 １，５６８．４３４８、ｍ／ｚの実測値 １，５６８．４４００；ｄＣＴＰアナログに関して、（Ｍ−Ｈ）Ｃ５２Ｈ６５Ｎ１１Ｏ３０Ｐ３Ｓ４の計算値 １，５４５．２０７０、ｍ／ｚの実測値 １，５４５．２０８０、およびｄＧＴＰアナログに関して、（Ｍ−Ｈ）Ｃ６６Ｈ９３Ｎ１２Ｏ２７Ｐ３Ｓ４の計算値 １，７０６．４３６９、ｍ／ｚの実測値 １，７０６．４４００。別の態様では、本発明は、切断可能なジスルフィドがｇｅｍ−ジメチル基に隣接し、リンカーがウレア基（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−）を介してＰＡ−ヌクレオチドに結合しているｄＡＴＰアナログの化合物４３と同様に、切断可能リンカーを有するヌクレオチドを伴う。化合物を、図１４（ｄＡＴＰアナログに関して）に従って合成することができる。他のヌクレオチドアナログ（例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰのアナログに関して）は、反応順序の最後のステップで４２を適切なＰＡ−アナログに置き換えることによって同様に合成することができる。
（実施例１９）
化合物３７の合成
撹拌子を備えた１Ｌ丸底フラスコにおいて、５−（ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ペンタノール（３６、２０ｇ、６２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（２５６ｍＬ）に室温で溶解した。溶液に、ＡｃＯＨ（４３ｍＬ）およびＡｃ２Ｏ（１４５ｍＬ）を逐次添加した。フラスコをゴム栓で閉じ、Ｎ２下に置き、室温で２０時間撹拌した。反応の終了をＴＬＣによって確認した。次いで反応混合物を３Ｌビーカーに移し、フラスコを水で洗浄した。ビーカーを氷浴中で冷却し、反応混合物を５０％飽和Ｋ２ＣＯ３（４００ｍＬ）によって３０分間中和した。混合物を分液漏斗に移し、ＥｔＯＡｃ（２×７００ｍＬ）によって抽出した。次いで、有機相を５０％飽和Ｋ２ＣＯ３（２×４００ｍＬ）によって洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗油をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜２０％Ｂで２０分、Ａ＝Ｈｅｘ、Ｂ＝ＥｔＯＡｃ）によって精製した。分画の収集および濃縮により、化合物３７（１７．７７ｇ、７５％）を白色の固体として得る。図１４を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 7.79 (d, J = 7.33, 2H), 7.63 (d, J = 7.83, 2H), 7.441 (t, J = 7.33, 2H), 7.357 (t, J = 7.58, 2H), 4.803 (bs, 1H), 4.643 (s, 2H), 4.43 (d, J = 6.82, 2H), 4.24 (t, J= 6.82, 1H), 3.54 (t, J = 6.32, 2H), 3.251 (m, 1H), 2.167 (s, 3H), 1.657-1.550 (m, 4H), and 1.446-1.441 (m, 2H) ppm.
（実施例２０）
化合物３８の合成
化合物３７（２．７７ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を、撹拌子および栓を備えた２５０ｍＬ丸底フラスコ中、Ｎ２下で、ＤＣＭ（６０ｍＬ）に溶解した。フラスコに、トリエチルアミン（３．０ｍＬ、２１．６ｍＬ、３当量）および４Åモレキュラーシーブ（２８ｇ）を添加した。懸濁液を室温で１０分間撹拌し、その後氷浴中で３０分間撹拌した。フラスコに、ＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中の１Ｍ溶液、１４．４ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、反応混合物を氷浴中で１時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（１：１ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）を介して出発材料の消失によりモニターした。ＳＯ２Ｃｌ２の活性化が完了した後、ＤＭＦ（６０ｍＬ）中のチオトシル酸カリウム（２．４５ｇ、１０．８ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を、急速に添加した。反応混合物を室温まで徐々に１時間加温した。次いでフラスコに、３−メルカプト−３−メチルブタノール（１．８ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ、２当量）を充填し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、４０℃の真空下で濃縮した。ＦＣＣ（０〜５０％Ｂで３０分、Ａ＝Ｈｅｘ、Ｂ＝ＥｔＯＡｃ）によって精製し、３８（４８２ｍｇ、１４％）を黄色の油として得た。図１４を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 7.76 (d, J = 7.81, 2H), 7.59 (d, J = 7.32, 2H), 7.40 (t, J = 7.32, 2H), 7.31 (t, J = 7.32, 2H), 4.87 (bs, 1H), 4.79 (s, 2H), 4.40 (d, J = 6.84, 2H), 4.21 (t, J = 6.84 1H), 3.78 (t, J = 6.84, 2H), 3.57 (t, J = 6.35, 2H), 3.20 (m, 2H), 1.88 (t, J = 6.84, 2H), 1.64-1.50 (m, 4H), 1.42-1.39 (m, 2H) and 1.32 (s, 6H) ppm.
（実施例２１）
化合物３９の合成
化合物３８（１３５ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬ丸底フラスコ中、真空下で２時間乾燥させた。真空を外し、フラスコをＮ２下に置いた。化合物３８をＤＭＦ（３．１ｍＬ）に溶解し、フラスコにＤＩＰＥＡ（９６μＬ、０．５５ｍｍｏｌ、２当量）を充填した。溶液を１０分間撹拌し、次いでＤＳＣ（１２０ｍｇ、０．４６８ｍｍｏｌ、１．７当量）の一用量を固体として添加した。反応混合物を２時間撹拌し、終了をＴＬＣ（１：１ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）を介して確認した。次いで反応物を３５℃の真空下で濃縮し、高真空下で１時間さらに乾燥させた。粗油をシリカゲルにロードし、ＦＣＣ（０〜５０％Ｂで１４分、Ａ＝ｈｅｘ、Ｂ＝ＥｔＯＡｃ）によって精製した。分画をＴＬＣによってチェックし、濃縮して、化合物３９（１３３ｍｇ、７６％）を、時間と共に結晶化する油として得た。図１４を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 7.78 (d, J = 7.58, 2H), 7.61 (d, J = 7.58, 2H), 7.42 (t, J = 7.58, 2H), 7.33 (t, J= 7.58, 2H), 4.87 (bs, 1H), 4.80 (s, 2H), 4.48 (t, J = 7.07, 2H), 4.44 (d, J = 6.82, 2H), 4.24 (t, J = 7.07, 1H), 3.58 (t, J = 6.32, 2H), 3.22 (m, 2H), 2.83 (s, 4H), 2.08 (m, 2H), 1.649-1.562 (m, 4H), 1.443-1.390 (m, 2H) and 1.366 (s, 6H) ppm.
（実施例２２）
化合物４０の合成
２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（９２μＬ、６３５μｍｏｌ、１０当量）およびトリエチルアミン（１７６μＬ、１２７０μｍｏｌ、２０当量）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＤＭＦ（２．７ｍＬ）中の６−ＲＯＸ、ＮＨＳエステル（４０ｍｇ、６４μｍｏｌ、１当量）の別の溶液も調製した。６−ＲＯＸ、ＮＨＳエステル溶液を、ジアミンを含有する高速で撹拌中の溶液に滴下した。反応物を２時間撹拌し、進行をＣ１８ ＨＰＬＣ−ＭＳ（０〜１００％Ｂで１０分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＭｅＣＮ）によってモニターした。終了後、反応物を、分取Ｃ１８−ＨＰＬＣ（１０〜１００％Ｂで５０分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を介して精製した。分画を合わせて、凍結乾燥し、化合物４０（２０ｍｇ、４８％）を赤紫色の固体として得た。図１４を参照されたい。ＭＳ（ＥＳ−）（Ｍ−Ｈ）Ｃ３９Ｈ４５Ｎ４Ｏ６の計算値６６４．３３、ｍ／ｚの実測値６６４．５６。
（実施例２３）
化合物４１の合成
化合物４０（１０ｍｇ、１５μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（８μＬ、４５μｍｏｌ、３当量）を充填した。個別に、化合物３９（２８ｍｇ、４５μｍｏｌ、３当量）をＤＭＦ（０．２１ｍＬ）に溶解した。化合物３９の溶液を、化合物４０を含む溶液に急速に添加した。反応物をシェーカープレート上に１．５時間置き、その時点で分析的Ｃ１８−ＨＰＬＣ（０〜１００％Ｂで１０分、Ａ＝５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．２、Ｂ＝ＭｅＣＮ）によって、化合物４０が残っていることが明らかとなった。追加の化合物３９（１３ｍｇ、２１μｍｏｌ、１．４当量）を添加して、反応物をシェーカープレート上にさらに１時間置いた。追加の分析を行うことなく、ピペリジン（３００μＬ）を添加し、１０分間反応させた。次いで、反応混合物を分取Ｃ１８−ＨＰＬＣ（１０〜１００％Ｂで５０分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＭｅＣＮ）に直接注入した。分画を収集し、凍結乾燥し、化合物４１（４．７ｍｇ、３４％）を赤紫色の固体として得た。図１４を参照されたい。ＭＳ（ＥＳ＋）（Ｍ＋Ｈ）Ｃ５１Ｈ６８Ｎ５Ｏ９Ｓ２ ＋の計算値９５９．４５、ｍ／ｚの実測値９５９．７６。
（実施例２４）
化合物４３の合成
５ｍＬ試料バイアルにアミン４１（２ｍｇ、２μｍｏｌ）、ＤＳＣ（０．８ｍｇ、３μｍｏｌ、１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（０．７μＬ、４μｍｏｌ、２当量）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．７ｍＬ）を充填した。反応混合物をシェーカー上に１時間置いた。反応の進行を、Ｃ１８−ＨＰＬＣ（０〜１００％Ｂで１０分、Ａ＝５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．２、Ｂ＝ＭｅＣＮ）によってモニターした。次に、０．１ Ｎａ２ＨＰＯ４（３．３ｍＬ）中のヌクレオチド４２（６μｍｏｌ、３当量、参考文献、ＵＳ２０１３／０１３７０９１ Ａ１）を添加し、反応混合物をシェーカー上に一晩置いた。次に反応物を水によって希釈し、分取Ｃ１８−ＨＰＬＣ（０〜６０％Ｂで７０分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＭｅＣＮ）によって精製し、表題の化合物４３（０．５μｍｏｌ、２５％）を得た。図１４を参照されたい。ＭＳ（ＥＳ−）（Ｍ−Ｈ）Ｃ６７Ｈ８７Ｎ１３Ｏ２２Ｐ３Ｓ２の計算値１５８１．４７、ｍ／ｚの実測値１５８１．６５。
（実施例２５）
別の態様では、切断可能リンカーは、ウレア官能基を介してＰＡ−ヌクレオチドに繋がれ、ジスルフィドが２炭素リンカーによって色素に接続されている化合物４５であり得る。そのような場合に得られたヌクレオチドアナログは、図１５に従って合成することができる化合物４９（ｄＧＴＰアナログ）と同様であり得る。他のヌクレオチドアナログ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰのアナログ）は、反応順序の第３のステップにおいて、ヌクレオチド４６を適切なＰＡ−ヌクレオチドアナログに置き換えることによって同様に合成することができる。
（実施例２６）
化合物４４の合成
磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、ＣＨ２Ｃｌ２中の３７（１．００ｇ、２．５９ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブおよびトリエチルアミン（０．７２ｍＬ、５．１８ｍｍｏｌ）を充填した。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、０℃に冷却した。塩化スルフリル（４．４０ｍＬ、４．４０ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。ヘキサン中の２０％酢酸エチルを使用するＴＬＣ分析により、出発材料の消失が示され、Ｎ’，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中のベンゼンチオスルホン酸（benzenethionosulfonic acid）ナトリウム塩（６４８ｍｇ、３．８９ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で一度に添加し、反応混合物を室温で２０分間撹拌した。次に、Ｎ−（トリフルオロアセトアミド）エタンチオール（８９６ｍｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を一度に添加し、得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過によって除去し、溶媒を減圧下で除去し、残渣を、０〜２０％酢酸エチル−ヘキサンの勾配を使用するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーを介して精製し、表題の化合物４４（５２９ｍｇ、３９％）を黄色がかった油として得た。1H NMR (CDCl3) ,図15を参照のこと: δH 7.76 (d, J = 7.52 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 7.50 Hz, 2H), 7.40-7.38 (m, 2H), 7.30-7.25 (m, 2H), 4.82 (s, 2H), 4.42 (d, 2H), 4.21-4.20 (m, 1H), 3.70-3.67 (m, 2H), 3.59-3.55 (m, 2H), 3.17-3.16 (m, 2H) and 1.64-1.40 (m, 6H) ppm.
（実施例２７）
化合物４５の合成
磁気撹拌子を備えた２５ｍＬ丸底フラスコに、カルバメート４４（１００ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン溶液１ｍＬを室温で充填した。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次いで、アセトニトリル（５ｍＬ）によって希釈し、０〜３０％アセトニトリル−ＴＥＡＢ緩衝液の勾配を使用する逆相分取ＨＰＬＣを介して精製し、表題の化合物４５（１１ｍｇ、２０％）を透明な油として得た。図１５を参照されたい。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δH 4.90 (s, 2H), 3.64-3.60 (m, 2H), 3.32 (s, 2H), 2.98-2.93 (m, 2H), 2.86-2.82 (m, 2H), 1.66-1.60 (m, 2H), 1.50-1.48 (m, 2H) and 1.33-1.30 (m, 2H) ppm.
（実施例２８）
化合物４７の合成
５ｍＬ試料バイアルにアミン４５（０．９６０ｍｇ、３．０μｍｏｌ）、ＤＳＣ（１．１５ｍｇ、４．５μｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６０μＬ、６．０μｍｏｌ）を充填し、室温で２時間振とうした。次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＬ中の３当量のヌクレオチド４６からなる溶液（参考文献、ＵＳ２０１３／０１３７０９１ Ａ１）を添加した。反応混合物をシェーカー上に１２時間置いた。次に、反応物をＴＥＡＢ緩衝液によって希釈し、０〜３０％アセトニトリル：５０ｍＭ ＴＥＡＢ緩衝液の勾配を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製し、表題の化合物４７（収率１４％）を得た。図１５を参照されたい。ＭＳ（ＥＳ−）：（Ｍ−Ｈ）Ｃ２６Ｈ３７Ｆ３Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ２ −の計算値、９５９．１０、ｍ／ｚの実測値９５９．２４。
（実施例２９）
化合物４８の合成
ヌクレオチド４７（１μｍｏｌ）をＴＥＡＢ緩衝液（５０ｍＭ水溶液２００μＬ）に溶解し、水酸化アンモニウム（３０％水溶液）２００μＬによって室温で５０分間処理した。次いで反応物を、ＴＥＡＢ緩衝液（１Ｍ溶液１ｍＬ）および蒸留水（５ｍＬ）によって希釈した。得られた混合物を、Ｃ１８−ＨＰＬＣ、０〜３０％アセトニトリル：５０ｍＭ ＴＥＡＢ緩衝液の勾配を介して精製し、表題の化合物４８（０．４０μｍｏｌ、９０％）を得た。図１５を参照されたい。ＭＳ（ＥＳ−）：（Ｍ−Ｈ）Ｃ２４Ｈ３８Ｎ１０Ｏ１５Ｐ３Ｓ２ −の計算値、８６３．１２、ｍ／ｚの実測値８６３．４５。
（実施例３０）
化合物４９の合成
化合物４８のアリコート（０．０４μｍｏｌ）を、３ｍＬエッペンドルフ管中で蒸留水０．１ｍＬおよび０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（２０μＬ）に溶解した。別の管において、ＲＯＸ−ＮＨＳエステル１ｍｇ（０．１６８μｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ ４８μＬに溶解した。次いで、この溶液を反応混合物に全て一度に添加し、室温で６．０時間撹拌した。次いで反応混合物を、５０ｍＭ ＴＥＡＢ（５ｍＬ）によって希釈した。生成物を、（０〜６０％Ｂの勾配、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリル）を使用するＣ１８−ＨＰＬＣによって精製した。化合物４９を、標的分画の凍結乾燥後に得た（０．０３μｍｏｌ、収率３０％）、図１５を参照されたい。ＭＳ（ＥＳ−）（Ｍ−Ｈ）、Ｃ５７Ｈ６７Ｎ１２Ｏ１９Ｐ３Ｓ２ −の計算値１３８０．３３、実測値１３８０．２５。
通常のジスルフィド連結ヌクレオチドとの切断の比較
本明細書に開示される切断可能なオキシメチレンジスルフィド（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）リンカーを含有するこの新規クラスのヌクレオチドを、還元性のホスフィンベースの切断条件で通常のジスルフィド（−ＳＳ−）連結ヌクレオチド（例えば、米国特許出願第２０１３／０１３７０９１号［４８］に記載されるヌクレオチド５０）と比較した。これらの２つのクラスのヌクレオチドには純然たる差が観察された。標識ヌクレオチド５０を、１０当量のＴＣＥＰに６５℃で曝露すると、ＬＣ−ＭＳによって同定される予想される生成物５１と共に、化合物５２を含む多数の副生成物を生成した（図１６、ならびに図１７ＡおよびＢ、５分間の曝露）。望ましくない副生成物の割合は、時間と共に増加した（図１８ＡおよびＢ、１５分間の曝露）。同一の切断条件で、オキシメチレンジスルフィド連結ヌクレオチド３５は、所望の切断生成物、すなわち化合物５３および５４をきれいに産生した。リンカーのメチレンチオール部分（−ＣＨ２ＳＨ）は、ジスルフィド基の切断時にヌクレオチドから完全に除去された（図２０ＡおよびＢならびに図２１ＡおよびＢ、５分間の曝露）。さらに、ＴＣＥＰに持続的に曝露しても、ＬＣ−ＭＳによって明らかとなるようにさらなる副生成物を生成しなかった（図２２、１５分間の曝露）。したがって、この新規クラスのヌクレオチドは、図４に示すチオール基の存在に固有の副反応を除去することによって、ＤＮＡの合成による配列決定（ＳＢＳ）の使用において有意な利点をもたらし得る。
（実施例３１）
化合物５７の合成
別の実施形態では、ヌクレオチドの３’−ＯＨ基を、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔまたは−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅによってキャップすることができ、フルオロフォア色素を、先に記載した（例えば、化合物３５、４３、および４９のように）切断可能な−ＯＣＨ２−ＳＳ−リンカーの１つを介して核酸塩基に結合させる。
３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔおよび−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅを有するＰＡヌクレオチドの合成はそれぞれ、図１０および図２２に従って行うことができる。３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅアナログの合成と３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔの合成との違い（図１０）は、図２２に示す適切なステップでのメルカプトエタノール（ＥｔＳＨ）のメタンチオールまたはチオメトキシドナトリウムによる置き換えである。−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅ基は、全ての起こり得る３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒアナログにおける最小の構造である。したがって、３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅキャッピング基を有するヌクレオチドアナログは、酵素の取り込み速度およびＴＣＥＰなどの還元剤による切断可能性に関して、他のアナログより良好な性能を有するはずである。
次に、得られたＰＡ−ヌクレオチド（例えば、５７）を、適切な切断可能−ＯＣＨ２−ＳＳ−リンカーにカップリングさせて、最終的に、活性化リンカー３２を使用して図２３に示すフルオロフォア色素にカップリングさせることができる。異なる色素を有する他のヌクレオチドを、適切なＰＡ−ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰのＰＡアナログ）およびＮＨＳ活性化色素（Ａｌｅｘａ４８８−ＮＨＳ、ＲＯＸ−ＮＨＳ、Ｃｙ５−ＮＨＳエステル等）を使用して同様に合成し、異なるフルオロフォア報告基によって標識されたヌクレオチドアナログを得ることができる。
（実施例３２）
異なるリンカーを有するヌクレオチドアナログを、化合物６０および６１（図２４）の合成において示されるように、記載のプロトコールに従って得ることができる。
切断可能リンカー−ＯＣＨ２−ＳＳ−を有するが、鎖長が異なり、α炭素で置換を有する多様な組の３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔおよび３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅヌクレオチドを、同様に合成することができる。得られたクラスのヌクレオチドを、図２５、図２６、および図２７に示す。図２５に示すヌクレオチドでは、切断可能リンカーは、フレキシブルエチレングリコールリンカーに結合した安定化ｇｅｍ−ジメチル基に隣接し、カルバメート官能基（−ＮＨ−Ｃ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−）を介してＰＡ−核酸塩基に結合するが、図２６では、カルバメート基は、ウレア基（−ＮＨ−Ｃ（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−）に置き換えられている。他方で、図２７に示すヌクレオチドでは、ジスルフィド基は、第一級炭素鎖に結合し、ウレア官能基によってＰＡ−核酸塩基に繋がれている。
（実施例３３）
化合物６４の合成：
２５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物６２（３．０ｇ、４．５８ｍｍｏｌ）、無水ＣＨ２Ｃｌ２ ２５ｍＬ、３Åモレキュラーシーブ（５．０ｇ）およびシクロヘキセン（０．５５ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）を充填した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷浴に入れて、ＳＯ２Ｃｌ２（６．８ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中で１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介して徐々に添加し、０℃で１時間撹拌した。次に、化合物６３への完全な変換を確実にするために、追加の０．５当量のＳＯ２Ｃｌ２を添加した。１０℃に近い温度を維持しながら、揮発物を真空下で除去した。得られた固体を無水ＤＭＦ ２０ｍＬに再懸濁し、窒素雰囲気下で維持した。
別のフラスコにおいて、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（２．４５ｇ、１１．４４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（２７４．５ｍｇ、油中で６０％）によって処理し、灰色のスラリーを産生した。これに、化合物６３を一度に添加し、窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。次いで反応混合物を、漏斗中でｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓ（２０ｇ）を通して濾過し、生成物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）によって溶出した。次いでＥｔＯＡｃ溶液を、蒸留水（２×１００ｍＬ）によって洗浄した。ＥｔＯＡｃ抽出物をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（カラム：ＲｅｄｉＳｅｐＲｆＧｏｌｄ １２０ｇ、勾配：８０％Ｈｅｘ〜５０ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）によって精製した。図４３を参照されたい。標的化合物（６４）を白色の固体（１．２ｇ、収率３２％、Ｒｆ：０．４、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／３：２）として得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.13 (m, 3H), 7.43 (m, 1H), 7.32 (m, 2H), 6.12 (m, 1H), 6.00 (s, 2H), 4.62 (m, 2H), 4.31 (m, 3H), 4.00 (m, 1H), 3.82-3.60 (m, 13H), 2.39 (m, 1H), 1.84 (m, 1H), 0.78 (m, 9H), and 0.01 (m, 6H) ppm.
（実施例３４）
化合物６５の合成：
化合物６４（１．２ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を、デシケーターにおいてＰ２Ｏ５によって高真空下で一晩乾燥させ、磁気撹拌子を備えた１００ｍＬフラスコ中で無水ＣＨ２Ｃｌ２ ３０ｍＬに溶解した。これに、ジメチルジスルフィド（０．６５７ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応フラスコを氷浴に入れた。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、３１６ｍｇ、１．１当量）を添加し、０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を２５０ｍＬ分液漏斗に移し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液５０ｍＬによって中和し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）によって抽出した。図４３を参照されたい。有機部分をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラム（ＲｅｄｉＳｅｐＲｆ ｇｏｌｄ ８０ｇ）において勾配８０〜５０％Ｈｅｘ−ＥｔＯＡｃを使用して精製し、化合物６５ ０．８２ｇ（収率８２％、ＲＦ＝０．５、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／３：２）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.15 (m, 3H), 7.42 (m, 1H), 7.35 (m, 2H), 6.11 (m, 1H), 4.80-4.65 (m, 2H), 4.34 (m, 1H), 4.28 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 3.83-3.67 (m, 2H), 2.49 (m, 1H), 2.34 (s, 3H), 1.90 (m, 1H), 0.78 (m, 9H), and 0.10 (m, 6H) ppm.
（実施例３５）
化合物６６の合成：
磁気撹拌子を備えた丸底フラスコに、化合物６５（０．３０９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０．０ｍＬ）１０．０ｍＬを充填し、窒素雰囲気下、氷浴に入れた。ＴＢＡＦ（０．７２ｍＬ、１Ｍ溶液中０．７２ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して徐々に添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を分液漏斗に移し、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）によってクエンチした。得られた混合物をＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。生成物６６を、勾配７：３〜２：３ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃを使用するＲｅｄｉＳｅｐＲｆカラム４０ｇによるシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１９６ｍｇ、Ｒｆ＝０．３、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１）後に、白色の粉末として収率７６％で得た。図４３を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 8.40 (s, 1H), 8.25 (m, 2H), 7.60 (m, 1H), 7.52 (m, 2H), 6.21 (m, 1H), 4.90-80 (m, 2H), 4.65 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.25 (m, 1H), 4.05-3.85 (m, 2H), 2.62 (m, 1H), 2.50 (s, 3H) and 2.31 (m, 1H) ppm.
生成物６７を、標準的な三リン酸エステル合成方法（詳細に関しては化合物５の合成を参照されたく、図８を参照されたい）を介する化合物６６のリン酸化後に得た（ＬＣ−ＭＳによって確認、６７のＣ１４Ｈ２３Ｎ４Ｏ１３Ｐ３Ｓ２に関してｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）６１１．１９）。これを、図１３、図１４、および図１５に表す化合物に関して記載した手順に従って色素標識生成物へとさらに変換した。
（実施例３６）
化合物７０の合成：
化合物６８（７．３ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を、デシケーター中で一晩乾燥させ、Ｎ２雰囲気下、撹拌子およびゴム栓を備えた乾燥させた５００ｍＬ丸底フラスコ中で無水ＤＣＭ（７０ｍＬ）に溶解した。シクロヘキセン（１．５４ｍＬ、１５．２ｍｍｏｌ、１．１当量）および無水３Åモレキュラーシーブ（１６．６ｇ）を反応混合物に添加し、得られた懸濁液を氷水浴中、０℃で２０分間撹拌した。次に、ＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中の１Ｍ溶液、３２．７ｍＬ、２．３６当量）を添加し、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ）を介して出発材料の消失によってモニターした。ＳＯ２Ｃｌ２の活性化が完了した後、ＤＭＦ（１２０ｍＬ）中の（ＭｅＯ）３ＢｎＳＨ（７．４ｇ、３４．５ｍｍｏｌ、２．５当量）およびＮａＨ（１．３２ｇ、３３．１２ｍｍｏｌ、鉱物油中で６０％）の混合物を調製し、一度に急速に添加した。反応物を室温まで徐々に加温し、１時間撹拌した。反応混合物を濾過して、４０℃の真空下で濃縮した。シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー（０〜６０％酢酸エチル：ヘキサンの勾配で１５分の後に、６０％酢酸エチル：ヘキサンで４５分の溶出）による精製によって、所望の化合物７０（４．２ｇ、収率４３．７％）を透明な油として得た。図４４を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 8.72 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.94 (m, 2H), 7.52 (m, 1H), 7.44 (m, 2H), 6.41 (m, 1H), 6.03 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 4.50 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.73 (m, 13H), 2.52 (m, 2H), 0.81 (s, 9H) and 0.002 (d, 6H) ppm.
（実施例３７）
化合物７１の合成：
化合物７０（２ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、撹拌子およびゴム栓を備えた２００ｍＬ丸底フラスコ中で無水ＤＣＭ（３８ｍＬ）に溶解し、氷水浴で冷却した。この混合物に、ジメチルジスルフィド（１．３ｍＬ、１４．３６ｍｍｏｌ、５当量）を添加した後に、ＤＭＴＳＦ（６２０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＣＭ（２０ｍＬ）中の溶液として一度に添加した。得られた混合物を室温まで徐々に加温し、次いで、さらに４時間撹拌した。反応物を、ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）の飽和水溶液の添加によってクエンチし、ＤＣＭ（１５０ｍＬ×２）およびＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、真空下で濃縮した。シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー（０〜６０％酢酸エチル：ヘキサンの勾配で１５分の後に、６０％酢酸エチル：ヘキサンで４５分の溶出）による精製によって、所望の化合物７１（１ｇ、収率６２％）を白色の粉末として得た。図４４を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 8.69 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.94 (m, 1H), 7.51 (m, 1H), 7.42 (m, 2H), 6.41 (m, 1H), 4.82 (m, 2H), 4.57 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.77 (m, 2H), 2.61 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 0.81 (s, 9H) and 0.00 (d, 6H) ppm.
（実施例３８）
化合物７２の合成：
化合物７１（５６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、撹拌子およびゴム栓を備えた１００ｍＬ丸底フラスコ中で無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、氷水浴で冷却した。次いで、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液１．５ｍＬ、１．５当量）を滴下し、０℃で２時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（１００％酢酸エチル、化合物７２に関してＲｆ＝０．２０５、化合物７１に関してＲｆ＝０．６２７）によってモニターした。反応の終了時、メタノール（５ｍＬ）を添加し、反応物を回転で濃縮し、残渣をシリカゲルによるカラムクロマトグラフィー（０〜６０％酢酸エチル：ヘキサンの勾配で１５分の後に、６０％酢酸エチル：ヘキサンで４５分の溶出）を介して精製し、所望の化合物７２（２８０ｍｇ、収率６２％）を白色の粉末として得た。図４４を参照されたい。1H NMR (CDCl3): δH 8.69 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.95 (m, 2H), 7.53 (m, 1H), 7.44 (m, 2H), 6.25 (m, 1H), 4.83 (m, 2H), 4.70 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 3.93 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 2.99 (m, 1H), 2.43 (s, 3H) and 2.41 (m, 1H) ppm.
次いで、化合物７２を、先に記載した標準的な三リン酸エステル合成に従って三リン酸エステル７３に変換した（図８における化合物５の合成を参照されたい）。
（実施例３９）
化合物１０８の合成：
撹拌子を備えた１Ｌ丸底フラスコに、無水ピリジン１００ｍＬ中の１，４−ブタンジオール（１８．３ｇ、２０３．１３ｍｍｏｌ）を充填し、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。次いでｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（１３．８ｍＬ、７０ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して滴下し、反応物を室温まで徐々に加温して、撹拌を室温で１２時間継続した。揮発物をロータリーエバポレーションによって除去し、残渣をシリカゲル８０グラムに吸収させた。ヘキサン中の３０〜５０％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーを介する精製により、４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−ブタン−１−オール、１０８（１３．７ｇ、収率５９．５％、１：１／ヘキサン：酢酸エチルでのＲｆ＝０．７）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.70 (m, 4H), 7.40 (m, 6H), 3.75 (m, 2H), 3.65 (2H, m), 1.70 (m, 4H), 1.09 (m, 9H,) ppm.合成を図５３に例証する。
（実施例４０）
化合物１０９の合成：
磁気撹拌子を備えた２５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物１０８（６．０７ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）および無水ＤＭＳＯ ９０ｍＬを充填した。酢酸（１５ｍＬ）および無水酢酸（５０ｍＬ）を逐次添加し、反応物を室温で２０時間撹拌し、分液漏斗に移し、蒸留水３００ｍＬと酢酸エチル３００ｍＬの間で分液した。次いで、有機層を１Ｌビーカーに移し、飽和Ｋ２ＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）を使用して中和した。有機層を蒸留水（３×３００ｍＬ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ４によって乾燥させた。揮発物を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル／９７：３〜９０：１０）を介して精製し、４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−１−Ｏ−（メチルチオメチル）−ブタン、１０９（５．１５ｇ、収率７１．７％、９：１／ヘキサン：酢酸エチル中でＲｆ＝０．８）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.70 (m, 4H,), 7.40 (m, 6H), 4.62 (s, 2H), 3.70 (m, 2H), 3.50 (m, 2H,), 2.15 (s, 2H), 1.70 (m, 4H), 1.08 (m, 9H) ppm. 合成を図５３に例証する。
（実施例４１）
化合物１１０の合成：
磁気撹拌子を備えた１Ｌ丸底フラスコに化合物１０９（１５．５ｇ、４０ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（４５０ｍＬ）、３Åモレキュラーシーブ（８０ｇ）およびトリエチルアミン（５．６ｍＬ）を充填し、反応物を、窒素雰囲気下、０℃で３０分間撹拌した。次に、ＳＯ２Ｃｌ２（ジクロロメタン中の１Ｍ溶液６４ｍＬ）をシリンジを介して徐々に添加し、０℃で１時間撹拌した。次いで、氷浴を外し、無水ＤＭＦ ２０ｍＬ中のチオトシル酸カリウム（１０．９ｇ、４８．１ｍｍｏｌ）の溶液を一度に添加した。得られた混合物を室温で２０分間撹拌し、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の３−メルカプト−３−メチルブタン−１−オール（４．４ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）の溶液を含有する２Ｌ丸底フラスコに一度に添加した。反応物を室温で３０分間撹拌し、次いでｃｅｌｉｔｅ−Ｓを通して濾過した。生成物を等量の酢酸エチルと水の間で分液した。有機抽出物を分液漏斗中で蒸留水によって洗浄した後、ロータリーエバポレーションによって粗生成物を濃縮した。酢酸エチル：ヘキサン勾配を使用するシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製により、表題の化合物１１０（５．６ｇ、２６％）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.67-7.70 (m, 4H), 7.37-7.47 (m, 6H), 4.81 (s, 2H), 3.81 (t, J = 6.73 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 6.21 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 6.55, 2H), 1.90 (t, J = 6.95 Hz, 2H), 1.58-1.77 (m, 4H), 1.34 (s, 6H), and 1.07 (s, 9H) ppm.合成を図５３に例証する。
（実施例４２）
化合物１１１の合成：
磁気撹拌子を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１１０（５．１ｇ、１０．３６ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１００ｍＬ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（３．３６ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で充填した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、無水ピリジン（５０ｍＬ）中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（７．６ｍＬ、５１．８ｍｍｏｌ）の溶液に注いだ。撹拌を１時間継続し、揮発物をロータリーエバポレーションによって除去した。得られた粗製物を、（ＣＨ２Ｃｌ２中の０〜１５％メタノール）を使用するシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーを介して精製し、化合物１１１（４．４ｇ、収率６５％）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.63-7.68 (m, 4H), 7.34-7.44 (m, 6H), 4.76 (s, 2H), 4.17 (t, J = 7.07 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 6.16 Hz, 2H), 3.60 (s, 4H), 3.49-3.51 (m, 6H), 3.31-3.39 (m, 2H), 2.88 (m, 2H),1.9 (t, J = 7.06 Hz, 2H), 1.57-1.73 (m, 4H), 1.31 (s, 6H) and 1.03 (s, 9H) ppm.合成を図５３に例証する。
（実施例４３）
化合物１１３の合成：
磁気撹拌子を備えた５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物１１１（０．９４ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）、無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）およびＴＢＡＦ（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液１．６ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、０℃で充填した。反応混合物を０℃で２．０時間撹拌し、その間にＬＣ−ＭＳにより、ＴＢＤＰＳ保護基の完全な除去が示された。回転で揮発物を除去した後、生成物を、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン中に０〜５％メタノールの勾配）を介して精製し、純粋な化合物１１２（０．２８４ｇ、収率４７％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）（Ｍ＋Ｈ）の計算値４２９．２１、ｍ／ｚの実測値４２９．１８。
次に、化合物１１２（０．２１７ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で無水アセトニトリル（１３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ＤＩＰＥＡ（９７．７μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−ＮＨＳエステル（２７３．６ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃で２時間撹拌した。ヘキサン中での５０〜９０％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製により、半純粋な生成物が産生され、これを、ＣＨ２Ｃｌ２中で２〜５％メタノールの勾配を使用するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーを介してさらに精製し、化合物１１３（０．２４５ｇ、収率７４％）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.70 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J =7.6 Hz), 7.32 (2H, m), 7.24 (2H, m), 4.69 (2H, s), 4.35 (2H, m), 4.16 (1H, m), 4.09 (2H, m), 3.60-3.45 (12H, m), 3.36-3.26 (4H, m), 1.82 (2H, m), 1.60 (4H, m) and 1.22 (6H, s) ppm.合成を図５３に例証する。
（実施例４４）
化合物１１４の合成：
磁気撹拌子を備えた５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物７（１７０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、無水アセトニトリル（１５ｍＬ）、ＤＳＣ（１００ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびＤＰＩＥＡ（６８μＬ、０．３９ｍｍｏｌ）を充填した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、追加のＤＳＣ（１００ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μＬ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（９：１／酢酸エチル：ヘキサン中、出発材料に関してＲｆ＝０．４、生成物のＲｆ＝０．８）によって追跡した。揮発物をロータリーエバポレーションによって除去し、残りの残渣を、ヘキサン−酢酸エチル勾配を使用する３回連続のシリカゲルカラムを介して精製し、化合物１１４（１２１ｍｇ、収率５９％）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.81 (m,2H), 7.63 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.33 (m, 2H), 4.78 (s, 2H), 4.43 (m, 2H), 4.37 (t, J = 7.65 Hz, 2H), 4.25 (m, 2H), 4.18 (m, 2H), 3.67-3.55 (m, 10H), 3.39 (m, 4H), 2.84 (s, 4H), 1.88 (m, 4H), 1.73 (m, 4H), and 1.32 (s, 6H) ppm.合成を図５３に例証する。
（実施例４５）
化合物１１７の合成：
磁気撹拌子を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに、化合物６８（７．３ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、デシケーター中で一晩予め乾燥）、無水ジクロロメタン（７０ｍＬ）、シクロヘキセン（１．５４ｍＬ、１５．２ｍｍｏｌ）および３Åモレキュラーシーブ（１６．６ｇ）を充填し、得られた懸濁液を、窒素雰囲気下、０℃で２０分間撹拌した。次に、ＳＯ２Ｃｌ２（ジクロロメタン中の１Ｍ溶液、３２．７ｍＬ、２．３６当量）を添加し、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。反応の進行を、出発材料（１００％酢酸エチル）の消失についてＴＬＣを介してモニターした。ＳＯ２Ｃｌ２活性化が完了した後、ＤＭＦ（１２０ｍＬ）中の（ＭｅＯ）３ＢｎＳＨ（７．４ｇ、３４．５ｍｍｏｌ、２．５当量）およびＮａＨ（１．３２ｇ、３３．１２ｍｍｏｌ、鉱物油中で６０％）の混合物を調製し、一度に急速に添加した。反応物を室温まで徐々に加温し、１時間撹拌した。反応混合物を濾過して、４０℃の真空下で濃縮した。ヘキサン中の０〜６０％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーによる精製によって、所望の化合物７０（４．２ｇ、収率４３．７％）を透明な油として得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.72 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.94 (m, 2H), 7.52 (m, 1H), 7.44 (m, 2H), 6.41 (m, 1H), 6.03 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 4.50 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.73 (m, 13H), 2.52 (m, 2H), 0.81 (s, 9H) and 0.002 (d, 6H) ppm.合成を図５４に例証する。
（実施例４６）
化合物７１の合成：
磁気撹拌子を備えた２００ｍＬ丸底フラスコに、Ｎ２雰囲気下で化合物１１７（２．０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（３８ｍＬ）を充填し、氷水浴で冷却した。この混合物に、ジメチルジスルフィド（１．３ｍＬ、１４．３６ｍｍｏｌ、５当量）を添加した後に、ＤＭＴＳＦ（６２０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ、１．１当量）をジクロロメタン（２０ｍＬ）中の溶液として添加した。得られた混合物を室温まで徐々に加温し、さらに４時間撹拌した。次いで反応物を、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１００ｍＬ）を添加することによってクエンチし、ジクロロメタン（１５０ｍＬ×２）および酢酸エチル（２００ｍＬ）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、真空下で濃縮した。シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の０〜６０％酢酸エチルの勾配によって溶出）による精製によって、所望の化合物７１（１．０ｇ、６２％）を白色の粉末として得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.69 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.94 (m, 1H), 7.51 (m, 1H), 7.42 (m, 2H), 6.41 (m, 1H), 4.82 (m, 2H), 4.57 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.77 (m, 2H), 2.61 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 0.81 (s, 9H) and 0.00 (d, 6H) ppm.合成を図５４に例証する。
（実施例４７）
化合物１１９の合成：
化合物７１（５６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、撹拌子およびゴム栓を備えた丸底フラスコ中で無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、氷水浴で冷却した。次いでＴＢＡＦ（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液１．５ｍＬ、１．５当量）を滴下し、０℃で２時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（１００％酢酸エチル、化合物１１９に関してＲｆ＝０．２、化合物７１に関してＲｆ＝０．６）によってモニターした。反応の終了後、メタノール（５ｍＬ）を添加した。反応物を回転で濃縮し、残渣を、シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー（０〜６０％酢酸エチル：ヘキサンの勾配で１５分の後に、ヘキサン中の６０％酢酸エチルで４５分の溶出）を介して精製し、所望の化合物１１９（２８０ｍｇ、収率６２％）を白色の粉末として得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.69 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.95 (m, 2H), 7.53 (m, 1H), 7.44 (m, 2H), 6.25 (m, 1H), 4.83 (m, 2H), 4.70 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 3.93 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 2.99 (m, 1H), 2.43 (s, 3H) and 2.41 (m, 1H) ppm.
次いで、−ＳＳＭｅ切断を最小限にするために、１０％ＮＨ４ＯＨによって室温で５時間処理することによって脱保護を実施したことを除き、以下に記載の標準的な三リン酸エステル合成方法を使用して、化合物１１９を三リン酸エステル１２０に変換した。収率２５％；ＨＲＭＳ−ＥＳ＋：Ｃ１２Ｈ２０Ｎ５Ｏ１２Ｐ３Ｓ２の計算値、５８２．９７６、ｍ／ｚの実測値５８２．９７５。合成を図５４に例証する。
（実施例４８）
化合物１２３の合成：
化合物１２１（２．５ｇ、４．９４ｍｍｏｌ）をデシケーター中で一晩乾燥させ、Ｎ２雰囲気下で、撹拌子およびゴム栓を備えた乾燥丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した。シクロヘキセン（０．５５ｍＬ、１．１当量）および無水３Åモレキュラーシーブ（６．０ｇ）を反応混合物に添加し、得られた懸濁液を室温で２０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷塩水浴に入れて、温度を氷点下にし、ＳＯ２Ｃｌ２（７．４ｍＬ、ジクロロメタン中の１Ｍ溶液）を、シリンジによって徐々に添加した。得られた混合物を０℃で１時間撹拌した後、０．５当量のＳＯ２Ｃｌ２を添加して反応を終了させた。反応の進行を、ＴＬＣを介して出発材料の消失によりモニターした。次に、ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の（ＭｅＯ）３ＢｎＳＨ（２．６５ｇ、１２．３５ｍｍｏｌ、２．５当量）およびＮａＨ（０．４７２ｇ、１１．８５ｍｍｏｌ、鉱物油中で６０％）の懸濁液を別のフラスコで調製した。反応混合物を合わせて室温に徐々に加温し、１時間撹拌した。次いで反応混合物を、ガラス焼結漏斗を通して濾過してＭＳを除去し、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４水溶液（５０ｍＬ）の添加によって濾液をクエンチし、ジクロロメタンによって抽出した。合わせた有機物を、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、真空下で濃縮した。ヘキサン：酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによる精製によって、所望の化合物１２３（１．４ｇ、収率４２．２％）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.29 (m, 1H), 7.77 (m, 2H), 7.48 (m, 1H), 7.38 (m, 2H), 6.15 (m, 1H), 5.99 (m, 2H), 4.55 (m, 2H), 4.32 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.69 (m, 9H), 2.52 (m, 1H), 1.97 (m, 1H), 0.80 (m, 9H) and 0.01 (m, 6H) ppm.合成を図５５に例証する。
（実施例４９）
化合物１２４の合成：
化合物１２３（１．４ｇ、２．０８ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、撹拌子およびゴム栓を備えた２００ｍＬ丸底フラスコ中で無水ジクロロメタン（４２ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。この混合物に、ジメチルジスルフィド（０．９３ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌ、５当量）を添加した後に、ＤＭＴＳＦ（４５０ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。得られた混合物を０℃で２時間撹拌した。反応物を、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）の添加によってクエンチし、ジクロロメタン（１００ｍＬ×２）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、真空下で濃縮した。生成物を、シリカゲルによるカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜３０％酢酸エチルの勾配によって溶出）によって精製し、所望の化合物１２４（０．９３ｇ、８３．１％）を白色の粉末として得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.48 (m, 1H), 7.93 (m, 2H), 7.56 (m, 1H), 7.47 (m, 1H),7.37 (m, 2H) 6.00 (m, 1H), 4.73 (m, 2H), 4.34 (m, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.73 (m, 1H), 2.44 (m, 1H), 2.33 (m, 3H), 2.25 (m, 1H), 0.76 (m, 9H) and 0.01 (m, 6H) ppm.合成を図５５に例証する。
（実施例５０）
化合物１２５の合成：
化合物１２４（９３０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、撹拌子およびゴム栓を備えた１００ｍＬ丸底フラスコ中で無水ＴＨＦ（５２ｍＬ）に溶解し、氷水浴で０℃に冷却した。次いで、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液３．５ｍＬ、１．５当量）を滴下し、０℃で４時間撹拌した。反応の終了時、メタノール（５ｍＬ）を添加して反応物をクエンチし、揮発物を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルによるカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の０〜７５％酢酸エチルの勾配）を介して精製し、所望の化合物１２５（４２５ｍｇ、収率５８％）を白色の粉末として得た。1H-NMR (CDCl3): δH 8.24 (m, 1H), 7.81 (m, 1H), 7.51-7.42 (m, 2H), 7.41 (m, 2H), 6.09 (m, 1H), 4.80 (m, 2H), 4.50 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 2.58 (m, 1H), 2.40 (m, 3H) and 2.41 (m, 1H) ppm.合成を図５５に例証する。
（実施例５１）
化合物１２６の合成：
次いで、以下に記載の標準的な三リン酸エステル合成手順を使用して、化合物１２５を三リン酸エステル１２６に変換し、最終の脱保護ステップを、−ＳＳＭｅ切断を最小限にするために、１０％ＮＨ４ＯＨによって室温で２時間処理することによって実施した。収率３０％、ＨＲ ＭＳ−ＥＳ＋：Ｃ１１Ｈ２０Ｎ３Ｏ１３Ｐ３Ｓ２の計算値、５５８．９６５；ｍ／ｚの実測値５５８．９６４。合成を図５５に例証する。
（実施例５２）
化合物１３０の合成：
磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、１２７（２．０ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を充填し、高真空下のデシケーター中でＰ２Ｏ５により１２時間乾燥させた。ジクロロメタン（４０ｍＬ）を、Ｎ２下で添加し、得られた溶液を塩氷浴で１５分間冷却した。シクロヘキセン（０．３４ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）を添加した後に、ＳＯ２Ｃｌ２（３．４ｍＬ、ジクロロメタン中の１Ｍ溶液、３．４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を３０分間撹拌し、反応の進行を、ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン／１：１、−ＣＨ２Ｃｌ分解生成物に関して１２７のＲｆ＝０．５、１２８のＲｆ＝０．１５）によってモニターした。追加のＳＯ２Ｃｌ２（３．１ｍＬ、ジクロロメタン中の１Ｍ溶液、３．１ｍｍｏｌ）を滴下し、化合物１２８への完全な変換を確実にするために、反応混合物をさらに４０分間撹拌した。次いで、この混合物を０℃の高真空下で濃縮した。
次いで、Ｎ２下で無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）を残渣に添加し、全ての固体が溶解するまで混合物を０℃で撹拌した。ＤＭＦ（８ｍＬ）中のｐ−トルエンチオスルホン酸カリウム（０．９６ｇ、４２５ｍｍｏｌ）の溶液を徐々に添加し、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。混合物を最初に０℃の減圧下で濃縮し、次いで室温で濃縮した。残渣を、ヘキサン中の０〜１００％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルカラムによるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物１３０（１．１ｇ、５１％；ＴＬＣ Ｒｆ：０．３５、酢酸エチル：ヘキサン２：１）をクリーム色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：７３３［Ｍ＋１＋］。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δH 8.02 (br.s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.88 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.45 (m, 4H), 7.38 (m, 6H), 7.27 (m, 2H), 6.01 (t, J=6.6 Hz 1H), 5.46 & 5.38 (AB, JAB=12.1 Hz, 2H), 4.97 (m, 1H), 3.86 (m, 1H), 3.74 (dd, J=12.5, 2.8 Hz, 1H), 3.55 (dd, J=12.5, 2.9 Hz, 1H), 2.87 (m, 1H), 2.65 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.17 (m, 1H), 1.26 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.25 (d, J=6.9 Hz, 3H) ppm.合成を図５６に例証する。
（実施例５３）
化合物１３１の合成：
氷水浴中で冷却したジクロロメタン（無水、４０ｍＬ）中の１３０（１．１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジメチルジスルフィド（０．６６ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）をＮ２下で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、ＮａＳＭｅ（０．２３ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた反応混合物を０℃で４時間撹拌し、反応の進行をＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン／２：１、１３０のＲｆ＝０．３５、１３１のＲｆ＝０．４５）によってモニターした。混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ−Ｓを通して濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムによって精製し、ヘキサン中の酢酸エチル（０〜１００％）によって溶出し、化合物１３１（０．６８ｇ、７５％；ＴＬＣ Ｒｆ：０．４５、酢酸エチル／ヘキサン／２：１）を白色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：６２５［Ｍ＋１＋］。1H NMR (CDCl3): δH 8.02 (s, 1H), 8.00 (br. s, 1H), 7.45 (m, 4H), 7.39 (m, 4H), 7.28 (m, 2H), 6.24 (t, J=6.2 Hz, 1H), 5.05 (m, 1H), 4.99 & 4.94 (AB, JAB=11.4 Hz, 2H), 4.27 (m, 1H), 3.99 (dd, J=12.5, 2.3 Hz, 1H), 3.86 (dd, J=12.5, 2.3 Hz, 1H), 3.12 (m, 1H), 2.74 (m, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.50 (m, 1H), 1.30 (d, J=6.6 Hz, 3H) and 1.29 (m, 3H) ppm.合成を図５６に例証する。
（実施例５４）
化合物１３２の合成：
次いで、化合物１３１を、標準方法の節に記載した標準的な三リン酸エステル合成方法を介して三リン酸エステル１３２に変換した。収率２５％；ＨＲＭＳ−ＥＳ＋：Ｃ１２Ｈ２０Ｎ５Ｏ１３Ｐ３Ｓ２の計算値、５９８．９７１、ｍ／ｚの実測値５９８．９７０。合成を図５６に例証する。
（実施例５５）
化合物１３４の合成：
化合物１３３（４．４７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）および（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（ＴＭＰＭ−ＳＨ）を、高真空下で２時間乾燥させ、次いで、Ｐ２Ｏ５によるデシケーター内に１２時間入れた。化合物１３３を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０．０ｍＬ）に溶解し、シクロヘキセン（１０ｍＬ、９６．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を窒素雰囲気下、−１０℃で１５分間撹拌した。次に、新たに調製したＣＨ２Ｃｌ２中の１Ｍ ＳＯ２Ｃｌ２（２５ｍＬ、２６．７５ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下漏斗を介して滴下し、得られた混合物を−１０℃で１時間撹拌した。浴温を１０℃に維持しながら揮発物を真空下で除去した。次いで、残渣を無水ＤＭＦ（５２ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下で維持した。
別のフラスコにおいて、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（４ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で無水ＤＭＦ（４８ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。次いでＮａＨ（１．１ｇ、２６．８ｍｍｏｌ、鉱物油中で６０％）を添加し、得られた灰色のスラリーを０℃で１５分間撹拌した。これを前者の溶液に一度に添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。次いで反応混合物を分液漏斗において分液した（１５０：３００ｍＬ／塩水：酢酸エチル）。次いで、有機層を塩水（２×１５０ｍＬ）によって洗浄した。水層を逆抽出した（４×５０ｍＬ酢酸エチル）。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムによって乾燥させた。溶媒を除去し、生成物を、シリカゲルカラムによるフラッシュクロマトグラフィー（カラム：ＲｅｄｉＳｅｐＲｆＧｏｌｄ−ＩＳＣＯ １２０ｇ、勾配ヘキサン中の０〜１００％酢酸エチル）によって精製した。標的化合物１３４を、白色の固体として収率２２％（１．３５ｇ）で得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.17 (s, 1H), 7.39 (d, 1H), 6.30 (m, 1H), 6.12 (s, 2H), 4.71 (dd, 2H), 4.43 (m, 1H), 4.04 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.83 (m, 9H), 3.74(dd, 1H), 2.74 (ddd, 1H), 2.34 (ddd, 1H), 1.93 (m, 2H) 1.53 (s, 3H), 0.93 (m, 9H), 0.11(m, 6H) ppm.ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ［Ｍ−Ｈ＋］実測値５８１、Ｒｆ＝０．５９（４：６ヘキサン−酢酸エチル）。化合物１３５はまた、副生成物として収率２２．５％（１．１３ｇ）で単離された。1H NMR (CDCl3): δH 8.55 (s, 1H), 7.41 (m, 1H), 6.12 (M, 3H), 4.76 (dd , 2H), 4.47 (m, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.82 (m, 9H), 3.75(m, 1H), 2.29 (m, 2H), 2.04 (s, 3H) and 1.91 (m, 2H) ppm.ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ［Ｍ−Ｈ＋］実測値４６７。合成を図５７に例証する。
（実施例５６）
化合物１３６の合成：
１００ｍＬ丸底フラスコ中の化合物１３４（３．６ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を、高真空下で２時間乾燥させ、次いでＰ２Ｏ５による真空デシケーターに１２時間入れた。無水ＣＨ２Ｃｌ２（９６ｍＬ）およびジメチルジスルフィド（２．８ｍＬ、３０．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃に冷却した。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、１．３４ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を０℃で１時間撹拌した。次に、反応混合物を２５０ｍＬ分液漏斗に移し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液９０ｍＬによって中和し、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）によって抽出した。合わせた有機層を、無水硫酸ナトリウムによって乾燥させ、回転で濃縮した。残渣を、ヘキサン中の３０〜５０％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルカラムによるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。標的化合物１３６を白色の固体（２．１ｇ、収率７７％）として得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.99 (s, 1H), 7.47 (d, 1H), 6.29(dd, 1H), 4.87 (dd, 2H), 4.49 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.5 (m, 1H), 2.47 (s, 3H), 2.45 (dd, 1H), 2.04 (dd, 1H) and 1.54 (s, 2H) , 0.93 (m, 9H) and 0.13 (m, 6H) ppm.ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ［Ｍ−Ｈ＋］実測値４４７．０。合成を図５７に例証する。
（実施例５７）
化合物１３７の合成：
高真空下で２時間乾燥させた１００ｍＬ丸底フラスコ中の化合物１３６（２．１６ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させた後に、酢酸（１．２ｍＬ）およびＴＨＦ中のＴＢＡＦ（１Ｍ溶液６．７ｍＬ、６．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで、室温でさらに２時間撹拌した。揮発物を真空下で除去し、残渣を、ジクロロメタン中の０〜８％メタノールの勾配を使用するＲｅｄｉＳｅｐＲｆ ｇｏｌｄカラム４０ｇによるフラッシュクロマトグラフィーを介して精製した。標的化合物１３７を白色の固体（１．４５ｇ、収率９０％）として得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.12 (s, 1H), 7.36 (d, 1H), 6.11(t, 1H), 4.87 (dd, 2H), 4.57 (m, 1H), 4.14 (q, 1H), 3.94 (dd, 1H), 3.83 (m, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.4(m, 2H), 1.93 (s, 3H) ppm; LCMS (ESI) [M-H+]実測値333.合成を図５７に例証する。
（実施例５８）
化合物１３８の合成：
生成物１３８は、以下に記載の標準的な三リン酸エステル合成方法を使用して、化合物１３７のリン酸化後に得た。収率４０％、ＨＲ ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ２１Ｎ２Ｏ１４Ｐ３Ｓ２の計算値、５７３．９６５；ｍ／ｚの実測値５７３．９６４。合成を図５７に例証する。
（実施例５９）
化合物１４１の合成：
磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１３９（２．２３ｇ、３．５５ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）、３Åモレキュラーシーブ（３．５ｇ）およびシクロヘキセン（０．６０ｍＬ）を充填した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で２０分間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、ＳＯ２Ｃｌ２（５．４ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中で１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介して徐々に添加した。反応物を０℃で１．５時間撹拌し、追加のＳＯ２Ｃｌ２（ジクロロメタン中の１Ｍ溶液）１．８ｍＬを添加して、化合物１４０への完全な変換を確実にするために、撹拌を０℃で４０分間継続した。浴温を１０℃近くに維持しながら、揮発物を減圧下で除去した。得られた固体を無水ＤＭＦ ２０ｍＬに再懸濁し、窒素雰囲気下で維持した。
別のフラスコにおいて、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（１．９８ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（２４７ｍｇ、鉱物油中で６０％、６．１７ｍＭ）によって処理し、暗灰色のスラリーを産生した。次に、化合物１４０の溶液を一度に添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を、蒸留水（１５０ｍＬ）と酢酸エチル（１５０ｍＬ）の間で分液した。有機層を蒸留水（２×１５０ｍＬ）によってさらに洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。揮発物を減圧下で除去し、残渣を、ヘキサン中の８０〜１００％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルカラムによるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。標的化合物１４１を白色の固体（７９８ｍｇ、２８％）として得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.33 (s, 1H), 7.57 (m, 1H), 6.53 (m, 2H), 6.00 (s, 2H), 4.62 (m, 2H), 4.44 (m, 1H), 4.32 (m, 2H), 3.97 (m, 1H), 3.80-3.60 (m, 11H), 3.10 (m, 6H), 2.36 (m, 1H), 2.24 (m, 1H), 0.80 (m, 9H) and 0.01 (m, 6H) ppm.ＬＣ−ＭＳによってさらに確認した：ｍ／ｚの実測値７９５．２５（Ｍ−Ｈ）。合成を図５８に例証する。
（実施例６０）
化合物１４２の合成：
磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１４１（０．７７９ｇ、０．９８ｍｍｏｌ、Ｐ２Ｏ５により１２時間真空乾燥）および無水ＴＨＦ（２０．０ｍＬ）を充填し、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。ＴＢＡＦ（１．１７ｍＬ、ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、１．１７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して徐々に添加し、反応混合物を０℃で１．５時間撹拌した。次に、追加のＴＢＡＦ（１ｍＬ、ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、１ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で３時間反応させた。次いで、反応混合物を分液漏斗に移し、メタノール（５ｍＬ）の添加によってクエンチし、蒸留水（１００ｍＬ）を添加し、反応物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）によって抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、真空下で濃縮した。ヘキサン中の８０〜１００％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルによる残渣のカラムクロマトグラフィーによって、化合物１４２を白色の粉末（５２５ｍｇ、７９％）として得た。1H NMR (メタノール-d4): δH 8.33 (s, 1H), 7.19 (m, 1H), 6.06(m, 2H), 6.03 (m, 1H), 4.72 (m, 2H), 4.64 (m, 1H), 4.57 (m, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.17 (m, 1H), 3.75 (m, 9H), 3.16 (m, 6H), 2.80 (m, 1H) and 2.28 (m, 1H) ppm; LC-MS: M-H実測値m/z 680.0.合成を図５８に例証する。
（実施例６１）
化合物１４３の合成：
化合物１４３は、標準方法の節に記載した標準的な三リン酸エステル合成手順を介して化合物１４２から合成した。収率６５％、ＬＲＭＳ−ＥＳ−：Ｃ２５Ｈ３３Ｎ５Ｏ１５Ｐ３Ｓ−の計算値、７６８．０９；ｍ／ｚの実測値７６８．５４（Ｍ−Ｈ）。合成を図５８に例証する。
（実施例６２）
化合物１４４の合成：
５０ｍＬ錐形管に、化合物１４３（ＨＰＬＣ等級の水中の５．２５ｍＭ溶液３．８０ｍＬ、２０μｍｏｌ）およびｐＨ４．６５の酢酸緩衝液（４．７５ｍＬ）を充填し、ｐＨ４．６５の酢酸緩衝液中で新たに調製したＤＭＴＳＦ（８０ｍＭ）溶液９．０ｍＬと迅速に合わせた。得られた混合物を室温で２時間振とうし、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（２ｍＬ）の添加によってクエンチした。生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：３０×２５０ｍｍ Ｃ１８Ｓｕｎｆｉｒｅ、方法：１００％Ａで０〜２．０分の後に５０％Ｂで７０分、流速：２５ｍＬ／分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリル）によって直ちに精製した。適切な分画を凍結乾燥し、ＨＰＬＣ等級の水に溶解した後に合わせて、化合物１４４ ２３．４μｍｏｌ（収率７３％）を得た。ＬＲＭＳ−ＥＳ−：Ｃ１６Ｈ２３Ｎ５Ｏ１２Ｐ３Ｓ２−の計算値、６３４．００、ｍ／ｚの実測値６３４．４２（Ｍ−Ｈ）。合成を図５８に例証する。
化合物１４４を、標準方法の節に記載の手順に従って色素標識生成物（７６）に変換した（図５９）。化合物１４６を、２ステップで収率７５％で得た。ＬＲＭＳ−ＥＳ＋：Ｃ３４Ｈ５９Ｎ７Ｏ１９Ｐ３Ｓ４の計算値、１０９０．２０、ｍ／ｚの実測値１０９０．２４（Ｍ＋Ｈ）。化合物７６を１４６から収率５０〜７０％で得た。ＨＲＭＳ−ＥＳ−：Ｃ６７Ｈ８６Ｎ９Ｏ２３Ｐ３Ｓ４の計算値、１６０５．３９３；ｍ／ｚの実測値１６０５．３８０（Ｍ−Ｈ）。
（実施例６３）
化合物１５０の合成：
２５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物１４８（３．０ｇ、４．５８ｍｍｏｌ）、無水ＣＨ２Ｃｌ２ ２５ｍＬ、３Åモレキュラーシーブ（５．０ｇ）およびシクロヘキセン（０．５５ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）を充填した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷浴に入れ、ＳＯ２Ｃｌ２（６．８ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中で１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介して徐々に添加し、反応物を０℃で１時間撹拌した。次に、化合物１４９への完全な変換を確実にするために、追加の０．５当量のＳＯ２Ｃｌ２を添加した。温度を１０℃近くに維持しながら、揮発物を真空下で除去した。得られた固体を無水ＤＭＦ ２０ｍＬに再懸濁し、窒素雰囲気下で維持した。
別のフラスコにおいて、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（２．４５ｇ、１１．４４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（２７４．５ｍｇ、シリコン油中で６０％）によって処理し、灰色のスラリーを産生した。これに、化合物１４９を一度に添加し、反応物を、窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を、ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓを通して濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）によって洗浄した。酢酸エチル溶液を蒸留水（２×１００ｍＬ）によって洗浄し、有機抽出物をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、真空下で濃縮し、ヘキサン中の２０〜５０％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルカラムによるフラッシュカラムクロマトグラフィーを介して精製した。標的化合物１５０を白色の固体（１．２ｇ、収率３２％、Ｒｆ：０．４、ヘキサン：酢酸エチル／３：２）として得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.13 (m, 3H), 7.43 (m, 1H), 7.32 (m, 2H), 6.12 (m, 1H), 6.00 (s, 2H), 4.62 (m, 2H), 4.31 (m, 3H), 4.00 (m, 1H), 3.82-3.60 (m, 13H), 2.39 (m, 1H), 1.84 (m, 1H), 0.78 (m, 9H), and 0.01 (m, 6H) ppm.合成を図６０に例証する。
（実施例６４）
化合物１５１の合成：
化合物１５０（１．２ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を、高真空下、デシケーター中でＰ２Ｏ５によって一晩乾燥させ、磁気撹拌子を備えた１００ｍＬフラスコ中で無水ＣＨ２Ｃｌ２ ３０ｍＬに溶解した。これに、ジメチルジスルフィド（０．６５７ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応フラスコを氷浴に入れた。ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、３１６ｍｇ、１．１当量）を添加し、０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を２５０ｍＬ分液漏斗に移し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液５０ｍＬによって中和し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）によって抽出した。有機層を、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中の８０〜５０％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルカラムによって精製し、化合物１５１ ０．８２ｇ（収率８２％、ＲＦ＝０．５、ヘキサン：酢酸エチル／３：２）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 8.15 (m, 3H), 7.42 (m, 1H), 7.35 (m, 2H), 6.11 (m, 1H), 4.80-4.65 (m, 2H), 4.34 (m, 1H), 4.28 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 3.83-3.67 (m, 2H), 2.49 (m, 1H), 2.34 (s, 3H), 1.90 (m, 1H), 0.78 (m, 9H), and 0.10 (m, 6H) ppm.合成を図６０に例証する。
（実施例６５）
化合物１５２の合成：
磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１５１（０．３０９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、および無水ＴＨＦ １０．０ｍＬ（１０．０ｍＬ）を充填し、窒素雰囲気下の氷浴に入れた。ＴＢＡＦ（０．７２ｍＬ、ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、０．７２ｍｍｏｌ）をシリンジを介して徐々に添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を分液漏斗に移し、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液液（５０ｍＬ）によってクエンチした。次いで、得られた混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。生成物１５２を、勾配７：３〜２：３ヘキサン：酢酸エチルを使用するシリカゲルカラムによるシリカゲルカラムクロマトグラフィー後に白色の粉末として収率７６％で得た（１９６ｍｇ、Ｒｆ＝０．３、ヘキサン：酢酸エチル／１：１）。1H NMR (CDCl3): δH 8.40 (s, 1H), 8.25 (m, 2H), 7.60 (m, 1H), 7.52 (m, 2H), 6.21 (m, 1H), 4.90-80 (m, 2H), 4.65 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.25 (m, 1H), 4.05-3.85 (m, 2H), 2.62 (m, 1H), 2.50 (s, 3H) and 2.31 (m, 1H) ppm. 合成を図６０に例証する。
（実施例６６）
化合物１５３の合成：
化合物１５３は、以下に記載の標準的な三リン酸エステル合成方法を使用して化合物１５２のリン酸化後に収率３０％で得た（ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ２３Ｎ４Ｏ１３Ｐ３Ｓ２の計算値、６１０．９８；ｍ／ｚの実測値６１１．１１（Ｍ−Ｈ）。これを、標準方法の節に記載した手順に従って、色素標識生成物（７２）にさらに変換した（図６１）。化合物１５５を、２ステップで収率４９％で得て、化合物７２を、収率６０〜８５％で得た。ＨＲＭＳ−ＥＳ−：Ｃ５３Ｈ６８Ｎ８Ｏ３０Ｐ３Ｓ６ −の計算値、１５８１．１５６（Ｍ−Ｈ）；ｍ／ｚの実測値１５８２．１６０。
（実施例６７）
化合物１５９および１６０の合成：
磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１５７（２．０４ｇ、２．３９ｍｍｏｌ）を充填し、高真空下で１２時間乾燥させた。反応容器にアルゴンを流した後、無水ＣＨ２Ｃｌ２ １３ｍＬおよびシクロヘキサンセン（cyclohexanesene）（０．３０ｍＬ、２．８６ｍｍｏｌ）を逐次添加した。次いで、反応フラスコを氷塩水浴に入れて、１０分間撹拌し、混合物を０℃未満にした。ＳＯ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中で１Ｍ、４．０ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して２分間滴下し、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。追加の０．８当量のＳＯ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を１分間滴下し、反応物を０℃でさらに１／２時間撹拌した。次に、浴温を約１０℃で維持しながら、揮発物を真空下で除去した。得られた固体を、無水ＤＭＦ １５ｍＬに再懸濁し、アルゴン雰囲気下で維持した。
別の１００ｍＬフラスコにおいて、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（ＴＭＰＭ−ＳＨ、１．２７ｇ、６．０ｍｍｏｌ、一晩真空乾燥）を、アルゴン雰囲気下で無水ＤＭＦ（１６ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（１９５ｍｇ、油中で６０％、４．８８ｍｍｏｌ）によって処理し、灰色のスラリーＴＭＰＭＴ−ＳＮａ塩を産生した。混合物を、気体の発生が収まるまで（約１０分間）撹拌した。これに、ＴＭＰＭＴ−ＳＮａ塩を一度に添加し、ＴＬＣ（マイクロワークアップ：ジクロロメタン／水；溶媒：ヘキサン：酢酸エチル／１：１）によって完全な変換が確認されるまで（１時間）、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。次いで、反応混合物を、濾過漏斗中でｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓ（１０ｇ）を通して濾過し、生成物をジクロロメタン（１００ｍＬ）によって溶出した。次いで、ジクロロメタン溶液を水（３×１００ｍＬ）によって洗浄した。水層を３×１００ｍＬジクロロメタンによって抽出した。合わせたジクロロメタン抽出物をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮した。次いでこれを、フラッシュクロマトグラフィー（カラム：１００ｇ、勾配：２５％〜５０％ヘキサン：酢酸エチルで５ＣＶ、次いで５０％ＥＥで１０ＣＶ）によって精製した。標的化合物１６０を、白色の泡（１．２２ｇ、収率５１％）として得た。1H NMR (DMSO-d6): δH 10.63 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.3-7.5 (m, 8H), 7.20-7.3 (m, 2H), 6.40 (m, 1H), 6.15 (m, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.50 (dd, 1H), 4.30 (m, 2H), 3.95 (m, 1H), 3.81 (m, 11H), 3.3 (m, 4H), 2.7 (m, 1H), 1.05 (m, 8H), 0.8 (m, 9H) and 0.11 (m, 6H) ppm.ＬＣＭＳ：１０１９．３７１Ｄａ。合成を図６２に例証する。
さらに、ＴＢＤＭＳ−脱保護生成物１５９を、副生成物として収率２５％（０．４８ｇ）で得た。Ｒｆ＝０．２／ヘキサン：酢酸エチル／１：１。1H NMR (DMSO-d6): δH 10.63 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.3-7.5 (m, 8H), 7.20-7.3 (m, 2H), 6.40 (m, 1H), 6.15 (m, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.50 (dd, 1H), 4.30 (m, 2H), 3.95 (m, 1H), 3.81 (m, 11H), 3.5 (m, 1H), 3.3 (m, 4H), 2.7 (m, 1H), and 1.04 (m, 8H) ppm. LCMS: 905.286 Da.
（実施例６８）
化合物１６１の合成：
磁気撹拌子およびゴム栓を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１６０（０．３６ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を充填し、高真空下で１２時間乾燥させた。アルゴンを流した後、無水ジクロロメタン７ｍＬおよびジメチルジスルフィド（０．１６ｍＬ、１．７６ｍｍｏｌ）を添加した。反応フラスコを氷浴に入れて、１０分間撹拌し、混合物を０℃にした。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、８０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を、ＴＬＣ（マイクロワークアップ：ジクロロメタン／水；溶媒：ヘキサン：酢酸エチル／１：１）まで０℃で撹拌した。反応混合物を２５０ｍＬ分液漏斗に移し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液５０ｍＬによって中和し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）によって抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラム（カラム：２５ｇ、勾配：１０％〜５０％ヘキサン：酢酸エチルで３ＣＶ、次いで５０％酢酸エチルで５ＣＶ）によって精製した。標的化合物１６１を黄色の泡（０．２３ｇ、収率７４％）として得た。合成を図６２に例証する。
（実施例６９）
化合物１６２の合成：
磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、無水ＴＨＦ ７．０ｍＬに溶解した化合物１６１（０．１８ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を充填し、アルゴン雰囲気下で氷浴に入れた。混合物を１０分間撹拌して、０℃にし、酢酸０．２８ｍＬを添加した。ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中で１Ｍ、０．４７ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して１分間滴下した。反応混合物を０℃で０．５時間撹拌し、次いで、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル／１：１）によりなおも、出発材料が示された。追加のＴＢＡＦ（ＴＨＦ中で１Ｍ、０．４７ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して１分間滴下し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。次に、混合物をメタノール２ｍＬによってクエンチし、室温で１０分間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーションによって除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム：１０ｇ、ヘキサン：酢酸エチル／１：１〜１００％で２ＣＶ、次いで１００％酢酸エチルで２０ＣＶ）によって精製し、化合物１６２を白色の泡（９６ｍｇ、６２％）として得た。合成を図６２に例証する。
（実施例７０）
化合物１６３の合成：
化合物１６３は、脱保護ステップにおいて、水酸化アンモニウムの代わりにＡＭＡまたはメタノール性アンモニアを使用したことを除き、以下に記載の標準的な三リン酸エステル合成方法を使用して化合物１６２のリン酸化後に得た。これを、以下の標準手順に従って色素標識生成物７８にさらに変換した。化合物７８は、化合物１６５から収率９７％で得た。ＨＲＭＳ−ＥＳ− Ｃ６７Ｈ９６Ｎ９Ｏ２７Ｐ３Ｓ６（Ｍ−Ｈ）の計算値１７４３．３９５、実測値１７４３．３９０。合成を図６２に例証する。
（実施例７１）
化合物１６９の合成：
１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１６７（３．１２０ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）、無水ＣＨ２Ｃｌ２ ３０．０ｍＬ、３Åモレキュラーシーブ（５．０ｇ）およびシクロヘキサンセン（０．７０ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ）を充填した。得られた混合物を窒素雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。次いで反応フラスコを氷浴に入れた。これに、ＳＯ２Ｃｌ２（８．５ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中で１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介して徐々に添加し、０℃で１時間撹拌した。次に、化合物１６８への完全な変換を確実にするために、追加の１Ｍ ＳＯ２Ｃｌ２ ４．０ｍＬを添加して４０分間撹拌した。温度を１０℃近くに維持しながら、揮発物を真空下で除去した。得られた固体を、無水ＤＭＦ ２０ｍＬに再懸濁し、窒素雰囲気下で維持した。
別のフラスコにおいて、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（３．０２８ｇ、１４．１５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（５６６ｍｇ、油中で６０％、１４．１５ｍＭ）によって処理し、灰色のスラリーを産生した。これに、化合物１６８の溶液を一度に添加して、窒素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。次いで反応混合物を、酢酸エチル（２００ｍＬ）と共にｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓ（２０ｇ）を通して濾過した。次いで、酢酸エチル溶液を、蒸留水（３×２００ｍＬ）によって洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮し、ＲｅｄｉＳｅｐＲｆＧｏｌｄ １２０ｇ、勾配：ヘキサン：酢酸エチル（７：３〜３：７）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。標的化合物（１６９）を白色の固体（１．４３ｇ、収率３５．５％、Ｒｆ：０．５、ヘキサン：酢酸エチル／１：１）として得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.98 (m, 1H), 6.09 (m, 1H), 6.00 (m, 2H), 4.67-4.51 (m, 2H), 4.30 (m, 1H), 4.22 (m, 2H), 4.00 (m, 1H), 3.80-3-60 (m, 11H), 2.31 (m, 1H), 1.83 (m, 1H), 0.80 (m, 9H) and 0.01 (m, 6H) ppm.合成を図６４に例証する。
（実施例７２）
化合物１７０の合成：
化合物１６９（１．４３ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を、高真空下でＰ２Ｏ５によって１２時間乾燥させ、磁気撹拌子および窒素ガス供給源を備えたフラスコ中で無水ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解した。これに、ジメチルジスルフィド（０．８９ｍＬ、９．８８ｍｍｏｌ）を添加し、反応フラスコを氷浴で撹拌した。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、４３０ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で１．０時間撹拌した。反応混合物を５００ｍＬ分液漏斗に移し、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３水溶液１００ｍＬによってクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１５０ｍＬ）によって抽出した。有機部分をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮した。粗生成物を、ヘキサン−酢酸エチル（８：２〜３：７）の勾配を使用するシリカゲルカラム（ＲｅｄｉＳｅｐＲｆ ｇｏｌｄ ８０ｇ）により精製し、化合物１７０ ０．６２２ｇ（収率５４％、ＲＦ＝０．６、ヘキサン：酢酸エチル／１：１）を得た。1H NMR (CDCl3): δH 7.99 (brs, 1H, NH), 7.98 (s, 1H), 6.12 (m, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.35 (m, 1H), 4.19 (m, 2H), 4.06 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.60 (m, 2H), 2.40 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 1.88 (m, 1H), 0.78 (m, 9H), and 0.10 (m, 6H) ppm.合成を図６４に例証する。
（実施例７３）
化合物１７１の合成：
磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１７０（０．６２３ｇ、１．０６ｍｍｏｌ、Ｐ２Ｏ５によって１２時間真空乾燥）および無水ＴＨＦ（２０．０ｍＬ）を充填し、窒素雰囲気下で氷浴に入れた。ＴＢＡＦ（１．２７ｍＬ、ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、１．２７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して徐々に添加した。反応混合物を０℃で１．５時間撹拌し、追加のＴＨＦ中の１Ｍ ＴＢＡＦ溶液０．９ｍＬを添加して、０℃で、全体で４時間撹拌した。次いで、反応混合物を分液漏斗に移し、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）によってクエンチした。得られた混合物を、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。勾配ヘキサン中の７：３〜３：７酢酸エチルを使用するＲｅｄｉＳｅｐＲｆ ８０ｇのカラムによるシリカゲルカラムクロマトグラフィー後に、生成物１７１を白色の粉末として収率６３％（３１１ｍｇ）で得た。1H NMR (methanol-d4): δH 8.16 (s, 1H), 6.06 (m, 1H), 4.79 (m, 2H), 4.69 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 4.14 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 3.63 (m, 2H), 2.36 (m, 3H), 2.32 (m, 1H), and 2.08 (m, 1H) ppm, LRMS-ES-: M-H observed m/z 468.0 Da.合成を図６４に例証する。
（実施例７４）
化合物１７２の合成：
生成物１７２を、標準的な三リン酸エステル合成方法を使用して化合物１７１のリン酸化後に収率５８％で得た。ＬＲＭＳ Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３Ｏ１４Ｐ３Ｓ２ −（Ｍ−Ｈ）の計算値 ６１１．９７、実測値 ６１２．１５。化合物１７１を、以下に記載の標準方法の節に記載の標準手順に従って色素標識生成物（７４）へとさらに作製した（図６５）。化合物１７４を、２ステップで収率７４％で得た。ＨＲＭＳ−ＥＳ− Ｃ３２Ｈ５５Ｎ５Ｏ２１Ｐ３Ｓ４ −（Ｍ−Ｈ）の計算値１０６６．１５、実測値１０６６．４２。化合物７４を収率６２％で得た。ＨＲＭＳ−ＥＳ− Ｃ５９Ｈ８０Ｎ７Ｏ２５Ｐ３Ｓ４ −（Ｍ−Ｈ）の計算値、１５０７．３３０、実測値１５０７．３２５。
（実施例７５）
三リン酸エステル合成の標準方法：
高真空下でＰ２Ｏ５によって予め乾燥させたヌクレオシド（１６０μｍｏｌ）およびプロトンスポンジ（１．５当量）を、２５ｍＬナシフラスコ中、Ｎ２雰囲気下でトリメチルホスフェート（０．８ｍＬ）に溶解し、全ての固体が完全に溶解するまで２０分間撹拌した。次いでフラスコを氷水浴に入れて、反応物を（−５〜０℃）にした。次いで、ＰＯＣｌ３（１．５当量）をシリンジを介して一度に添加し、反応物を１時間撹拌した。
ピロリン酸ｎ−ブチルアンモニウム（０．３６ｇ）、ｎ−Ｂｕ３Ｎ（０．３６ｍＬ）、および無水ＤＭＦ（１．３ｍＬ）の混合物を、１５ｍＬ錐形管中で調製し、濃厚なスラリーを産生した。完全に溶解した後、これを、激しく撹拌中の混合物に一度に添加し、室温で１５分間撹拌した。
次いで、反応混合物を２５０ｍＬ丸底フラスコ中で０．１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液１００ｍＬに注ぎ、室温で３時間撹拌した。次いで、これを真空下で２５ｍＬとなるまで濃縮し、水酸化アンモニウム（２８〜３０％ＮＨ３含有量）２５ｍＬによって室温で８時間処理した。減圧下で揮発物のほとんどを除去した後、粗反応物を、０．１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液（３０ｍＬ）に再懸濁し、Ｃ１８分取−ＨＰＬＣ（３０×２５０ｍｍ、Ｃ１８ Ｓｕｎｆｉｒｅカラム、方法：１００％Ａで０〜２分の後に５０％Ｂで７０分、流速２５ｍＬ／分；Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＡＣＮ）によって精製した。標的分画を凍結乾燥し、ＨＰＬＣ等級の水（２０ｍＬ）に溶解した後に合わせた。この半純粋生成物を、ＰＬ−ＳＡＸ分取カラムによるイオン交換ＨＰＬＣ（方法：１００％Ａで０〜５分、次いで７０％Ｂまでの線形勾配で７０分、Ａ＝１５％アセトニトリル水溶液、Ｂ＝１５％アセトニトリル中の０．８５Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液）によってさらに精製した。最終的な精製を、上記のようにＣ１８分取ＨＰＬＣによって実施した。ヌクレオシド三リン酸を凍結乾燥後、収率２０〜６５％で得た。
（実施例７６）
ＤＭＴＳＦを使用して３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰを３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰに変換するための標準方法：
５０ｍＬ錐形管に、３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰ（ＨＰＬＣ等級の水中の５．２５ｍＭ溶液３．８０ｍＬ、２０μｍｏｌ）およびｐＨ＝４．６５の酢酸緩衝液（５．２０ｍＬ）を充填し、ＤＭＴＳＦ（ｐＨ＝４．６５酢酸緩衝液中の８０ｍＭ溶液）９．０ｍＬと迅速に合わせた。得られた混合物を室温で２時間振とうし、反応物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液２．０ｍＬによってクエンチし、３０×２５０ｍｍ Ｃ１８ Ｓｕｎｆｉｒｅカラムによる分取ＨＰＬＣ、方法：１００％Ａで０〜２．０分の後に、５０％Ｂまでの線形勾配で７０分、流速：２５ｍＬ／分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリルによって直ちに精製した。標的分画を凍結乾燥し、ＨＰＬＣ等級の水に溶解した後合わせて、ヌクレオチドに応じて３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰを収率５０〜７５％で得た。３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰの構造の例を図６６に例証する。
（実施例７７）
ＮＨＳ活性化リンカーのコンジュゲーションのための標準方法：
ＨＰＬＣ等級の水（２ｍＬ）に溶解したＭｅＳＳｄＮＴＰ−ＰＡ（１０μｍｏｌ）を、新たに調製した０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液（１ｍＬ）によって希釈した。錐形管において、ＮＨＳ活性化リンカー（ＮＨＳ−Ａ−Ｆｍｏｃ、１１４、３５ｍｇ、２．５当量）を、無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解した。次いで、ＭｅＳＳｄＮＴＰ−ＰＡ／Ｎａ２ＨＰＯ４溶液を一度に添加し、室温で８時間撹拌した。
次いで、反応物を０．１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液（２．０ｍＬ）によって希釈し、ピペリジン（０．６ｍＬ）によって処理した。混合物を室温で１時間撹拌し、０．１Ｍ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）によってさらに希釈し、３０×２５０ｍｍ Ｃ１８ Ｓｕｎｆｉｒｅカラムによる分取ＨＰＬＣ、方法：１００％Ａで０〜２．０分の後に、５０％Ｂまでの線形勾配で７０分、流速：２５ｍＬ／分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリルによって迅速に精製した。標的分画を凍結乾燥し、ＨＰＬＣ等級の水に溶解した後合わせて、ＭｅＳＳｄＮＴＰ−Ａ−ＮＨ２を収率４５〜７５％で得た。
（実施例７８）
ＮＨＳ色素による標識のための標準方法：
ＨＰＬＣ等級の水２．０ｍＬ中のＭｅＳＳｄＮＴＰ−Ａ−ＮＨ２（４．５５μｍｏｌ）を、１５ｍＬ錐形管中でＮａ２ＨＰＯ４（０．５Ｍ水溶液０．８ｍＬ）によって希釈し、無水ＤＭＦ １．４ｍＬ中のＮＨＳ活性化色素（２．５当量）と合わせた。反応混合物を室温で８時間撹拌し、０．１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液（４０ｍＬ）によって希釈し、３０×２５０ｍｍ Ｃ１８ Ｓｕｎｆｉｒｅカラムによる分取ＨＰＬＣ（方法：１００％Ａで０〜５分の後に、５０％Ｂまでの線形勾配で７０分、流速２５ｍＬ／分）によって精製した。標的分画を凍結乾燥し、ＨＰＬＣ等級の水に溶解した後合わせて、標識生成物を収率５０〜８０％で得た。
（実施例７９）
切断可能リンカーおよびマーカーの核酸塩基への結合
切断可能リンカーを結合させるために使用する好ましい部分の１つは、プロパルギルベースまたはアリルベースの部分である。切断可能リンカーおよび色素を結合させる他の手段も企図される。特に、色素切断後に残留リンカーがほとんどまたは全くない塩基部分との結合が特に好ましい。切断後に荷電を有しない残留リンカーが得られる塩基との結合も好ましい。これらの特色は、標識／色素の切断後に、ヌクレオチドが酵素によって核酸の成長する鎖に効率的に確実に取り込まれるために重要である。本発明によって企図される１つの特定の実施形態は、切断可能な色素に結合するためにヒドロキシメチル改変塩基部分の使用を含む。そのような化合物の例を、図７１に示す。図７２は、色素と３’−Ｏ保護基の切断後のヒドロキシメチル誘導体の構造を示す。
（実施例８０）
切断可能リンカーおよび３’−Ｏ保護基の切断
多様な切断剤を使用して、本発明のリンカーおよび保護基を切断することができる。例えば、多様なチオール含有化合物を、（「Thiol-Disulfide Interchange」、Singh, R.およびWhitesides, G. M.、Sulfur-Containing Functional Groups；補遺Ｓ、Patai, S.編、J. Wiley and Sons, Ltd.、１９９３年、６３３〜６５８頁）［１５］に記載のように使用することができる。還元チオール基を有する特定の化合物では、ｐＫａ、例えばジチオブチルアミン、ＤＴＢＡを使用して、迅速かつ効率的な切断収率を得ることができる（Lukeshら、J. Am. Chem. Soc.、２０１２年、１３４巻（９号）、４０５７〜４０５９頁［１６］）。本発明の切断を実施するために使用することができるチオール含有化合物の例を、図７３Ａ〜７３Ｉに示す。
本発明のジチオ終結基およびリンカーを切断するために適した別のクラスの化合物は、ホスフィンである（Harppら、J. Am. Chem. Soc.、１９６８年、９０巻（１５号）、４１８１〜４１８２頁［１２］、Burnsら、J. Org. Chem.、１９９１年、５６巻、２６４８〜２６５０頁［１３］、Getzら、Analytical Biochemistry、２７３巻、７３〜８０頁（１９９９年）［１４］）。本発明のジチオベースの保護基およびリンカーを切断するために有用なホスフィンの例には、トリフェニルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリス−ヒドロキシメチル−ホスフィン（ＴＨＭＰ）、トリス−ヒドロキシプロピル−ホスフィン（ＴＨＰＰ）、トリス−カルボエトキシ−ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。ある特定の場合には、リンカーまたは３’−保護基のいずれかを選択的に切断することができることが望ましい場合がある。これは、保護基およびリンカーの設計ならびに切断試薬の選択によって行うことができる。例えば、３’−アジドメチルエーテル保護基とジスルフィドリンカー含有ヌクレオチドとの組合せをこの目的のために使用することができる。この場合、ジスルフィド架橋の選択的切断は、チオールベースの切断試薬を使用することによって行うことができ、３’−アジドメチルエーテル保護基の除去は、ＴＣＥＰなどのホスフィンを使用することによって行うことができる。そのような手順の例を、図７３Ａ〜７４Ｃ、図７４Ａ〜７５Ｃ、および図７５に例証する。図７３Ａ〜７４Ｃは、起こっている化学反応のスキームおよび形成された化合物の構造を示し、図７４Ａ〜７５Ｃは、各段階で収集されたＨＰＬＣクロマトグラムを示し、図７５は、各ピークで抽出された吸収スペクトルを示す。ステップＡ）標識された３’−Ｏ−保護ヌクレオチドは、１つのピーク（１）を示し、ヌクレオチド（２８０ｎｍ；プロパルギル化合物の最大値は、２８０〜２９０ｎｍへとシフトしていることに注意されたい）および色素（５７５ｎｍ）の両方で吸収を示す。ステップＢ）ＤＴＴによる処理は、色素（５７５ｎｍ）で吸収ピークを有し、かつより遅く移動する（より疎水性の）ピーク２、および（２７８ｎｍ）吸収を有し、かつより親水性の特徴のためにより速く移動するピーク３を産生する。ステップＣ）ＴＣＥＰによってさらに処理すると、２７８で吸収最大を有するが３’−ＯＨ保護基の喪失と一貫してさらに低い保持時間でも色素を有しないピーク４を産生する。切断された色素はさらなるピーク（５、６）へと分割するが、いずれのピークも同一の吸収を有する。
切断の別の例を、図７６Ａ〜Ｅおよび図７７Ａ〜７８Ｂに示す。図７６Ａ〜Ｅは、３’末端でジチオベースの保護基を有するヌクレオチドおよびジチオベースリンカーを使用する切断反応のスキームを示す。この図が示すように、切断反応は１ステップまたは２ステッププロセスで実施することができる。図７７Ａ〜７８Ｂは、多様な切断剤：ジチオコハク酸、Ｌ−システイン、ＤＴＴ、およびシステアミンを使用して実施した切断実験の結果を示す。図７７Ａは、切断剤ジチオコハク酸、Ｌ−システイン、ＤＴＴ、およびシステアミンと共にインキュベーション後の出発材料および反応混合物に関して生成されたＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図７７Ｂは、Ｌ−システイン、ＤＴＴ、およびシステアミンの場合にはリンカーと３’−保護基の両方の完全な切断、ならびにジチオコハク酸の場合には、３’−Ｏ−保護基の選択的切断を示す、反応混合物の同定された組成を示す。これは、リンカーの構造、保護基、および切断剤の性質を選択することによって（すなわち、ＳＨ基のｐＫａおよび立体妨害の程度を変化させることによって）選択性を得ることができることを示している。これらに加えて、多様な適した切断剤、例えば、ビス（２−メルカプトエチル）スルホン（ＢＭＳ）およびＮ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン（ＤＭＨ）を使用することができる（Singhら、Bioorg. Chem.、２２巻、１０９〜１１５頁、（１９９４年）［１７］）。セレノールを含めることによって反応をさらに触媒することができる（Singhら、Anal Biochem.、１９９５年１１月２０日；２３２巻（１号）：８６〜９１頁［１８］）。ホウ化水素ナトリウムなどのホウ化水素もこの目的のために使用することができ（Stahlら、Anal. Chem.、１９５７年、２９巻（１号）、１５４〜１５５頁［１９］）、アスコルビン酸も同様である（Nardaiら、J. Biol. Chem.、２７６巻、８８２５〜８８２８頁（２００１年）［２０］）。さらに、ジスルフィドおよびチオレダクターゼなどのジスルフィド結合の酵素的切断方法もまた、周知であり、本発明の化合物と共に使用することができる（Holmgrenら、Methods in Enzymology、２５２巻、１９９５年、１９９〜２０８頁［２１］）。
（実施例８１）
スカベンジャー
使用する切断剤に応じて、当業者は、切断反応の終了後に過剰量の切断剤を除去するスカベンジャーを選択する必要がある。例えば、チオール含有切断剤の場合、遊離のＳＨ基と反応することができるスカベンジャーを使用することができる。例えば、ヨードアセトアミドまたはマレイミド誘導体などのアルキル化剤を使用することができる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６２３，５９８号［４９］）。ホウ化水素の場合、当業者は、ケトン含有化合物、例えばレブリン酸または類似の化合物を使用することができる。最後に、過剰量の切断剤を非反応種に酸化させる酸化試薬、例えば過ヨウ素酸塩も使用することができる（Molecules、２００７年、１２巻（３号）、６９４〜７０２頁［５０］）。
（実施例８２）
モジュラー合成
本発明の標識ヌクレオチドは、合成のいくつかのステップを必要とし、多様な色素を異なる塩基に連結することを伴う。リンカーおよび色素の結合を、段階的プロセスよりもモジュラー様式で行うことができることが望ましい。モジュラーアプローチは、一方の末端で保護基を有し、他方の末端で活性化基を有するリンカー部分を予め構築するステップを伴う。次いでそのような予め構築されたリンカーを使用して、プロパルギルアミンヌクレオチドにカップリングさせ、マスクされたアミン基を脱保護し、次いで活性化色素をカップリングさせることができる。これは、段階的合成と比較して少ないステップおよび高い収率という利点を有する。例えば、図１３の化合物３２は、活性化反応性基（ジスクシンイミジルカーボネート）およびマスクされた／保護されたアミン（Ｆｍｏｃ）と共に、切断可能な官能基を含む予め活性化されたリンカーの例である。プロパルギルアミンヌクレオチド上の遊離のアミンにカップリングさせた後、保護基を例えば、塩基（アンモニア水、ピペリジン）による処理によって都合よく除去することができ、活性化（ＮＨＳ）色素分子にカップリングすることができる。
（実施例８３）
本発明のリンカーを、その疎水性を測定するために試験した。化合物のｌｏｇＰ値は、ｎ−オクタノールと水との間のその分配係数の対数であり、ｌｏｇ（ｃｏｃｔａｎｏｌ／ｃｗａｔｅｒ）は、化合物の親水性（またはその欠如）の良好に確立された測定である［５１］。低い親水性、したがって高いｌｏｇＰ値は、不良な吸収または透過を引き起こす。この場合、予測ソフトウェアを使用してｌｏｇＰ値を計算し、以下の表は、結果を示し、リンカー（例えば、図２５のリンカー）が疎水性リンカーであるが、一部の商業的に使用されるリンカーは親水性であることを示している。
（実施例８４）
本実施例は、３’−０−（メチルメチレンジスルフィド）５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル）−ｄＵ（（ＭｅＳＳｄＵ−ＰＡ（ＣＯＣＦ３）、７）の合成を示す。図８５を参照されたい。
Ａ．５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（5’-0-(tert-hu0,1dimethylsily1)-5-(N-trifluoroacetyl-aminopropargy1)-2’-deoxyuridine）（２）の合成：
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１、２５．００ｇ、５３．３７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６．１６ｇ、５．２７ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（２．３１６ｇ、１２．１６ｍｍｏｌ）によってアルゴン雰囲気下、室温で１０分間処理した。次いで、Ｎ−トリフルオロアセチル−プロパルギルアミン（２３．９９ｇ、１５７．８ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１４．７ｍＬ、１０５．５ｍｍｏｌ）を逐次添加し、室温で３．０時間撹拌した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションによって除去した。得られた粗生成物を、ＥｔＯＡｃ ５００ｍＬに溶解し、分液漏斗に移した。次いで、有機部分を飽和ＮａＨＣＯ３（２×４００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×４００ｍＬ）溶液によってそれぞれ洗浄した。
次いで、ＥｔＯＡｃ部分を無水Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。Ｎａ２ＳＯ４塩を濾過して除去した後、濾液の酢酸エチル部分を、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。次いで、これを３×４０ｇシリカゲルに結合させるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（１：１ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ〜２：３ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ、２００ｇ、１５ｕ ＨＰ ｐｕｒｉｆｌａｓｈカラム、３回注入）によって精製し、２ ２１．９９４ｇ（収率８３．８８％）を得た。ＨＲ−ＭＳ：実測値４９２．１７７３、Ｃ２０Ｈ２９Ｆ３Ｎ３Ｏ６Ｓｉ ［Ｍ＋１１］＋の計算値４９２．１６９９。1H-NMR in DMF-d7: 6H 11.65 (brs, 1H, NH), 10.15 (brs, 1H, NH), 8.15 (brs, 1H), 6.37 (t, J= 5.99 Hz), 5.42 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.37（ｂｒｓ、２Ｈ、プロパルギルアミン基のＮＨ−ＣＨ２に関して）、4.00 (m, 1H), 3.84-3.97 (m, 2H), 2.30 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 0.97 (s, 9H) and 0.19 (s, 6H) ppm.
Ｂ．５’−０−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−０−（メチルチオメチル）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（5’-0-(tert-butyldimethylsily1)-3’-0-(inethylthioinethyl)-5-(N-trifluoroacetylaminopropargy1)-2’-deoxyuridine）（３）の合成
先のステップで得られた化合物２（２１．９９ｇ、４４．７７ｍｍｏｌ）を、１０００ｍＬ丸底フラスコ中でＤＭＳＯ（９０ｍＬ）に溶解した。次いでこれに、ＡｃＯＨ（４０ｍＬ）および無水酢酸（１３２ｍＬ）を逐次添加し、室温で４８時間撹拌した。反応混合物を、ＣＯ２ガスの発生が停止するまで、飽和Ｋ２ＣＯ３によって徐々に中和した。次いで、混合物を分液漏斗に移し、さらに抽出した（２×５００ｍＬ ＣＨ２Ｃｌ２）。次いで、合わせた有機部分を飽和ＮａＨＣＯ３（１×５００ｍＬ）によって洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。有機部分を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／７：３〜１：１）によって精製し、ＵｔａｉｓｉｌｆｕｎｉｔＳ４ｂ§．０３／ｎ８８４ １２．３８ｇを得た。Ｃ２２Ｈ３３Ｆ３Ｎ３Ｏ６ＳＳｉ（Ｍ＋Ｈ）＋の計算値 ５５２．１７。化合物３の1H-NMR(DMSO-d6): 6H 11.69 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 6.07 (m, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.38 (m, 1H), 4.19 (m, 2H), 4.03 (m, 1H), 3.75 (m, 2H), 2.34 (m, 1H), 2.14 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 0.86 (s, 9H) and 0.08 (s, 6H) ppm.
Ｃ．３’−０−（ＴＭＰＭＴ）−５’−０−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（５）の合成
丸底フラスコに、化合物３（３．１２０ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）、無水ＣＨ２Ｃｌ２ ３０．０ｍＬ、３Ａモレキュラーシーブ（５．０ｇ）およびシクロヘキセン（０．７０ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ）を充填した。次いで、反応フラスコを氷浴に入れた。これに、ＳＯ２Ｃｌ２（８．５ｍＬ、ＣＨ２Ｃ１２中で１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介して徐々に添加し、０℃で１時間撹拌した。次に、化合物４への完全な変換を確実にするために、余分の１Ｍ ＳＯ２Ｃｌ２ ４．０ｍＬを添加し、さらに４０分間撹拌した。温度を１０℃近くに維持しながら、揮発物を真空下で除去した。得られた固体を、無水ＤＭＦ ２０ｍＬに再懸濁し、窒素雰囲気下で維持した。
別のフラスコにおいて、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（３．０ｇ、１４．１５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（５６６ｍｇ、油中で６０％、１４．１５ｍＭ）によって処理し、灰色のスラリーを産生した。これに、化合物４の溶液を一度に添加し、窒素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。次いで反応混合物を、漏斗中でｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓ（２０ｇ）を通して濾過し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）によって生成物を溶出した。次いで、ＥｔＯＡｃ溶液を、蒸留水（３×２００ｍＬ）によって洗浄した。ＥｔＯＡｃ抽出物をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（カラム：ＲｅｄｉＳｅｐＲｆＧｏｌｄ １２０ｇ、勾配：７：３ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ〜３：７ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）によって精製した。標的化合物（５）を白色の固体（１．４３ｇ、収率３５．５％、Ｒｆ：０．５、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１）として得た。1 H NMR (CDC13): 8H 7.98 (m, 1H), 6.09 (m, 1H), 6.00 (m, 2H), 4.67-4.51 (m, 2H), 4.30 (m, 111), 4.22 (m, 2H), 4.00 (m, 1H), 3.80-3-60 (m, 11H), 2.31 (m, 1H), 1.83 (m, 1H), 0.80 (m, 9H) and 0.01 (m, 6H) ppm.
Ｄ．３’−０−（メチルメチレンジスルフィド）−５’４９−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（3’-0-(methylmethylenedisulfide)-5’49-(tert-butyldimethylsi/lyl-5-(N-trifluoroacetylaminopropargy1)-2’-deoxyuridine）（６）の合成
化合物５（１．４３ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を、高真空下のデシケーター中でＰ２Ｏ５によって一晩乾燥させ、磁気撹拌子および窒素ガス供給源を備えるフラスコ中で無水ＣＨ２Ｃｌ２ ２５ｍＬに溶解した。これに、ジメチルジスルフィド（０．８９ｍＬ、９．８８ｍｍｏｌ）を添加し、反応フラスコを氷浴で撹拌した。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、４３０ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で１．０時間撹拌した。反応混合物を、５００ｍＬ分液漏斗に移し、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３水溶液１００ｍＬによってクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１５０ｍＬ（15OrnL））によって抽出した。有機部分をＮａ２ＳＯ４によって乾燥させ、ロータリーエバポレーションによって濃縮した。粗生成物を、勾配８：２／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ〜３：７／Ｈｅｘ−ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルカラム（ＲｅｄｉＳｅｐＲｆ ｇｏｌｄ ８０ｇ）によって精製し、化合物６ ０．６２２ｇ（収率５４％、ＲＦ＝０．６、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１）を得た。1H NMR (CDC13): 811 7.99 (brs, 1H, NH), 7.98 (s, 1H), 6.12 (m, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.35 (m, 1H), 4.19 (m, 2H), 4.06 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.60 (m, 2H), 2.40 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 1.88 (m, 1H), 0.78 (m, 9H), and 0.10 (m, 6H) ppm.
Ｅ．３’−Ｏ−（メチルメチレンジスルフィド）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノ−プロパルギル）−２’デオキシウリジン（７）の合成
磁気撹拌子を備えた丸底フラスコに、化合物６（０．６２３ｇ、１．０６ｍｍｏｌ、Ｐ２Ｏ５によって一晩真空乾燥）および無水ＴＨＥ（２０．０ｍＬ）を充填し、窒素雰囲気下で氷浴に入れた。ＴＢＡＦ（１．２７ｍＬ、１．２７ｍｍｏｌ、１Ｍ溶液中）を、シリンジを介して徐々に添加した。反応混合物を０℃で１．５時間撹拌した。次いで、余分の１Ｍ ＴＢＡＦ ０．９ｍＬを添加し、氷冷温度で全体で４時間撹拌した。次いで反応混合物を分液漏斗に移し、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）によってクエンチした。得られた混合物をＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた。勾配７：３〜３：７ Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃを使用するＲｅｄｉＳｅｐＲｆ ８０ｇのカラムによるシリカゲルカラムクロマトグラフィー後に、生成物７を白色の粉末として収率６３％（３１１ｍｇ）で得た。1H NMR (Me0H-d4): 611 8.16 (s, 1H), 6.06 (m, 1H), 4.79 (m, 2H), 4.69 (ni, 1H), 4.40 (m, 1H), 4.14 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 3.63 (m, 2H), 2.36 (m, 3H), 2.32 (m, 1H), and 2.08 (m, 1H) ppm.ＬＣ−ＭＳによってさらに確認した：Ｍ−Ｈ ｍ／ｚの実測値 ４６８．０。
（実施例８５）
本実施例は、３’−０−（メチルメチレン（methylinethylene）ジスルフィド）−５−（アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（3’-0-(methylinethylenedisulfide)-5-(aminopropargy1)-2’-deoxyuridine；ＭｅＳＳｄＵＴＰＰＡ、８）の合成を示す。図８６ＡおよびＢを参照されたい。化合物７の真空乾燥試料（１５５ｍｇ、３３０ｎｍｏｌ）およびプロトンスポンジ（１００ｍｇ）を、Ａｒ雰囲気下で磁気撹拌子を含有する２５ｍＬナシフラスコに入れた。固体を、トリメチルホスフェート（１．４ｍＬ）に懸濁し、全ての固体が完全に溶解するまで室温で３０分間撹拌した。次いで、フラスコを氷塩水浴に入れて、１０分間撹拌し、フラスコを氷点下の温度（−５〜０℃）にした。次いで、ＰＯＣｌ３（５０［ＩＬ、５７０ｎｍｏｌ）を、マイクロシリンジを使用して一度に添加した。次いで、混合物を同じ温度で１時間撹拌した。次に、ピロリン酸−Ｂｕ３Ｎ−ＤＭＦのプレミックスを、１５ｍＬ遠心分離管中で可能な限り迅速に調製し、濃厚溶液（ピロリン酸−Ｂｕ３ＮＨ＋ ０．７３ｇ、Ｂｕ３Ｎ ０．７３ｍＬ、無水ＤＭＦ ２．６ｍＬ）を産生した。完全に溶解した後、混合物を、激しく撹拌中の反応混合物に急速に一度に添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで反応混合物を、５００ｍＬ丸底エバポレーションフラスコ中で０．１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液２００ｍＬに注いだ。混合物を室温で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を水酸化アンモニウム６０ｍＬ（２８〜３０％ＮＨ３含有量）によって室温で１時間処理した。次いで、混合物をロータリーエバポレーションによって濃縮し、分取ＨＰＬＣ（１９×２５０ｍｍ、Ｃ１８ Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｗａｔｅｒｓ、方法：１００％Ａで０〜２分の後に、２０％Ｂで７０分、流速１４ｍＬ／分；Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＡＣＮ）によって精製した。標的分画（Ｒｆ＝３２〜３７分）を凍結乾燥し、ＨＰＬＣ等級の水に溶解した後合わせて、ＭｅＳＳｄＵＴＰ−ＰＡ、８ １０３ｎｍｏｌ（収率５８％）を得た。生成物を、ＬＣ−ＭＳによって確認した：ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ） ６１２．００。
（実施例８６）
本実施例は、ＭｅＳＳｄＵＴＰ−ＡＲＡ−ＮＨ２、１１の合成を示す。
化合物ＭｅＳＳｄＵＴＰ−ＰＡ（８）を、１５ｍＬ遠心分離管にアリコートにした（６．９２ｍＭで２．１６ｍＬ＝１５．ｔｍｏｌ）。これをＨＰＬＣ等級の水０．８ｍＬおよびＨＰＬＣ等級の水中で新たに調製した０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ １．５ｍＬによって希釈した。別の管に、活性化リンカーＮＨＳ−ＡＲＡ−Ｆｍｏｃ（１０、４４ｆ．ｉｍｏｌ）３５ｍｇを無水ＤＭＦ ３．０ｍＬに懸濁した。この溶液を、ＭｅＳＳｄＵＴＰ−ＰＡ／Ｎａ２ＨＰＯ４溶液に一度に添加し、手動で軽く振とうした。次いで、これをシェーカー上に置いて、室温で一晩反応させた。翌日、ＨＰＬＣ分析により、コンジュゲート生成物（１０）への定量的変換が示された。これを０．１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液１．０ｍＬによって希釈した。これに、ピペリジン０．７ｍＬを添加し、室温のシェーカー上で１時間撹拌した。次いで生成物を、３０×２５０ｍｍ Ｃ１８ Ｓｕｎｆｉｒｅ−Ｗａｔｅｒｓカラム上による分取ＨＰＬＣ、方法：１００％Ａで０〜２．０分の後に５０％Ｂで７０分、流速：２５ｍＬ／分、Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリル、１回のみの注入によって直ちに精製した。標的分画（Ｒｆ＝４６分）を合わせて凍結乾燥し、最終生成物をＨＰＬＣ等級の水に溶解し、濃度をＵＶ分光法によって決定し、ＭｅＳＳｄＵＴＰＡＲＡ−ＮＩ−１２、１１ ６．８ｎｍｏｌ（２ステップで収率４５％）を得た。生成物を、ＬＲ−ＬＣ−ＭＳによってさらに確認した：ｍ／ｚの実測値 １０６７。
（実施例８７）
本実施例は、本明細書において紹介した切断試験の一般的方法を表す。
１００ｍＭ切断試薬（表１を参照されたい）の保存溶液を、１５．０ｍＬ遠心分離管において１．０Ｍ ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．５、Ｓｉｇｍａ＃Ｔ９２８５）中で調製した。次いで、そのうちの２０μＬアリコート（２，０００ｎｍｏｌ）を、１．０ｍＬ遠心分離管中で蒸留水７６．９μＬによって希釈し、６．５ｍＭ ＭｅＳＳｄＵＴＰ−ＡＲＡ−ＮＨ２（１１、２０ｎｍｏｌ）３．０７μＬを添加し、総体積１００ｌｉｔＬとした（最終濃度：２０ｍＭ切断剤、０．２ｍＭヌクレオチド、２００ｍＭ ＴＥ緩衝液）。混合物の管を、予め加熱したサーモサイクラー上で軽く振とうしながら６５℃で加熱した。１０分後、混合物を、ＬＣ−ＭＳによって直ちに分析した。％変換を波長２８０ｍｕで抽出したそれぞれのピークの相対的ピーク面積によって決定した。
本発明は、これらの好ましい実施形態を参照して記載されているが、他の実施形態も同じ結果を達成することができる。本発明の変形形態および改変は、当業者に明白であり、そのような全ての改変および同等物が、添付の特許請求の範囲に含まれると意図される。上記で引用した全ての出願、特許、および刊行物、ならびに対応する出願の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (39)

  1. ＤＮＡ配列中の標識ヌクレオチドを検出するための方法であって、
    ａ）核酸鋳型および前記鋳型にハイブリダイズしてプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なプライマー、チオール含有化合物を含む切断試薬および切断スカベンジャー試薬を提供するステップと、
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシド三リン酸を前記プライマーおよび鋳型に添加して反応混合物を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が核酸塩基および糖を含み、前記糖が３’−Ｏに切断可能な保護基を含み、前記切断可能な保護基がメチレンジスルフィドを含み、前記デオキシヌクレオシド三リン酸が、切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して前記核酸塩基に結合した第１の検出可能な標識をさらに含む、ステップと、
    ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供して改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が組み込まれている、ステップと、
    ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記デオキシヌクレオシド三リン酸の前記第１の検出可能な標識を検出するステップと、
    ｅ）前記切断可能な保護基および前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去する条件下で前記切断試薬を導入するステップと、
    ｆ）前記切断スカベンジャー試薬を導入するステップと
    を含む方法。
  2. 前記切断試薬がジメルカプトプロパンスルホネートを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ジメルカプトプロパンスルホネートが緩衝液中にある、請求項２に記載の方法。
  4. 前記緩衝液がＣＨＥＳである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記切断試薬のｐＨが９．０〜１０．０の間である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記切断試薬の前記ｐＨが９．５である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記切断スカベンジャーが酸化的スカベンジャーである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記酸化的スカベンジャーが過酸化水素である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記過酸化水素が緩衝液中にある、請求項８に記載の方法。
  10. 前記緩衝液がＴＲＩＳである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＴＲＩＳ緩衝液が、８．５〜９．０の間のｐＨにある、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＴＲＩＳ緩衝液が８．８のｐＨにある、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記酸化的スカベンジャーがｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドである、請求項７に記載の方法。
  14. ステップｂ）の前記反応混合物がフローセル中にある、請求項１に記載の方法。
  15. 前記フローセルが移動支持体上に配置されている、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記移動支持体が回転ステージである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記フローセルの少なくとも一部が透明である、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記フローセルが機器内に組み込まれている、請求項１４に記載の方法。
  19. ステップｂ）の繰り返しの間に、第２のデオキシヌクレオシド三リン酸を添加するステップをさらに含み、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸が第２の切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合した第２の検出可能な標識を含み、前記第２の検出可能検出可能な（detectible detectable）標識が前記第１の検出可能検出可能な（detectible detectable）標識と異なる、請求項１に記載の方法。
  20. 前記チオール含有化合物がビシナルジチオール系化合物である、請求項１に記載の方法。
  21. 前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸の前記核酸塩基が、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の前記核酸塩基と異なる、請求項２０に記載の方法。
  22. Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵのアナログを表す、少なくとも４種の異なって標識された、３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャップされたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物の混合物が、ステップｂ）で使用される、請求項１に記載の方法。
  23. 前記検出するステップが、前記組み込まれた第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基の決定を可能とする、請求項２２に記載の方法。
  24. ＤＮＡ配列中の標識ヌクレオチドを検出するための方法であって、
    ａ）核酸鋳型および前記鋳型にハイブリダイズしてプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なプライマー、ならびにフローセルを提供するステップであって、前記フローセルが、チオール含有化合物を含む切断試薬を含む第１のリザーバーおよび酸化的洗浄液を含む第２のリザーバーと流体連通する、ステップと、
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシド三リン酸を前記プライマーおよび鋳型に添加して、前記フローセル中で反応混合物を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が核酸塩基および糖を含み、前記糖が３’−Ｏに切断可能な保護基を含み、前記切断可能な保護基がメチレンジスルフィドを含み、前記デオキシヌクレオシド三リン酸が切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して前記核酸塩基に結合した第１の検出可能な標識をさらに含む、ステップと、
    ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供して改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が組み込まれている、ステップと、
    ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記デオキシヌクレオシド三リン酸の前記第１の検出可能な標識を検出するステップと、
    ｅ）前記切断可能な保護基および前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去する条件下で前記切断試薬を前記第１のリザーバーから前記フローセルに導入するステップと、
    ｆ）前記酸化的洗浄液を、前記第２のリザーバーから、前記フローセルに導入するステップと
    を含む方法。
  25. 前記切断試薬が、ジメルカプトプロパンスルホネートを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ジメルカプトプロパンスルホネートが緩衝液中にある、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記緩衝液がＣＨＥＳである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記切断試薬のｐＨが９．０〜１０．０の間である、請求項２４に記載の方法。
  29. 前記切断試薬の前記ｐＨが９．５である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記酸化的洗浄液が過酸化水素を含む、請求項２４に記載の方法。
  31. 前記過酸化水素が緩衝液中にある、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記緩衝液がＴＲＩＳである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記酸化的洗浄液がｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドを含む、請求項２４に記載の方法。
  34. １つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬、使用説明書、酸化的スカベンジャー、およびチオール含有化合物を含む切断試薬を含むキット。
  35. 前記チオール含有化合物がジメルカプトプロパンスルホネートである、請求項３４に記載のキット。
  36. 前記酸化的スカベンジャーが過酸化水素である、請求項３４に記載のキット。
  37. 前記酸化的スカベンジャーがｔｅｒ−ブチルペルオキシドである、請求項３４に記載のキット。
  38. 前記１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬が、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型およびヌクレオチドを含む群から選択される、請求項３４に記載のキット。
  39. 溶液中で鋳型にハイブリダイズしたプライマーを含むフローセルであって、前記溶液がチオール含有化合物および酸化的スカベンジャーを含む、フローセル。
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