DE2122529C2

DE2122529C2 -

Info

Publication number: DE2122529C2
Application number: DE2122529A
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr. Eckstein; Roger Sidney Dr. 3400 Goettingen De Goody
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1971-05-06
Filing date: 1971-05-06
Publication date: 1987-10-01
Also published as: NL178599C; IL39338A0; HU168968B; IL39338A; DE2122529A1; NL178599B; JPS5640160B1; GB1328609A; NL7206144A; US3846402A; SU437288A3; FR2135669A1; FR2135669B1

Description

Die Erfindung betrifft neue Thiophosphatanaloge der Nucleosid- di- und -triphosphate, in denen ein Sauerstoffatom am endständigen Phosphoratom der Phosphorsäureanhydrid-Kette durch ein Schwefelatom ersetzt ist, sowie die Herstellung dieser Verbindungen.

Es wurden bereits Nucleotidanaloge beschrieben, die durch Ersatz eines Sauerstoffs an der Phosphatgruppe durch Schwefel modifiziert wurden. Auch sind bereits Nucleotidanhydride bekannt, die ein Schwefelatom am α-Phosphoratom tragen. Die bekannten Verbindungen zeigen zwar interessante Eigenschaften, wenn sie in enzymatischen Umsetzungen in Konkurrenz zu den natürlichen entsprechenden Nucleotiden eingesetzt werden. Ein schwerwiegender Nachteil dieser Verbindungen liegt jedoch darin, daß sie infolge der Asymmetrie des α-Phosphoratoms im Nucleotid in diastereoisomeren Formen vorliegen, die äußerst schwierig zu trennen sind und die ganz unterschiedlich gegenüber speziellen Enzymen wirken können. Diese Schwierigkeiten sollten nicht auftreten bei den Di- und Triphosphaten, welche am endständigen Phosphoratom Schwefel enthalten, da diese Verbindungen an dieser Stelle keine Asymmetrie aufweisen. Es besteht daher ein Interesse an der Schaffung solcher Verbindungen.

Gegenstand der Erfindung sind daher neue Verbindungen der allgemeinen Formel

in der
Beine natürliche oder modifizierte Nucleinbase Xein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe und m und njeweils die Zahl 1 oder 2 bedeuten, sowie die Salze dieser Verbindungen.

In der obigen allgemeinen Formel kann B, wenn es eine natürliche Nucleinbase ist, Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Cytosin, Uracil, Thymin, 5-Methylcytosin oder 5-Hydroxymethylcytosin bedeuten. Wenn X eine Hydroxylgruppe darstellt, handelt es sich um die Derivate der normalen Nucleotide, falls X ein Wasserstoffatom bedeutet, um die entsprechenden Desoxyribonucleotide.

Beispiele für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Adenosin-5′-O-(2-thiodiphosphat), Guanosin-5′-O-(2-thiodiphosphat), Inosin-5′-O-(2-thiodiphosphat), Cytidin-5′-O- (2-thiodiphosphat), Uridin-5′-O-(2-thiodiphosphat), Thymidin- 5′-O-(2-thiodiphosphat), 5-Methylcytidin-5′-O-(2-thiodiphosphat), 5-Hydroxymethylcytidin-5′-O-(2-thiodiphosphat), Adenosin-5′-O-(2-thiodiphosphat)-disulfid, Guanosin-5′-O- (2-thiodiphosphat)-disulfid, Inosin-5′-O-(2-thiodiphosphat)- disulfid, Cytidin-5′-O-(2-thiodiphosphat)-disulfid, Uridin- 5′-O-(2-thiodiphosphat)-disulfid, Thymidin-5′-O-(2-thiodiphosphat)- disulfid, Adenosin-5′-O-(3-thiotriphosphat), Guanosin- 5′-O-(3-thiotriphosphat), Inosin-5′-O-(3-thiotriphosphat), Cytidin-5′-O-(3-thiotriphosphat), Uridin-5′-O-(3-thiotriphosphat), Thymidin-5′-O-(3-thiotriphosphat), Adenosin-5′-O- (3-thiotriphosphat)-disulfid, Guanosin-5′-O-(3-thiotriphosphat)- disulfid, Inosin-5′-O-(3-thiotriphosphat)-disulfid, Cytidin-5′-O-(3-thiotriphosphat)-disulfid, Uridin-5′-O- (3-thiotriphosphat)-disulfid und Thymidin-5′-O-(3-thiotriphosphat)- disulfid.

Wenn in der obigen allgemeinen Formel B eine modifizierte Nucleinbase ist, so leitet sich diese durch Ersatz einer oder mehrerer Substituenten am Kern von den natürlichen Nucleinbasen ab. So können am Purin- oder Pyrimidin-Kern Halogenatome, Alkylgruppen, substituierte Aminogruppen, Sulfhydrylgruppen in den verschiedenen Positionen gebunden sein.

Beispiele für derartige Verbindungen sind 1-Methyl-, 2-Methyl- oder 7-Methyladenin, -guanin, -hypoxanthin, -xanthin, 3-Methyl-, N⁴-Methylcytosin, 5-Brom-, 5-Jod-, 5-Chloruracil, 8-Brom-, 8-Jod-, 8-Fluorguanin, N⁶-Dimethyladenin, 1-Dimethylallyladenin, 2-Aminopurin, 2-Ketopurin, 2-Thio- oder 4-Thiouracil, Orotsäure, 1-Methyl- oder 3-Methyluracil, 5-Hydroxyuracil, 5-Hydromethyluracil, Monoalkylamino- und Dialkylaminopurine u. dergl.

Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden erfindungsgemäß hergestellt, indem ein Nucleosid-5′-mono- oder -diphosphat mit Diphenylphosphorsäurechlorid und einer Verbindung der allgemeinen Formel II

in der R die Gruppe

bedeutet, umgesetzt, die Gruppe R aus dem Reaktionsprodukt abgespalten und gegebenenfalls so erhaltenes Nucleosid-5′-O-thiodi- oder -triphosphat zum Disulfid oxidiert wird.

Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise in einem polaren organischen Lösungsmittel. Die Reihenfolge, in der die drei Reaktionskomponenten miteinander zur Umsetzung gebracht werden, ist nicht kritisch, und durch einfache Vorversuche läßt sich jeweils bestimmen, welche Umsetzungsreihenfolge zur Herstellung eines bestimmten Produktes am vorteilhaftesten ist. So wird gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zuerst das P¹-Diphenyl-P²-Nucleosid-5′-pyrophosphat hergestellt und dann im polaren organischen Lösungsmittel mit S-2-Carbamoyläthylthiophosphat umgesetzt und das Reaktionsprodukt alkalisch verseift und gegebenenfalls zum Disulfid oxidiert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das wie oben angegeben erhaltene P¹-Diphenyl- P²-Nucleosid-5′-pyrophosphat mit einem Dithiophosphorsäuresalz im polaren Lösungsmittel umgesetzt und das Reaktionsprodukt mit einer Mercaptoverbindung reduziert und gegebenenfalls zum Disulfid oxidiert.

Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird S-2-Carbamoylthiophosphat mit Diphenylphosphorsäurechlorid umgesetzt und das Reaktionsprodukt mit dem Nucleosid-5′-diphosphat zur Reaktion gebracht, das erhaltene Produkt alkalisch verseift und gegebenenfalls zum Disulfid oxidiert.

Als polares organisches Lösungsmittel hat sich Pyridin besonders bewährt. Aber auch andere polare organische Lösungsmittel sind geeignet.

Die Umsetzungen können bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 100°C durchgeführt werden, vorzugsweise wird bei Raumtemperatur gearbeitet.

Die Abspaltung der Gruppe R aus dem Reaktionsprodukt erfolgt im Falle der Carbamoyläthylgruppe vorzugsweise durch Erhitzen mit verdünnter Alkalilauge, im Falle der Thiophosphorsäuregruppe vorzugsweise durch Reduktion mit einer Mercaptoverbindung. Als Mercaptoverbindung hat sich β-Mercaptoäthanol besonders bewährt.

Die Phosphorsäuregruppen enthaltenden Ausgangsverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren können in freier Form eingesetzt werden, wobei dann ein zur Salzbildung geeignetes polares organisches Lösungsmittel bevorzugt wird, oder können in Form ihrer in organischen Lösungsmitteln löslichen Salze, insbesondere der Salze mit tertiären Aminen, verwendet werden.

Die Oxidation der erhaltenen Nucleosid-thiodi- oder -triphosphate zum entsprechenden Disulfid kann nach den üblichen Methoden zur Überführung von Sulfhydrylgruppen in Disulfide erfolgen. Bevorzugt wird die Oxidation mit Kaliumferricyanid oder verdünntem Wasserstoffperoxid.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind aufgrund ihrer Eigenschaften von großem wissenschaftlichem und therapeutischem Interesse. Die chemische Reaktivität des Schwefels in den erfindungsgemäßen Verbindungen mit terminaler Thiophosphatgruppe ist unterschiedlich zu der von Analogen mit α-Thiophosphatgruppen; durch Oxidation erfolgt eine S-S-Verknüpfung unter Bildung der Dimeren, die die Grundlage für eine Affinitätsmarkierung ("affinity labelling") von Proteinen bildet. Im Gegensatz zu den bekannten α-S-Nucleotidanalogen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen gegen Phosphatasen und ATPasen (bzw. GTPasen) stabil, und die Polymerisation erfindungsgemäßer γ-Thiotriphosphate führt zu RNA mit einer 5′-terminalen γ-Thiophosphatgruppe, aber unveränderter Phosphatinternucleotidbindung. Im Gegensatz zu α-S-Nucleotidanalogen kann die endständige Thiophosphatgruppe der erfindungsgemäßen Verbindungen durch Kinasen z. B. auf Proteine übertragen werden. Aufgrund dieser Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen z. B. als Substrate für RNA, wodurch eine Trennung von neu synthetisierter von endogener RNA durch Affinitätschromatographie möglich ist, und als Substrat für Proteinkinasen; im Vergleich zu GTP zeigt GTPγS eine ca. 40mal stärkere Aktivatorwirkung für hormongesteuerte Adenylatcyclase. Aufgrund ihrer hohen Stabilität gegenüber Phosphatasen können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit den natürlichen Nucleotiden im Stoffwechsel konkurrieren und ganz allgemein überall dort eingesetzt werden, wo Nucleotide und Polynucleotide am Stoffwechsel beteiligt sind.

Beispiel 1

347 mg Adenosin-5′-phosphat (1 mmol) in Form der freien Säure wurde zu 5 ml trockenem Methanol und 0,43 ml Tri-n-octylamin (1 mmol) gegeben und die Mischung bis zur vollständigen Auflösung schwach erwärmt. Dann wurde das Lösungsmittel bei verringertem Druck abgezogen und der Rückstand durch wiederholtes Eindampfen mit 5 ml Aliquots trockenem Dimethylformamid getrocknet. Dann wurden 7 ml trockenes Dioxan zugesetzt, gefolgt von 1 ml trockenem Dimethylformamid, falls keine sofortige Auflösung erfolgte. Anschließend wurden 0,3 ml Diphenylphosphorsäurechlorid und anschließend 0,3 ml Tri-n- butylamin zugesetzt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag, der sich beim Rühren wieder auflöste. Nach 3stündigem Stehen wurde das Lösungsmittel abgedampft und 50 ml trockener Äther zugesetzt. Die Mischung wurde 1/2 Stunde bei 4°C stehengelassen und dann der Äther abdekantiert. Dem Rückstand wurden 5 ml trockenes Dioxan zugesetzt und die erhaltene Suspension zur Trockne eingedampft. Dann wurde eine Lösung von 2 mmol S- 2-Carbamoyläthylthiophosphat in Form des Tri-n-butylammoniumsalzes in 6 ml trockenem Pyridin zugesetzt. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, wobei sich ein Niederschlag bildete. Das Pyridin wurde unter vermindertem Druck abgezogen, 80 ml 0,2 mol/l NaOH wurden zugegeben und die erhaltene trübe Lösung wurde 10 Minuten auf 100° erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit Ionenaustauscher in Pyridiniumform neutralisiert, mit 0,5 ml β-Mercaptoäthanol behandelt, filtriert und über DEAE-Cellulose unter Anwendung eines linearen Gradienten von Triäthylammoniumbicarbonat- Puffer pH 7,5 zwischen 0,05 und 0,3 mol/l chromatographiert. Das Produkt wurde bei etwa 0,22 mol/l eluiert. Die Ausbeute betrug 35%, bezogen auf Adenosin-5′-phosphat. Die Verbindung hat das Adenosinspektrum λ 259 µm (Σ 15.000) Adenosin|P =|:2,07

Beispiel 2

302 mg (1 mmol) Dikaliumdihydrogendithiophosphat wurde durch Ionenaustauscher-Passage über Merck I Ionenaustauscher in Pyridinform in das Pyridiniumsalz umgewandelt. Dem Pyridiniumsalz wurden 2 mmol Tri-n-butylamin zugesetzt und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde in 4 ml trockenem Pyridin aufgenommen und dann anstelle des S-2-Carbamoyläthylthiophosphats in dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren eingesetzt, wobei bei der Herstellung des P¹-Diphenyl-P²- nucleosids von 0,5 mmol Adenosin-5′-phosphat ausgegangen wurde. Nach 16stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, der Rückstand in 20 ml Wasser gelöst, mit 2 ml β-Mercaptoäthanol behandelt und wie in Beispiel 1 beschrieben an DEAE-Cellulose gereinigt. Die Ausbeute betrug 26%, bezogen auf eingesetztes Adenosin-5′-phosphat. Das Produkt war identisch mit dem von Beispiel 1.

Beispiel 3

0,5 mmol S-2-Carbamoyläthylthiophosphat-lithiumsalz wurden wie in Beispiel 2 beschrieben am Ionenaustauscher in das Pyridiniumsalz und anschließend mit 0,22 ml (0,5 mmol) Tri- n-octylamin in das Mono-(tri-n-octylammonium)-salz überführt. Das Produkt wurde in 3,5 ml trockenem Dioxan gelöst und mit 0,15 ml Diphenylphosphorsäurechlorid, gefolgt von 0,23 ml Tri-n-butylamin versetzt. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann unter verringertem Druck eingedampft. Dem Rückstand wurden 10 ml Äther zugesetzt, und nach kurzem Schütteln wurden 20 ml Petroläther (40 bis 60°) zugesetzt und die Mischung 1/2 Stunde bei 4°C stehengelassen. Der Überstand wurde dekantiert, der Rückstand in 3 ml trockenem Dioxan gelöst und die Lösung im Vakuum eingeengt. Dem erhaltenen Sirup wurden 0,25 mmol Adenosin-5′-diphosphat-[mono-(tri-n-octylammonium)-mono- (tri-n-butylammonium)]-salz in 3 ml trockenem Pyridin zugesetzt und die Lösung 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgezogen, dann wurden 20 ml 2 mol/l NaOH zugesetzt und die Mischung 10 Minuten auf 100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung neutralisiert unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, mit 0,5 ml β-Mercaptoäthanol versetzt und durch Chromatographie an DEAE-Cellulose gereinigt unter Verwendung eines linearen Triäthylammoniumbicarbonat-Puffers pH 7,5, 0,15 bis 0,4 mol/l. Das gewünschte Adenosin-5′-O-(3-thiotriphosphat) wurde bei etwa 0,28 mol/l eluiert. Durch Wiederholung der Chromatographie an DEAE-Sephadex bei Pufferkonzentrationen zwischen 0,35 und 0,6 mol/l wurde das Produkt, welches bei etwa 0,5 mol/l von der Säule kam, gereinigt. Die Verbindung hat das Adenosinspektrum λ 259 µm (Σ 15.000), Adenosin|P =|:2,94.

Beispiel 4

1 mmol des nach Beispiel 1 erhaltenen Adenosin-5′-O-(2-thiodiphosphat), gelöst in Wasser, wurden mit einer wäßrigen Kaliumferricyanid-Lösung versetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die erhaltene Lösung wurde auf Chromatographiepapier überführt und bei pH 7,5 und 2200 V elektrophoretisch getrennt. Das Adenosin-5′-O-(2-thiodiphosphat)- disulfid wurde mit einer Lösung gleicher Teile Methanol und Wasser eluiert. Ausbeute: 60%. Die Verbindung hat das Adenosinspektrum λ 259 µm (Σ 30.000)

Beispiel 5

6 µmol Adenosin-5′-O-(2-thiodiphosphat) in 0,8 ml Wasser wurden mit 0,1 ml 3%iger Wasserstoffperoxidlösung behandelt und dann sofort zur Trockne eingedampft. Dem Rückstand wurde 1 ml Wasser zugesetzt und abgedampft. Dies wurde zur Entfernung von restlichem Wasserstoffperoxid dreimal wiederholt. Es erfolgte eine quantitative Umwandlung in Disulfid.

Beispiel 6

Adenosin-5′-O-(3-thiotriphosphat) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben zum Adenosin-5′-O-(3-thiotriphosphat)-disulfid oxidiert. Die Ausbeute betrug 50%. Die Substanz hat das Adenosinspektrum λ 259 µm (Σ 30.000).

Beispiel 7

Adenosin-5′-O-(3-thiotriphosphat) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben zum Adenosin-5′-O-(3-thiotriphosphat)-disulfid oxidiert. Die Ausbeute betrug 90%.

Die Verfahren der Beispiele 1 bis 7 wurden wiederholt, wobei jedoch anstelle der Adenosin-Verbindung jeweils die entsprechende Guanosin-, Inosin-, Cytidin-, Uridin-, Thymidin-, 5-Methylcytosin- oder 5-Hydroxy-methylcytosin-Verbindung eingesetzt wurde. Desgleichen wurden entsprechende Desoxyverbindungen verwendet. In allen Fällen verliefen die Umsetzungen in gleicher Weise mit vergleichbaren Ausbeuten.

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel I in der
Beine natürliche oder modifizierte Nucleinbase Xeine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom und m und njeweils unabhängig voneinander die Zahl 1 oder 2 bedeuten, sowie die Salze dieser Verbindungen.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nucleosid-5′- mono- oder -diphosphat mit Diphenylphosphorsäurechlorid und einer Verbindung der allgemeinen Formel II in der R die Gruppe bedeutet, umgesetzt, die Gruppe R aus dem Reaktionsprodukt abgespalten und gegebenenfalls so erhaltenes Nucleosid-5′-O-(thiodi- oder triphosphat) zum Disulfid oxidiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Verbindungen von Formel I, in denen n die Zahl 1 bedeutet, das Nucleosid-5′-monophosphat zuerst mit dem Diphenylphosphorsäurechlorid umgesetzt und so erhaltenes P¹-Diphenyl-P²-nucleosid-5′-pyrophosphat mit der Verbindung der Formel II umgesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen n die Zahl 2 bedeutet, die Verbindung der Formel II zuerst mit dem Diphenylphosphorsäurechlorid umgesetzt und das erhaltene Produkt mit dem Nucleosid-5′-diphosphat zur Reaktion gebracht wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in einem polaren organischen Lösungsmittel gearbeitet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Abspaltung der Gruppe R = Carbamoyläthyl mit verdünnter Alkalilauge erhitzt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Abspaltung der Gruppe R = Thiophosphat eine Mercaptoverbindung zugesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Mercaptoverbindung ß-Mercaptoäthanol verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation zum Disulfid durch Zugabe von Kaliumferricyanid oder H₂O₂ erfolgt.

11. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Affinitätsmarkierung von Proteinen.