DE2122529A1 - Thiophosphatanaloge der Nucleosid di und tnphosphate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Thiophosphatanaloge der Nucleosid di und tnphosphate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung

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DE2122529A1 DE19712122529 DE2122529A DE2122529A1 DE 2122529 A1 DE2122529 A1 DE 2122529A1 DE 19712122529 DE19712122529 DE 19712122529 DE 2122529 A DE2122529 A DE 2122529A DE 2122529 A1 DE2122529 A1 DE 2122529A1
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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. RWeickmann,
Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing.-R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
I MÜNCHEN 27, DEN
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 483921/22
Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. -Göttingen, Bunsenstraße 10 . - - ....... ........
Thiophosphatanaloge der Nucleosid~di- und -triphosphate
sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft neue Ihiophosphatanaloge der Nucleosiddi- und -triphosphate, in denen ein Sauerstoffatom am endständigen Phosphoratom der Phosphorsäureanhydrid-Kette durch ein Schwefelatom ersetzt ist, sowie die Herstellung dieser Verbindungen.
Es wurden bereits Nucleotidanaloge beschrieben, die durch Ersatz eines Sauerstoffs an der Phosphatgruppe durch Schwefel modifiziert wurden. Auch sind bereits Nucleotidanhydride bekannt, die ein Schwefelatom am OC-Phosphoratom tragen. Die bekannten Verbindungen zeigen war interessante Eigenschaften, wenn sie in enzymatischen Umsetzungen in Konkurrenz zu den natürlichen entsprechenden Nucleotiden eingesetzt werden. Ein schwerwiegender Nachteil dieser Verbindungen liegt jedoch darin, daß sie infolge der Asymmetrie des CK-Phosphoratoms im Nucleotid indiastereoisomeren Formen vorliegen, die äußerst schwierig zu trennen sind und die ganz unterschiedlich gegenüber speziellen Enzymen wirken können. Diese
209851/1217
Schwierigkeiten sollten nicht auftreten bei den Di- und Triphosphaten, welche am endständigen Phosphoratom Schwefel enthalten, da diese Verbindungen an dieser Stelle keine Asymmetrie aufweisen. Es besteht daher ein Interesse an der Schaffung solcher Verbindungen.
Gegenstand der Erfindung sind daher neue Verbindungen der allgemeinen Formel - ■ -
S -PO.
PO3)n - O - CH2 B .0
OH X
(D
-ι 3-
in der B eine natürliche oder modifizierte Nucleinbäse X ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe und m und η jeweils die Zahl 1 oder 2 bedeuten,
sowie die Salze dieser Verbindungen.
In der obigen allgemeinen Formel kann B, wenn es eine na türliehe Nucleinbäse ist, Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Cytosin, Uracil, !Phymin, 5-Methylcytosin oder 5-Hydroxymethylcytosin bedeuten. Wenn X eine Hydroxylgruppe darstellt, handelt es sich um die Derivate der normalen Nucleotide, falls X ein Wasserstoff atom bedeutet, um die entsprechenden Desoxyribonucleotide.
209851 /1217
Beispiele für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind
Adenosin-5'-O-(2-thiodiphosphat), Guanosin-5'-0-(2-thiodiphosphat), Inosin-5'-0-(2-thiodiphosphat), Cytidin-5'-0-(2-thiodiphosphat), Uridin-5'-0-(2-thiodiphosphat), Thymidin-5 i_0-(2-thiodiphosphat), 5-Methylcytidin-5.'-0-(2-thiodiphosphat), 5-Hydroxymethylcytidin-5'-0-(2-thiodiphosphat), Adenosin-5'-0-(2-thiodiphosphat)-disulfid, Guanosin-5'-0-(2-thiodiphosphat)-disulfid, Inosin-5f-0-(2-thiodiphosphat)-disulfid, Cytidin-5'-0-(2-thiodiphosphat)-disulfid, Urid'in-5«-0-(2-thiodiphosphat)-disulfid, Thymidin-5'-0-(2-thiodiphosphat) -disulf id, Adenin-5'-0-(3-thiotriphosphat), Guanosin-5'-0-(3-thiotriphosphat), Inosin-5'-0-(3-thiotriphosphat), Cytidin-5'-0-(3-thiotriphosphat), Uridin-5'-0-(3-thiotriphosphat), Thymidin-5'-O-(3-thiotriphosphat), Adenin-5'-0-(3-thiotriphosphat)-disulfid, Guanosin-5'-0-(3-thiotriphosphat)-disulfid, Inosin-5'-0-(3-thiotriphosphat)-disulfid,
Cytidin-5'-0-(3-thiotriphosphat)-disulfid, Uridin-5'-0-.
(3-thiotriphosphat)-disulfid und Thymidin-5'-0-(3-thiotriphosphat) -disulfid, ■ .
Wenn in der obigen allgemeinen Formel B eine modifizierte
Nucleinbase ist, so leitet sich diese durch Ersatz; einer oder mehrerer Substituenten am Kern von den natürlichen Nucleinbasen ab. So können am Purin- oder Pyrimidin-Kern Halogenatome, Alkylgruppen, substituierte Aminogruppen, Sulfhydrylgruppen in den verschiedenen Positionen gebunden sein.
Beispiele für derartige Verbindungen sind 1-Methyl-, 2-Methyl- oder 7-Methyladenin, -guanin, -hypoxanthin, -xanthin, 3-Methy1-, N-Methylcytosin, 5-Brom-, 5-Jod-, 5-Chloruracil, 8-Brom-, 8-Jod-, e-Pluorguanin, N -Dirnethyladenin, 1-Dimethylallyladenin, 2-Aminopurin, 2-Ketopurin, 2-Thio- oder 4-Thiouracil, Orotsäure, 1-Methyl- oder 3-Methyluracil, 5-Hydroxyuracil, 5-Hydromethyluracil, Monoalkylamino- und Dialkylaminopurine u. dergl.
2 0 9 8 FH / 1 2 1 7
Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden erfindungsgemäß hergestellt, indem ein Nucleosid-5'-mono- oder -diphosphat mit Diphenylphosphorsäurechlorid und einer Verbindung der allgemeinen Formel II
R - S - P - Cn) XlI)
OH
in der R die Gruppe H2N-C-CH2-CH2- oder HPOy-S- bedeutet, umgesetzt, die Gruppe R aus dem Reaktionsprodukt abgespalten und gegebenenfalls so erhaltenes Nudeosid-5'-O-thiodi- oder -triphosphat zum Disulfid oxydiert wird.
Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise in einem polaren organischen Lösungsmittel. Die Reihenfolge, in der die drei Reak-
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tionskomponenten miteinander zur Umsetzung gebracht werden, ist nicht kritisch,und durch einfache Vorversuche läßt sich jeweils bestimmen, welche Umsetzungsreihenfolge zur Herstellung eines bestimmten Produktes am vorteilhaftesten ist. So wird gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver-
1 2
fahrens zuerst das P -Diphenyl-P -Nucleosid-5f-pyrophosphat hergestellt und dann im polaren organischen lösungsmittel mit S-2-Carbamoyläthylthiophosphat umgesetzt und das Reaktionsprodukt alkalisch verseift und gegebenenfalls zum Disulfid oxydiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das wie oben angegeben erhaltene P -Diphe-
2
nyl-P -Nucleosid-S'-pyrophosphat mit einem Dithiophosphorsäuresalz im polaren Lösungsmittel umgesetzt und das Reaktionsprodukt mit einer Mercaptoverbindung reduziert und gegebenenfalls zum Disulfid oxydiert.
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird S-2-Carbamoylthiophosphat mit Diphenylphosphorsäurechlorid umgesetzt und das Reaktionsprodukt mit dem Nucleosid-5'-diphosphat zur Reaktion gebracht, das erhaltene Produkt alkalisch verseift und gegebenenfalls zum Disulfid oxydiert.
Als polares organisches Lösungsmittel hat sich Pyridin besonders bewährt. Aber auch andere polare organische Lösungsmittel sind geeignet.
Die Umsetzungen können bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 1000C durchgeführt ι
peratur gearbeitet.
1000C durchgeführt werden, vorzugsweise wird bei Räumtem-
Die Abspaltung der Gruppe R aus dem Reaktionsprodukt erfolgt im Falle der Carbamoyläthylgruppe vorzugsweise durch Er-*
209851/1217
hitzen mit verdünnter Alkalilauge, im Falle der TMophosphoreäuregruppe vorzugsweise durch Reduktion mit einer Mercaptoverbindung. Als Mercaptoverbindung hat sich ß-Mercaptoäthanol besonders bewährt.
Die Phosphorsäuregruppen enthaltenden Ausgangsverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren'können in freier Form eingesetzt werden, wobei dann ein zur Salzbildung geeignetes polares organisches Lösungsmittel bevorzugt wird) oder können in Form ihrer in organischen Lösungsmitteln löslichen Salze, insbesondere der Salze mit tertiären Aminenj verwendet werden.
Die Oxydation der erhaltenen Nucleosid-thiodi- oder -triphosphate zum entsprechenden Disulfid kann nach den üblichen Methoden zur Überführung von Sulfhydrylgruppen in Disulfide erfolgen. Bevorzugt wird die Oxydation mit Kaliumferricyanid oder verdünntem Wasserstoffperoxyd.
Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen sind auf Grund ihrer mit den Nucleotiden nahe verwandten Struktur von großem wissenschaftlichem und therapeutischem Interesse. Sie können zur Affinitätsmarkierung ("affinity labelling") von Proteinen, die im aktiven Zentrum SH- oder SS-Gruppen aufweisen, sowie zur Affinitätschromatographie von Nucleotid-abhängigen Enzymen verwendet werden.. Auf dem Gebiet der Pharmakologie zeichnen sie sich durch ihre Stabilität gegenüber Phosphata-8en und damit ihre erhöhte Beständigkeit aus. Sie können da her mit den natürlichen Nucleotiden im Stoffwechsel konkurrieren und überall dort eingesetzt werden, wo Nucleotidt und Polynucleotide am Stoffwechsel beteiligt sind.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
209851 /1217
-Jr-
Beispiel
347 mg Adencsin-51-phosphat (1 mMol) in Form der freien Säure wurde zu 5 ml trockenem Methanol und 0,43 ml Tri-n-octylamin (1 mMol) gegeben und die Mischung bis zur vollständigen Auflösung schwach erwärmt. Dann wurde das Lösungsmittel bei verringertem Druck abgezogen und der Rückstand durch wiederholtes Eindampfen mit 5/Aliquots trockenem Dimethylformamid getrocknet. Dann wurden 7 nil trockenes Dioxan zugesetzt, gefolgt con 1 ml trockenem Dimethylformamid, falls keine sofortige Auflösung erfolgte. Anschließend wurden 0,3 ml Diphenylphosphorsäurechlorid und anschließend 0,3 ml Tri-nbutylamin zugesetzt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag, der sich beim Rühren wieder auflöste. Nach 3stündigem Stehen wurde das Lösungsmittel abgedampft und 50 ml trockener Äther zugesetzt. Die Mischung wurde 1/2 Stunde bei 4°C stehengelassen und dann der Äther abdekantiert. Dem Rückstand wurden 5 ml trockenes Dioxan zugesetzt und die erhaltene Suspension zur Trockne eingedampft. Dann wurde eine Lösung von 2 mMol S-2- Carbamoyläthylthiophosphat in Form des Tri-n-butylammoniurasalzes in 6 ml trockenem Pyridin zugesetzt. Die Mischung wurde 3 Stunden bei' Zimmertemperatur stehengelassen, wobei sich ein Niederschlag bildete. Das Pyridin wurde unter vermindertem Druck abgezogen, 80 ml 0,2N NaOH wurden zugegeben und die erhaltene trübe Lösung wurde 10 Minuten auf 100° erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit Ionenaustauscher Merck I in Pyridiniumform neutralisiert, mit 0,5 ml ß-Mercaptoäthanol behandelt, filtriert und über DEAE-Cellulose unter Anwendung eines linearen Gradienten von Triäthylammoniumbicarbonat-Puffer pH 7>5 zwischen 0,05 und 0,3M chromatographiert. Das Produkt wurde bei etwa 0,22M eluiert. Die Ausbeute betrug 35$i bezogen auf Adenosin-5'-phosphat.
. TT rs
Die Verbindung hat das Adenosinspektrum \ 2U259 πιμ (Σ15.000)
max AdenoRin IV « | : 2,07
2098ΠΊ/12 17
Beispiel 2
302 mg (1 mMol) Dikaliumdihydrogendithiophosphat wurde durch Ionenaustauscher-Passage über Merck I Ionenaustauscher in Pyridinform in das. Pyridiniumsalz umgewandelt. Dem Pyridiniumsalz wurden 2 mMol Tri-n-butylamin zugesetzt und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde in 4 ml trockenem Pyridin aufgenommen und dann anstelle des S-2-Carbamoyläthylthiophosphats in dem in Beispiel 1 beschriebenen.Verfahren
1 2
eingesetzt, wobei bei der Herstellung des P -Diphenyl-P nucleosids von 0,5 mMol Adenosin-5'-phosphat ausgegangen wurde. Nach 16stündigem Stehen bei Zimmertemperatur "wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, der Rückstand in 20 ml Wasser gelöst, mit 2 ml ß-Mercaptoäthanol behandelt und wie in Beispiel 1 beschrieben an DEAE-Cellulose gereinigt. Die Ausbeute betrug 26$, bezogen auf eingesetztes Adenosin-5'-phosphat. Das Produkt war identisch mit dem von Beispiel 1.
Beispiel 3
0,5 mMol S-2-Carbamoyläthylthiophosphat-lithiumsalz wurden wie in Beispiel 2 beschrieben am Ionenaustauscher in das Pyridiniumsalz und anschließend mit 0,22 ml (0,5 mMol) Trin-octylamin in das Mono-(tri-n-octylammonium)-salz überführt. Das Produkt wurde in 3»5 ml trockenem Dioxan gelöst und mit 0,15 ml Diphenylphosphorsäurechlorid, ,gefolgt von 0,23 ml Tri-n-butylamin versetzt. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann unter verringertem Druck eingedampft. Dem Rückstand wurden 10 ml Äther zugesetzt und nach kurzem Schütteln wurden 20 ml Petroläther (40 bis 60°) zugesetzt und die Mischung 1/2 Stunde bei 40C stehengelassen. Der Überstand wurde dekantiert, der Rückstand in 3 ml trockenem Dioxan gelöst und die Lösung im Vakuum eingeengt. Dem erhaltenen Sirup wurden 0,25 mMol Adenosin-5'-diphosphat-/~mono-(tri-n-octylammo'nium)-mono-(tri-n-butylammonium)_7-salz in 3 ml trockenem Pyridin zu-
209851/121 7
gesetzt und die Lösung 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgezogen, dann wurden 20 ml 2N NaOH zugesetzt und die Mischung 10 Minuten auf 1000C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung neutralisiert unter Verwendung eines Ionenaustausche rharzes, mit 0,5 ml ß-Mercaptoäthanol versetzt und durch Chromatographie an DEAE-Cellulose gereinigt unter Verwendung eines linearen Triäthylammoniumbicarbonat-Puffers pH 7,5, 0,15 bis 0,4M. Das gewünschte Adenosin-5'-0-(3-thiotriphosphat) wurde bei etwa 0,28M eluiert. Durch Wiederholung der Chromatographie an DEAE-Sephadex bei Pufferkonzentrationen zwischen 0,35 und 0,6M wurde das Produkt, welches bei etwa 0,5M von der Säule kam, gereinigt. Die Verbindung hat das AdenosinspektrumX^g^ 259 ΐημ (Σ15.000), Adenosin /p = / : 2,94.
Beispiel 4
1 mMol des nach Beispiel 1 erhaltenen Adenosin-5'-0-(2-thiodiphosphat), gelöst in Wasser, wurden mit einer wäßrigen Kaliumferricyanid-Lösung versetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die erhaltene Lösung wurde auf Chromatographiepapier überführt und bei pH 7,5 und 2200 V elektrophoretisch getrennt. Das Adenosin-5f-0-(2-thiodiphosphat)-disulfat wurde mit einer Lösung gleicher Teile Methanol und Wasser eluiert. Ausbeute: 60$.
ATT Λ 2 259 πιμ (Σ30.000)
max Beispiel 5
6/uMol Adenosin-5'-0-(2-thiodiphosphat) in 0,8 ml Wasser wurden mit 0,1 ml 3$iger Wasserstoffperoxydlösung behandelt und dann sofort zur Trockne eingedampft. Dem Rückstand wurde 1 ml Wasser zugesetzt und abgedampft. Dies wurde zur Entfernung von restlichem Wasserstoffperoxyd dreimal wiederholt. Es erfolgte eine quantitative Umwandlung ins Disulfid.
2 0 9 8 5 1/12 17
Beispiel 6
Ädenosin-5f-0-(3-thiotriphosphat) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben zum Adenosin-5'-O-(3-thiotriphosphat)-disulfit oxydiert. Die Ausbeute betrug 50$.
Die Substanz hat das AdenosinspektrumA^g 259 πιμ (£30.000)
Beispiel 7
Adenosin-5'-0-(3-thiotriphosphat) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben zum Adenosin-5'-0-(3-thiotriphosphat)-disulfid oxydiert. Die Ausbeute betrug 90$.
Die Verfahren der Beispiele 1 bis 7 wurden wiederholt, wobei jedoch anstelle der Adenosin-Verbindung jeweils die entsprechende Guanosin-, Inosin-, Cytidin-, Uridin-, Thyinidin-, 5-Methylcytosin- oder S-Hydroxy-methylcytosin-Verbindung eingesetzt wurde. Desgleichen wurden entsprechende Desoxyverbindungen verwendet. In allen Fällen verliefen die Umsetzungen in gleicher Weise mit vergleichbaren Ausbeuten.
20985 1/12 17

Claims (11)

  1. Pate nt anspriiche
    Verbindungen der allgemeinen Formel I
    s -
    ι 3-
    3>n - O - CH0 B
    2 O
    OH X
    in der B eine natürliche oder modifizierte Nucleinbase
    X eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom und m und η jeweils unabhängig voneinander die Zahl 1 oder 2 bedeuten,
    sowie die Salze dieser Verbindungen.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nucleosid-5·- mono- oder -diphosphat mit Diphenylphosphorsäurechlorid und einer Verbindung der allgemeinen Formel II
    R-S
    ti
    P OH
    (II)
    20 98 5Ί7Τ2 17
    ο Λ
    in der R die Gruppe H2N-C-CH2-CH2- oder HPOy-S- bedeutet, umgesetzt, die Gruppe R aus dem Reaktionsprodukt abgespalten und gegebenenfalls so erhaltenes Nucleosid-5'-0-(thiodi- oder triphosphat)■zum Disulfid oxydiert wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Verbindungen von Formel I, in denen η die Zahl 1 bedeutet, das Nucleosid-5'-monophosphat zuerst mit dem Diphenylphosphorsaurechlorid umgesetzt und so erhal-
    1 2
    tenes P -Diphenyl-P -nucleosid-5'-pyn bindung der Formel II umgesetzt wird.
    1 2
    tenes P -Diphenyl-P -nucleosid-5'-pyrophosphat mit der Ver-
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen η die Zahl 2 bedeutet, die Verbindung der Formel II zuerst mit dem Diphenylphosphorsaurechlorid umgesetzt und das erhaltene Produkt mit dem Nucleosid-5'-diphosphat zur Reaktion gebracht wird.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 biß 4, dadurch gekennzeichnet, daß in einem polaren organischen Lösungsmittel gearbeitet wird.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Abspaltung der Gruppe R = Carbamoyläthyl mit verdünnter Alkalilauge erhitzt wird.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Abspaltung der Gruppe R = Thiophosphat eine Mercaptoverbindung zugesetzt wird.
    2 0 9.851 /121 7.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Mercaptoverbindung ß-Mercaptoäthanol verwendet wird.
  10. 10. " Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9» da- · durch gekennzeichnet, daß die Oxydation zum Disulfid durch Zugabe von Kaliumferricyanid öder H2Op erfolgt.
  11. 11. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Affinitätsverbindung von Proteinen.
    209&517T2t7
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