DE2351321A1 - Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden - Google Patents

Description

Vorfahren zur Herstellung von Oliflonucleotiden

Die Bedeutung der Desoxyribonucleinsäure (DNS) im biologischen

Geschehen ist eminent. In ihr ruht nicht nur die genetische Information, vielmehr spielt sie eine entscheidende Rolle bei den in der Zelle ablaufenden. Regulationsvorgängen. Rationelle Synthesewege für diese Substanzklasse zu entwickeln, ist daher von außerordentlicher Bedeutung. Gegenstand dieser Anmeldung ist ein vereinfachtes Verfahren, um zu den für die Synthese von Oligonucleotiden notwendigen Bausteine - den 3'-0-geschützten Desoxyribonucleosid-5¹-phosphaten, Didesoxyribonucleosiddiphosphaten und Tridesoxyribonucleosidtriphosphaten - zu gelangen. Diese Bausteine werden nach bekannten Methoden (Agarwal et al. Angew. Chem. 84, 489 (1972))miteinande?^u01igonucleotiden von einer Kettenlänge von meist η ^ 8 verknüpft und diese wiederum nach ebenfalls bekannten Methoden ( Sgaramella et al. J. Mol.Biol. 7£, 427 (1972)) enzymatisch zu biheliealen Polynucleotiden mit biologisch sinnvoller Information verbunden.

Da ein entscheidender Schritt der enzymatischen Verlängerung eine Phosphorylierung der 5'-0H-Gruppe mit Pol'ynuoleotidkinase und ATP darstellt, beginnt die Synthese der kurzen Oligonucleotide mit einer Kettenlänge von meist η ^ 8 vorteilhaft mit einem an der 5-OH-Gruppe geschützten Nucleosid. Die Verlängerung erfolgt durch 3'-O- acetylierte Desoxyribonucleosid-5 '-phosphate oder in einem späteren Stadium mit Blöcken vorzugsweise Didesdxyribonucleosiddiphosphate und Tridesoxyribonucleosidtriphosphate. Um eine eindeutige 3^l-5'-Internucleotidbindung wie sie in natürlicher DNS vorliegt herbeizuführen, sind die Aminogruppen der heterocyclischen Basen ebenfalls zu schützen. Pur die Synthese eines bihelicalen Polydesoxynucleotids mit definierter Sequenz und biologisch sinnvoller Information ist daher eine große Zahl verschiedener Zwischenprodukte darzustellen ( Verbindungen vom Typ 4, 7, H und 15). Im Falle der Verwendung nur der vier in natürlicher DNS vorkommenden Nucleoside"handelt es sich dabei allein um verschiedene mögliche Verbindungen. Es wäre daher von großem

Vorteil, wenn wenige Schlüsselsubstanzen, die leicht und mit geringem Kostenaufwand darstellbar sind, in verschiedener Richtung verwendet werden könnten, um damit den synthetischen Aufwand zu verringern.-Die hier beschriebene Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen 7, IJ. und 1.5 ausgehend von den billigeren Desoxyribonucleosiden J., auf einfachem Weg mit guten Ausbeuten und rein dargestellt werden können und außerdem deren Ausgangsverbindungen 4, § und VZ im Verlauf der Kettensynthese anfallen. Die Reinheit der Verbindungen ist außerordentlich wichtig als Voraussetzung für eindeutige Kettenverlängerungsreaktionen, da sonst Fehlsequenzen auftreten.

Darstellung von Verbindungen vom Typ 7 :

Verbindungenvom Typ 7 werden bisher ausgehend von den käuflichen und recht teuren Desoxyribonucleosid-5¹-phosphaten durch Peracylierung, De-O-acylierung und Acetylierung dargestellt. Es ist dabei besonders zeitraubend, daß die käuflichen Desoxy-.ribonucleosid-5¹ -phosphate aus Gründen der -besseren -löslichkeit meist erst in die Pyridiniumsalze überführt werden müssen, wodurch große Flüssigkeitsmengen anfallen, die eingedampft und zur Acylierung getrocknet werden müssen. Dieser Vorgang wiederholt sich nach der selektiven De-O-acylierung, um die Natriumsalze zu entfernen. Das Eindampfen hat besonders bei den sehr labilen N-acylierten Purinnucleotiden nunmehr unter 20° zu erfolgen. Die Darstellung größerer Mengen wie sie wegen der noch unvollkommenen Kondensationstechnik notwendig sind, ist daher außerordentlich zeitraubend. Hinzu kommt, daß eine Reihe von Verunreinigungen (Nebenprodukte der Acylierung) im Produkt verbleiben. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren v/erden diese geschützten Desoxyribonucleosid-5'-phosphate durch direkte Phosphorylierung der kristallinen und damit in größeren Mengen und rein darstellbaren Verbindungen 6 erhalten. Die Verbindungen 6 sind aus 4 leicht durch zwei annähernd quantitativ verlaufende im gleichen Reaktionsgefäß durchzuführende Reaktionen (Acetylierur.^, Detritylierung) zu erhalten. Besonders rationell ist dabei die Tatsache, daß die Verbindungen 4_ gleichermaßen als Kettenanfänge und zur Darstellung der Verbindungen 7 dienen»

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Die Darstellung von Ribonucleosid-5¹-phosphaten mit Hilfe von Phosphorsäurechlorid wurde intensiv untersucht. Es wurden 2J.,3·-O-geschützte Ribonucleoside (Yoshikawa et al.Bull. Chem.Soc.Jap.,42, 3505(1969), Patentschriften Nr. 1301318,1119278 Auslegeschriften Nr.1445421, 1445471, Offenlegungsschriften Nr. "1695494, 1795622, 1595869,. 1445442, 1445970) aber auch ungeschützte Ribonucleoside direkt mit Phosphorsäurechlorid oder Phosphortrichlorid. selektiv an der 5'-OH-Grupp.e phosphoryliert (Yoshikawa et al. Bull.Chem.Soc.Jap., 42, 3505(1969), Patentschriften Nr. 1620547, .1620548, Offenlegungsschriften Nr. 1645984, 1645986, 1645979, 1620562, 1620558, 1620553, 1620494, 1545547, 1620568,- 1645896 und 1670016). Die Ausbeuten an Ribonucleosid-5'-phosphaten liegt meist über 80 ^pß>. Als Nebenprodukte treten in geringem Umfang 5'- und 3'-Diphosphate, 5'-und 2'-Diphosphate und 5^f-,3'- und2^l-Triphosphate auf. . -

Die Übertragung dieser Reaktionsbedlngungen auf ungeschützte Desoxynucleoside führt zu einem Gemisch aus Desoxynucleosid-5'phosphat, Desoxynucleosid-3¹-phosphat und in geringer Menge .ein doppelt phosphoryliertes Produkt. Dabei erweist es sich als außerordentlich schwierig diese beiden Verbindungen in größerer Menge voneinander zu trennen.

Die selektive Phosphorylierung von -^esoxynucleosiden gelingt dagegen nur mit geschützten Phosphorsäurehalogeniden wie z.B. mit Phosphorsäure-bis-(trichloräthylester)chlorid (Pranke et al. Chem.Ber.101, 2998(1968)). Hierbei führt jedoch die Abspaltung der Phosphatschutzgruppe zu ausbeutevermindernden Nebenprodukten und ist überdies zeitaufwendig.

Im Hinblick auf die Synthese von Oligonucleotiden bietet es auch keinen Vorteil ungeschützte Nucleoside zu phosphorylieren, da für die Kettenverlängerung ohnehin geschützte Derivate eingesetzt werden müssen. Es ist daher sehr viel vorteilhafter, wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die für die Öligonucleotidsynthese bereits richtig geschützten Derivate einfach durch Phosphorylierung mit ungeschützten Phosphoraäürehalogeniden dargestellt werden können.

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Als Lösungsmittel für die Phosphorylierung von 6 können dienen: Trialkyl- und Triarylphosphate, aliphatische Nitrile, aliphatische und aromatische Nitroverbindungen, Dialkylather, cyclische Äther, Sulfoxide, Ester organischer Säuren, Formamide und Ketone. Vorzugsweise wird Tetrahydrofuran verwendet, da dann die Bildung von Nebenprodukten am meisten-unterdrückt wird.

Als Phosphorylierungsmittel können Phosphorsäurechlorid, Phosphorsäurebromid, Phosphortrichlorid, Phosphorpentachlorid, Pyrophosphorsäuretetrachlorid verwendet werden. Als besonders vorteilhaft erwies sich jedoch Phosphorsäurechlorid. Das Verhältnis Desoxynucleosid 6 : Phosphorsäurechlorid liegt zwischen 1:1 und 1:10, vorzugsweise "bei 1: 1.5.

Von besonderer Bedeutung im Hinblick auf Unterdrückung von Nebenprodukten ist die Verwendung der Base. Allgemein können tertiäre Amine verwendet werden. Besonders vorteilhaft aber ist die Verwendung von sterisch gehinderten tertiären Aminen wie z.B. 2.6-Lutidin. Da die Substitution des ersten Halogenatons .nach aligemeiner Basenkatalyse, der folgenden . Halogenatome aber nach spezieller Basenkatalyse erfolgt, verläuft die Phosphorylierung der 5'~0H-Gruppe schnell, Folgereaktionen, an denen die noch verbliebenen Halogenatome beteiligt sind, werden jedoch sehr stark verzögert. Das Verhältnis tertiäres Amin : Phosphorylierungsmittel liegt zwischen 1:1 und 1:50, vorzugsweise bei 1:10.

Zur Durchführung des erfindungs gemäß en Verfahrens werden die geschützten Desoxynucleoside 6 durch Abdampfen mit Methanol/ Benzol oder mit dem tertiären Amin von Feuchtigkeitsspuren befreit, sodann im Lösungsmittel gelöst, mit der tertiären Base versetzt und sodann gekühlt. Es werden Temperaturen zwischen -30 und + 20° vorzugsweise 0° gewählt und das Phosphorylierungsmittel hinzugegeben. Die Reaktionszeit liegt zwischen 10 Minuten und 30;Stunden, vorzugsweise bei 30 Minuten. Nach der üblichen Hydrolyse mit dem Puffer einer.tertiären Base bei pH-Werten von 6.5 bis 7.5 und 0°, wird das überschüssige Phosphat in der üblichen Weise mit Bariumacßtat bei pH 7 gefällt und eine Adsorption an einem Ionenaustauscher z.B. DEAE-Gellulose angeschlossen. Zunächst wird das in Spuren noch vorhandene unumgesetzte Desoxynucleosid 6 mit einem Puffer niedriger Kolaritiit.

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0-25 mM in Gegenwart eines Alkohols z.B. 10-80?ό Methanol herausgewaschen, anschließend wird das vollständig geschützte Desoxynucleosid-5¹-phosphat 7 mit einem Puffer von 100-300 mM in Gegen wart von 1 0-80$ Methanol eluiert, die 7_ enthaltenden Fraktionen eingedampft und in der üblichen Weise in Äther gefällt.

Darstellung von Verbindungen vom Typ I_-I und 15:

Für die Darstellung von Öligonucleotid-5¹-phosphaten sind einige Verfahren beschrieben. Sie gehen alle von Nucleosid-5'-phosphaten aus, deren 5'-Phosphatgruppe geschützt ist. Hierfür wurde z.B. die ß-Cyanoäthylgruppe ( Tener, J.Amer_echem.Soc. 8_3, 159(1961)) oder' die β,β,β-Trichloräthylgruppe (Franke et al., Chem.Ber.101,9?^^§ο8^?ΐ Im ersteren Fall entstehen durch die Labilität der ß-Cyanoäthylgruppe im Verlauf der zum Dinucleotid oder Trinucleotid führenden Kondensation Nebenprodukte auf, die eine chromatographische Trennung notwendig machen. Wegen der chromatographischen Ähnlichkeit der entstehenden Produkte ist die Reinisolierung größerer Mengen an \]_ und Vj recht zeitraubend. Im zweiten Fall entstehen bei der Abspaltung der Trichloräthylgruppe Nebenprodukte, die die Ausbeute vermindern und die ebenfalls bei größeren Ansätzen nur schlecht abgetrennt werden können. Diese Überlegungen treffen auch für die Verwendung der S-Äthylgruppe zu (Cook et al. J.Amer.chem.Soc.9;!, 6479(1969))» Kürzlich wurde über ein Extraktionsverfahren berichtet (Agarwal et al. J.Amer.chem.Soc.,93, 2754(1971)), bei dem ebenfalls von den Desoxynucleosid-5¹-phosphaten ausgegangen wird. Die 5'-Phosphatgruppe wird hier über eine Phosphorsäureamidatbindung mit dem lipohilen Amin Triphenylanilin geschützt. Die Synthese von \\ verläuft über mehrere Stufen und führt zu keinem vollständig reinen Produkt.. Dies gibt bei den nachfolgenden Oügonucleotidsynthesen Anlaß . zu Fehlsequenzen, deren chromatographische Abtrennung vom 'ge- " wünschten Produkt auf große Schwierigkeiten stoßen kann.

Die erfindungsgemäße direkte Phosphorylierung der/Verbindungen 2Q und \\ ist indessen noch nicht beschrieben worden und stellt einen sehr einfachen Weg dar, zu diesen sonst nur recht umständlich darstellbaren Verbindungen-zu gelangen. Verbindungen vom Typ

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8 und· 12 können mit hohen Ausbeuten synthetisiert und in Falle von 8 durch Extraktion recht rein, im Falle von 12 durch Extraktion stark vorgereinigt erhnlten werden und direkt nach Abspaltung der Tritylgruppe zu 10 bzw. 14 umgesetzt werden. Von Bedeutung ist auch hier, daß für die Kettensynthese und für die Synthese der Blöcke vom Typ VI und 15 die gleichen Zwischenprodukte verwendet werden können. 10 und H werden dazu der erfindungsgemäßen und oben bereits erwähnten direkten Phosphorylierung unterworfen.

Im Hinblick auf Lösungsmittel, PhosphorylierungsrnitteL und Base gelten die bereits beschriebenen Bedingungen. Dasgleiche gilt für die Verhältnisse von 2Q bzw. H zu Phosphorylierungsmittel und Base, sowie für die Reaktionstemperatur und -zeit.

Im Gegensatz zur Phosphorylierung von 6 jedoch wird die Phosphorylierung von 10 und ^4 vorteilhaft in heterogener Reaktion in Gegenwart einer sterisch gehinderten tertiären Base durchgeführt. Um eine Suspension einerseits, andererseits eine entsprechend gute Reaktionsfähigkeit von 1Q und H zu gewährleisten, ist die Wahl des Suspensionsmittels von großer Bedeutung. Tragen die beiden. Basen von 10 keine Acylgruppen (z.B. B-J=Bp= Thymin) so ist die Verwendung von Tetrahydrofuran vorteilhaft, •trägt eine der beide Basen eine N-Acylgruppe (z.B. B₁=N -Benzoyladenin, Bp^hymin) ist die Verwendung von Diäthylather mit 20-40 % Tetrahydrofuran von Vorteil, tragen beide Basen eine N-Acylgruppe (z.B. B₁=N -Anisoylcytosin, B₂=N -Isobutylguanin) ist die Verwendung von Diäthy lather mit 10-20 "Jo Petroläther erforderlich. Im Falle von 14 gilt entsprechendes.

Für einen guten Reaktionsverlauf ist die Konzentration an _1O und 1_4 wichtig. Sie kann zwischen 10 und 500 raM liegen, sollte vorzugsweise aber nicht geringer als 100 mSi sein, da sonst intramolekulare -fcebenreaktionen ablaufen können.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die nach Fällung in Äther dargestellten Salze von W und 14 mit der teriären Base durch Schütteln mit Glasperlen in eine feine Suspension, gebracht, die teiüäre Base hinzugefügt, abgekühlt und das Phosphorylierungsmittel zugesetzt. Nach beendeter Reaktionszeit wird hydrolysiert iHid an einem Ionenaustauscher z.B. DEAE- Cellulose in Gegenwart von Alkoholen chromatographiert. Das un-

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umgesetzte 1^0 "bzw. 14 wird zunächst "bei niederer Molarität herausgewaschen, anschließend durch einen steilen linearen Ionenstärkegradienten in Gegenwart von Alkoholen j.1. und ^2 eluiert. ■ ~ .■ -

Das erfindungsgemäße Verfahren soll anhand der folgenden Beispiele erläutert werden, jedoch soll in der Auswahl keine Beschränkung gesehen werden, da das erfindungsgemäße Verfahren der Phosphorylierung von Verbindungen vom Typ W und 24 auch mit Analoga in der Base und im Zucker durchgeführt werden kann. Ebenso können Derivate von 7, 1.1. und .1.5 der Thiophosphorsäure auf diese Weise hergestellt werden.

Bei.sp_ie_l_12_

1.42 g (5 mMql) 3'-0-Acetyldesoxythymidin werden zweimal nit je-30 ml wasserfreiem Pyridin abgedampft, dasgleiche noch einmal mit 20 ml 2.6-Lutidin wiederholt, in 40 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 8 ml (68.8 mMol) 2.6-lutidin versetzt. Nach Abkühlen auf 0° werden 0.76 ml (7.5 EiMoI) Thxophosphorsäurechlorid hinzugegeben. Nach magnetischem Rühren über 27 Stunden bei 0° wird die Reaktion durch Zugabe von 60 ml 0.2 M Triäthylammoniumacetatpuffer pH 7 beendet. Nach 15-stündigem Stehen bei 0° wird die Lösung zentrifugiert, zweimal mit je 60 ml Wasser gewaschen und der "Überstand auf 1 1 mit Wasser verdünnt und in der üblichen Weise an DEAE-Cellulose chromatographiert. Durch Y/aschen mit 11 1OmM Triäthylammoniumacetatpuffer wurden 10.760 O.D.gg·? entsprechend 1.11 mMol 3^I-0-Acetyldesoxythymidin zurückgewonnen, sodann wurden durch Anlegen eines linearen Gradienten von je 41 10-mM Triäthylanunoniumaeetat und 300 mM Triäthylammoniumacetat 35.980 O.D.₂g₇ entsprechend 3.73 mMol (74.5 ⁰A) 3'-0-Acetyl-desoxythymidin-5^lthiophosphat eluiert. Das Eluat_owurde eingedampft, in 10 ml Wasser gelöst und in der üblichen V/eise durch Bariumacetat (35 ml, enthaltend 18.9 g) bei pH 7 das überschüssige Thiophosphat bei 0° ausgefällt. Nach dreistündigem stehen bei 0° wird zentrifugiert, der- Niederschlag dreimal mit je 50 ml Wasser gewaschen und in der üblichen v/eise durch aufeinanderfolgendes v/aschen über einen Kationaustauscher in der H- und in der Na-Porn, das Natriumsalz dargestellt. Nach Gefriertrocknung betrug die Ausbeute 1.53 g. Durch Messung eines Aliquots bei λ= 267 entspricht dies 3.65 mMol (73 ⁰A). Das Produkt ist gegenüber Alkalischer Phosphatase aus

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E. coli resistent. Die R^-Werte in den Laufmitteln Äthanol: 1M Amnoniumacetat pH 7.5 = 7:3 und Isopropano1:konz.Ammoniak: V/asser = 7:1:2 stimmen mit Literaturwerten ( Eckstein, J.Amer. chem.Soc.92t, 4718(1970)) überein.

1 mMol 3'-0-Acetyl-de3oxythymidin (285 mg) werden in 8 ml trockenem. Tetrahydrofuran gelöst, mit 1.75 ml Lutidin (15 mMol) versetzt und unter magnetischem Rühren und Eiskühlung 0.138 ml (1.5 mMol) frisch destilliertes Phosphorsäurechlorid hinzugefügt. Nach 15 Minuten wird die Kühlung entfernt und nach insgesamt 30 Minuten die Reaktionsmischung mit 12 ml 0.2 M Triäthylammoniumacetatpuffer pH 7 hydrolysiert. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 1. Ausbeute 8.900 O.D₂g₇ entsprechend 0.92 mMol (92 ^cjo) an 3'-O-Acetyl-desoxythymidin-5¹phosphat.

.1 mMol 3*-0-Acetyl-N -benzoyldesoxyadenosin v/erden in 8 ml Tetrahydrofuran gelöst, mit 1.75 ml 2.6-Lutidin versetzt und unter Eiskühlung und magnetischem Rühren 0.138 ml Phosphorsäurechlorid hinzugefügt. Nach einer Reaktionszeit von 30 I-iinuten bei 0° wird wie in Beispiel 1 und 2 aufgearbeitet. Alisbeute: 17.200 0.D.₂₈₁ entsprechend 0.94 mMol (94 ⁰Jo) an 3'-0-Acetyl-N -benzoyl-desoxyadenosin-5'-phosphat.

0.82 g ( 1.0 mMol) dee 2.6-Lutidiniumsalzes von Desoxythymidylyl (3^f—5*)-3'-0-acetyl-N -anisoyl-desoxycytidin (dT-dan C(Ac))werden

mit Hilfe einer Reihe von Glasperlen (Durchmesser 2-3 mm) durch kräftiges Schütteln in einer Mischung aus 1.6 ml Tetrahydrofuran und 2.4 ml Diäthyläther unter Zugabe von 2.91 ml 2.6-Lutidin (25 mMol) suspendiert. Die Suspension wird auf -10° abgekühlt und 0.23 (2.5 mMol) frisch destilliertes Phosphorsäurechlorid zugesetzt und kräftig 15 Minuten lang geschüttelt. Wach einer Stunde wird 12 ml 0.3 M Triäthylammoniumacetatpuffer pH 7 zugesetzt und 12 Stunden bei 0° hydrolysiert. Es schließt sich ein-e in der üblichen V/eise durchgeführte Chromatographie an DEAE-Cellulose an (Abb.1). Das Hydrolysat wird hierzu auf 1 1/2

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so verdünnt, daß die Lösung 40 $ Methanol enthält und auf die Säule (2.5 cm χ 90 cm) aufgetragen. Tropfgeschwindigkeit 120 ml/ Stunde. Zunächst wird die Säule mit 1 1 25mM Triäthylammoniumacetatpufi'er pH 7/40 "/> Methanol gewaschen, dann ein linearer Gradient von 3 1 25 mM/40 °/₀ gegen 250 nM Triäthylammoniumacetat/ 40 i° Methanol und danach ein line ar e_r Gradient von je 11 250 mM/40 <p gegen 400 mM/40 °ß> 'Methanol angelegt. Es werden Fraktionen zu 23 ml gesammelt. Die Fraktionen 240 -304 enthielten 14.200 O.D._27O entsprechend 0.55 mMol (55'/Ο· Das Absorptionsmaximum der Verbindung liegt bei 270 rra mit einer Schultei bei 300 nm. Das Verhältnis der Absorptionen bei 280 nm zu 260 nm beträgt 1.08. Der relative R^-Wer-t zu Desoxythymidin-5' -phosphat beträgt 1.1. Nach Abspaltung der 0- und N-Acylgruppen läßt sich das Produkt zu dT-dC mit Alkalischer Phosphatase aus E.coli dephosphorylieren.Damit ist die Identität der Verbindung als 5^t-0-Phosphoryl-desoxythymidylyl-(3^l-5^l)-3'-O-acetyl-H -anisoylcytidin (pdT-dan C(Ac)) erwiesen.

Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden eingedampft, durch Abdampfen mit Pyridin getrocknet und in der üblichen "'eise in Äther ausgefällt.

1 mMol Desoxythymidylyl-(3'-5')-3^l-0-acetyldesoxyth3'-midin (dT-dT(Ac)) v/erden in 4 ml Tetrahydrofuran in Gegenwart von 2.91 ml 2.6-Lutidin (25 mMol) mit Hilfe von Glasperlen suspendiert, auf 0° gekühlt und 0.23 ml Phosphorsäurechlorid hinzugefügt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 4. Ausbeute: ' 10.000 0.D.₂₆₇ entsprechend 0.54 mMol (54 ^c/°) an 5'-0-Phosphoryldesoxythymidylyl-(3J—5«)-3«-0-acetyl-desoxythymidin.

0.9 g (1.0 mMol) des Lutidiniumsalzes von N -Benzoyl-desoxyadenylyl-(3'-5^l)-3'-O-acetyl-desoxythynidin (dbz A-dT(Ac)) werden mit Hilfe von Glasperlen in 3.2 ml Diäthylather und 0.8 ml Tetrahydrofuran in Gegenwart von 2.91 nl 2.6-Lutidin suspendiert,gekühlt auf -10° und 0.23 ml Phosphorsäurechlorid hinzugefügt. Nach einer Stunde wird wie in Beispiel 4 aufgearbeitet. Ausbeute: 12.800 O.D.₂₇g entsprechend 0.51 ml-iol (51 ^c/>) an 5'~0-Phosphoryl=N -benzoyl-desoxyadenylyl-(3'-5^t)-3'-0-acetyl-desoxythymidino 509 817/0 9 76

- ίο -

Be:is£ie_l__7.L

1 DiMoI des Lutidiniumsalzes von N -Anisoyl-desoxycytidylyl-(3'—5')-3'-0-isobutyryl-N -isobutyryl-desoxyguanosin (dan C-dibu G werden mit Hilfe von Glasperlen in 0.8 ml Petroläther ($0-70°), 3.2 ml Diäthyläther und 2.91 ml 2.6-Lutidin suspendiert und auf - 10° gekühlt. Die gekühlte Suspension wird mit 0.23 ml Phosphorsäurechlorid versetzt und eine Stunde kräftig bei - 10° geschüttelt. Die Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 4 beschrieben. Ausbeute: 17.200 O.D.^pc entsprechend 0.57 mMol (57 ^C,O) an . 5'-0-Phosphoryl-N -Anisoyl-desoxycytidylyl-(3'-5')-3'-0-iso-

ο 4 2

butyryl-N -Isobutyryl-desoxyguanosin ( pdan C-dibu G(iBu)). Extinktionsmaximum bei 285 und 263 nm, Minimum bei 270 und 236 nm. Verhältnis-der Extinktionen bei 302/280 = 0.82 und 280/260 = 1.00.

Claims (6)

Patentansprüche:

1) Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden dadurch gekennzeichnet, daß die dafür notwendigen geschützten Desoxynucleosid-5¹-phosphate, Dinucleosiddiphosphate und Trinucleosidtriphosphate durch direkte Phosphorylierung der geschützten Desoxynucleoside, Dinuclecsidmonophosphate und Trinucleosiddiphosphate dargestellt werden. Die so erhaltenen Verbindungen können dann in an sich bekannter Y{eise zu längeren Oligonucleotiden verknüpft werden.

2) Verfahren nach Anspruch 1) dadurch gekennzeichnet, daß alle in natürlicher DNS vorkommenden Desoxynucleoside eingesetzt werden, sowie auch solche, die in der heterocycljsehen Base modifiziert sind, wie z.B. Ν,Ν-Dimethyladenin, 6-Chlorpurin, 5-Hydroxymethylcytbsin, 4-Thiothymin^ 5-Bromuracil, 6-Azathymin.

3) Verfahren nach Anspruch 1) dadurch gekennzeichnet, daß als Dinucleosidmonophosphate und Trinucleosiddiphosphate die in der Natur vorkommenden Desoxyribo- und Kibo-Verbindungen in Betracht kommen, wie auch Analoge im Zuckerteil ( z.B. Arabinofuranosyl, Xylofuranosyl, Glucopyranosyl) und in der Base, sowie Gemische derselben.

4)Verfahren nach Anspruch 1-3) dadurch gekennzeichnet, daß als Phosphoryiierungsriittel Phosphorsäurehalogenide₉ Thio phosphorsäur ehalogenide, Phosphortrichlorid, Phosphorpentachlorid und

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Pyrophosphorsäuretetrachlorid verwendet werden.

5) Verfahren nach Anspruch 1-3 dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungs- bzw. Suspensionsmittel Trialkyl-, Triarylphosphate, aliphatische Nitrile, aliphatische und aromatische Nitroverbindungen, Dialkyläther, cyclische Äther, Ester organischer Säuren, Suloxide, Formamide, Ketone und lineare und cyclische Kohlenwasserstoffe sowie Gemische derselben verwendet werden.

6) Verfahren nach Anspruch 1-3) dadurch gekennzeichnet, daß. in Gegenwart von tertiären Basen gearbeitet werden kann.

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