DE1670016C3

DE1670016C3 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribunucleotiden durch selektive Phosphorylierung

Info

Publication number: DE1670016C3
Application number: DE1670016A
Authority: DE
Inventors: Takeyoshi Ohsawa; Shunji Ouchi; Kenji Sato; Saburo Senoh; Tuneo Sowa
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1966-12-16
Filing date: 1967-12-15
Publication date: 1974-11-14
Also published as: DE1670016B2; NL6717119A; GB1180460A; US3466273A; DE1670016A1; IT1006003B

Description

3 4

Die Verwendung geringerer Mengen an Salzen des trierte Rückstand wurde mit Methanol versetzt, und

organischen Amins mit einer anorganischen Säure als das entstandene Gemisch wurde allmählich gekühlt,

die der angegebenen Mengen führt zu einer Verrin- wobei schöne, nadelförmige Kristalle auskristalli-

gerung der Geschwindigkeit der Phosphorylierungs- sierten.

reaktion des Nucleosids und zu einer verstärkten 5 Die Kristalle wurden abfiltriert und im Vakuum

Bildung von Nebenprodukten. getrocknet, man erhielt 5,1 g reines Dinatrium-5'-gu-

Da die meisten Salze von organischen Aminen mit anylat (Reinheit 95,6%, Wasser 3,2%).
anorganischen Säuren hygroskopisch sind, ist es vom

verfahrenstechnischen Standpunkt aus vorteilhafter, Beispiel 2
Amine und anorganische Säure dem bei der Reaktion io

verwendeten organischen Lösungsmittel unter Bildung Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung,

der gewünschten Salze in diesem Lösungsmittel ge- daß 2,75 ml (20 ml Mol) Pyrophosphorylchlorid an

trennt zuzufügen, statt die vorgebildettn Salze zu Stelle von Phosphoroxychlorid verwendet wurde. Die

verwenden. Umwandlung in Guai>osinphosphate und in 5'-Guanyl-

AIs bei dem erfindungsgemäßen Verfahren brauch- 15 säure war 98 bzw. 93,1 %.
bare Amine bieten sich primäre, sekundäre und tertiäre

Amine an, während als anorganische Säuren z. B. B e i s ρ i e 1 3
Salzsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure oder Chlorsäure verwendet werden können. Zu 15 ml Dichlormethan wurden 3 ml (33 mMol)

Es ist als überraschend anzusehen, daß beim *> Phosphoroxychlorid und 7,3 g (46,2 mMol) «-Picolin-

Phosphorylieren von nicht geschütztem Ribonucleosid Hydrobromid gegeben. Das entstandene Gemisch

unter Verwendung von Phosphoroxychlorid, -bromid wurde auf 4 bis 6⁰C gekühlt und unter Rühren mit

oder Pyrophosphorylchlorid die Selektivität der Phos- 4,2 g (14,8 mMol) Guanosin versetzt. Nach 5stündiger

phorylierung der primären Hydroxylgruppe des Ri- Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in 600 ml

bonucleosids verstärkt werden kann, wenn die Reak- as Eiswasser gegossen. Die Umwandlung in Guanosin-

tion in Gegenwart eines der genannten polaren phosphate bzw. 5'-Guanylsäure betrug 94,5 bzw. 85,2%.

organischen Lösungsmittel, welches ein Salz eines Man ließ das Gemisch etwa 2 Stunden bei 0 bis 5⁰C

organischen Amins mit einer anorganischen Säure stehen. Die entstandene wäßrige Lösung wurde mit

enthält, durchgeführt wird. Natriumhydroxyd auf einen pH von 3 eingestellt und

Ein hoher Umwandlungsg^ad und eine hohe 30 dann mit 120 ml Methanol versetzt. Man ließ die Selektivität der Reaktion wird jedoch nur dann Lösung über Nacht bei etwa 5°C stehen. Der enterzielt, wenn die Reagenzien in den angegebenen standene Niederschlag wurde abfiltriert und in 50 ml Mengenverhältnissen angewendet werden. warmem Wasser gelöst, worauf die Lösung in der

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand oben beschriebenen Weise mit Methanol behandelt

der folgenden Beispiele näher erläutert. 35 wurde. Der entstandene Niederschlag wurde mit

200 ml Wasser gelöst und, nachdem der pH der

Beispiel 1 Lösung auf 7,0 bis 8,0 eingestellt war, ließ man die

Lösung durch eine Kolonne laufen, die mit 50 ml

Zu 15 ml Acetonitril wurden 2,75 ml (30,3 mMol) Anionenaustauscher (Cl-Form) gefüllt war. Die Ko-

Phosphoroxychlorid und 8,3 g (73,2 mMol) Pyridin- 40 lonne wurde danach zunächst mit Wasser gewaschen

Hydrochlorid gegeben. Das entstandene Gemisch, das und dann mit verdünnter wäßriger Salzsäurelösung

bei 0 bis 2° C gehalten wurde, wurde mit 4,2 g eluiert. Dann wurde wie bei Beispiel 1 weiter ver-

(14,8 mMol) Guanosin versetzt. Das Reaktions- fahren. Man erhielt 4,7 g Dinatnum-5'-guanylat

gemisch, das zunächst als Suspension vorlag, ging bei (Reinheit 96,1 %, Wasser 2,5%).
voranschreitender Reaktion allmählich in eine voll- 45

ständig klare Lösung über. Nach 4stündiger Reaktion Beispiel 4
wurde das Reaktionsgemisch mit 150 ml Eiswasser

versetzt, wobei man eine wäßrige Lösung erhielt. Beispiel '. *:■■■<& wiederholt mit der Abweichung,

Eine Analyse der entstandeinen wäßrigen Lösung daß an Sfe"c ν --·ι-> Acetonitril Nitromethan verwendet

stellte sicher, daß die Umwandlung in Guanosin- 50 wurde. Die Lunwandlung in Guanosinphosphate und

phosphate und 5'-Guanylsäuire zu 97,6 bzw. 92% in 5'-Guanylsäure betrug 98,2 bzw. 92,3%. Man

erfolgt war. erhielt 5,05 g Dinatrium-5'-guanylat (Reinheit 94,8%,

Nachdem die wäßrige Lösung 2 Stunden lang bei Wasser 3,7 %).

etwa 5°C gehalten wurde, wurde sie durch eine mit Beispiel 5
150 ml granulierter Aktivkohle beschickte Säure 55

geschickt, um die Guanylsäure zu adsorbieren. Die Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung,

Kolonne wurde dann mit etwa 600 ml Wasser ge- daß an Stelle von Acetonitril Dioxan verwendet wurde,

waschen und dann mit 0,ln-wäßriger Natriumhydro- Die Umwandlung in Guanosinphosphate und 5'-Gu-

xydlösung eluiert. Das Eluat wurde nach der Ein- anylsäure betrug 89,4 bzw. 83,8%. Man erhielt

stellung seines pH auf weniger als 8,0 durch eine 60 4,7 g Dinatrium-5'-guanylat (Reinheit 96,8 %, Wasser

Kolonne geschickt, die mit einem Anionaustauscher- 1,8%).

harz (Cl-Form) gefüllt war, um Guanylsäure zu ad- Beispiele
sortieren. Dann wurde die Kolonne zunächst mit

Wasser gewaschen und anschließend mit einer 0,03n- Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung,

wäßrigen Lösung von Chlorwasserstoff eluiert. In 65 daß ein Lösungsmittelgemisch, bestehend aus 10 ml

dem Eluat wurde mit Natriumhydroxyd der pH auf 7,6 Acetonitril und 5 ml Propionitril, an Stelle von Ace-

eingestellt. Das Eluat wurde unter vermindertem tonitril allein verwendet wurde. Die Umwandlung in

Druck bis zu einem Sirup konzentriert. Der konzen- Guanosinphosphate und in 5'-Guanylsäure betrug

97,3 bzw. 92,4%. Man erhielt 4,8g Dinatrium- Beispiel 10
5'-guanyIat (Reinheit 96,3%, Wasser 2,1%).

. . Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung,

ö e ι s ρ ι e I 7 _daß _3ß5 _{g (15 mMo}r) Undin an Stelle von Guanosin

Zu 15 ml Acetonitril, enthaltend 2,7 g (74 mMol) 5 verwendet wurden. Die Umwandlung in Uridin-

Chlorwasserstoff, wurden 2,5 ml (27,5 mMol) Phos- phosphate und 5'-Uridylsäure betrug 98_t2 bzw.

phoroxychlorid und 5,2ml (64,4mMol) Pyridin 94,0%. Man erhielt4,6 gNatriu<n-5'-uridylat (Reinheit

gegeben. Zu dem entstandenen Gemisch wurden 97,8%, Wasser 1,1%).

unter Rühren bei 0 bis 5^CC 4g (14,9 mMol) Inosin Beispiel 11

gegeben. Nach 2stündiger Reaktion wurde das io

Reaktionsgemisch mit 150 ml Eiswasser versetzt. Beispiel 7 wurde wiederholt mit der Abweichung,

Die Papierelektrophorese der entstandenen wäßrigen daß 5,5 g (68 mMol) Bromwasserstoff an Stelle von

Lösung ergab, daß die Umwandlung in Inosinphosphat Chlorwasserstoff verwendet wurden. Man erhielt

und in 5'-Inosinsäure zu 99 bzw. 95% erfolgt war. 5,3 g Dinatrium-5'-inosinat (Reinheit 99,0%, Wasser

Dann wu.de weiter wie bei Beispiel 1 verfahren. 15 0,8%).

Man erhielt 5,5 g Dinatrium-5'-Inosinat (Reinheit _n __{; c} „.- _ 1 η

98,4%, Wasser 1,0%). Beispiele

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung,

Beispiel 8 daß 10 g (72,5 mMol) Triäthylamin-Hydrochlorid an

ao Stelle von Pyridin-Hydrochlorid verwendet wurden.

15 ml Acetonitril wurden mit 2,7 ml (29,7 mMol) Die Umwandlung in Guanosinphosphate und 5'-Gu-

Phosphoroxychlorid und 7,4 g (65,2 mMol) Pyridi- anylsäure betrug 94,7 bzw. 86,5%. Man erhielt

niumchlorid versetzt. Dieses Gemisch wurde bei 0 bis 4,9 g Dinatrium-5'-guanylat (Reinheit 96,3 %, Wasser

2°C gehalten und mit 4 g (15 mMol) Adenosin unter 2,1 %).

Rühren versetzt. Nach 2,5stündiger Reaktion wurde 35 B e i s d i e 1 13
das Reaktionsgemisch mit 200 ml Eiswasser gemischt.

Die Umwandlung in Adenosinphosphat und 5'-Adenyl- Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung,

säure betrug 93,7 bzw. 87,9%. Die entstandene wäßrige daß 11g (40,5 mMol) Morpholin-Schwefelsäuresalz

Lösung wurde mit Aktivkohle in der Art behandelt, an Stelle von Pyridin-Hydrochlorid verwendet wurden,

wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Dann wurde sie 30 Die Umwandlung in Guanosinphosphate und in

durch eine Kolonne geschickt, die mit einem Anionen- 5'-Guanylsäure betrug 95,3 bzw. 85,5 %. Man erhielt

austauscher (Cl-Form) gefüllt war. Die Kolonne 4,7 g Natrium-5'-guanylat (Reinheit 95,7%, Wasser

wurde zunächst mit Wasser gewaschen und an- 2,8%).

schließend mit 0,05n-wäßriger Salzsäure eluiert, wobei Beispiel 14

nur Adenylsäure eluiert wurde. 35

Das Eluat wurde bei niederer Temperatur konzen- Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung,

triert und der konzentrierte Rückstand wurde mit daß an Stelle von Guanosin 4,3 g (15 mMol) Xanthosin

Methanol versetzt und das entstandene Gemisch ließ verwendet wurden. Die Umwandlung in Xanthosin-

man in einem Kühlschrank stehen. phosphate bzw. 5'-Xanthylsäure betrug 90,1 bzw.

Als Niederschlag konnten schöne Kristalle abfiltriert 40 85,1%. Man erhielt 4,7 g Dinatrium-5'-xanthylat

werden. Nach dem Trocknen erhielt man 4,5 g (Reinheit 94,8%, Wasser 3,5%).

5'-Adenylsäure (Reinheit 99,1·/·, Wasser 0,5%). .

Beispiel 9 Beispiel 10 wurde wiederholt mit der Abweichung,

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, 45 daß 13 g (45,3 mMol) Phosphoroxybromid an Stelle daß 3,65 g (15 mMol) Cytidin an Stelle von Guanosin von Phosphoroxychlorid verwendet wurden. Die verwendet wurden. Die Umwandlung in Cytidin- Umwandlung in Uridinphosphate und in 5'-Uridylphosphate und 5'-Cytidylsäure betrug 95,6 bzw. säure betrug 99,2 bzw. 96,4%. Man erhielt 4,8 g 88,8%. Natrium-5'-uridylat (Reinheit 99,2%, Wasser 0,1%).

Claims

schrift 1428 186 werden Lösungen von Nucleosiden

Patentanspruch: _nach Zugabe von Metaborsäure zum Schützen der

2',3'-Hydroxygruppen erhitzt und danach mit Phos-

Verfahren zur Herstellung von 5'-RibonucIeo- phoroxychlorid an der 5'-Hydroxygruppe phosphorytiden durch selektive Phosphorylierung des ent- S liert. Schließlich wird die Reaktionslösung nach Entsprechenden Ribonucleosids mit Hilfe einer Phos- fernen von unumgesetztem Phosphoroxychlorid durch phorhalogenverbindung und anschließende Hydro- Zugabe von Äthanol hydrolysiert,
lyse, dadurch gekennzeichnet, daß Die Durchführung dieser verschiedenen Reaktionen

man das Ribonucleosid in mehr als 1 Liter, erfordert jedoch einen hohen Arbeitsaufwand, da bezogen auf ein Mol des Ribonucleosids, Acetoni- io jeweils die Reaktionsbedingungen der gewünschten tril, Propionitril, Nitromethan, Nitroäthan, Tetra- Reaktionen eingestellt werden müssen,
hydrofuran, Dioxan, Dichlormethan, Chloräthan, Es wurde bereits versucht, ungeschützte Nucleoside

Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Aceton, selektiv zu phosphorylieren (G u 11 a η d und H ο b-Methyläthylketon oder deren Gemischen als day, J. Chem. Soc, 1940, S. 746; Barker und Lösungsmittel mit Phosphoroxybromid, -chlorid 15 Foil, J. Chem. Soc, 1959, S. 3798 und T e η e r, oder Pyrophosphorylchlorid in einer Menge von J. Chem. Soc, 1961, [Bd. 83], S. 159). Bei diesen über 1 Mol bis zu 5,0 MoI pro Liter des Lösungs- bekannten Verfahren sind jedoch der Umsatz und die mittels in Gegenwart eines Salzes eines organischen Selektivität der Reaktion so unbefriedigend gering, Amins mit einer anorganischen Säure, in einer daß sie keine praktische Bedeutung erlangt haben. Menge von über 0,5 bis 2,5 MoI pro Mol der ao Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren Phosphorhalogenverbindung bei —30 bis +30⁰C zur Herstellung von 5'-RibonucIeotiden zugänglich 0,5 bis 10 Stunden lang phosphoryliert und danach zu machen, bei dem die selektive Phosphorylierung das Reaktionsgemisch in üblicher Weise hydroly- der primären Hydroxygruppe von ungeschützten siert. Ribonucleosiden mit guter Selektivität und Ausbeute

25 durchgeführt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren

zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden durch selektive

Phosphorylierung des entsprechenden Ribonucleosids mit Hilfe einer Phosphorhalogenverbindung und

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung 30 anschließende Hydrolyse, das dadurch gekennzeichnet

von 5'-RibonucIeotiden durch selektive Phosphory- ist, daß man das Ribonucleosid in mehr als 1 Liter, lierung von Ribonucleosiden. Die erfindungsgemäß in bezogen auf 1 Mol des Ribonucleosids, Acetonitril, wirtschaftlicher Weise hergestellten 5'-Ribonucleotide Propionitril. Nitromethan, Nitroäthan, Tetrahydro-

eignen sich als chemische Reagenzien oder als Würze furan, Dioxan, Dichlormethan, Chloräthan, Dimethyl-

und Würzkomponenten. 35 sulfoxid, Dimethylformamid, Aceton, Methyläthyl-

Zur Phosphorylierung einer primären Hydroxy- keton oder deren Gemischen als Lösungsmittel mit

gruppe eines Nucleosids hat man es bisher meist für Phosphoroxybromid, -chlorid oder Pyrophosphoryl-

erforderlich gehalten, die sekundären Hydroxygruppen chlorid in einer Menge von über 1 bis zu 5,0 Mol des Nucleosids mit Hilfe geeigneter Gruppen zu pro Liter des Lösungsmittels in Gegenwart eines Salzes

schützen. 40 eines organischen Amins mit einer anorganischen

Dabei müssen folgende drei Reaktionsstufen durch- Säure in einer Menge von über 0,5 bis 2,5 Mol pro Mol

geführt werden: der Phosphorhalogenverbindung bei —30 bis +30⁰C

!.Herstellung von 2',3'-O-geschütztem Ribonu- 0,5 bis 10 Stunden lang phosphoryliert und danach das

cleosid Reaktionsgemisch in üblicher Weise hydrolysiert.
2. Hersteilung von 2\3'-O-geschütztem Ribonu- ^4S Bei der praktischen Durchführung des erfindungscleosid-5'-phosphat gemäßen Verfahrens werden dem bei der angegebenen
3. Abspaltung der Schutzgruppen in 2',3'-Stellung. Temperatur gehaltenen Lösungsmittel Phosphoroxy

chlond, -bromid oder Pyrophosphorylchlorid sowie

Ein Beispiel für dieses bekannte Verfahren gibt die Salze von organischen Aminen mit den anorganischen französische Patentschrift 1 417 811, gemäß der als 50 Säuren unter Rühren zugefügt, worauf dann die ent-Schutzgruppe die Isopropylidengruppe verwendet standene Mischung zu einem ungeschützten Ribonuwird, die in der letzten Verfahrensstufe durch Erhitzen cleosid gegeben und gerührt wird. Durch Vermischen in saurer Lösung wieder entfernt wird. des entstandenen Reaktionsgemisches mit Wasser Es ist zwar bekannt, diese drei Reaktionen ohne werden restliches Phosphoroxyhalogenid, -bromid Isolierung von Zwischenprodukten einstufig durch- 55 oder Pyrophosphorylchlorid sowie das entstandene zuführen (vergleiche z. B. J. Am. Chem. Soc, Bd. 83, phosphordihalogenierte Nucleosid hydrolysiert. Die S. 3640 [1961] und die französischen Patentschriften entstandene wäßrige Lösung wird in der für das 1 434 511 und 1 428 186). Gemäß der französischen Reinigen von Nucleotiden üblichen Weise behandelt, Patentschrift 1 434 511 werden zunächst die T- und um das gewünschte 5'-Ribonucleotid zu erhalten, die 3'-Hydroxygruppen des Nucleosids in Gegenwart 60 Die genannten Lösungsmittel sind polare Lösungsvon Phosphoroxychlorid in einem Lösungsmittel in mittel. Nichtpolare Lösungsmittel sind für das die Isopropylidengruppe übergeführt; dann wird erfindungsgemäße Verfahren nicht geeignet. Auch Pyridin zu dem Reaktionsgemisch gegeben und, ohne solche Lösungsmittel wie Carbonsäuren, Amine und das 2',3'-O-Isopropylidennucleosid vorher zu isolieren, Alkohole sind nicht geeignet, weil sie zu Nebenreakdie 5'-Hydroxygruppe phosphoryliert und anschließend 65 tionen und zur Bildung von Nebenprodukten in die Hydrolyse der Schutzgruppen durch Erhitzen im größerem Umfang führen. Die angegebenen Lösungssauren Medium durchgeführt. mittel können allein oder im Gemisch verwendet Nach dem Verfahren der französischen Patent- werden.