DE1445421C - Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 5'-RibonucleotidenInfo
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Description
5'-Ribonucleotide, wie 5'-Inosinat und 5'-Guanylat, haben nicht nur als Wiirzstoffe, sondern auch als
Pharmazeutika Bedeutung erlangt.
Es sind schon verschiedene Methoden zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden durch Phosphorylierung
bekanntgeworden. Soweit diese Methoden technische Bedeutung besitzen, ist ihnen gemeinsam, daß
der Phosphorylierung Ribonucleoside unterworfen werden, deren 2'- und 3'-Hydroxylgruppen zuvor in
einer getrennten Verfahrensstufe durch Umsetzung mit Ketonen geschützt worden sind. Nach dem Verfahren
der deutschen Auslegeschrift 1119 278 wird z. B. bei der Phosphorylierung von 2',3'-Isopropyliden-
^uanosin mit Pyrophosphorylchlorid eine Ausbeute von 70 bis 80°/0 an Guanosin-5'-phosphat erzielt.
Pyrophosphorylchlorid ist jedoch ein relativ schwer zugängliches Reagenz und sehr reaktiv, so daß die
Umsetzung bei sehr niedrigen Temperaturen, die die Anwendung von Kühlmitteln erfordern, durchgeführt
verden muß.
Nach dem in J. American Chem. Soc. 83, (1961), i. 3640 bis 3645, veröffentlichten Verfahren wird als
°hosphorylierungsmittel für 2',3'-O-Isopropylidenibonucleoside
das, ebenfalls schwer zugängliche Tetra-p-nitrophenylpyrophosphat verwendet. In allen
Tällen werden die erhaltenen Phosphorylierungsirodukte
zunächst mit Wasser hydrolysiert und danach lie Alkylidenschutzgruppe mit verdünnter Säure
bgespalten. Diese Hydrolysen der Zwischenprodukte sind bei Verwendung von Tetra-p-nitrophenylyrophosphat
als Phosphorylierungsmittel besonders chwierig.
Es wurde nun gefunden, daß die Bildung von -Ribonucleotiden aus den entsprechenden Ribonu-'eosiden
über die entsprechenden 2',3'-Alkylidenerivate ohne Isolierung von Zwischenprodukten in
ner Verfahrensstufe in guten Ausbeuten gelingt, wenn lan das Ribonucleosid, gegebenenfalls in Anwesen-
;it von Protonen aufnehmenden Basen oder Äthern, mit einem Keton und mit in bestimmtem Ausmaß teilhydratisiertem
Phosphoroxychlorid in bestimmten Molverhältnissen umsetzt, in üblicher Weise den erhaltenen
Dichlorphosphorsäureester hydrolysiert und die Alkylidengruppe abspaltet.
Das Verfahren der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des Ribonucleosids mit
Phosphoroxychlorid im Molverhältnis von 1:2,1 bis 23 in Gegenwart von 1,5 bis 17 Mol Keton, wobei die
ίο Ketonmenge im Verhältnis zur Phosphoroxychloridmenge
niedrig gehalten werden soll, bei 4 bis 8° C und unter Zugabe von 0,1 bis 0,5 Mol Wasser oder einem
niedermolekularen aliphatischen Alkohol vorgenommen wird oder an Stelle des Phosphoroxychlorids mit
der zugehörigen Wasser- oder Alkoholmenge bereits im entsprechenden Verhältnis teilhydratisiertes Phosphoroxychlorid
verwendet wird.
Da die gemäß der Erfindung als Ausgangsmaterial verwendeten Ribonucleoside, wie Inosin, Adenosin,
Guanosin und Xanthosin, auf biochemischem Wege im großtechnischen Maßstab hergestellt werden und
wie Phosphoroxychlorid und die anderen für das beanspruchte Verfahren benötigten Reagenzien leicht
zugänglich sind, besitzt das Verfahren gemäß der Erfindung entscheidende Vorteile gegenüber den bekannten
Verfahren.
Die folgende Tabelle zeigt, daß innerhalb des weiten Verhältnisbereichs von 2,1 bis 23 Mol Phosphoroxychlorid
und 1,5 bis 17 Mol Keton pro Mol Ribonucleosid befriedigende Ausbeuten erhalten werden.
| 1 | Inosin (Mol) |
POC13
(Mol) |
Aceton (Mol) |
Hydratisierungs mittel |
Phosphory- lierungsaus- beute (%) |
|
| 35 | 2 | |||||
| 3 | 1 | 2,1 | 3 | H2O 0,1 Mol | 61 | |
| 4 | 1 | 4,1 | 3 | H2O 0,1 Mol | 74 | |
| 40 5 | 1 | 5 | 4 | H2O 0,1 Mol | 78 | |
| 6 | 1 | 5 | 8 | H2O 0,1 Mol | 74 | |
| 7 | 1 | 5 | 11 | H2O 0,1 Mol | 70 | |
| 8 | 1 | 6 | 6 | H2O 0,1 Mol | 76 | |
| 9 | 1 | 7 | 1,5 | H2O 0,1 Mol | 70 | |
| 45 10 | 1 | 7 | 4 | H2O 0,1 MoI | 80 | |
| ■ 11 | 1 | 7 | 14 | H2O 0,1 Mol | 82 | |
| 12 | 1 | .7 | 17 | H3O 0,1 Mol | 78 | |
| 13 | 1 | 8 | 2 | H,0 0,1 Mol | 80 | |
| 1 | 8 | 5 | H2O 0,1 Mol | 82 | ||
| 50 14 | 1 | 15 | 6 | t-BuOH | 84 | |
| 0,25 Mol | ||||||
| 15 | 1 | 15 | 9 | t-BuOH | 83 | |
| 0,25MoI | ||||||
| 16 | 1 | 15 | 13 | t-BuOH | 90 | |
| 0,25 Mol | ||||||
| 1 | 23 | 6 | H2O 0,1 Mol | 65 |
Zu Reaktionsbeginn findet die Umsetzung zwischen dem Ribonucleosid und dem Keton zu dem entsprechenden
2',3'-Alkylidenribonucleosid statt, die durch Phosphoroxychlorid katalysiert wird, danach
die Umsetzung von 2',3'-Alkylidenribonucleosid und dem Phosphoroxychlorid zu dem entsprechenden
2',3'-Alkylidenribonucleosid-5'-phosphat, die durch das Keton katalysiert wird. Zu hohe Phosphoroxychloridkonzentrationen
zu Reaktionsbeginn führen zu Nebenprodukten, da die Phosphoroxylierungsreaktion dann bereits einsetzen kann, ehe die Blockierung
der 2',3'-OH-Gruppen durch das Keton beendet ist.
3 4
Eine gewisse Hydratisierung des Phosphoroxy- Lösung 20 Minuten auf 70° C erhitzt, um die Isochlorids
zu Beginn der Reaktion ist erforderlich. Auch propylidengruppe abzuspalten, und der pH-Wert auf
wird durch das während der Bildung der 2',3-Alkyliden- 3,0 eingestellt. Die Reaktionslösung enthielt in einer
derivate gebildete Wasser die gesamte Reaktion deut- Ausbeute von 90 % 5'-Inosinat. Sodann wurde die
lieh begünstigt. 5 Lösung durch eine Kolonne mit einem aus einem
Eine zu große Wassermenge ist dagegen schädlich. m-Phenylendiamin-Resorcin-Formaldehyd-Copolymer
Sie führt zu unerwünschten Wirkungen, die vermut- bestehenden Entfärbungsharz geschickt, um die anlich
auf eine Spaltung der Glycosidbindung durch den organischen Substanzen zu entfernen. Das adsorbierte
bei der Reaktion zwischen Wasser und Phosphoroxy- Inosinmonophosphat wurde mit 0,8n-Natronlauge
chlorid gebildeten Chlorwasserstoff zurückzuführen io eluiert. Der pH-Wert des Eluats wurde auf 7,7 eingesind.
stellt. Die Lösung wurde auf einen Gehalt von 15 %
Der gebildete Chlorwasserstoff kann dadurch ent- Natriuminosinat konzentriert, mit einer Menge Äthafernt
werden, daß man durch die Reaktionsmischung nol, die dem Zweifachen ihres anfänglichen Volumens
inertes Gas oder Luft hindurchleitet. entsprach, versetzt und in den Eisschrank gestellt. Es
Die unerwünschte Wirkung des Chlorwasserstoffs 15 wurden 1,5 g Natrium-5'-inosinat · 7,5H2O erhalten,
kann man auch durch Zusatz von Protonen aufneh- was einer Ausbeute von 76°/0 entspricht,
menden Basen oder Äthern zur Reaktionsmischung Reinheitsgrad: 100%; λ max. bei 250 πιμ bei pH 1. ausschalten. Einige Beispiele für organische Basen Elementaranalyse (nach 4stündigem Trocknen der sind Pyridin oder Picolin, für Äther, Dimethyl-, Di- Kristalle bei 120° C):
äthyl-, Diisopropyläther oder Dioxan und für an- 20 Berechnet für
menden Basen oder Äthern zur Reaktionsmischung Reinheitsgrad: 100%; λ max. bei 250 πιμ bei pH 1. ausschalten. Einige Beispiele für organische Basen Elementaranalyse (nach 4stündigem Trocknen der sind Pyridin oder Picolin, für Äther, Dimethyl-, Di- Kristalle bei 120° C):
äthyl-, Diisopropyläther oder Dioxan und für an- 20 Berechnet für
organische Basen Calciumhydroxyd, Calciumoxyd oder . . .
Lithiumhydroxyd. Auch Ketone, wie Aceton, Methyl- C10H11U8JN4J-JNa2 ... JN J.4,/y /0, r /,»y /0,
äthylketon oder Cyclohexanon, die ohnehin der gefunden N 14,15%, P 7,68%.
Reaktionsmischung zur Bildung der 2',3'-Alkyliden- „ . -19
nucleoside zugesetzt werden, wirken als Protonen auf- 25 B e 1 s ρ 1 e 1 2
nehmende Stoffe. Es muß jedoch vermieden werden, 1 g Inosin, 2,5 ml Phosphoroxychlorid, 0,03 ml
diese Verbindungen im Überschuß anzuwenden, da Wasser und 3,2 ml Methyläthylketon wurden bei
sie die Löslichkeit der Nucleoside im Reaktions- 5° C gemischt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde
medium herabsetzen. wurde dem Reaktionsmedium 0,4 g wasserfreies
Wird die Protonen aufnehmende Verbindung, wie 30 Calciumcarbonat zugesetzt und die Reaktion weitere
ein Äther oder eine anorganische Base, während der 6 Stunden bei 5° C fortgesetzt. Sodann wurde die
Phosphorylierungsperiode zugesetzt, erreicht die Phos- Reaktionslösung in 20 ml Eiswasser gegossen, um den
phorylierungsausbeute mehr als 90 %. Dichlorphosphorsäureester zu hydrolysieren. Die wei-
Mit einer Mischung eines niedermolekularen ali- tere Aufarbeitung erfolgte wie im Beispiel 1. Es wurden
phatischen Alkohols mit Phosphoroxychlorid werden 35 1,4 g Natrium-5'-inosinat · 7,5H2O erhalten, was einer
die Nucleoside weniger stark zersetzt als in einer Ausbeute von 74% entspricht.
wasserhaltigen Mischung da in diesem Fall bei der Reinheitsgrad: 99,6%; λ max. bei 250ΐημ bei pH 1.
Bildung von Dichlororthophosphorsaure gemäß der
Gleichung Beispiel 3
POCl3 + ROH -► POCl2(OH) + RCl 4° .
Ig Guanosm, 5 ml Phosphoroxychlorid, 2,4 ml
vorwiegend das entsprechende niedermolekulare ali- Methylisobutylketon und 0,03 ml Wasser wurden bei
phatische Chlorid entsteht. 5° C unter Rühren vermischt und 6 Stunden reagieren
Das gemäß der Erfindung verwendete teilhydrati- gelassen. Die Reaktionslösung wurde bei —70°C
sierte Phosphoroxychlorid besteht hauptsächlich aus 45 in einem Trockeneis-Aceton-Bad konzentriert und
nicht hydratisiertem Phosphoroxychlorid und Di- nicht umgesetztes Phosphoroxychlorid entfernt. Sochlororthophosphorsäure.
Dichlororthophosphorsaure dann wurde die Mischung in Eiswasser gelöst, der
kann nach verschiedenen bekannten Methoden her- pH-Wert der Lösung auf 1,5 eingestellt und die Lösung
gestellt werden (vergleiche z.B. Z. Anorg. Allgem. 30 Minuten auf 70° C erhitzt, um die Isohexyliden-Chem.
294, [1958] S. 244; Angew. Chem. 70, [1958] 50 gruppe abzuspalten. Sodann wurde der pH-Wert der
S. 73; J. American Chem. Soc. 81, [1959] S. 6360; Lösung mit 6η-Natronlauge auf 3 eingestellt, die neu-Angew.
Chem. 70, [1970 [1958] S. 594). tralisierte Lösung durch eine Kolonne mit einem aus
Jedoch stellt der Zusatz von Wasser oder eines einem m-Phenylendiamin-Resorcin-Formaldehyd-Coniedermolekularen
aliphatischen Alkohols zu Phos- polymer bestehenden Entfärbungsharz geschickt, das
phoroxychlorid einen einfachen Weg zur Herstellung 55 Harz nach dem Waschen mit Wasser mit 0,2 n-Natronteilhydratisierten
Phosphoroxychlorids dar. lauge eluiert und der pH-Wert des Eluats auf 7,5 bis
Das Verfahren der Erfindung soll durch folgende 7,7 eingestellt. Die neutralisierte Lösung wurde auf
Beispiele veranschaulicht werden. einen Gehalt von 25 % Guanylsäure konzentriert, mit
. -I1 Äthanol versetzt, wobei man 1 g 5'-Guanylat erhielt,
ü ei sρ 1 e 1 1 60 was einer 70%igen Ausbeute entspricht.
1 g Inosin, 5 ml Phosphoroxychlorid, 0,17 ml tert. Reinheitsgrad: 99,4%; λ max. bei 252 πιμ bei pH 7.
Butylalkohol und 3,4 ml Aceton wurden bei 5°C mit- Elementaranalyse (nach 4stündigem Trocknen der
einander gemischt und die Reaktion 6 Stunden unter Kristalle bei 120° C):
Rühren durchgeführt. Sodann wurde die Reaktions- Berechnet für
Rühren durchgeführt. Sodann wurde die Reaktions- Berechnet für
lösung zur Hydrolyse des Dichlorphosphorsäureesters 65
in Eiswasser gegossen, der pH-Wert der erhaltenen C10H12O8N5PNa2 ... N 17,20%, P 7,61%;
Lösung mit 6n-Natronlauge auf 1,5 eingestellt, die gefunden N 17,00%, P 7,55%.
Lösung mit 6n-Natronlauge auf 1,5 eingestellt, die gefunden N 17,00%, P 7,55%.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden durch Umsetzen, von Ribonucleosiden mit Ketonen zum Schutz der 2',3'-Stellung, Phosphorylieren mit Phosphoroxychlorid, gegebenenfalls in Anwesenheit von Protonen aufnehmenden Basen oder Äthern, Hydrolyse des erhaltenen Dichlorphosphorsäureesters mit Wasser und Abspaltung der Alkylidenschutzgruppe mit verdünnter Säure, dadurchgekennze ichnet, daß die Umsetzung des Ribonucleosids mit Phosphoroxychlorid im Molverhältnis von 1:2,1 bis 23 in Gegenwart von 1,5 bis 17 Mol Keton, wobei die Ketonmenge im Verhältnis zur Phosphoroxychloridmenge niedrig gehalten werden soll, bei 4 bis 8° C und unter Zugabe von 0,1 bis 0,5 Mol Wasser oder einem niedermolekularen aliphatischen Alkohol vorgenommen wird oder an Stelle des Phosphoroxychlorids mit der zugehörigen Wasser- oder Alkoholmenge bereits im entsprechenden Verhältnis teilhydratisiertes Phosphoroxychlorid verwendet wird.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3847462 | 1962-09-10 | ||
| JP3847462 | 1962-09-10 | ||
| DEA0042921 | 1963-04-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1445421A1 DE1445421A1 (de) | 1969-03-27 |
| DE1445421B2 DE1445421B2 (de) | 1973-01-11 |
| DE1445421C true DE1445421C (de) | 1973-08-02 |
Family
ID=
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