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Vwjffthran sur Herstellung ovn 5'-Ribonucleotiden.
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Bie Erfindung betrifft ein chemisches, in incustriellem messtab durchführbares
Verfahren zu rherstellung von 5'-@ibonucleotiden.
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Sattiu @atrium-5'-ribonculeotide, wie natrium-5'-incsinst, natrium-5'-guanglst
finden bekanntlich nicht nur als närzstooff,e aondern auch als rharmechetuca anwenung.
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Es cind £chou verschiedene metoden, 5'-Nuclsotide durch thosphorylierung
der 5'-Hyuroxylgruppen der Nucleoside auf coneidschen Wege herzustellen. bekannt
geworden, Vor der @bos, horylierung der 5'Hydroxylgruppen sollten jedoch 1s bllgemeinen
die 2'- und 3'-Hydroxylgruppen gonch itzt werden.
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Um die 2'-und #'-Hyarolxylgru nen der Nucleoside zu schützen, sind
bes ndere Behandlungsmethoden und für die Phosuhorvlierung der 5'-Hydroxylsruspen
besondere Reagenzien erforderlich. Au-erdem stellen diese Verfahren komplizierte
Operationen dar. sie können daher nicht unmittelbar vür die rroauktionvon'-ibonucleotinLindustriellen
Masstab angewen et werden. Bislang ist noch kein befriedigendes insustrielles Verfahren
die 5'0Hydroxylgrupse selektiv in einem einstufigen Verfahren zsu shosphorylieren,
bekannt geworden.
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Mit dem Ver. trhren der Erfindung ist die selektive einstufige Synthese
der 5'-Ribonucleotide, wie 5'-Inosinat, 5'-Guanylat und 5'-Adenylat durch Umsetzung
der entsprechenden Nucleoside mit Phosphoroxychlorid in Gegenwart von Ketonen gelungen.
Die dazu benötigten Reagenzien sind billig und leicht erhaltlich und machen in Anbetracht
der einfachen Verfahrensführung, des Verfahren ween seiner Anwendbarkeit im industriellen
Masstab susserorde. blich wertvoll.
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Bislang sind keine Versuche bekannt pewrdeh, ungeschützte
Mucleoside in Thosghoroxychlorid zu ohos. horylieren. Untersuchungen über eine direkte
thos whorylierung mit rhosrahoroxydchloride, Ketonen und siuren, insbesondere mit
hydrvtisiertem
Phosphoroxychlorid-die zur Ausarbeitung des Verfahrens
der Erfindung fiihrten-haben ergeben, dass bei bestimmten molaren Verhältnissen
der einzelnen Reagenzien die 5'-Hydroxylgruppe selektiv phosphoryliert werden kann
und unter bestimmten anderen Bedingunfen die 2', 3'-O-Alkyliden-Rucleoside selektiv
erhalten werden können. Jedes dieser Frodukte kann durch einstellung des molaren
Verhältnisses der verwendeten Reagenzien selektiv erhalten werden. Es ist bemerkenswert,
d ? ss die 5'-Hydroxylgruppe in Gegenwart von Ketonen bevorzugt phosphoryliert wird,
selbst unter Bedingungen, unter denen die Phosphorylierung Vorrang hat.
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Hydratisiertes Phosphoroxychlorid und Ketone spielen in dem Verfebren
der Erfindung eine wichtige Rolle, wie den weiteren Erläuterungen zu entnehmen ist.
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~ Nucleoside sollen dazu neigen, sich in polarem Phosphoroxychlorid
zu lösen, wenn ein einsames Elektronenpaar des Nucleosidestickstoffe mit einem Proton
des hydratisierten Phosphoroxyohlorids eine Koordination eingeht.
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Dse Verfahren der Erfindung wird unter sauren Bedingungen durchgeführt,
w.'js mit einem frrossen Vurteil verbuncmn ist, wenn es auf Gunnosin angewandt wird.
Die mit der Phosdphorylierung von. Guanosin mit Phonuhoroxychlorid in pyridinlösung
verbundenen
Schwierigkeiten sind, wie Khorane H.G. (JACS, 79, 3747
(1957)) erklärteaufdiezwischender2-AmiDOgrp.ppeunddex3'-* Hycroxylgruppe des Guanosins
gebildete Wasserstoffbinaung zuriickzuführen. Das Verfahren der Erfindung kenn mit
Erfolg auch auf die Phosphorylierung von Guenosin angewandt werden, wegen der Proteonisierung
(protonation) der Aminogruppe, wodurch die weiter oben beschriebene Spaltung der
Wasserstoffindung unvermeidbar wird.
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MischtmanalleReagenzienaufeimselmiteinanderundführ die Reaktion bei
niedriger Temperatur (vorzugsweise bei 4 - 8°C) durch, dann beträgt die Ausbeute
70 - 80 %.
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Tabelle I zeigt, dase innerhalb eines weiten Verhältnisbereichs von
Phosphoroxychlorid und Keton zu Nucleosid praktisch immer befriedlgende Ausbeuten
erhalten werden.
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Bevorzugt kann ein Bereich von 4-2o Mol i=hosphoro : vchl. orid und
15 Mol Keton zu Nucleosid benutzt werden.
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Tabelle I
| Inosim POOl3 Acetem Kydrat Agents Phosphory- |
| lierungs- |
| Ausbeute |
| 1 1 Mol 2,1 Mol 3 Mol H2O 0,1 Mol 61 % |
| a 4, 1 w |
| # 3 # " " |
| 74 |
| 5 " " 11 " |
| 6 " 6 6 " |
| 14 82 |
| ayez |
| 9 " " 14 " " 82 |
| 10 " " 17 " " 78 |
| 11 " @ 2 " " 80 |
| 12 " " 5 " " 82 |
| 13 " 15 6 t-BucM i0,25 84 |
| 14 " " 9 " " 83 |
| 15 " " 13 " " 90 |
| 16 " 23 6 H2O 0,1 65 |
| 17 " 5 3 - - 70 |
Die Katommange wird vorsugeweise niedrig neghalten, da unter derartigen Bedingungen
die Reaktionen zwischen den 2',3'-Hydroxylgruppen und den Ketenen rellativ gering
ist. Es wurde gefunden,
Basa die Hydratisierung zu Beginn der Reaktion
wünschenswert ist, da während der Bildung der Alkylidenderivate gebildetes Wasser
die ganze Reaktion deutlich begünstigt und die Endausbeute an 2', 3'-O-Alkyliden-nucleoside-5'-phosphaten
tussent zufriedenstellend sind.
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Jedoch die Anwesenheit von überschüssigem Chlorwasserstoff, der sich
bei übermässiger Hydratisierung bildet, ist schädlich, da die Glycosidbindung zwischen
Ribose-un Purinbasen in stark saurem Medium sehr schwach ist. Den gebildeten Chlorwasserstoff
kann man sebr wirksam entfernen, wenn man inertes Gas oder Luft durch die Reaktionsmischung
hindurohleiet.
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Es wurde weiterhin gefunden, dqss man die unerwünschte-Wirkung des
Chlorwasserstoffs durch Zusatz von Protonenaoceptoren zur Reaktionsmischung autheben
kann. In dem Verfahren gemmas Erfindung sollen unter Protonenacceptoren organische
Basent wie Pyzidin, Picolin etc., Sauerstoffverbundungen, wie Dimethyläther, Diäthyläther,
Diisopropyläther, Dioxan, Aceton, Methyläthylketon, Cyclohexanon etc., anorganische
Basen, wie Calciumhydroxyd, Calclumoxyd, Lithiumhydroxy, sowie molare Siebe etc.
verstanden werden. Es muss jedoch vermieden werden, sie im Ueberschuss anzuwendxr,
da sie die Loslichkeit der Nucleoside in den Reaktionsmedien herabsetzen. Der Pronenaccentor
wird in einem
späteren Stadium der Reaktion zugesetzt. Ketone wirken
Chlorwassermtoff gegenüber nicht nur als Reagenz, sondern auch als Protonenacceptor.
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Bei grosses Ueberschuss von Keton zu Phosphcroxychloridy ist die Bildung
von 2', 3'-0-Alkylidenderivaten vorherschend, die gewiinschtenfells in hoher Ausbeute
abgetrennt werden können.
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In diesem Fall ist jedoch ein grosser Säureübernchuss notwendig und
es wird vermutet, dass des Phosphoroxychlorid oder des hydratisierte Phosphoroxychlorid
als Hydratisierungsmittel wirkt. Sie reagieren mit dem gebildeten wasser unter Bildung
von Chlorwasserstoff und weiterem hydratisiertern Phosphoroxychlorid das die Reaktion
ebenso begünstigt.
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Die Wirkungen des molaren Verhältnisses von Pbos, horoxychlorid zu
Nuoleosidenaind in Tabelle II gezeigt.
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Tabelle II Die Wirkungen der Phosphoroxychloridmenge auf die Bildung
von 2', 3'-0-Alkylidennucleosiden (in allen Versuchen wurden 46 Mol Aceton, das
1 % Wasser enthielt, benutzt ; die Reaktionszeit betrug 1 Stunde, die Temperatur
4-8° C) Molarea Verbaltnis POCl3/Nucleosiden 1,5 2 3 47-'Ausbeute an Isopropylideninosin
(%) 83 91 93 89 go Ausbeute an Isopropylidenguanosin (%) 58 78 80 96 83
Wie
der Tabelle II zu entnehmen ist, werden die 2',3'"0-Alkylidenderivate in mehr als
80%iger ausbeute erhalten.
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Die allmähliche Phosphorylierung kann denn durch Entfernung des überschüssigen
Ketons aus der ReaktionsMischung mit nachfolgendem Zusatz von weiterem Phosphoroxychlorid
in passender Menge erreicht werden. Wird der Protoenenacceptor, wie Aether, oder
anoranische Basen, während der Phosphorylierungsperiode zugesetzt, erreicht die
l'hosphorylierungsausbeute mehr als go %. Dann wird die Reaktionsmischung in Tasser
gelost. Um das 2', 3'-0-Alkyliden-nucleosid-5-dichlorphosphorssureester (-phosphoridichloridate)
zu hydrstisierten, wird die Alkylidengruppe durch Erhitzen in verdiinnter wässriger
Säurelösung eliminiert. Die 5'-Ribonucleotide können in kristalliner i'orm in 7o-75%
iger Ausbeute in bekannter weise erhalten werden.
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Das gemäss Erfindung hydratisierte Phosphoroxychlorid besteht hauptsächlich
aus Dichlororthophosphorsäure, die sich vernutlich aus Phoaphoroxychlorid und Wasser
gemäss folfender Gleichung bildet :
Es ist schon über einige Methoden zur Herstellung partiel hydratisiertem Phosphoroxychlorid
berichtet worden. (Goubeau, Schelz, Z. Anorg. Allgem. Chem. 294, 244, (1958); Gunze,
Thilo, Angew. Chem. 70, 72 (1958), Wazer, Flunk, JACS 81, 6360 (1959),
Sambeth,
Angew. Chem, 70, 994 (1958)).
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Darnach diesen Methoden partiell hydratisierte Phosphoroxychlorid
kann mit Erfolg sowohl in reiner als auch in unreiner Zorm in dem Verfabren gemäss
Erfindung verwendet werden. luit de gereinigten Material können unerwünschte Wirkungen,
die auf den Chlorwasserstoff zurückzuführen sind, vermieden worden. In der Praxis
stellt der Zusatz von Wasser oder einem Dlederen aliphatischen Alkohol zu Phosphoroxychlorid
einen einfachen Weg zur Herstellung partiel hydratisierten Phosphoroxychlorida der.
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Die Ursache für die unerwünschten Wirkungen von überschüssiger Wassermenge
liegt vermutlich in der Spaltung der Glycosidbindung durch den bei der Reaktions
zwischen tasser und Phosphorpxychlorid gebildeten Wasserstoff. Wird eine Mischung
von niederem aliphatiachem Alkobol und Phospboroxychlorid benutzt, dann ist die
Zersetzung der Nucléoside nicht so deutlich, de die Dichlororthophosphorsdure gebildet
wird, ohne dassChlorwasserstoff entsteht.
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Das Verfahren der Erfindung soll durch folgende Beispiele weranschaulicht,
aber nicht begrenazt werden.
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Beispiel 1 1 K Inosin, 5 ccm hosphoroxychlorid, 0,17 ccm tert.-Butylalkoyhol
und 3,4 ccm Aceton wurden bei 5° C miteinander gemischt und die Reaktion 6 Stunden
unter Führen durchgeführt. Sodann wurde. die Reaktionslösung zur Hydratisierung
: des Chloridats in Eiswasser gegossen und der pH-wert der erhlatenen Lösuntg mit
6n Natronlauge auf 1, 5 eingestellt, sodann die Lösung 2o Min. auf 70° C erhitzt,
um die Isoaropylidengruppe zu hydrolysieren und der pH-Wert auf 3,0 eingestellt.
Die Reaktionslösung enthielt 90% des gewnschten Produkts. Sodann wurde die Lösung
durch eine Kollnne mit Entfärbungsharz Centranol w-, # geshhickt, danach die Kolonne
mit Vawser gewaschen, um die anorganischen Substanzen zu entfernen, und schliesslich
doa adsorbierte Inosinmonophosphat mit o, 8 n Natronlauge eluiert. Der pH-Wert des
Eluats wurde auf 7, 7 eingestellt.
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Die Lösung wurde auf 15 % natriuminosinat konzentriert, sodann fiigt
man Aethanol in einer Menge zu der Lösung, die dem zweifachen ihres initiale Volumes
entsprach, und liess die Mischung im Eisschrank stehen. Ms wurden 1, 5 g Natrium-5'-inmosinat
# 7,5H2O erhT/iten, was einer Ausbeute von 76 % entsproach.
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Beispiel 2 1 g Inosin, 2,5 5 ccm Phosphoroxychlorid, o, o3 ccm Wasser
und 3<2 ccm Methyl-athyl-keton wurden bei 5° C gemischt, nach einer Reaktionszeit
von einer Stunde o, 4 g wasserfreies Caloiumcarbonat dem Reaktionsmedium zugesetzt
und die Reaktion weitere 6 Stunden bei 5° C fortgosetzt. Sodann wurde die Reaktionalösung
in
2o ccm Eiswasser gegossen, um das Chloridat zu bydrolysieren und weiter wie in Buis,
Niel 1 beschrieben verfahren. Es wurden 1,4gnatricm-5'-inosinat # 7, 5 H2o erhalten
was einer Ausbeute von 74% entsprach.
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Beispiel 3 1 g guanosin, 1o ccm Phosphoroyxchlorid 2, 4 ccm Methylisobutylketon
und o, o3 ccm Wasser wurden bei 5°c unter Riihren vermischt und 6 Stunden reagieren
gelasse. Die Reaktionslösung wurde bei -70°C in einem Trockeneis-Aceton-Bad konzentriert
und nicht umgesetztes Phosphoro/xychlorid entfernt. Sodenn wurde das Ranze in Eiswasser
gelöst, der pH-Wert der Losung auf 1, 5 eingestellt und die Lösung 3o Min. auf 7o*
C erhitzt, um die Isohexylidengruppe zu hydrolysieren.
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Sodann wurde der pH-Wert der Losung mit 6n Natronlauge auf 3 eingestellt,
die neutralisierte Lösung durch eine kolonne mit Entfärbungsharz Centraol w-291
geführt, das Hntz nach dem Waschen mit Masser mit o, 2n Natronlauge eluiert und
der pH-wert des Eluats auf 7, 5 bis 7i7 eingestellt.
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Die neutralisierte Lösungwurde auf 25 % Guanylsiure konzentriert sodann
Aethanol zugefügt, wobei man 1g 5'-Guan lat erhielt, was einer 70%igen Ausbeute
entsprach.
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Beispiel 4 1 g Adenosin, 0,3 ccm Phosphoroxychlorid, 1,6 ccm Aceton
und
o, o2 ccm Wasser wurden 1 Stunde unter Rüh en miteinander gemischt,
sodann 8 ccm Phosphoroxychlorid, danach o, 2 ccm éther der Mischung zugesetzt und
die Reaktion weitere 6 Stunden durchgeführt. Die erhaltene Reaktionslösung wurde
bei-70° in einem Trockeneis-Aceton-Bad gefroren und konzentriert. Die flüchtigen
Losungsmittel, wie Phosphoroxychlorid wurden vollständig entfernt. Der pH-Wert der
Lösung wurde auf 1, 5 ein : ; estellt und die Lesung 2o Min. auf 70° C erhitzt,
Um die Isopropylidengruppe zu hydrolysieren. Danach stellte man den pH-wert der
hydrolysierten Lösung auf 7,5 - 7,7 ein, konzentrierte ; die Lösung und fällte mit
Aethanol
'in kristalliner Form. Die rohen Kristalle hatten ein Gewicht vin 1, 1g, was einer
Ausbeute von 77 % entsprach.
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Beispiel 5 1g Inosin, o, 4 ccm Phosphoroxychlorid, 4 ccm Cyclohexan
und o, ccm partiell hydratisiertes Phosphoroxychlorid - hergestellt nach der Methode
von Sampeth et al. Angew. Chem., ? ol 594 (1958))-wurden 1 Stunde unter Rühren miteinander
gemischt, denach 8 ocm Phosphoroxychlorid und o, 4 g wasserfreies Natriumcarbonat
zugesetzt und die Mischung 6 Stunden bei 5° C reagieren gelasse. Dann filtrierteman
das nicht umgesetzte Phosphoroxychlorid unter vermindertem Druck, ab, goss die erhal
ène
Lösung zur Hydrolyse des Chloridats in Eiswasser und führte die weitere Aufarbeitung
in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durch. Es wurden 1, 56 g Natrium-5'-inosinat
. 7,5 H2O erhaltdn, was einer Ausbeute von 79% entsprach.
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Beispiel 6 1 g Guanosin, 0,3 ccm Phosphoroxychlorid, 2 ccm Aceton
und 0,1 ccm tert. Butylalkohol wurden bei 5° C gemischt, die Mischung 1 Stunde unter
RUhren reagieren gelasse, sodann 8 ccm Phosphoroxychlorid dem Reaktionamedium zugesetzt
und die Reaktion weitere 6 Stunden durchgeführt. Danach wurde die Reaktionslösung
in eiswasser gegossen, um das Chloridat zu bydrolysieren, der pH-Wert der hydrolysiertan
Lesung auf 1, 5 eingestellt und die Losung 2o Min. auf 70° C erhitzt, um die Isopropylidengruppe
zu hydrolysieren. Nach weiterer Aufarbeitung - wie in Beispiel 1 beschrieben-wurden
1, o8 g Natrium-5Lguanylat erhalten, was einer ausbeute von 75 % entsprach.
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Beispiel 2 g Guanosln wurden nach und naoh unter Rühren zu 12o oom
Aoeton, des 4, 1 g Phoaphoroxychlorid enthielt, zugegeben und die Misohung 1 bis
2 Stunden gerührt, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Nach 3 Stunden wurde die
Reaktionsmiachung sorgfältig in 500 com Eiswasser gegossen, der pH-Wert der erhaltenen
lösung mit 10 n Nstronlauge auf 8 eingestellt,
die Lösung konzentriert,
um das Aceton zu entfernen, und der pH-Wert der Lösung mit Salzsäure zur Kiristallisation
auf 6 eineestellt. Es wurden 1, 4 g umkristallisiertes 2',3'-O-isorpopyliden-guanosin
erhalten (70 %) Beispiel 8 2 g Inosin wurden nach und nach unter Rühren der Mischung
von 4o cam Aceton und 1, 7g Phosphoroxychlorid zugegeben. Das Rühren war notwendig,
um die Reaktionsmischung in eine Lösung überzuführen.
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Nach 4 Stunden wurde die Reaktionslösung in 5oo ccm Eiswasser eingetropft,
die erhaltene Lösung mit lo n Natronlauge auf DH 8-9 neutralisiert, sodann der pH-Wert
der neutralisierten Lösung mit Salzsäure auf 4 eingestellt, um das 2', 3'-O-Isopropyliden-inosin
zur Kristallisation zu brin ! en. Es wurden 1,84 g des gewünschten Produkts erhalten
(Ausbeute : 70 %).
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Beispiel 9 166 g hosphoroxychlorid wurden allmählich zu 1, 5 1 Aceton,
des 1 % Wasser enthielt, zugefügt und die Mischung unter Wasserkuhlung auf 30° C
gehalten. Dann aetzta man 10 g Inosin der Lösung in mehreren Anteilen unter Riihren
zu, fiihxte die Reaktion bei 30° C durch, setzte das Rühren weitere 15-2o Min fort,
wobei man eine klare Lösung erhielt. 30 Min nach Beendigung des Inosinzusatzes war
die Reaktion beendet.
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Den pH der erhaltenen Lösung stellte mnn mit 2, 5 n Natronlauge auf
9 iein und hielt die Lösung unter Kühlen nuf loo C.
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Das ausgefallene kristalline NatriumDhosDhat filtrierte man nb und
wusch es mit 5o %igem (V/V) wässrigem Aceton (hydrate acetone). Das Filtrat und
die Waschwässer wurden vereinigt, des Aceton unter vermindertem Druck entfernt,
danach die erhaltene Lösung auf 1, 5 1 konzentriert, sodann mit Eiswnsser p-ekühlt,
der pH-Wert der Lösung mit 2 n Salzsäure auf 6,8 ei Sestellt, wobei sich ein kristalliner
Niederschlag bildete, der abfiltriert, mit Wasser pewaschen und getrocknet wurde.
Es wurden 8, 3 g des gewünschten Produkts erhalten (78,5 %). (Smp. 274 - 276° C)
Beispiel 10 @@@@@@ Es wurde in derselben Weise wie in Beispiel 9 verfahren und für
jeden Versuch 2 g Adenosin, Cytidin, Uridin oder Ganosin, 4-g Phosphoroxychlorid
und 80 g Aceton, das 1 % Wasser enthielt, verwendet. Es wurden folsende Ergebnisse
erhalten.
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Nucleosid Reakti ons- Ausbeute an Smp. dauer 2',3'-O-Sub- (0° C) stituiertem
tucleosid (%) Adenosin 1 99 216 Cytidin 2 98 224 Uridin 1 99 161 Guanosin 1 95 300
1§3..9..-.
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4 ccm Wasser wurden 250 ccm Methyl-äthyl-keton zugaseztzt, der erhaltenen
lösung unter Rühren 33,4 g Phosphoroxychlorid nech und nch zugefügt, die erhaltene
Lösung unterhalb von 30° C gehalten, sodann ? o g Inosin zugesetzt und weitere 30
Min. gerührt. Der pH-Wert der Umsetzungslösung wurde mit 2, 1--n Salzsäure auf 9
- 9, 5 eingestellt, wobei bei 1o* C kristallines Natriumphosphat aufsfiel, das abfiltriert
wuirde.
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Das Methyl-äthyl-keton wurde entfernt und das Filtrat unter vermindertem
Druck auf 2o0-15o com eingeengt. Der pH-iNert der konzentrierten Lösung wurde suf
6, 8 eingestellt, wobei. kristallines 2', 3'-O-isobutyliden-inosin ausfiel, dq59
abfiltriert und getrocknet wurde. Es wurden 20, 3 g untcristallisierte Kristalle
erahlten, was einer Ausbeute von 85 % entsprach. Smp.
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274 - 277°C AnsQ*' ber. für : C14H18O5N4 C 52,17%, H 5,63 %, N 17,38%
gef. : C 52,01%, H 5,89 %, N 17, 64% Beispiel 12: Adenosin, Guanosin, Cytidin und
Uridin wurden der in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrensweise unterworfen, wobei
folgende 2', 3'-0-Isobutyliden-nucleoside erhalten wurden : Nucleosid Ausbeute an
2', 3'-O-substitutiertem Nucleosid (%) Nue Guanosin57 Cytidin 93 Uridin 99
Beispiel
13 4 ccm Wasser wurden 25o ccm Cyclohexanon zugesetzt und der erhaltenen Löaung
nacb und nach unter Riihren 33, 4 g Pborphoroxychlorld zugegeben, wobei die Lösung
durch Wasserkuhlung unterhalb von 3o* C gehalten wurden, sodann setzte man der Löaungsmischung
allmahlich unter Rühren Inosin zu und führte die Reaktion 1 Stunde bei einer Temperatur
zwischen 2o und 30° C durch. Die rohen Kristalle wurden in der in Beispiel 9 beschriebenen
Weise behandelt und aus Wasser umkristallisiert. Es wurden 22, 8 g 2'93'-0-Cyclohexyliden-inosin
erhalten. Die Ausbeute betrug 88 %, Smp. 283 - 286° C.
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Analyse : ber. für C16H20O5N4: C55,2%, H 5,8%, N 16,1% gef. : C 54,
? 8%, 5,86%, N 16,1%