DE2016049A1 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphaten bzw. ihren Estern - Google Patents

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann,

Dipl.-Ing. H.Teickmann, Dipl.-Phys. Dr.K.Fincke

Dipl-Ing. E A.¥eicxmann, Dipl-Chem. B. Huber

' 8 MÜNCHEN 86, DEN

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int. Nr. 1678 -Möhlstrasse 22, rufnummer 483921/22

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., Mannheim

Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphaten bzw. ihren

Estern .

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von siddiphosphaten bzw. ihren Estern durch Umsetzung eines Nucleösidmonophosphatamidates mit Phosphorsäure bzw. einem Phosphorsäureester,

Es ist bereits bekannt, Nucleosiddiphosphatester durch Umsetzung des Nueleosidphosphats mit Cyelohexylcarbodiimid in Gegenwart eines "Phosphorsäureesters herzustellen., Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß es eine Reaktionsdauer von 7 ?agen er fordert, zahlreiche Nebenprodukte liefert und nur unbefriedigende Ausbeuten bis etwa 45 % ergibt. Nach einem anderen Vorsehlag wird vom Nucleoside'-phosphoramid ausgegangen, mit Picyclohexyloarbodiimid das entsprechende Dihexylguanidiniumsalz hergestellt und letzteres durch iß-rstündiges Erhitzen in o^Qhlo phenql bei 1QO⁰Q mit einem Phosphorsäureester kondensiert« Bei ,diesem Verfahren wird swar die Reaktionsdauer abgekürzt, Ausbeu ten und Reinheit,sind jodoch ebenso unbefriedigend wie bei dem zuvor erwähnten Verfahren. .

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Neben diesem chemischen Verfahren wurde auch bereits die enzymatische Herstellung verschiedener Nucleosiddiphosphatester durch Umsetzung der entsprechenden Nucleosidtriphosphate mit Phosphorsäureestern in Gegenwart entsprechender Enzyme beschrie ben. Dieses Verfahren ist für eine technische Herstellung der gewünschten Produkte ungeeignet.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur chemischen Herstellung von Nucleosiddiphosphaten bzw. Nucleosiddiphosphatestern, welches die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist und mit guten Ausbeuten ohne Bildung wesentlicher Mengen an störenden Nebenprodukten innerhalb kurzer Zeit zu den gewünschten Verbindungen führt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Nucleosiddiphosphate oder ihrer Ester durch Umsetzung eines Nucleosidmonophosphatamidates mit Phosphorsäure bzw. einem Phosphorsäureester besteht darin, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I

„■j
X-O- PO₂ - Am

in der X einen Nucleosidrest und Am einen Eest der Formel Ν-_νρ

2 worin E.. und Ep» ^d*^e gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom oder niedrig-Alkylrest mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, die auch, gegebenenfalls unter Einschluß eines weiteren Heteroatoms, zu einem Ring verbunden sein können, bedeuten, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II

O₅P²" - 0 - R

in der E ein Wasserstoffatom oder den Eest einer hydroxylgrup- penhaltigen organischen Verbindung bedeutet, in einem aliphatischen Alkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einem Dialkylketon mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen ^e Alky!kette oder Dimethylformamid oder deren Mischungen mit H₂O bei pH-Werten zwischen 1 und

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6,5, vorzügsweise 4 bis 5» umsetzt. Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise bei Raumtemperatur ixnä führt innerhalb von-etwa 1 bis 24 Stunden zu Ausbeuten bis zu 90 $ und darüber.

Besonders überraschend ist, daß unter den Bedingungen des erfindxmgsgemäßen Verfahrens die Ifttcleosid-5-phosphatester mit dem Lösungsmittel nicht oder nur in sehr geringen Mengen gebildet werden, da J« Moffat vnä H.G> Khorana in J.AnuChem. Soc. 83, 649 (1961) unter ganz ähnlichen Bedingungen die praktisch quantitative Bildung des entsprechenden Methylesters bei Gegenwart von Methylalkohol beschrieben haben. Überraschend ist weiter, daß neben dem Ausbleiben der zu erwartenden Esterbildung mit dem Lösungsmittel kaum Dinucleosidpyrophosphate gebildet werden. '

Die Ausgangsprodukte der allgemeinen Formel I sind teilweise bekannt, teilweise lassen sie sich nach an sich bekannten Verfahren ohne weiteres gewinnen.

Der Nucleosidrest in der Verbindtmg der Formel I kann von einem natürlich vorkommenden oder synthetischen Mucleosid abgeleitet; sein. Beispiele für geeignete natürliche Nucleoside sind Cytidin, Gridin, Ihymidin, 5-Methylcytidin, 5-Hydroxymethylcytidin, !•seudöuridin, Adenösin, Guanosin.* Inosin^öv/ie die entsprechenden E'-Desoxyverbindungen« Die verwendbaren synthetischen Nucleoside stellen zumeist Derivate der oben erwähnten natürlichen Nucleoside dar.

Die Niicleoside werden erfindungsgemäß als Amidate eingesetzt, wobei neben einer Amidgruppe selbst vor allem die mono- und dialkylsubstituierten Amidate wie z.B.Dimethylamidat, Mono- und Diäthylamidät, Mono- und Dipropylamidat, Isopropylamidate, " Biitylafflidate sowie gemischte Amidate in Frage kommen. Besonders interessant sind solche Amidate, deren Alkylreste unter Ringbildung Terknüpft sind wie z.B. im Morpholidat, Piperidatj '' Cyclohexylimidat ναϊδ. An^lidat- Besonders bevorzugt ,wirä das

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Morpholidat verwendet, wie z.B. Cytidin-5'-phosphorsäuremorpholidat, Adenosin-5¹-phosphorsäuremorpholidat und Uridin-5'-phosphorsäuremorpholidat.

Als zweite Komponente wird beim erfindungsgemäßen Verfahren Phosphorsäure bzw. ein Phosphorsäureester verwendet. Bei Verwendung von Phosphorsäure führt das erfindungsgemäße Verfahren zu den entsprechenden Nucleosiddiphosphaten.

Von besonderer Bedeutung ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Nucleosiddiphosphorsäureester durch Umsetzung der Verbindung der Formel I mit einem entsprechenden Phosphorsäureester. Die Phosphorsäure kann hierbei mit irgendeiner geeigneten hydroxylgruppenhaltigen organischen Verbindung eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß dieser Phosphorsäureester im erfindungsgemäß angewandten lösungsmittelsysteni ausreichend löslich ist. Beispiele für geeignete hydroxylgruppenhaltige organische Verbindunger., die in Form ihrer Phosphorsäureester eingesetzt werden können, sind ein- und mehrwertige Alkohole und Aminoalkohole wie z.B. Äthanolamin, Oholin, hydroxylgruppenhaltige Aminosäuren wie z.B. Serin, Zucker wie z.B. Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Glycerinaldehyd, sowie die zugehörigen Ketosen und Aminozucker. Beispiele für Verbindungen der allgemeinen Formel II sind daher Cholinphosphat, Äthanolaminphosphorsäure, Serinphosphat, Glucose~1-phosphat, Glucose-6-phosphat, Galactose-1-phosphat, Mannose-1-phosphat usw.

Als Lösungsmittel wird bevorzugt Methanol verwendet. Aber auch die anderen oben angegebenen Alkohole sowie Dimethylformamid sind geeignet, desgleichen können auch dio erwähnten niedrigen Dialkylketone allein oder im Gemisch miteinander verwendet werden. Als besonders geeignet erwies sich Methanol, dem im

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Laufe der Reaktion Isopropanol zugesetzt wird, um die Ausfällung des Produktes zu unterstützen. Dimethylformamid» welches für die Reaktion ebenfalls sehr gut geeignet ist, erfordert jedoch eine etwas aufwendigere Aufarbeitung des Reaktionsgemisches. . ■".·"."■"

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß nicht wasserfrei gearbeitet werden muß.'Allgemein ist ein gewisser Wassergehalt tolerierbar und in manchen Fällen nützlich als Lösungsvermittler, da manche Ausgangssubstanzen sich in den verwendbaren organischen Lösungsmitteln, z.B. reinem Methanol, nicht oder zu wenig lösen. Andererseits führt ein Wasserzusatz zu einer etwas verringerten Ausbeute. Die Größe des Wassergehaltes spielt dabei an sich keine Rolle. und es wurden noch bei Wassergehalten von 40 $ sehr gute Ergebnisse erzielt.

Als Säure für die Einstellung des pH-Wertes in den erforderlichen Bereich zwischen 1 und 6,5 eignen sich grundsätzlich sowohl anorganische als auch organische Säuren, die in dem angewandten Lösungsmittelsystem löslich sind. Bevorzugt werden die Halogenwasserstoffsäuren, insbesondere Chlorwasserstoffsäure. Infolge der Wassertoleranz des erfiridungsgemäßen Verfahrens können die Säuren, insbesondere auch die Halogenwässerstoffsäuren,, in wasserhaltiger Form eingesetzt werden, beispielsweise als konzentrierte Salzsäure. Geeignete Säuren sind alle, die nicht zur Ausfällung eines Reaktionspartners führen oder irreversibel mit diesem reagieren (z.B. Perchlorsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure),

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Reaktionsteilnehmer können in Form ihrer Salze verwendet werden, insbesondere der Alkali- und Erdalkalisalze. Als besonders geeignet haben sich' die Calciumsalze erwiesen. Es wird angenommen, daß die Calciumionen hierbei lösmigsvermittelnde Eigenschaften entwickeln. Aber auch Natrium-, Kalium-, Lithium-, Strontium-Mg, Bariumsalze und einige Salze von organischen Aminen,

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z.B. der Zuckerphosphate oder Aminoalkoholphosphate erwiesen sich als geeignet. Dabei wurde gefunden, daß bei Verwendung der Natrium-, Kalium- und Bariumsalze wegen deren geringerer Löslichkeit der Wassergehalt im Reaktionsmedium zweckmäßig erhöht wird. Die Calciumsalze können auch als Misch3alze verwendet werden, beispielsweise als Mischsalze mit Halogenwasserstoffsäuren wie z.B. Cholinphosphatcalciumchlorid. Hierin ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zu sehen, da viele der einzusetzenden Reagentien in Form ihrer Calciumsalze teilweise als Calciumchloridsalze im Handel erhältlich sind und in dieser Form, ohne vorherige Trocknung usw. direkt eingesetzt werden können.

Wie bereits angegeben, verläuft die erfindungsgemäße Reaktion im Sauren. Die besten Ergebnisse werden hierbei bei pH-Werten zwischen 4 und 5 erzielt. Je nach den verwendeten Ausgangsmaterialien können aber auch niedrigere pH-Werte vorteilhaft sein. Unterhalb von pH 4 steigt jedoch die Tendenz zur Bildung von Veresterungsprodukten mit dem Lösungsmittel, also z.B. des Methylesters bei Verwendung von Methanol.

Die Reaktionstemperatur ist an sich unkritisch und die Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen O und etwa 60⁰C durchgeführt werden. Bevorzugt wird Zimmertemperatur.

Die Reinigung und Aufarbeitung der erhaltenen Produkte ist einfach, da sie bereits verhältnismäßig rein anfallen und im allgemeinen nur Spuren von Verunreinigungen enthalten. In vielen Fällen kristallisiert das Produkt im Laufe der Reaktions bereits direkt aus, z.B. in Form des Calciumsalzes. Die Fällung kann durch Zugabe eines die Löslichkeit des Produktes vermin- · dernden weiteren Lösungsmittels, z.B. von Isopropanol, unterstützt werden. Durch das Ausfallen des R_eaktion3produktes im Laufe der Reaktion wird zudem das Gleichgewicht zugunsten des gewünschten Endproduktes verschoben, vas zu den erfindungsgemäß erzielbaren sehr guten Ausbeuten beiträgt.

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Neben den,bereits erwähnten guten Ausbeuten und der wesentlich verkürzten Reaktionsdauer, sowie der leichten Reinigung und Gewinnung der Produkte sind weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Anwendbarkeit einfacher und billiger Lösungsmittel sowie der Möglichkeit, in Gegenwart von Wasser zu arbeiten, zu sehen. Das "erfindungsgemäße Verfahren kann daher selbst im technischen Maßstab in einfachen Geräten durchgeführt /Warden und der sonst übliche große Zeitaufwand zur Entfernung von Wasser aus dem Reaktionsmilieu mittels azeotroper Destillation, Behandlung mit Molekularsieben UBW. entfällt. Auf den Vorteil, daß dia Ausgangsprodukte zumeist in Form der handelsüblichen Salze eingesetzt werden können und nicht erst in die freien Phosphorsäuren überführt werden müssen, wurde ebenfalls bereits hingewiesen. Das Verfahren der Erfindung bringt daher insgesamt einen wesentlichen technischen Portschritt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Produkte sind physiologisch interessant und finden daher sowohl als Arzneimittel wie auch in der Forschung Verwendung. Zahlreiche der erhältlichen Verbindungen spielen eine große Rolle im physiologischen Zellgeschehen, beispielsweise bei der Biosynthese von Phosphatiden, von Zellwandstrukturen und dgl. Beispielsweise erfolgt die Biosynthese von Phosphatiden von Basen wie Lecithin, Kephalin und Sphingomyelin durch Aktivierung der Base*, bei den übrigen Verbindungen mit weniger basischen Resten wie Serin, Inosit, Cardiolipin durch Aktivierung des Diglycerides. Die Aktivierung besteht dabei in allen Fällen in der Bildung der entsprechenden Cytidindiphosphat (CDP)-Verbindung, welche den aktivierten Rest dann weiter übertragen kann. Bei einer Reihe von Krankheiten mit Phosphatidbeteiligung treten die Phospholipide vermindert auf, z.B. bei den "Glykolipiddeseases", Sphingomyelinase (Morbus Niemann-Bieck) u.a. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in wesentlich verbesserter Ausbeute und Reinheit erhältliches Gytidindiphosphatcholin wurde·beispielsweise erfolgreich bei Hirnverletzungen als Lecithinvorläufer verabreicht und führte zu bemerkenswerten Verbesserungen

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der klinischen Symptome. Die Überlebensrate bei Grehirnschädigungen konnte durch Behandlung mit dieser Substanz erheblich gesteigert werden.

Me folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, cBeispiel 1
Cytidindiphosphat-cholin (CDP-cholin)

81 g Cholinphosphatcalciumchlorid . 4 H₂O werden in 1 1 heißem Methanol gelöst und mit konz. Salzsäure auf pH 3»5 angesäuert. Eine Lösung von 47 bis 48 g Cytidin-S'-phosphorsäuremorpholidat (CMP-Morpholidat) in 600 ml Methanol wird zu der Cholinphosphatlösung gegeben.

Die anfänglich klare Lösung wird trübe und kurze Zeit später tritt eine kräftige Fällung ein. Nach v/eiteren 24 Stunden wird mit 1,6 1 Isopropanol versetzt und der Niederschlag abfiltriert, in H₂O gelöst, neutralisiert und über eine Säule mit 2,0 1 Anionenaustauscher Dowex 1 χ 2-Formiatform, 50 - 100 mesh cbroraatcgraphiert. Nach H₂O-VZaSChUnS wird mit 0,02 m HCOOH das CDP-cholin eluiert. Die CDP-cholinhaltigen Fraktionen werden konzentriert, mit Natronlauge neutralisiert und durch Zusatz von Äthanol kristallisiert. Das CDP-cholin-Natrium . 4 HgC".wird abgesaugt und mit Äthanol gewaschen und getrocknet.

Ausbeute:

61 bis 65 g (85 bis 91 $> d. Theorie, bezogen auf eingesetztes CMP-Morpholidaij).

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Beispiel 2 .

CDP-Äthanolamin .

■17,5 g Äthanolaminphosphat und 18 g Calciumchlorid (CaClg . 2H₂O) werden in.55 bis 60 ml dest. H₂O gelöst, mit 4 bis 5 ml konz, HCl (34#ig) angesäuert und mit Methanol auf 500 ml aufgefüllt. 24 g CMP-Morpholidat in 300 ml Methanol werden obiger lösung zugegeben. Nach wenigen Minuten tritt kräftige Fällung ein. ■ " . ; .-■""■■/■■"- '-"'-' ""-. ·

Nach etwa 3 bis 4 Stunden gibt man tropfenweise unter leichtem Rühren, über einen Zeitraum von 6 bis 7 Stunden 3ÖO ml; Isopropanol zu. Nach weiteren 2 Stunden wircLder Niederschlag abfiltriert, in H₂O gelöst, neutralisiert und über eine Säule mit 1 1 Anionenaustauscher Dowex 1 χ 2, Formiatform, 50 bis 100 mesh, chromatographiert. Nach HpO-Waschung wird mit 0,02 m Ameisensäure das CDP-Äthanolamin eluiert. Die GDP-Äthanolaminhaltigen Fraktionen werden konzentriert, mit NaOH neutralisiert und durch Zusatz von Äthanol kristallisiert. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit Äthanol gewaschen und getrocknet.

Ausbeute:

18,6 bis 21,5 g (65 bis 75 % d. Theorie, bezogen auf eingesetztes CMP-Morpholidat)

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Beispiel 3
ADP-Galactose

Η»5 g Galactose-1-phosphat-Ca werden in 500 ml Methanol suspendiert und durch Zusatz von konz. HCl gerade eben in Lösung ge-,bracht. (pH ca. 2,5 bis 3).

10 g Adenosin-5'-phosphorsäure-Morpholidat (AMP-Morpholidat) in 200 ml Methanol gelöst werden der Galactose-1-phosphatlösung bis zur beginnenden Trübung zugegeben. Der Rest der AMP-MorpholidatlÖBung wird langsam unter Rühren zugetropft. 2 Stunden nach der letzten AMP-Morpholidat-Zugabe beginnt man mit dem langsamen Zutropfen von 250 ml Isopropanol. Nach 10 Stunden wird der Niederschlag abfiltriert, in HpO gelöst, neutralisiert und über eine Säule mit 500 ml Anionenaustauscher Dowex 1x2, Formiatform, 50 - 100 mesh, chromatographiert. Nach HpO-Waschung wird mit 0,7 m Natriumformiat eluiert. Die Fraktionen mit ADP-Galactose werden vereinigt und über eine 2,0 1 Kohlesäule chromatographiert. Nach H₂O-Waschung der Kohlesäule wird die ADP-Galactose mit Isopropanol:HpO!Ätznatron = 50:50:0,5 eluiert. Die Eluate werden vereinigt, mit Natronlauge auf pH 7,2 gestellt, konzentriert und das Na-SaIz der ADP-Galactose mit dem 10fachen Volumen Methanol gefällt.

Ausbeute:

6,5 bis 7 g (46 bis 50 # d. Theorie, bezogen auf AIiP-Morpholidat)

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1 Π 9 BA 3 / 1 9 2 5

Beispiel 4 '

Uridindiphosphatglucose (UDPG)

15»3 g Glucose-i-phosphat-calcium (G-1-P-Ca) werden in 500 ml Methanol suspendiert und durch Zusatz von konz. HCl gerade eben in Lösung gebracht»

10 g Uridin-S'-phosph/orsäure-Morpholidat in 200 ml Methanol gelöst werden der G-1-P-Ca-Losung bis zur beginnenden Trübung zugegeben. Der Rest des UMP-Mo wird langsam unter Rühren zugetröpft. Weitere Aufarbeitung des UDPG v/ie in Beispiel 4 beschrieben.

Ausbeute:

8 bis 9 g (56 bis. 64 # d. Theorie, bezogen auf UMP-Morpholidat).

Beispiel 5
UDPG

15*3 g G-I-P-Ca und 10 g ü-5-MP-Morphölidat werden in 100 ml dest. Wasser gelöst und mit 2 η Salzsäure auf pH 4,0 angesäuert. Ca. 200 ml Methanol werden bis zur beginnenden Trübung zugesetzt* Nach wenigen Minuten beginnt aus dieser Trübung eine starke Ausflockung. Nach 4 Stünden Reaktionszeit werden 200 ml Isopropanol tropfenwei&e unter leichtem Rühren innerhalb 15 Stunden zugetropft* Der ausgefallene Niederschlag wird eine Stunde später abgesaugt, in HgO gelöst und _/ wie unter Beispiel 4 beschrieben, chromatographiert und weiter aufgearbeitet»

Ausbeuteί

9 bis iö £ UDPG-Häg (62 bis 70 % d. Theorlie, bezogen auf eingesetztes UMP-Morphölidat)* '

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Beispiel 6
ÜDPG

1513 g G-1-P-Ca und 10 g U-5-MP-Piperidat werden in 100 ml dest. Wasser gelöst und wie in Beispiel 6 beschrieben mit SaIz-,säure angesäuert und weiter aufgearbeitet. Es wird die gleiche Ausbaute wie nach Beispiel 6 erhalten.

Auf gleichem Wege wurde unter Verwendung von Glucosaminphosphat bzw. N-Acotylglycosaminphosphat in Form der Calciumsalze ÜDP-Glucosamin und UDP-N-Acetylglycosamin hergestellt.

Beispiel 7
Adenosindiphosphat (ADP)

4,2 ml konz. Phosphorsäure werden in 200 ml Methanol gelöst, mit Morpholin bis pH 3,0 neutralisiert und auf 60⁰C erwärmt. 13g AMP-Morpholidat in 100 ml warmem Methanol von 60° gelöst, werden zugegeben (der pH-Wert steigt durch die Zugabe der neutralen AMP-Morpholidatlösung und v/ährend der Reaktion etwas an). Das Reaktionsgemisch wird 24 Stimden bei Raumtemperatur stehengelassen und danach auf ca. 50 ml konzentriert (Methanolentfernung) und wie in Beispiel 4 beschrieben über eine Säule mit 600 ml Anionenaustauscher Dowex 1x2 chromatographiert und aufgearbeitet.

Ausbeute:

9 g ADP-Na₂ (ca. 50 $ d. Theorie).

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Claims (10)

1. 2016043

   Patentansprüche

   '\) Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphaten oder ihren Estern durch Umsetzung eines Nucleosidmonophosphatamidates mit Phosphorsäure bzw. einem Phosphorsäureester, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel I

   -1
   X-O-PO₂-Am (I)

   in der X einen Nucleosidrest und Am einen Rest der Formel N_NTJ ,

   ■ -"-p

   worin E₁ und R₂, äie gleich oder verschieden sein können, je ein Wasserstoffatom oder einen niedrig-Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen bedeuten, wobei die Reste R^ und R₂ gegebenenfalls unter Einschluß eines weiteren Heteroatoms auch zu einem Ring verbunden sein können, mit einer Verbindung der allgemeinen Fonnel II .·

   O₃P²" - O - R, ; (II)

   in der R ein Wasserstoff atom oder den - <■■ Rest einer hydroxylgruppenhaltigen organischen Verbindung bedeutet, in einem Alkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einem Dialkylketon mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen je Alkylkette oder in Dimethylformamid bei pH-Werten zwischen 1 und 6,5, vorzugsweise zwischen 4 und 5» umsetzt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als lösungsmittel Methanol verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-V/ert mit einer Halogenwasserstoff saure eingestellt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der methanolischen Lösung Isopropanol zugesetzt wird.

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   -H-
5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei Zimmertemperatur oder mäßig erhöhter Temperatur gearbeitet wird.
6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der allgemeinen Formel II in Form eines Alkali- oder Erdalkalisalzes eingesetzt wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das CalciuQsalz verwendet wird.
8. 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung der allgemeinen Formel II ein Zuckerphosphat, Aminoalkoholphosphat oder Cholinphosphat verwendet wird.
9. 9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Nucleosidphosphorsäureamidat ein Morpholidat, Piporidab, Anisidat, Cyclohexylimidat oder Araidat verwendet wird.
10. 10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reaktionsgemisch HpO zugesetzt wird.

    I Π 9 H % j / 1 Ü 2 5