DE2014440C3 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5'-di- und -5'-triphosphaten - Google Patents

Description

OH OH

in der R die OH-Gruppe oder den Rest
O

Il

HO — P-O —

OH

bedeutet und B die Bedeutung von Purin, Pyrimidin oder deren Derivaten besitzt, durch Umsetzen eines reaktionsfähigen Nucleosid - 5' - monophosphorsäurederivats mit Phosphorsäure bzw. Pyrophosphorsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man das entsprechende Nucleosid-5'-phosphordichlorid oder -bromid mit 1 bis 10 Mol Phosphorsäure bzw. Pyrophosphorsäure und 1 bis 10 Mol eines organischen Amins pro Mol Nucleosid-5'-phosphordichlorid oder -bromid, wobei beide Komponenten auch in Form des organischen Aminsalzes eingesetzt werden können, in Nitromethan, Nitropropan, Nitrobenzol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Propionitril, Dichlormethan, Aceton, Acetophenon, Dimethylformamid, Trimethylphosphat oder Dimethylsulfoxid bei —20 bis +30⁰C umsetzt und das Reaktionsgemisch mit Wasser hydrolysiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nucleosid-S'-phosphordichlorid oder -bromid in Form eines Reaktionsgemisches, welches durch Phosphorylieren des entsprechenden Nucleosids mit Phosphoroxychlorid, -bromid oder Tetrachlorpyrophosphat erhalten worden ist, einsetzt.

sich Adenosin-5'-diphosphat und -5'-tripnosphat durch Umsetzen von Adenosin-5'-monophosphat in Pyridinlösungmit 85%iger Phosphorsäure Tnbutylamin und DCC herstellen. Gemäß A. R.Todd(J Chem Soc., 1949 S 582) läßt sich Adenosin-5 -diphosphat durch Umsetzen von Silberadenosin-5'-monophosphat mit Dibenzylphosphorchloridat herstellen; durch Umsetzen des erhaltenen Diphosphats nach derselben Reaktion läßt sich Adenosin-5'-triphosphat herstellen. Gemäß T W i e 1 a η d (Monatsh. Chem., 98, S. 1381 [1967]) läßt sich Adenosin-5'-diphosphat dürr¹: Behandeln von Tributylammoniumadenosin-i .nonoohosphat und Phosphorsäure mit Brom in Gegenwart eines Hydrochinonderivats herstellen; durch dieselbe Behandlung von Adenosin-5'-diphosphat erhält man danach das 5'-Triphosphat. Bei den bekannten Verfahren zum Herstellen von Nucleosid-5-di- und 5'-triphosphaten sind teure Reagenzien, wie Morpho-Hn und DCC, erforderlich, sie erfordern zum Teil mehrere schwierige Stufen, und die Ausbeuten sind gering Außerdem ist es nicht möglich, bei diesen bekannten Verfahren, das bei der Herstellung der Nucleosid-5'-monophosphate durch Phosphorylieren der entsprechenden Nucleoside erhaltene Reaktionsgemisch direkt als Ausgangsprodukt einzusetzen, vielmehr muß das Nucleosid-S'-monophosphat vorher isoliert und gereinigt werden. Diese Nachteile sowie die Notwendigkeit der Abtrennung von Nucleosid-S'-monophosphat als Zwischenprodukt machten die bekannten Verfahren unwirtschaftlich und für den technischen Maßstab ungeeignet.

Es wurde nun gefunden, daß man Nudeosid-5'-diphosphate und Nucleosid-S'-triphosphate der allgemeinen Formel

R_p_O—P—O—CH₂

ι 1

OH OH

OH OH

in der R die OH-Gruppe oder den Rest
O

HO — P-O —

Nucleosid-S'-di- und -5'-triphosphate eignen sich als Reagenzien für wissenschaftliche Untersuchungen und als pharmazeutische Substanzen. Die Erfindung schafft ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zum Herstellen dieser Verbindungen.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zum Herstellen von Nucleosid-5'-polyphosphat aus Nucleosid-S'-monophosphat bekannt. Beispielsweise läßt sich gemäß J. G. Moffatt (J. Amer. Chem. Soc, 87, S. 2265 [1965]) Adenosin-5'-triphosphat durch Umsetzen von Adenosin-5'-monophosphat mit Morpholin und Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und anschließendes Umsetzen des erhaltenen Adenosin-5'-monophosphormorpholidats mit Tetratributylanimoniumpyrophosphat herstellen. Gemäß H. G. K h or a na (J. Amer. Chem. Soc, 80, S. 1141 [1958]) läßt OH

bedeutet und B die Bedeutung von Purin, Pyrimidin oder deren Derivaten besitzt, in einfacher Weise und in hoher Ausbeute herstellen kann, indem man das entsprechende Nucleosid-5'-phosphordichlorid oder -bromid mit 1 bis 10 Mol Phosphorsäure bzw. Pyrophosphorsäure und 1 bis 10 Mol eines organischen Amins pro Mol Nucleosid-5'-phosphordichlorid oder -bromid, wobei beide Komponenten auch in Form des

organischen Aminsalzes eingesetzt werden können, in Nitromethan, Nitropropan, Nitrobenzol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Propionitril, Dichlormethan, Aceton, Acetophenon, Dimethylformamid, Trimethyiphosphat oder Dimethylsulfoxid bei —20 bis

+30⁰C umsetzt, und das Reaktionsgemisch mit Wasser hydrolysiert.

Das als Ausgangsmaterial bei dieser Erfindung angewendete Nucleosid-5'-phosphordihalogenid läßt sich

2 4

in einfacher Weise direkt aus dem ungeschützten direkte Phosphorylierung von ungeschütztem Nu-

Nucleosid durch Phosphorylieren der Hydroxygruppe cleosid als Ausgangsmaterial erhaltenen Reaktions-

in der 5'-Stellung mit Phosphoroxychlorid, -bromid gemisches ausgeführt werden.

oder Tetrachlorphyrophosphat und anschließendes Reines Nucleosid-5'-di- und -5'-triphosphat kann in Ausfällen aus der Reaktionsmischung durch Zusetzen 5 an sich bekannter Weise aus der bei dem erfindungseines nichtpolaren organischen Lösungsmittels, wie gemäßen Verfahren eihaltenen wäßrigen Hydrolyse-Äthyläther, herstellen. lösung hergestellt werden. Beispielsweise kann man

Setzt man nicht geschütztes Nucleosid mit Phosphor- reines Nucleosid-5'-di- und -5'-triphosphat in Form oxychlorid, -bromid oder Tetrachlorpyrophosphat, des Bariumsalzes aus dieser wäßrigen Lösung nach dem z.B. gemäß dem in den japanischen Offenlegungs- io Reinigen der Lösung mit Aktivkohle und einem Ionenschriften 12 676/67 und 11 464/68 beschriebenen Ver- austauschharz gewinnen.

fahren, um, so kann man das erhaltene Reaktions- Die Erfindung wird nun an Hand der folgenden Beigemisch, welches Nucleosid-5'-phosphordichlorid oder spiele weiter erläutert,
-bromid enthält, ohne weiteres als Ausgangsmaterial . .
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwenden, 15 B e 1 s ρ 1 e 1 1
ohne das 5'-Phosphordichlorid oder -bromid vorher 9,3 ml Tetrachlorpyrophosphat wurden zu 30 ml abzutrennen. Acetonitril zugegeben, und zu dem auf 0 bis 2° C ge-

Die erfindungsgemäße Umsetzung wird in einem haltenen Gemisch wurden unter Rühren 7,3 g

polaren organischen Lösungsmittel ausgeführt. Als ge- (30 mMol) Cytidin zugegeben. Nach etwa 30 Minuten

eignete Lösungsmittel wurden Nitromethan, Nitro- so dauernder Umsetzung (Bildung des Cytidin-5'-phos-

propan, Nitrobenzol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Aceto- phordichloridats in einer Ausbeute von 99%) wurde

nitril, Propionitril, Dichlormethan, Aceton, Aceto- das Cytidin-5'-phosphordichloridat durch Zusetzen

phenon, Dimethylformamid, Trialkylphosphat und von Äther ausgefällt und das Produkt nach Dekan-

Dimethylsulfoxid ermittelt. tieren der überstehenden Flüssigkeit erhalten. Der

Die erforderliche Menge an Phosphorsäure oder 25 Niederschlag wurde in 50 ml Dimethylformamid wie-Pyrophosphorsäure und organischem Aminsalz bei dem der aufgelöst, und zu dieser Lösung wurden 21,3 g erfindungsgemäßen Verfahren beträgt 1 bis 10 Mol, (39 mMol) Ditributylammoniumphosphat zugegeben, vorzugsweise 3 bis 8 Mol pro Mol Nucleosid-5'-phos- Nach 3stündiger Umsetzung bei 5°C wurde das phordichlorid oder -bromid, je nach der Art der letzt- Reaktionsprodukt in 200 ml Wasser gegossen und hygenannten Verbindungen und der Art des Lösungs- 30 drolysiert. Die erhaltene wäßiige Lösung des Cytidinmittels. Falls das durch direkte Phosphorylierung von 5'-triphosphats wurde durch eine mit etwa 1,5 1 Aktivungeschützten Nucleosid erhaltene Reaktionsgemisch kohle bepackte Kolonne geleitet, und die Kolonne als Ausgangsmaterial verwendet wird, hängt die anzu- wurde mit einer wäßrigen Methanol/Ammoniaklösung wendende Menge an Phosphorsäure oder Pyrophos- gewaschen und die Waschlösungen zur Trockne eingephorsäure und 01 ganischem Amin oder deren organi- 35 dampft. Der trockene Rückstand wurde erneut in schem Aminsalz von der Art und Menge des bei der Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde durch eine direkten Phosphorylierung des ungeschützten Nu- mit etwa 200 ml eines Anionenaustauschharzes (ChIocleosids angewendeten Phosphorylierungsmittels ab; ridtyp) beschickte Kolonne hindurchgeleitet. Nach dem dabei soll das darin enthaltene Nucleosid-S'-phosphor- Waschen der Kolonne mit einer wäßrigen 0,01 n-HCl/ dichlorid oder -bromid möglichst von Nebenprodukten 40 0,05m-NaCl-Lösung wurde Cytidin-S'-triphosphat mit frei sein. Als organische Amine wendet man Vorzugs- einer wäßrigen 0,01 n-HCl-/0,5m-NaCl-Lösung eluiert. weise tertiäre Amine, wie Pyridin, Picolin, Tiiäthyl- Das gesamte Eluat wurde durch Eindampfen eingeengt amin oder Tributylamin, an. und mit 56,3 g Bariumchlorid versetzt, mit wäßriger

Durch die Anwesenheit eines organischen Amins Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und

wird eine vorteilhafte Wirkung auf den glatten Verlauf 45 über Nacht in einem kalten Raum stehengelassen. Die

der Umsetzung des Nucieosid-S'-phosphordichloiids hierbei ausgeschiedenen Kristalle wurden abfiltriert

oder -bromids mit Phosphorsäure oder Pyrophosphor- und über Phosphorpentoxid getrocknet. Dabei wurden

säure erzielt, wobei im Verlauf der Umsetzung freige- 15,4 g kristallines Batiumcytidin-S'-triphosphat mit

setzter Chlor- oder Bromwasserstoff als organisches einer Reinheit von 97,8% erhalten.

Aminhydrochlorid oder -bromid gebunden wird. I nsbe- 50

sondere ist der Zusatz eines organischen Amins nach Beispiel 2
dem Zusatz der Phosphorsäure oder Pyrophosphor-

säure zu dem Nucleosid - 5' - phosphordihalogenid 7,8 g (20 mMol) Adenosin-5'-phosphordichloridat

äußerst wirksam. wurden in etwa 40 ml Dimethylformamid aufgelöst;

Die erfindungsgemäße Umsetzung wird bei einer 55 zu der auf 5"C gehaltenen Lösung wurden unter

Temperatur zwischen —20 und +30⁰C, vorzugsweise Rühren 54,8 g (100 mMol) Ditributylammoniumpyro-

— 10 bis 1 20°C, ausgeführt. Bei höheren Tempe- phosphat zugegeben. Die Reaktion wurde dann

raturen treten Nebenreaktionen und damit eine Ver- 2 Stunden lang fortgesetzt, und das Reaktionsprodukt

ringerung der Ausbeuten an dem gewünschten Nu- wurde in etwa 200 ml Eiswasser gegossen. Nach Be-

cleosid-5'-di- oder -5'-triphosphat ein, und ferner wird 60 endigung der Hydrolyse wurde die Lösung auf gleiche

die Reinigung des erhaltenen Produkts erschwert. Weise wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet. Dabei wurden

Bei niedrigeren Temperaturen verringeit sich die 11,2 g Bariumadenosin-5'-triphosphat mit einer Rein-

Reaktionsgeschwindigkeit in unerwünschter Weise, heit von 97% erhalten,

wenn auch sonst keine anderen Nachteile entstehen. .

Die technische Herstellung von Nucleosid-5'-diphos- 65 B e 1 s ρ 1 e I 3

phat oder Nucleosid-S'-triphosphat gemäß dem erfin- 7,2 g (20 mMol) Uridin-5'-phosphordichloridat wur-

dungsgemäßen Verfahren kann äußerst wirtschaftlich den in 20 ml Acetonitril aufgelöst und mit 9,8 g

und in hoher Ausbeute unter Verwendung des durch (100 mMol) in 30 ml Acetonitril aufgelöster Ortho-

<t

phosphorsäure versetz, Zu dem ^^ gehaltenen ^ggSJS^J^JS^

Gemisch wurden tropfenweise 11,9 ml (50 mMol) Tn- *™™*undTo hydrolysiert. Die erhaltene wäßrige

butylamin zugegeben; die Reaktion wurde 3 Stunden gf°^^{n u}™;°_auf ^y _Ie4_e Weise wie in Beispiel 1

bei Zimmertemperatur fortgesetzt. Das Reaküonsge- Losung^ wurdeam g kristallines

misch wurde in 250 ml Eiswasser gegossen und so hy- .·. J«*™™n^triphosphat in einer Reinheit von

drolysiert. Die erhaltene Lösung wurde auf gleiche Banumadenosin d in_{P F}

Weise wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, mit der Aus- 96,5 /_o ernaiten.

nähme, daß das beladene Anionenaustauschharz mit B e i s ρ i e 1 7

einer wäßrigen 0,005 n-HCl/0,025m-NaCl-Lösung aus- Pyrophosphorsäure wurden zu einer

gewaschen und als Eluierungsmittel eine wäßrige >u 4g (22 mMcα) ζ^νΓ°Ρ™ » „_{6 M} ,. _{y jd}

aOlu-HClAOSm-NaCl-Lösung angewendet wurden. gerührten Losung von 5* g ^{™ ^g^",*

Dabei wu/den 8,5 g kristallines Uridin-5'-diphos_Phat ^Phordjchlondat in ^a^n^D.oxan^on

mit einer Reinheit von 96,5 % erhalten. _trOpf_eaw3e 5,0 g (63 mMol) Pyridin zugegeben. Nach

B e i s ρ i e 1 4 _>5 etwa lOstündiger Umsetzungsdauer wurde das Reak-

12 g (42 mMol) Tributylammoniumphosphat wur- *»*?%* » f"[^ **iS^sung ^S au"f

den unter Rühren zu einer Lösung von 8 g (20 mMol) drolysiert. Die ^lf^^^^^J^^

Guanosin-S'-phosphordichloridat in 20 ml Dimethyl- gleiche Weise wie f .^P™_aJ.^Sü ™J~rShosnhai

sulfoxid von0bis2^oCzugegeben. Nachdem die Reak- wurden J8g^knstalhnes BanumunJ η 5 tr.phosphat

tion 6 Stunden fortgeschritten war, wurde das Reak- »o in einer Reinheit von 94,8_/o erhalten,

tionsprodukt auf gleiche Weise wie in Beispiel 3 weiter- Beispiel 8

verarbeitet. Dabei wurden 9,7 g Bariumguanosin-S'-di- _(20mMol) Adenosin wurden zu einem ge-

phosphat in einer Reinheit von 94,8 % erhalten. ^g gümJVi ^ _g ^ _{Phosphoroxychlori}d, 20 ml

B e i s ρ i e 1 5 _a5 Acetonitril, 0,88 ml Wasser und 7,8 ml Pyridin von

phordicUoridat ₂ugeget»n, und die Reaktion wurde pyiophosphat in 50 ml Dunelhyffomam

!stunden lang tortiesem. Da₅ Reaküonsgemiseh 3= und te!Ro*üon wurde weiten^2 Stunden

phosphat in einer Reinheit von 95,6% erhalten. 35 j^™¹^^ Bariumadenosin-S'-triphos-

Beispiel 6 phat in einer Reinheit von 96,5 % erhalten. Das An-

9,5 g (2OmMoI) in 50 ml Dimethylsulfoxid aufge- ionenaustauschharz wurde nach der Eluierung des

löstes Adenosin-5'.phosphordibromidat wurden unter Adenosin-S'-triphosphats mit wäßriger ln-Salzsaure

Rühren mit 20 g (112 mMol) Pyrophosphorsäure bei ₄o gewaschen, wobei Waschlosungen mi.einem Gehalt

einer Temperatur von 5°C vermischt Zu dem Gemisch von 1,8 g Ad«»^5'.po!yphc^to (4 bis 5 Wfol Phos-

wurde tropfenweise 13 g (108 mMol) Ν,Ν-Dimethyl- phorsäure pro Mol Adenosin) erhalten wurden.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5'-di- und -5'-triphosphaten der allgemeinen Formel

O O

I! I!

R—P—O—P—O—CH_a

I I

OH OH

10