DE1645979C3

DE1645979C3 - Verfahren zur Herstellung von Ribonucleosid-5'-monophosphatea

Info

Publication number: DE1645979C3
Application number: DE1645979A
Authority: DE
Inventors: Naohito Tokio Kameyama; Masakazu Saitama Kurihara; Saburo Tokio Senoh; Tuneo Miyazaki Sowa; Shunji Ouchi Hiraku Yamada
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1966-07-14
Filing date: 1967-06-19
Publication date: 1974-10-03
Also published as: DE1645979B2; IT1006508B; US3475409A; NL6708049A; NL150803B; DE1645979A1; GB1176930A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Ribonucleosid-S'-monophosphaten der allgemeinen Formel

HO	O Ν	B
	\ Il P-	\ /
HO		DH



-Ο—CH₂ O


/ ^x
OH C

in der B den Rest einer Purin- oder einer Pyrimidinbase bedeutet, durch selektive Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des entsprechenden, in 2'- und 3'-Stellung ungeschützten Ribonucleosids.

Ir

Es sind bereits Versuche bekanntgeworden, ungeschütztes Nucleosid zu phosphorylieren; beispielsweise haben Gulland und Hobday die Reaktion von Guanosin mit Phospboroxychlorid in Pyridin untersucht (vgl Journal of Chemical Society, 1940, S. 746 bis 752); Barker und Foil haben ähnliche Untersuchungen am Adenosin durchgeführt (vgl Journal of Chemical Society 1957, S. 3798 bis 3800).

ro Die Tatsache, daß die Phosphorylierung von ungeschütztem Nucleosid weder industriell noch im Laboratoriurasmaßstab angewendet wird, dürfte auf die folgenden beiden Grunde zurückzuführen sein: Unter den bekannten Reaktionsbedingungen ist ungescbütztes Nucleosid einer Phosphorylierungsrcakuion weniger zugänglich als geschütztes Nucleosid; die Umwandlungsgeschwindigkeit der Reaktion ist gering; außerdem führt die Phosphorylierung von ungeschütztem Nucleosid unter anderem zu 2'- und 3'-Monophosphaten, 3' (oder 2'), 5'-Dipho5phat und Dinucleosidphosphat als Nebenprodukte statt zu dem gewünschten 5'-Monophosphat und besitzt somit nur eine geringe Selektivität.

Um das gewünschte 5'-Monophosphat zu erhalten, hat man bisher ein Verfahren angewendet, das sich etwa durch die folgende chemische Gleichung wiedergeben läßt:

in der B die angegebene Bedeutung hat, in einem Reaktionsgemisch, das auf 1 Mol des Ribonucleosids 0,2 bis 3 1 Nitromethan, Nitroäthan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Propionitril oder Dichlormethan, 2 bis 12 Mol Phosphoroxychlorid, 2 bis 6 Mol Wasser und 1,5 bis 10 Mol Pyridin, Picolin, Lutidin oder Collidin enthält, bei einer Reaktionstemperatur von —30 bis +30⁰C umsetzt, das Reaktionsgemisch gründlieh mit Wasser vermischt und nach Ablauf der Hydrolysereaktion das 5'-Monophosphat isoliert. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man weniger als die äquimolare Menge Wasser, bezogen auf das Phosphoroxychlorid, verwendet.

HOCH₂ O B
\

OH OH
HOCH, O B

O O

(Π)

R R

HO O

POCH₂ O B
HO

O O

60

(HI)

R R
HO O

P-O-CH₂ O B
HO

(IV)

OH OH

1 64S979

wobei B eine Purin- oder eine Pyrimidinbase und R eine Alkyl-, eine Arylgruppe oder ein WasserstolT-atora bedeutet.

Bei den oben erläuterten Reaktionen entspricht die Reaktion II einer Addition von schutzenden Gruppen, z. B. von Aceton an die Hydroxylgruppen in der 2'- oder ^'-Stellung, während die Reaktion III die Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe und die Reaktion IV die Hydrolyse der schützenden Gruppen darstellt.

Beispiele für diese bekannten Verfahren, bei denen vor der Phosphorylierung der 5'-HydroxyIgruppe in Rjbonucleosiden die T- und 3'-HydroxyIgruppen geschützt werden, geben die französischen Patentschriften 1434511 und 14.18 186. Bei diesen bekannten Verfahren wird in einem Fall das Nucleosid zum Schutz der sekundären Hydroxylgruppen mit Aceton, im anderen Fall unter Komplexbildung mit Metaborsäure umgesetzt. In einer weiteren Stufe wird dann erst die Phosphorylierung der S'-Hydroxvlpruppe und anschließend das Abspalten der schützenden Gruppen vorgenommen.

Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Herstellen von RmonucIeosid-5'-monophosphaten der allgemeiner. Formel

HO O

P-O-CH, 0

HO

OH UH

in der B den Rest einer Purin- oder einer Pyrimidinbase bedeutet, durch selektive Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des entsprechenden in 2'- und 3'-Stellung ungeschützten Ribonucleosids zugänglich zu machen, das in einfacher und wirtschaftlicher Weise durchgeführt werden kann und zu hohen Ausbeuten des Ribonucleosid-S'-monophosphats führt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ribonucleosid der allgemeinen Formel

HO-CH₂ O B

H [ IH

OH OH

in der B die angegebene Bedeutung hat. in einem Reaktionsgemisch, das auf I MoI des Ribonucleosids 0,2 bis 31 Nitromethan. Nitroäthan. Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril. Propionitril oder Dichlormethan, 2 bis 12 Mol Phosphoroxychlorid. 2 bis 6 Mol Wasser und 1,5 bis 10 Mol Pyridin, Picolin, Lutidin, oder Collidin enthält, bei einer Reaktionstemperatur von —30 bis +30⁰C umsetzt, das Reak tionsgemisch gründlich mit Wasser vermischt und nach Ablauf der Hydrolysereaktion das 5'-Monophosphat isoliert.

Es ist offensichtlich, daß die bekannten Verfahren, bei denen geschützte Ribonucleoside eingesetzt werden, auch dann, wenn ohne Isolieren der Zwischenprodukte gearbeitet wird, komplizierter sind als die erfindungsgemäße selektive Phosphorylierung, da die in dem vorstehenden Formelschema gezeigten Reaktionen II und IV durchgeführt werden müssen.

Andererseits werden nach dem zitierten Verfahren von B a r k e r und Foil 5'-, 3'- und 2'-Monophosphate in einem Verhältnis von 6:3:1 erhalten, und die Ausbeute an 5'-Monophosphat beträgt nur 6%, bezogen auf das Ausgangsnucleosid. Demgegenüber

ίο beträgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Umwandlungsrate des Nucleosids nahezu 100% und die Selektivität der 5'-Phosphorylierung überschreitet immer 90%. Das erfindungsgemäße Verfahren kann im einzelnen wie folgt näher erläutert werden.

Zunächst werden innerhalb der angegebenen Grenzwerte liegende Mengen eines der angegebenen polaren organischen Lösungsmittel, nämlich Nitromethan, Nitroäthan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Propionitril oder Dichlormethan. Phosphoroxychlorid. Wasser und eines der angegebenen cyclischen tertiiiren Amine, nämlich Pyridin. Piccolin. Lutidin oder Collidin. miteinander vermischt: zu dem entstandenen Gemisch, das bei einer Temperatur innerhalb des angegebenen Bereichs gehalten wird, wird das Ribonucleosid unter Rühren gegeben.

Die Reaktionsmischung, die anfangs eine Suspension bildet, geht mit fortschreitender Reaktion allmählich in eine klare Lösung über. Das entstandene Reaktionsgemisch wird in eine große Menge kaltes

}o Wasser oder auf Eiswasser gegossen, um eine wäßrige Lösung zu erhalten. Anschließend kann das Reaktionsgemisch mit den üblichen Methoden zum Abtrennen und Reinigen von Nucleosiden behandelt werden, z. B. unter Verwendung von Tierkohle und lonenaustauscherharzen. wobei man Ribonucleosid-5'-monophosphat erhält.

Bei der Durchfuhrung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind das Mischungsverhältnis der Bestandteile des Reaktionsgemisches sowie die Auswahl der oben angegebenen organischen Lösungsmittel und tertiären Aminen außerordentlich wichtig.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden polaren organischen Lösungsmittel sind Lösungsmittel mit einer hohen Dielektrizitätskonstante. Unter den angegebenen Substanzen werden Nitromethan und Acetonitril besonder; bevorzugt.

Die Menge dieser Lösungsmittel bei dem erfindungsgemäßen Verfahren hängt von der Art des Lösungsmittels und dem Ausgangsnucleosid und ferner von den Mengen an Phosphoroxychlorid, organischer Base und Wasser a'o. Die zu verwendenden Mengen liegen im Bereich von 0,2 bis 3 I pro Mol Ausgangsnucleosid. Die Verwendung dieser Lösungsmittel in einer Menge von weniger als 0.2 I pro Mol Nucleosid verursacht wegen der hohen Viskosität des Reaktionsgemisches unbequeme Arbeitsbedingungen, während bei Verwendung von mehr als 3 1 pro Mol Nucleosid die Menge an Phosphoroxychlorid und organischer Base erhöht werden müßte, was vom wirtschaftlichen Standpunkt aus unerwünscht ist. Diese organischen Lösungsmittel können einzeln oder als Gemisch von zwei oder mehreren Lösungsmitteln verwendet werden. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Menge an Phosphoroxychlorid steht in enger Beziehung zu der Art und Menge des organischen Lösungsmittels und den Mengen an cyclischen) tertiärem Amin sowie Wasser. Die anzuwendende Menge an Phosphoroxychlorid beträgt 2 bis

5 ^T 6

12 Mol pro Mol Ausgangsnucleosid. Die Verwen- im Bereich von -30 bis +30"C. Bei höheren Temdung von Phosphoroxychlorid in geringeren Mengen peraturen findet eine zu starke Zersetzungsreaktion als 2 Mol pro Mol Nucleosid ergibt eine sehr niedrige statt, die das Verfahren uninteressant macht, während Urawandlungsrate für die Reaktion, während anderer- bei niedrigeren Temperaturen die Reaktionsgeschwinseits die Verwendung von mehr als 12 Mol zu einer 5 digkeit sehr gering wird und eine zu lange Reaktionsallraählicben Abnahme der Umwandlungsgescbwin- dauer benötigt wird. Unter Berücksichtigung der verdigkeit der Reaktion und der Selektivität der 5'-Phos- schiedenen oben beschriebenen Reaktionsbedingunpnorylierung führt. Die bei dem erfindungsgemäßen gen beträgt die erforderliche Reaktionszeit gewöbn-Verfahren verwendeten cyclischen tertiären Amine lieb 30 Minuten bis 10 Stunden,
beeinflussen stark die Urawandlungsgescbwindigkeit io Obwohl die Reaktionstemperatur und -dauer einen und Selektivität der Reaktion. Als geeignete cyclische gewissen Einfluß auf das Aussehen des Reaktionstertiäre Amine wurden Pyridin, Picolin, Lutidin, gemisches und die Selektivität der 5'-Pbosphory-Collidin ermittelt. Die Verwendung von primären, lierung haben, sind sie nicht von so großer Bedeusekundären Ammen und aliphatischen tertiären Ami- tung wie die Mengen des Ausgangsmaterials,
nen ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht 15 Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der ratsam. Erfindung.

Die angegebenen cyclischen tertiären Amine wer- B e i s d i e 1 1
den in einer Menge von 1,5 bis IO Mol pro Mol

Nucleosid verwendet. Ein geringerer Überschuß an Zu einem Lösungsgemisch, enthaltend 20 ml Aceto-

cyclischem tertiärem Amin über eine äquimolare 20 nitril, H ml (0,087 MoI) Phosphoroxychlorid. 1 ml

Menge pro Mol Ausgangsnuclensid führt gewöhn- (0,056 Mol) Wasser und 7,9 m' (0,098 Mol) Pyridin.

Hch zu einem mäßig befriedigenden Ergebnis. das bei 0 bis 20' C gehalten wu^de, wurden 5.4 g

Die Verwendung von weniger als einer aquimolaren (0,022 Mol) Inosin unter Rühren gegeben. Nach

Menge Führt zu einer merklichen Verzögerung der 4stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch in

Reaktionsgeschwindigkeit und Verringerung der Aus- 25 etwa 5ÖÖ ml kaltes Wasser gegossen und das Rühren

beute an 5'-Nucleotid, während eine Menge von über etw;> 1 Stunde bei 0 bis 5^CC fortgesetzt.

10 Mol nicht nur vom wirtschaftlichen Standpunkt Die entstandene wäßrige Lösung wurde mit einer

aus erwünscht ist, sondern auch die Selektivität der wäßrigen Lösung von Natriumhydroxyd versetzt.

5'-Phosphorylierung ungünstig beeinflußt. Die cycli- um den pH-Wert des entstehenden Gemisches auf

sehen tertiären Amine werden einzeln oder als Mi- 30 etwa 1 einzustellen; es enthielt 99% Phosphatver-

schung verwendet. bindungen und 96% Inosin-5'-monophosphat. Dann

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu ver- ließ man die Mischung durch eine Kolonne laufen, wendende Wassermenge steht in enger Beziehung zu die 50 g Aktivkohle enthielt, wobei Inosinsäure adsorder Menge an Phosphoroxychlorid und organischer biert wurde. Nachdem die Säule mit wäßriger Base; innerhalb des genannten Mengenbereiches der 35 0.1 η-Salzsäure und einer kleinen Menge Wasser ausbeiden Bestandteile beträgt die Wassermenge 2 bis gewaschen war. wurde der Inhalt mit einem Lösungs-6 Mol pro Mol Ausgangsnucleosid. Wenn mehr als gemisch von 3% Ammoniak und 10% Methanol in 6 Mol Wasser verwendet werden, werden die uner- Wasser eluiert und das entstandene Eluat unter verwünschten Nebenreaktionen unterstützt und die mindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde Menge an Purinbase und anderer Nebenprodukte 40 in einer kleinen Menge Wasser gelöst, die Lösung erhöht. Wenn die Wassermenge ungewöhnlich gering wurde durch eine Kolonne geschickt, die etwa 20 ml ist im Vergleich zur optimalen Menge so läuft das eines Ionenaustauschers in der Η-Form enthielt, und Verfahren nicht immer reproduzierbar, und gleich- die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen. Die abzeitig wird die Ausbeute an 5'-Nucleotid herabgesetzt. fließende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeiten wur-Innerhalb der angegebenen Mengenbereiche ist eine 45 den mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxyd geringere Wassermenge als die äquimolare Menge. auf einen pH-Wert von 7,7 eingestellt. Die Mischung bezogen auf Phosphoroxychlorid. vorzuziehen. wurde unter vermindertem Druck bis zu einem Sirup

Es besteht keine besondere Beschränkung hinsieht- konzentriert. Nachdem man die konzentrierte Lö-

lich der Art und We'se, wie Wasser zugegeben wird. sung über Nacht in einem Eisbehälter stehenließ, bil-

jedoch sind Zugabemethoden, welche eine sofortige 50 deten sich Kristalle, die abfiltriert und bei 11OC

Reaktion von Wasser mit Phosphoroxychlorid ver- unter verringertem Druck getrocknet wurden; man

Ursachen, z. B. die Zugabe eines Gemisches von ter- erhielt 7,1 g Dinptriuminosin-5'-monophosphat in

tiärem cyclischem Amin und Wasser zu Phosphor- 98%iger Reinheit. Ferner wurde durch Zugeben von

oxychlorid, nicht ratsam. Alkohol und Stehenlassen der Mischung eine kleine

Auch die Reaktionstemperatur und -dauer sind 55 Menge Natriuminosinat aus dem Fil'rat erhalten,

wichtige Bedingungen für die Reaktion, wenn befrie- _R . 17

digende Ergebnisse erzielt werden sollen. Bei dem ρ e 1 s ρ 1 e I

erfindungsgemäßen Verfahren wird ähnlich wie bei Das Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abwei-

anderen ehemischen Reaktionen die Reaktionsgc- ehung, daß 10 ml (0,102 Mol) «-Picolin an Stelle von

schwindigkeit mit steigender Temperatur erhöht und 60 Pyridin verwendet wurden. Man erhielt 7,2 g Na-

mit fallender Temperatur verringert. Bei der Phos- triuminosinat in 95%iger Reinheit,

phorylierung von Nucleosid mit Phosphoroxychlorid _R . ■ 1 -s

sollte man berücksichtigen, daß beim überschreiten Beispiel

der optimalen 1 emperatur die Zersetzung des Aus- Zu einem Lösungsgemisch, bestehend aus 20 ml

gangsnucleosids unri des gebildeten Nucleotids merk- 6s Acetonitril mit einem Gehalt von 10% Propionitril.

lieh wird. Die Temperatur bei dem erfindungsgemäßen 8 ml (0,087 Mol) Phosphoroxychlorid, 1 ml (0,056 Mol)

Verfahren sollte in Verbindung mit der Menge an Wasser und 8 ml (0,082 Mol) «-Picolin, wurden bei

organischer Base bestimmt werden, sie liegt jedoch 0 bis 5^C 5,4 g (0,022 Mol) Inosin unter Rühren ge-

geben; die Reaktion wurde 5 Stunden lang fortgesetzt. Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurden 7,1 g Natriuminosinat mit 97%iger Reinheit erhalten.

Beispiel 4

Zu einem Lösungsgemisch, enthaltend 60 ml Nitromclhan 24 ml (0,262 Mol) Phosphoroxychlorid. 2.6 ml (0,144 Mol) Wasser und 23,7 ml (0.294 Mol) Pyridin. das bei etwa 5° C gehalten wurde, wurden 17 g (0,060 Mol) Guanosin unter Rühren gegeben. Nachdem man die Reaktion 5 Stunden lang laufen ließ. wurde das Reaktionsgemisch in etwa 2 1 kaltes Wasser gegossen und etwa 1,5 Stunden lang gerührt. Dann ließ man es stehen.

Die entstandene wäßrige Lösung, die 2% Guanosin, 1% Guanin, 92% Guanosin-5'-monophosphat und 5% andere Phosphate enthielt, ließ man durch eine Kolonne laufen, die 150 g Aktivkohle enthielt, und dann wurde mit Wasser gewaschen. Die Kolonne wurde dann mit 2,5 1 0,25 η-wäßrigem Natriumhydroxyd eluiert. Das Eluat ließ man anschließend durch eine Kolonne mit etwa 50 ml eines Ionenaustauschers in der Η-Form laufen; die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen. Die abfließende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt, dann wurde mit Natriumhydroxyd der pH-Wert der entstandenen Mischung auf 7,6 eingestellt; die Mischung wurde unter verringertem Druck konzentriert, wobei man etwa 100 ml konzentrierte Lösung erhielt. Die entstandene konzentrierte Lösung wurde mit 300 ml Methanol versetzt; man ließ sie über Nacht in einem Kühlschrank stehen. Die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet; man erhielt 20.6 g Dinatriumguanosin-5'-monophosphat, enthaltend 97% 5'-Guanylat und 1% andere Phosphate.

Beispiel 5

Zu einem Lösungsgemisch, bestehend aus 60 ml Acetonitril, 24 ml (0,262 Mol) Phosphoroxychlorid. 2,6 ml (0,144 Mol) Wasser und 24 ml eines Gemisches, enthaltend η-, β-, /-Picolin und 2,6-Lutidin in einem Verhältnis von 7:1:1:1 (etwa 0,238 Mol Picolin und Lutidin), das bei 0 bis 2° C gehalten wurde, wurden 17 g (0,060 Mol) Guanosin gegeben, worauf man die Reaktion etwa 6 Stunden laufen ließ. Nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhielt man 19,5 g Natriumguanylat, enthaltend 96% Guanosin-5'-monophosphat und 2% andere Phosphate.

Beispiel 6

Das Beispiel 4 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß Acetonitril und 16g (0,061 Mol) Adenosin an Stelle von Nitromethan bzw. Guanosin verwendet wurden. Als Ergebnis wurden 20 g Natriumadenylat mit einem Gehalt von 95% Adenosin-S'-monophosphat und 2% anderen Nebenprodukten erhalten.

_|0 B e i s ρ i e I 7

Zu einem Lösungsgemisch, enthaltend 20 ml Dichlormethan, 10 ml (0,109 Mol) Phosphoroxychlorid, 1,2 ml (0,067 Mol) Wasser, 9,5 ml (0,117MoI) Pyridin, das bei 5 bis TC gehalten wurde, wurden 5,4 g (0,022 Mol) Inosin unter Rühren gegeben, und man ließ die Reaktion 4 Stunden lang laufen. Beim Arbeiten nach Beispiel 1 wurden 6,8 g Natriuminosinat mit einem Gehalt von 90% 5'-Monophosphat und 3% anderen Phosphaten erhalten.

Beispiel 8

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 5,7 g (0,020 Mol) Xanthosin an Stelle von Inosin verwendet wurden. Man erhielt 6,6 g reines Natriumxanthosin-S'-monophosphat.

Beispiel 9

Zu e· item Lösungsgemisch, enthaltend 20 ml Acetonitril, 8 ml (0,087 Mol) Phosphoroxychlorid und 7,9 ml (0,098 Mol) Pyridin, das bei 0 bis 2" C gehalten wurde, wurden 5,8 g (0,019 Mol) Inoskidihydrat (0,038 Mol K ristall wasser) gegeben. Beim Arbeiten nach Beispiel 1 wurden 6,0 g 5'-Inosinat mit einer Reinheit von 90% erhalten.

Beispiel 10

Zu 15 ml Acetonitril wurden 6 ml (0,66 Mol) Phosphoroxychlorid. 0,72 ml (0,040MoI) Wasser und 7,2 ml (0,074 Mol) «-Picolin gegeben. Zu dem entstandenen Gemisch, das bei 0 bis 2° C gehalten wurde, wurden 3,7 g (0,015 Mol) Cytidin unter Rühren gegeben. Beim Arbeiten nach Beispiel 1 wurden 5,0 g Dinatriumcytidin-5'-phosphat in 99%iger Reinheit

. erhalten.

Beispiel 11

Beispiel 10 wurde wiederholt, wobei jedoch 3.7 g (0,015 Mol) Uridin an Stelle von Cytidin verwendet wurden. Man erhielt 5,1 g Dinatriumuridirl-5'-phosphat in 97%iger Reinheit.

409640/60

Claims

64i979

Patentansprüche:

I. Verfahren zum Herstellen von Ribonucleosid-5-monophospbaten der allgemeinen Formel

HO O

\ll

P-O-CH₂ ,0

HO

OH OH

in der B den Rest einer Purin- oder einer Pyri- midinbase bedeutet, durch selektive Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des entsprechenden, in T- und 3'-Stellung ungeschützten Ribonucleosids, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ribonucleosid der allgemeinen Formel

HO-CH₂ O B

HI IH

OH OH