DE1645984B2

DE1645984B2 - Verfahren zur Herstellung von 51-Ribofuranosyl-, 5"-Arabinofuranosyl- und o'-Glucopyranosyl-Nucleotiden

Info

Publication number: DE1645984B2
Application number: DE1645984A
Authority: DE
Inventors: Shunji Ouchi; Saburo Senoh; Tuneo Sowa; Kozo Tunoda
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1966-07-14
Filing date: 1967-07-11
Publication date: 1974-04-11
Also published as: DE1645984A1; GB1151948A; US3464973A; NL6709812A; DE1645984C3; NL141192B

Description

Wasser vermischt und das erhaltene Nucleotid in üblicher Weise isoliert.

chlormethan, oder deren Gemischen als Lösungs- 20 bekannten Verfahren sind jedoch der Umsatz und die mittel bei einer Temperatur von —30 bis +30⁰C Selektivität der Reaktion so unbefriedigend gering, umsetzt, das entstandene Reaktiorisgemisch mit daß sie keine praktische Bedeutung erlangt haben.

Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur direkten und selektiven Phosphorylierung der primären Hydroxygruppe eines ungeschützte Hydroxygruppen enthaltenden

— Nucleosids zugänglich zu machen, das sich nicht nur

in einfacher und verfahrenstechnisch vorteilhafter Weise durchführen läßt, sondern auch zu besseren

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung 30 Ausbeuten führt als vergleichbare bekannte Verfahren, von 5'-Ribofuranosyl-, S'-Arabinofuranosyl- und
6'-Glucopyranosyl-Nucleotiden, die den Adenin-,
Guanin-, Hypoxanthin-, Xanthin-, Cytosin- oder
Uracilrest als Base enthalten, durch selektive Phosphorylierung der entsprechenden Nucleoside an der pri- 35 Cytosin- oder Uracilrest als Base enthalten, durch mären Hydroxygruppe mit einem Phosphoroxyhalo- selektive Phosphorylierung der entsprechenden Nugenid in Gegenwart eines cyclischen tertiären Amins. cleoside an der primären Hydroxygruppe mit einem

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribofuranosyl-, 5'-Arabinofuranosyl- und o'-Glucopyranosyl-Nucleotiden, die den Adenin-, Guanin-, Hypoxanthin-, Xanthin-,

Zur Phosphorylierung einer primären Hydroxygruppe eines Nucleosids hat man es bisher meist für erforderlich gehalten, die sekundären Hydroxygruppen des Nucleosids mit Hilfe geeigneter Gruppen zu schützen.

Dabei ist die Durchführung folgender drei Reaktionen erforderlich:

45

1. Herstellung von 2',3'-O-geschütztem Ribonucleosid,

2. Herstellung von 2',3'-O-geschütztem Ribonucleosid-5'-phosphat,

3. Abspaltung der Schutzgruppen in 2',3'-Stellung.

Ein Beispiel für dieses bekannte Verfahren gibt die französische Patentschrift 1 417 811, gemäß der als Schutzgruppe die Isopropylidengruppe verwendet wird, die in der letzten Verfahrensstufe durch Erhitzen in saurer Lösung wieder entfernt wird.

Es ist zwar bekannt, diese drei Reaktionen einstufig ohne Isolierung von Zwischenprodukten, durchzuführen (vergleiche z. B. J. Am. Chem. Soc, Bd. 83; Phosphoroxyhalogenid in Gegenwart eines cyclischen tertiären Amins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Nucleosid mit einem Gemisch, das aus 1 bis 4 Mol Ameisensäure oder bis zu 50 % Wasser enthaltender Ameisensäure, wobei 1 Mol Wasser einem Mol Ameisensäure gleichzusetzen ist, 2 bis 8 Mol Phosphoroxychlorid oder -bromid und 2 bis 8 Mol cyclischem tertiärem Amin besteht, in Gegenwart von Acetonitril, Nitromethan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dichlormethan, oder deren Gemischen als Lösungsmittel bei einer Temperatur von —30 bis +30⁰C umsetzt, das entstandene Reaktionsgemisch mit Wasser vermischt und das erhaltene Nucleotid in üblicher Weise isoliert.

Es wird angenommen, daß bei. dem erfindungsgemäßen Verfahren sich das ungeschützte Nucleosid mit einem Komplex umsetzt, der durch Reaktion der Bestandteile des im Reaktionsmedium vorliegenden Gemisches aus Phosphoroxychlorid oder -bromid, Ameisensäure oder wäßriger Ameisensäure und dem cyclischen tertiären Amin gebildet wird.

Das Mischungsverhältnis dieser drei Komponenten

S. 3640 [1961], die französischen Patentschriften 60 ist für das erfindungsgemäße Verfahren von Bedeutung.

511 und 1428186). Gemäß der französischen Patentschrift 1 434 511 werden zunächst die T- und •die 3'-Hydroxygruppen des Nucleosids in Gegenwart von Phosphoroxychlorid in einem Lösungsmittel in die Isopropylidengruppe übergeführt; dann wird Pyridin zu dem Reaktionsgemisch gegeben und, ohne das 2',3'-O-Isopropylidennucleosid vorher zu isolieren, die 5'-Hydroxygruppe phosphoryliert und anschließend

Phosphoroxychlorid oder -bromid, Ameisensäure oder 50 %ige wäßrige Ameisensäure und cyclisches tertiäres Amin werden in einem Molverhältnis von 2 bis 8: bis 4: 2 bis 8, vorzugsweise in einem Molverhältnis von 2:1:2 vermischt. Die Abweichung von den genannten Mischungsverhältnissen führt nur zu unbefriedigenden Ergebnissen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die

3 4

Phosphorylierung in Gegenwart von Ameisensäure gehalten wird, wird unter Rühren mit 10,7 g Inosin

durchgeführt. Andere Säuren liefern keine befriedigen- versetzt.

den Ergebnisse, da sie zu Nebenreaktionen, insbe- Nach etwa 30 Minuten langem Rühren wird das

sondere zur Bildung von Acylderivaten, führen. Reaktionsgemisch in 400 ml kaltes Wasser gegossen

Die verwendete Ameisensäure kann bis zu 50% 5 und weitere 2 Stunden bei 0 bis 5° C gerührt.

Wasser enthalten. In diesem Fall muß jedoch die Zu der entstandenen wäßrigen Lösung wird Na-

molare Menge an Wasser, die in der Ameisensäure vor- triumhydroxyd gegeben und der pH des entstandenen

liegt, bei der Festlegung der molaren . Menge der Gemisches, das 99 % Phosphatverbindungen und 98 %

Ameisensäure berücksichtigt werden. Inosin-5'-monophosphat enthält, wird auf etwa 1 ein-

Die Reaktionsgeschwindigkeit der Phosphorylierung io gestellt.

hängt stark von der Lösungsgeschwindigkeit des Dann läßt man die Mischung durch eine mit 130 g

Nucleosids ab. Da diese Lösungsgeschwindigkeit Aktivkohle gefüllte Kolonne zum Absorbieren von

durch das Vorliegen von Ameisensäure stark ver- Inosinsäure laufen. Danach wird die Kolonne mit

bessert wird, wird bei dem erfindungsgemäßen Ver- 0,1 n-wäßriger Salzsäure und einer kleinen Menge

fahren die Reaktionsgeschwindigkeit der Phosphory- 15 Wasser ausgewaschen, während absorbierte Inosin-

lierung entsprechend erhöht und ein zufriedenstellendes säure mit einem Gemisch von 3 % Ammoniak —10 %

Ergebnis erzielt. Methanol — Wasser eluiert und das entstandene Eluat

Bei Verwendung einer bis zu 50% Wasser enthalten- unter vermindertem Druck bis zur Bildung eines Rück-

den Ameisensäure kann die Reaktionsgeschwindigkeit stands getrocknet wird.

ebenfalls in gewünschter Weise beeinflußt werden, in- 20 Der entstandene Rückstand wurde in einer kleinen

dem das Mischungsverhältnis von Ameisensäure zu Menge Wasser gelöst und die Lösung durch eine mit

Wasser verändert wird. etwa 50 ml Ionenaustauscher in der Η-Form gefüllte

Für die Zwecke der Erfindung geeignete cyclische Kolonne geführt, die anschließend mit Wasser ausge-

tertiäre Amine sind vorzugsweise Pyridin und Picolin. waschen wurde.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aus as Die abfließende Flüssigkeit und das Waschwasser

Phosphoroxychlorid oder -bromid, Ameisensäure oder wurden vereinigt, und sie wurden zu einer wäßrigen

50%iger wäßriger Ameisensäure und cyclischen! ter- Lösung von Natriumhydroxyd gegeben, um den pH

tiärem Amin gebildete Komplexverbindung ist bei auf 7,7 bis 8,0 einzustellen, dann wurde unter vermin-

Raumtemperatur oder in der Nähe von Raumtempe- dertem Druck bis zu einem Sirup konzentriert. Zu

ratur eine feste Substanz. Dadurch wird die Anwen- 30 einem Gewichtsteil des entstandenen Konzentrats

dung eines geeigneten Lösungsmittels erforderlich. wurden etwa 2 Gewichtsteile Methanol gegeben, und

Geeignete Lösungsmittel sind Acetonitril, Nitro- man ließ die Mischung über Nacht in einem Kühlmethan, Tetrahydrofuran, Dioxan und Dichlormethan, schrank stehen. Die ausgefallenen Kristalle wurden die alle polare organische Lösungsmittel darstellen. abfiltriert und bei 110⁰C unter vermindertem Druck Andere Lösungsmittel, wie Alkyläther, Ester und 35 getrocknet, wobei man 14,3 g (Ausbeute 91,7%) Di-Kohlenwasserstoffe sind für die Zwecke der Erfindung natrium-5'-inosinat mit einer Reinheit von 98 % erdagegen nicht geeignet. hielt. Dann wurde das Filtrat weiter konzentriert und

Bei der Bildung des Gemisches durch Zugeben und mit Äthanol versetzt, wobei man eine weitere kleine Mischen von Phosphoroxychlorid oder -bromid, Menge Dinatrium-5'-inosinat erhielt.
Ameisensäure oder 50%iger wäßriger Ameisensäure 40 . . und cyclischem tertiären Amin zu dem Lösungsmittel Beispiel Z
muß das Gemisch langsam unter Kühlung gerührt 40 ml Acetonitril, 20 ml Phosphoroxychlorid, 5,3 ml werden, und die Zugabe muß vorsichtig erfolgen, weil Ameisensäure und 19,5 ml Pyridin wurden in der aneine große Wärmemenge frei wird, gegebenen Reihenfolge unter Kühlen langsam ver-

Zur Durchführung der Phosphorylierungsreaktion 45 mischt. Zu dem entstandenen Gemisch, das bei 0 bis

wird das Nucleosid zu diesem Gemisch gegeben, 2⁰C gehalten wurde, wurden 11,3 g Guanosin unter

welches bei einer Temperatur von —30 bis +30° C, Rühren gegeben.

vorzugsweise von —10 bis +20°C, unter Rühren ge- Nach etwa 30 Minuten langem Rühren wurde das

halten wird. Reaktionsgemisch mit etwa 500 ml kaltem Wasser

Das erhaltene Reaktionsgemisch liegt zunächst als 50 versetzt und weitere 2 Stunden bei 0 bis 5°C gerührt, Suspension vor und wird nach 5 Minuten bis 10 Stun- Zu der entstandenen wäßrigen Lösung wurde den durchsichtig. Dann wird es mit Wasser vermischt eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxyd gegeben, und 1 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur, gegebenen- um den pH auf etwa 1 einzustellen. Die erhaltene falls unter Kühlung, stehengelassen. Die gebildete Lösung wurde durch eine mit 120 g Aktivkohle gewäßrige Lösung enthält das gewünschte Nucleotid, in 55 füllte Kolonne geschickt, um 5'-Guanylsäure zu adwelchem die Phosphorsäuregruppe an die primäre sorbieren. Nachdem die Kolonne genügend mit Wasser Hydroxylgruppe gebunden ist. Zur Isolierung des gewaschen war, wurde die adsorbierte 5'-Guanylsäure Nucleotids wird die'erhaltene wäßrige Lösung in mit warmer 0,1 η-wäßriger Natriumhydroxydlösung üblicher Weise aufgearbeitet, beispielsweise mit Aktiv- eluiert, bis sich kaum mehr eine Ultraviolettabsorption kohle oder Ionenaustauscherharzen. Es konnten hohe 60 nachweisen ließ.

Ausbeuten erzielt werden, die zwar von dem verwen- Die ablaufende Flüssigkeit wurde durch eine Ko-

deten Nucleosid abhängen, aber im allgemeinen im lonne mit einem Anionenaustauscherharz geführt, um

Bereich zwischen 85 und 100 % liegen. 5-Guanylsäure an dem Harz zu adsorbieren. Die daran

_..... adsorbierte 5-Guanylsäure wurde mit 0,02 n-wäßriger

Beispiel 1 _6§ salzsäure eluiert, bis das UV-Absorptionsspektrum

Es werden 40 ml Acetonitril, 20 ml Phosphoroxy- nahezu verschwunden war.

chlorid, 5,3 ml Ameisensäure und 19,6 ml Pyridin mit- Nachdem der pH der abfließenden Flüssigkeit auf

einander vermischt und das Gemisch, das bei 0 bis 2° C 7,6 bis 8,0 eingestellt war, wurde sie unter verminder-

5 6

tem Druck konzentriert, dann wurde das Konzentrat Beispiel 10
sehr langsam unter Rühren mit Methanol versetzt und

es fielen farblose nadeiförmige Kristalle aus. Nachdem Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, man das Ganze über Nacht stehen ließ, wurden die daß 1,0 g 1-a-D-Arabinofuranosyl-hypoxanthin an Kristalle abfiltriert und getrocknet, wobei man 14 g 5 Stelle von Guanosin verwendet wurden; die anderen reines Dinatrium-5'-guanylat erhielt (Ausbeute 86,2%, Reaktionspartner wurden in etwa Vio der im BeiReinheit 96,0 %). spiel 2 angewendeten Menge eingesetzt. Man erhielt _ · · . -j 11 g l-a-D-Arabinofuranosyl-hypoxanthin-S'-phos-^Belspie13 phat (Ausbeute 75,4%, Reinheit 96,8%).
Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, io

daß 10,7 g Adenosin an Stelle von Guanosin verwen- Beispielll
det wurden. Die nach Behandlung mit dem Anionen-

austauscher abfließende Flüssigkeit wurde ohne Ein- Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung,

stellen des pH unter Kühlen auf eine niedere Tempe- daß 1,2 g l-/?-D-Glucopyranosyl-hypoxanthin an Stelle

ratur konzentriert, wobei man schöne, nadeiförmige 15 von Guanosin verwendet wurde; die anderen Reak-

Kristalle erhielt, die abfiltriert und getrocknet 12,6 g tionspartner wurden in etwa Vio der im Beispiel 2 ver-

5'-Adenylsäure ergaben (Ausbeute 90,5%, Reinheit wendeten Menge eingesetzt. Man erhielt 1,1 g

97,8%). l-ß-D-Glucopyranosyl-hypoxanthin-o'-phosphat (Di-

Beisoiel4 natriumsalz) (Ausbeute 64,8%, Reinheit 96,5%).

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, B e i s ρ i e 1 12
daß an Stelle von Inosin 9,4 g Cytidin verwendet

wurden. Man erhielt 13,9 g reines Dinatrium-5'-cyti- Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung,

dilat (Ausbeute 97,9%, Reinheit 98,2%). daß 35 ml Tetrahydrofuran an Stelle von Acetonitril

25 verwendet wurden. Man erhielt 12,5 g Dinatrium-

B ei spiel 5 5'-güanylat (Ausbeute 76,8%, Reinheit 97,6%).

35 ml Nitromethan, 16 ml Phosphoroxychlorid, Beispiel 13
4,2 ml Ameisensäure und 15,5 ml Pyridin wurden langsam in der angegebenen Reihenfolge vermischt. Zu 30 Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, dem Gemisch, das bei 0 bis 5°C gehalten wurde, wur- daß an Stelle von 5,3 ml Ameisensäure 2,5 ml dieser den 9,8 g Uridin unter Rühren gegeben. Säure verwendet wurden. Es wurden 9,8 g Dinatrium-

Nach etwa 30 Minuten langem Rühren wurde das 5'-guanylat erhalten (Ausbeute 60,4 %, Reinheit

Reaktionsgemisch in 300 ml kaltes Wasser gegossen 97,5%).

und weitere 2 Stunden bei 0 bis 5°C gehalten. Nach 35 Beisoiel 14
Entfernen des abgetrennten Nitromethans wurde

die entstandene wäßrige Lösung in der gleichen Weise Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung,

wie im Beispiel 1 behandelt. Man erhielt 12,8 g Di- daß an Stelle von 19,5 ml Pyridin 12 ml verwendet

natrium-5'-uridinat (Ausbeute 86,6 %, Reinheit 95,6 %). wurden. Man erhielt 11 g Dinatrium-5'-guanylat (Aus-

40 beute 67,8%, Reinheit 97,1%).

^BeisP^ie16 . Beispiel^

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung,

daß Dichlormethan an Stelle von Acetonitril verwen- daß 6 g Phosphoroxybromid an Stelle von Phosphor-

det wurde. Man erhielt 12,5 g Dinatrium-5'-inosinat 45 oxychlorid verwendet wurden; die anderen Reaktions-

(Ausbeute 80,0 %, Reinheit 97,9 %). partner wurden in etwa Vio der im Beispiel 2 angegebenen Menge eingesetzt. Man erhielt 1,3 g Dina-

B e i s ρ i e 1 7 trium-5'-guanylat (Ausbeute 80,0 %, Reinheit 96,9 %).

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, 50 B e i s ρ i e 1 16
daß eine 50 %ige Ameisensäurelösung an Stelle von

Ameisensäure verwendet wurde und die Reaktionszeit Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung,

1,5 Stunden betrug. Man erhielt 14 g Dinatrium- daß 11,4 g Xanthosin an Stelle von Guanosin ver-

5'-inosinat (Ausbeute 89,6 %, Reinheit 98,1 %). wendet wurden; die Reaktionszeit war 6 Stunden. Man

. 55 erhielt 12,7 g Dinatrium-5'-xanthylat (Ausbeute 77,2 %,

Beispiele Reinheit 96,7%).

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, . .

daß 19 ml y-Picolin an Stelle von Pyridin verwendet B e 1 s ρ 1 e 1 17

wurden. Man erhielt 14,4 g Dinatrium-5'-inosinat Beispiel 4 wurde wiederholt mit der Abweic^: ung,

(Ausbeute 92,1 %, Reinheit 97,5 %). 60 daß 14,1 g Cytidin an Stelle von 9,4 g verwendet wur-

_ . -ic den; die Menge der zum Behandeln verwendeten

^ü ^e ^l ^{s p} ¹ ^e ^l ⁹ Aktivkohle war 200 g an Stelle von 130 g, Es wurden

Die im Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensschritte 16,3 g Dinatrium-5'-cytidylat erhalten (Ausbeute

wurden wiederholt, mit der Abänderung, daß an Stelle 76,6 %, Reinheit 95,2 %).

von Cytidin 9,4 g l-jß-D-Arabinofuranosyl-cytosin ver- 65

wendet wurden. Es wurden 13,1g kristallines Beispiel 18

l-/?-D-Arabinofuranosyl-cytosin-5'-phosphat erhalten Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung,

(Ausbeute 92,2%, Reinheit 98,3%). daß als Lösungsmittel eine Mischung von 20 ml

Acetonitril und 20 ml Nitromethan verwendet wurde. Man erhielt 13,9 g Diriatrium-5'-guanylat (Ausbeute 85,6%, Reinheit 96,7%).

Beispiel 19

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 19 ml eines aus gleichen Mengen bestehenden Gemisches von a-Picolin und y-Picolin an Stelle von

Pyridin verwendet wurden. Man erhielt 13,6 g Dinatrium-5'-guanylat (Ausbeute 83,7 %, Reinheit 97,5 %)

Beispiel 20

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 2,4-Lutidin an Stelle von Pyridin verwendet wurden; man erhielt 4,2 g Dinatrium-5'-guanylat (Ausbeute 26,9%, Reinheit 97,8%).

409515/436

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribofuranosyl-, 5'-Arabinofuranosyl- und 6'-Glucopyranosyl-Nucleotiden, die den Adenin-, Guanin-, Hypoxanthin-, Xanthin-, Cytosin- oder Uracilrest als Base enthalten, durch selektive Phosphorylierung der entsprechenden Nucleoside an der primären Hydroxygruppe mit einem Phosphoroxyhalogenid in Gegenwart eines cyclischen tertiären Amins, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nucleosid mit einem Gemisch, das aus 1 bis 4 Mol Ameisensäure oder bis zu 50 % Wasser enthaltender Ameisensäure, wobei 1 Mol Wasser einem Mol Ameisensäure gleichzusetzen ist, 2 bis 8 Mol Phosphoroxychlorid oder -bromid und 2 bis 8 Mol cyclischem tertiären Amin besteht, in Gegenwart von Acetonitril, Nitromethan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Didie Hydrolyse der Schutzgruppen durch Erhitzen im sauren Medium durchgeführt.

Nach dem Verfahren der französischen Patentschrift 1 428 186 werden Lösungen von Nucleosiden nach Zugabe von Metaborsäure zum Schützen der 2',3'-Hydroxygruppen erhitzt und danach mit Phosphoroxychlorid an der 5'-Hydroxygruppe phosphoryliert. Schließlich wird die Reaktionslösung nach Entfernen von unumgesetztem Phosphoroxychlorid durch

ίο Zugabe von Äthanol hydrolysiert.

Die Durchführung dieser verschiedenen Reaktionen erfordert jedoch einen hohen Arbeitsaufwand, da jeweils die Reaktionsbedingungen der gewünschten Reaktion eingestellt werden müssen.

Es wurde auch bereits versucht, ungeschützte Nucleoside selektiv zu phosphorylieren (G u 11 a η d und Hobday, J. Chem. Soc, 1940, S. 746; Barker und FoI 1, J. Chem. Soc, 1959, S. 3798 und Tenner,;. Chem. Soc, 1961 [Bd. 83], S. 159). Bei diesen