DE1645984C3 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribofuranosyl-, 5'-Arabinofuranosyl- und ö'-Glucopyranosyl-Nucleotiden - Google Patents

Description

SX^SSJ ££ ^wird'^{w5rd untcr Röhrcn mit 10}'^{78 Ino5in}

nderezur Biliunf Z "f*™***"™· mshe- Nach" etwa 30 Minuten langem Rühren wird das

Die verwendetZeSa₁ ^ί™^' ^fÖhren· Keaktionsgemisch in 400m! kaltes Wasser gegossen

Wasser erihahcn ί,ΖΓρ π n^ /" ⁵°^{% 5 U}"^{d WeiterC 2 Stunden ta}" ° ^{bis 5}°^C 8^erührt-

molare Nicn« an Wasser dT_el H Λ¹""·^{0 Jed}°^{ch die Zu der} entstandenen wäßrigen Lösung wird Na-

iTee? bei 2 FeSnder" mnf ^Tf ^ T" ^triumMroxyd gegeben und der pH des entstandenen

kn^SbSkSfc^*™ ^{Men£e der} F^emisci^es· ^das 99% Phosphatverbindungen und 98%

DieReaktionsgeschwindSkeitderPhosphooüerung „ JS —«P^sphat enthalt, wird auf etwa 1 e,n-

NucfcosMs ''^f'^W^indigkeit des Dznn läßt man die Mischung durch eine mit 130 g

£ Λ das virfieSn ^dieSe _Ä ^Lo!^ulW*hwindigkeit Aktivkohle gefüllte Kolonne zum Absorbieren von

tssert wird u^id beiT ^Am _fi ^ei?^{nSäUre Stark Ver}' ^Inosinsäu« laufen. Danach wird die Kolonne mit

?,h en dTe Re^k ?ηηΐ«,ι -^ei,-f"^{nESßemäßcn} ^ O.¹ ""^ßrigcr Salzsäure und einer kleinen Menge

iä™?JSÄ '^{5 Wasser} ausgewaschen, während absorbierte Inosin-

Ernctais Sieh ^ein2ufriedenstellendes säure mit einem Gemisch von 3% Ammoniak - 10%

n« Voru/i-nriiino ,..·„ u- cno-,., Methanol — Wasser eluiert und das entstandene EJuat

H. IZ f ϊ·" ο" T<° ^{WaSSer cmhaUen}- "nter vermindertem Druck bis zur Bildung eines Rück-

dcn Ameisensäure kann die Reaktionsgeschwindigkeit stands getrocknet wird.

im das MhChUJh?* "'"""^ ^WCrden· ⁱⁿ" " ^{Der entsta}"dene Rückstand wurde in einer kleinen

Wasser ver^ndeMw H ^V°" ^{Ameiicnsälire zu} Menge Wasser gelöst und die Lösung durch eine mit

ητί H^ 7«ί«ΪΛ ρ fi ^ · ^{elwa 50 mI} Ionenaustauscher in der Η-Form gefüllte

tprtiiL Amfn^ ,H ^Erfindung ß^p'gnete cyclische Kolonne geführt, die anschließend mit Wasser ausge-

tertiare Amine sind vorzugsweise Pyridin und Picolin. waschen wurde.

LIM "findungsgemäßen Verfahren aus >₅ D.c abfließende Flüssigkeit und das Waschwasser ÄÄa " -° ' ^AT^{ehemäme oder wurden vcre}in>gt. und sie wurden zu einer wäßrigen

⁸ LiiT'^Sl^nSaUrf ^Und ^^cIische™ ^ter- Lösung von Natriumhydroxyd gegeben, um den pH

S Oh ' Komplexverbindung ist bei auf 7.7 bis 8,0 einzustellen, dann wurde unter vermin-

ς ^d , '" ΐ,^Γ ^^Nahu ^V°.^{n Raumt}empe- dertem Druck bis zu einem Sirup konzentriert. Zu

„ 1 I ,^T-· ^Dadurch,^wlrd die Anwen- 3o einem Gewichtsteil des entstandenen Konzentrats

r^EJnn_P,,^g I Tu ^L™ⁿ&™^u<** erforderlich. wurden etwa 2 Gewichtsteile Methanol gegeben, und

_m?_han⁸TirIvH T" n^{Smd A}r^lonitril· ^Nitro- ^man »eß die Mischung über Nacht in einem Kühl-

^^th"'^™^h^^rofui?ⁿ'^Dl ₁°;^anu'»«>Dichlon_nethan, schrank stehen. Die ausgefallenen Kristalle wurden

I« £ ?S,n^C -f,"! · ^Lo _A ^s _I ^u"ß_I ^sn?^Ilte> darstellen. abfiltriert und bei IWC unter vermindertem Druck

ini^whJr ,⁸T ■ A r*^ie.· ?^yla!^her· ^{Ester und 35} g^ctroc^et, wobei man 14,3 g (Ausbeute 91.7%) Di-

S, e„ η ch _PP v^S'f^fUr ^ ^{Zwecke dcT} ™"^d™& natrium-S'-inosiiuil mit einer Reinheit von 98 % er-

RTi nai.f ^C8i % ■ u , u hielt. Dann wurde das Filtrat weiter konzentriert und MUrLn ?ηί Ik κ ^miSCS^S ^ ^¹"" ^{und mit Athano}« versetzt, wobei man eine weitere kleine Mischen von Phosphoroxychlond oder -bromid, Menge Dinatrium-5'-inosinat erhielt. Ameisensaure oder 50%iger wäßriger Ameisensäure to

und cyclischem tertiären Amin zu dem Lösungsmittel ' " B e i s ρ i e I 2

TrIn³LH⁶,?⁵? ^^n ""*· _u ^K.^ühlun8 g^crührt 40 ml Acetonitril, 20 ml Phosphoroxychlorid. 5,3 ml T^rl AnTw- ^ß T* ^v?T^chl'S erfolgen, weil Ameisensäure und 19,5 ml Pyridin wurden in der an-

eme große Wärmemenge rrei wird _ßC£cbenen Reihenfolge unter Kühlen langsam ver-

wiH H?« S "ι "f .^PhosP^hoiyl'erungsreaktion «₅ mischt. Zv dem entstandenen Gemisch, das bei 0 bis

wlih« L- °T ^{ZU d}.^{ieSem Ge}?A^{SCh ße6eben}· ²°^C g^cha:"^ ^wurdc· ^wurden 11.3 g Guanosin unter welches bei einer Temperatur von -30 bis +30⁰C, Rühren b< b >;

™™^ ^von -^{10 bis} +²°^ec' ^unler Rühren ge- Nach c= M Minuten langem Rühren wurde das

η«;,Ϊ7ι, η ι.,· . ... Reaki;.-ivvn-.iidi mit etwa 500 ml kaltem Wasser

ς,,«, nc· Reaktionsgeinisch hegt zunächst als 50 versetzt unO weitere 2 Stunden bei 0 bis 5°C gerührt.

Suspension vor und wird nach 5 Minuten bis 10 Stun- Zu der entstandenen wäßrigen Lösung wurde .

tZ ? £< ς, ⁸H T- D^{ird CS mit WaSSCr Vermischt eine waßr}'"g^{e Losu}"8 ^von Natriumhydroxyd gegeben, " \*" ^5S'^unden bei Raumtemperatur gegebenen- um den pH auf etwa 1 einzustellen. Die erhaltene ^ L" ^lU^'u^St:f^hen8^eIassen· D«^e gebildete Lösung wurde durch eine mit 120 g Aktivkohle ge-ηΓρη ί -^{aS gewunschte} NV^cIcolid. ⁱⁿ 55 füllte Kolonne geschickt, um S'-Guanylsäu« zu ad-Io ^Ph0SP'¹⁰"^aureg^ruP!>e an die primäre sorbieren. Nachdem die Kolonne genügend mit Wasser ^ *a - w,' ^Z-a .^Isol'^erunS ^ae> gewaschen war, wurde die adsorbierte 5'-Guanylsäure w · r κ , ΪΤ- ^Wa,^{Dnße Lösung :a mit warmcr} 0.1n-wäßriger Natriumhydroxydlösung i^Wese aufgearbeitet, beisp.clsweise mit Aktiv- eluiert. bis sich kaum mehr eine Ultraviolettabsorption kohle oder Ionenaustauscherharzen. Es konnten hohe 60 nachweisen ließ

iJJ^S*™·? K^Cv,^r-^{dCn> die}K^Wa- ^VOn„^dcm -^Venven- ^Die abrufende Flüssigkeit wurde durch eine Ko-

trli^-T S IT^J ^{im alI}«^emeinen im lonne mit einem Anioncnaustauscherharz geführt, um

Bereich zwischen 85 und 100% hegen. 5-Guanylsäure an dem Harz zu adsorbieren Die daran Beispiel 1 adsorbierte 5-Guanylsäure wurde mit 0,02n-wäßriger Vr ™„rA~_n Άη ι a . · ι ™ . r,. . ⁶' ^SaIzsSui"^e eluiert, bis das UV-AbsoφtίonsspektΓUΠl Es werden 40 ml Acetonitril, 20 ml Phosphoroxy- nahezu verschwunden war. ■ '

chlond, 5,3 ml Ameisensäure und 19,6 ml Pyridin mit- Nachdem der pH der abfließenden Flüssigkeit auf

einander vermischt und das Gemisch, das bei 0 bis 2'C 7,6 bis 8,0 eingestellt war, wurde sie unter vermincfcr-

tem Druck konzentriert, dann wurde das Konzentrat . sehr langsam unter Rühren mit Me'hanol versetzt und es fielen farblose nadeiförmige Kristalle aus. Nachdem man das Ganze über Nacht stehen ließ, wurden die Kristalle abfiltriert und getrocknet, wobei man 14 g reines Dinatrium-5'-guany!at erhielt (Ausbeute 86,2%, Reinheit 96,0%).

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 10,7 g Adejiosin an Stelle von Guanosin verwendet wurden. Die nach Behandlung mit dem Anioncnauslauscher abfließende Müssigkeit wurde ohne Einstellen des _FH unter Kühlen auf eine niedere Temperatur konzentriert, wobei man schöne, nadelförmige Kristalle erhielt, die abfUtriert und getrocknet 12,6 g 5'-AdenyIsäure ergaben (Ausbeute 90,5%, Reinheit 97,8%).

Beispiel 4

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß an Stelle von Inosin 9,4 g Cylidin verwendet wurden. Man erhielt 13,9 g reines Dinatrium-5'-cytidilat (Ausbeute 97,9%, Reinheit 98,2%).

Beispiel 5

35 ml Nitromethan, 16 ml Phosphoroxychlorid, 4,2 ml Ameisensäure und 15,5 ml Pyridin wurden langsam in der angegebenen Reihenfolge vermischt. Zu dem Gemisch, das bei 0 bis 5°C gehalten wurde, wurden 9,8 g Uridin unter Rühren gegeben.

Nach etwa 30 Minuten langem Rühren wurde das Reaktionsgemisch in 300 ml kaltes Wasser gegossen und weitere 2 Stunden bei 0 bis 5°C gehalten. Nach Entfernen des abgetrennten Nitromethans wurde die entstandene wäßrige Lösung in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 behandelt. Man erhielt 12,8 g Dinatrium-5'-uridinat (Ausbeute 86,6 %, Reinheit 95,6 %).

Beispiel 6

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß Dichlormethan an Stelle von Acetonitril verwendet wurde. Man erhielt 12,5 g Dinatrium-5'-inosinat (Ausbeute 80,0%, Reinheit 97,9%).

B e i s ρ i e 1 7

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß eine 50%ige Amcisensäurelösung an Stelle von Ameisensäure verwendet wurde und die Reaktionszeit 1,5 Stunden betrug. Man erhielt 14 g Dinatrium-5'-inosinat (Ausbeute 89,6%, Reinheit 98,1%).

Beispiel 8

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 19 ml y-Picolin an Stelle von Pyridin verwendet wurden. Man erhielt 14,4 g Dinatrium-5'-inosinat (Ausbeute 92,1%, Reinheit 97,5%).

Beispiel 10

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 1,0 g l-Ä-D-Arabinofuranosyl-hypoxanthin an Stelle von Guanosin verwendet wurden; die anderen Reaktionsparlner wurden in etwa Vio der im Beispiel 2 angewendeten Menge eingesetzt. Man erhielt 11 g l-A-D-Arabinofuranosyl-hypoxanthin-S'-phosphat (Ausbeute 75,4%, Reinheit 96,8%).

Beispiel 11

Beispiel2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 1,2 g l-ß-D-Glucopyranosyl-hypoxanthin an Stelle von Guanosin verwendet wurde; die anderen Reaktionspartner wurden in etwa Vio der im Beispiel 2 verwendeten Menge eingesetzt. Man erhielt 1,1 g l-^-D-GIucopyranosyl-hypoxanlhiii-o'-phosphat (Dinatriiimsal/.) (Ausbeute 64,8%, Reinheit 96,5°/).

Bei spiel 12

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 35 ml Tetrahydrofuran an Stelle von Acetonitril verwendet wurden. Man erhielt 12,5 g Dinatrium-5'-guan >Iat (Ausbeute 76,8%, Reinheit 97,6%).

Beispiel 13

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß an Stelle von 5,3 ml Ameisensäure 2,5 ml dieser Säure verwendet wurden. Es wurden 9,8 g Dinatrium-5'-guanylat erhalten (Ausbeute 60,4%, Reinheit 97,5%).

Beispiel 14

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß an Stelle von 19,5 ml Pyridin 12 ml verwendet wurden. Man erhielt 11g Dinatrium-5'-guanylat (Ausbeute 67,8%, Reinheit 97,1%).

Beispiell5

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß ό g Phosphoroxybromid an Stelle von Phosphoroxychlorid verwendet wurden; die anderen Rcaktionspartner wurden in etwa Vio der im Beispiel 2 j angegebenen Menge eingesetzt. Man erhielt 1,3 g Dinatrium-5'-guany!at (Ausbeute 80,0%, Reinheit 96,9%).

Be i spiel 16

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 11,4 g Xanthosin an Stelle von Guanosin verwendet wurden; die Reaktionszeit war 6 Stunden. Man erhielt 12,7 gDinatrium-S'-xanthylat (Ausbeute 77,2%, Reinheit 96,7%).

Beispiel 9

Die im Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensschritte wurden wiederholt, mit der Abänderung, daß an Stelle \on Cytidin 9,4 g l-ß-D-Arabinofuranosyl-cylosin verwendet wurden. Es wurden 13,1 g kristallines !-/,'-D-Arabinofiiranosyl-cylosin-S'-phosphat erhalten (Ausbeute 92,2%, Reinheit 98,3%).

Beispiel 17

Beispiel 4 wurde wiederholt mit der Abweic' ung, daß 14,1 g Cytidin an Stelle von 9,4g verwendet wurden; die Menge der zum Behandeln verwendeten Aktivkohle war 200 g an Stelle von 130 g, Es wurden 16,3 g Dinatrium-S'-cylidylat erhalten (Ausbeute 76,6%, Reinheit 95,2%).

Beispiel 18

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abwcichiinj!, daß als Lösungsmittel eine Mischung von 20 ml

Acetonitril und 20 ml Nitromethan verwendet wurde. Man erhielt 13,9 g Dinatrium-5'-guanylat (Ausbeute 85,6%, Reinheit 96,7%).

Beispiel 19

Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 19 ml eines aus gleichen Mengen bestehenden Gemisches von a-Picolin und y-Picolin an Stelle von

Pyridin verwendet wurden. Man erhielt 13,6 g Di natrium-5'-guanylat (Ausbeute 83,7 %, Reinheit97,5 %

Beispiel 20

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung daß 2,4-Lutidin an Stelle von Pyridin verwendet wur den; man erhielt 4,2 g Dinatrium-5'-guanylat (Aus beute 26,9%, Reinheit 97,8%).

Claims (3)

die Hydrolyse der Schutzgruppen durch Erhitzen im Patentar Spruch: sauren Medium durchgeführt. Nach dem Verfahren der französischen Patent-Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribofuranosyl-, schrift 1428 186 werden Lösungen von Nucleosiden 5'-Arabinofuranosyl- und o'-Glucopyranosyl-Nu- 5 nach Zugabe von Metaborsäure zum Schützen der cleotiden, die den Adenin-, Guanin-, Hypoxanthin-, 2\3'-Hydroxygruppen erhitzt und danach mit Phos-Xanthin-, Cytosin- oder Uracilrest als Base ent- phoroxychlorid an der 5'-Hydroxygruppe phosphoryhalten, durch selektive Phosphorylierung der ent- liert. Schließlich wird die Reaktionslösung nach Entsprechenden Nucleoside an der primären Hydroxy- fernen von unumgesetztem Phosphoroxychlorid durch gruppe mit einem Phosphoroxyhalogenid in Gegen- io Zugabe von Äthanol hydrolysiert, wart eines cyclischen tertiären Amins, dadurch Die Durchführung dieser verschiedenen Reaktionen gekennzeichnet, daß man das Nucleosid erfordert jedoch einen hohen Arbeitsaufwand, da mit einem Gemisch, das aus 1 bis 4 Mol Ameisen- jeweils die Reaktionsbedingungen der gewünschten säure oder bis zu 50% Wasser enthaltender Amei- Reaktion eingestellt werden müssen, sensäure, wobeil Mol Wasser einem Mol Ameisen- 15 Es wurde auch bereits versucht, ungeschützte Nusäure gleichzusetzen ist, 2 bis 8 Mol Phosphoroxy- cleoside selektiv zu phosphorylieren (G u 11 a η d und Chlorid oder -bromid und 2 bis 8 MoI cyclischen! Hobday, J. Chem. Soc, 1940, S. 746; B a r k e r tertiären Amin besteht, in Gegenwart von Aceto- und Foil, J. Chem. Soc, 1959, S. 3798 und Ten· nitril, Nitromethan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Di- η e r, J. Chem. Soc, 1961 [Bd. 83], S. 159). Bei diesen chlormethan, oder deren Gemischen als Lösungs- ao bekannten Verfahren sind jedoch der Umsatz und die mittel bei einer Temperatur von —30 bis +30C Selektivität der Reaktion so unbefriedigend gering, umsetzt, das entstandene Reaktionsgemisch mit daß sie keine praktische Bedeutung erlangt haben. Wasser vermischt und das erhaltene Nucleotid in Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zuüblicher Weise isoliert. gründe, ein neues Verfahren zur direkten und selek- 45 tiven Phosphorylierung der primären Hydroxygruppe eines ungeschützte Hydroxygruppen enthaltenden Nucleosids zugänglich zu machen, das sich nicht nur in einfacher und verfahrenstechnisch vorteilhafter Weise durchführen läßt, sondern auch zu besseren Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung 30 Ausbeuten führt als vergleichbare bekannte Verfahren, von 5'-Ribofuranosyl-, 5'-Arabinofuranosyl- und Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren ö'-Glucopyranosyl-Nucleotiden, die den Adenin-, zur Herstellung von 5'-Ribofuranosyl-, 5'-Arabino-Guanin-, Hypoxanthin-, Xanthin-, Cytosin- oder furanosyl- und o'-Glucopyranosyl-Nucleotiden, die Uracilrest als Base enthalten, durch selektive Phospho- den Adenin-, Guanin-, Hypoxanthin-, Xanthin-, rylierung der entsprechenden Nucleoside an der pri- 35 Cytosin- oder Uracilrest als Base enthalten, durch mären Hydroxygruppe mit einem Phosphoroxyhalo- selektive Phosphorylierung der entsprechenden Nugenid in Gegenwart eines cyclischen tertiären Amins. cleoside an der primären Hydroxygruppe mit einem Zur Phosphorylierung einer primären Hydroxy- Phosphoroxyhalogenid in Gegenwart eines cyclischen gruppe eines Nucleosids hat man es bisher meist für tertiären Amins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß erforderlich gehalten, die sekundären Hydroxygruppen 40 man das Nucleosid mit einem Gemisch, das aus 1 bis des Nucleosids mit Hilfe geeigneter Gruppen zu 4 Mol Ameisensäure oder bis zu 50 % Wasser enthalschützen. tender Ameisensäure, wobei 1 Mol Wasser einem Mol Dabei ist die Durchführung folgender drei Reak- Ameisensäure gleichzusetzen ist, 2 bis 8 Mol Phostionen erforderlich: phoroxychlorid oder -bromid und 2 bis 8 Mol cycli- 45 schem tertiärem Amin besteht, in Gegenwart von

1. Herstellung von 2',3'-O-geschütztem Ribonu- Acetonitril, Nitromethan, Tetrahydrofuran, Dioxan, cleosid, Dichlormethan, oder deren Gemischen als Lösungs-

2. Herstellung von 2',3'-O-geschütztem Ribonu- mittel bei einer Temperatur von —30 bis +30° C um· cleosid-S'-phosphat, setzt, das entstandene Reaktionsgemisch mit Wasser

3. Abspaltung der Schutzgruppen in 2',3'-Stellung. 50 vermischt und das erhaltene Nucleotid in üblicher

Weise isoliert.

Ein Beispiel für dieses bekannte Verfahren gibt die Es wird angenommen, daß bei dem erfindungs

französische Patentschrift 1 417 811, gemäß der als gemäßen Verfahren sich das ungeschützte Nucleosid Schutzgruppe die Isopropylidengruppe verwendet mit einem Komplex umsetzt, der durch Reaktion der wird, die in der letzten Verfahrensstufe durch Erhitzen 55 Bestandteile des im Reaktionsmedium vorliegenden in saurer Lösung wieder entfernt wird. Gemisches aus Phosphoroxychlorid oder -bromid,

Es ist zwar bekannt, diese drei Reaktionen ein- Ameisensäure oder wäßriger Ameisensäure und dem stufig ohne Isolierung von Zwischenprodukten, durch- cyclischen tertiären Amin gebildet wird, zuführen (vergleiche z. B. J. Am. Chem. Soc, Bd. 83,' Das Mischungsverhältnis dieser drei Komponenten

S. 3640 [1961], die französischen Patentschriften 60 ist für das erfindungsgemäße Verfahren von Bedeutung. 434 511 und 1 428 186). Gemäß der französischen Phosphoroxychlorid oder -bromid, Ameisensäure oder Patentschrift 1 434 511 werden zunächst die T- und 50%ige wäßrige Ameisensäure und cyclisches tertiäres •die 3'-Hydroxygruppen des Nucleosids in Gegenwart Amin werden in einem Molverhältnis von 2 bis 8:1 von Phosphoroxychlorid in einem Lösungsmittel in die bis 4: 2 bis 8, vorzugsweise in einem Molverhältnis von Isopropylidengruppe übergeführt; dann wird Pyridin 65 2:1: 2 vermischt. Die Abweichung von den genannten zu dem Reaktionsgemisch gegeben und, ohne das Mischungsverhältnissen führt nur zu unbefriedigenden 2',3'-O-Isopropylidennucleosid vorher zu isolieren, die Ergebnissen. 5'-Hydroxygruppe phosphoryliert und anschließend Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die