-
-
Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribchuclectid Die Erfihdung bezieht
sich auf ein Verfaren zur Herstelleung von 5'-Ribonuclectid durch Umsetzung der
entp'e''he?-fl\Ä £.(iÜI're?ie' it' e1n"'e s'e414e' ?phphorylierungsmittel in Gegenwart
von Nitrilverbindungen und anschlie#ende Hydrolyse des erhaltenen Produkes.
-
Ribonucleosid hat driel Hydroylgruppen in 2'-, 3'- und 5'-Stellung
an seiner Riboserkompohente. Wern Ribonueleosid direkt der Phosphoryllerng unterworfen
Wird, entsteht ein Gemisch von Ribonucleosid-2',5'-diphosphat und -3',5'-diphosphat.
Zur selektiven Herstellung von 5'-Ribonucleocid aus dem entsprechenden Riochucleosid
-e äÄe'r' -teÄd7j'r, &e -y''r""ök-iü{'rk 1?ffl und - 3'-Stellung mit gewissen
geeigneten Substituenten zu schützen, bevor die Phosphorylierung in der 5'-SteliIün-'
\ib:rgäf«e' d'e Die bisher bekannten Verfanren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotid
aus dem entsprechenden Riochucleosid dmI' a'-in äf' a'n dre £?t --a -r'öxü1-br"iL'p'peÄ
-i -([-e fRbb:-ekO"äi6n'nt e" iL' Ä'bLeten K z' ;t einem Acetylrest oder Benzoylrest)
oder einer Isopropylidengruppe schützt und anschlie#end die freie 5'-Hydroxyl-
gruppe
durch geeigente Mittel phosphoryliert, worauf die schützenden gruppen entfernt werden.
-
Die bisher bekannten Verfahren lassen sich Jedoch im tecnischen Ma#stab
nicht vorteilhaft für die Herstellung von 5'-Ribonucleotid aus dem entsprechenden
Ribonucleosid anwenden, weil sie viele umständliche Stufen erfordern, insbesondere
den Schutz der 2'-und 3'-OH-Gruppen und die Entfernung der schützenden Gruppen.
ernr it die Produktausbeute bei diesen Verfahren $niadrig.
-
Von der Anmelderin wurde bereits vorgeschlagen, 5'-Ribonuclectide
auo den entsprechenden Ribonucleosiden durch Umsetzung der Riboncleoside mit einem
Phosphorylierungsmittel in Gegenwart von Phenolen herzustellen, da restgestelit
wurde, daB hierbei nur eine OH-Gruppe in der 5'-Stellung des Ribonucleosids selektiv
phosphoryliert wir, ohne da# ein Schutz der Hydroxylgruppen in der 2'- und 3'-Stellung
vor der Phosphorylierung erforderil e * -iS-t-% Es wurde nun gefunden, da# bei Verwendung
von Nitrilverbindungen an Stelle von Phenolen nur die Hydroxylgruppe in der 5'-Stellung
bei der Umsetzng des Ribomucleosids mit einem Phosphorylierungsmittd ohne Schutz
der Hydroxylgruppen in der 2'- und 3'-Stellung selektiv phosphoryliert wird, und
da# die Zeit. die zur Vollendung der Phosphorylierungsreaktion bei Verwendung der
Nitrilverbindungen an Stelle der Phenole erforderlich ist, stark verkürzt wird.
-
Gegenstand der Erfindung ist demgemä# ein Verfahren zur Herstellung
von 5'-Ribonucleotiden aus den entsprechenden Ribonucleosiden, das da durch gekennzeichnet
ist, da# man das Ribonucleosid mit einem Phosphorylierungs mittel in Gegenwart von
Nitrilverindungen umsetzt und
das erhaltene Produkt der Hydrolyse
unterwirft.
-
Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden die 5'-RiL-onucleotide in
guter Ausbeute in einfacher Weise ohne den Schutz der Hydroxylgruppen in der 2'-
und 3'-Stellung erhalten. Das Verfahren läßt sich vorteilhaft im tecnischen Ma#stab
durchführen, da umständliche Verfahrensstufen, z.B. Schutz der 2'- und 3'-Hydroxylgruppen
und die Entfernung der schUtzenden Gruppen, entfallen.
-
F5r die Zwecke der Erfindung kommen natürliche und synthetische Ribonucleotide
in Frage, die eine Purinbase (z*B. Adenin, Hypoxanthin, Guanin), eine Pyrimidinbase
(z.B. Cytosin, Uracil, Thymin) und eine Pyridinbase (z.B. Nicotinatnid und Ribonucleosid)
enthalten.
-
Als Nitrilverbindungen eignen sich -für die Zwecke der Erfindung solche
mit 2 - 8 C-Atomen, z.B. aliphatische Mononitrile, z.B. Acrylnitril, Acetonitril,
Butyronitril, aliphatische Dinitrile, z.B. Malononitril, Succinonitril, aromatische
Nitrile, z.B. Benzonitril, Beneylnitril und Tolunitril. Diese Nitrilverbindungen
können erfolgreich allein oder in verschiedenen Kombinationen verwendet werden.
Von den Nitrilverbindungen werden Acrylnitrll, Benzylnitril, Acetonitril, Malononitril
und Benzonitril bervorzugt. Besonders gute Ergebnisse werden mit Acetonitril, Malonoitril
und Benzonitril erhalten.
-
Als Phosphorylierungsmittel eignen sich für das Verfahren gemäß der
Erfindung beispielsweise Phosphortrichlorid, Phosphoroxychlorid, Phosphorpentachlorid,
Pyrophosphoryltetrachlorid, teilweise hydrolysiertes Phosphoroxychlorid, teilweise
hydrolysiertes Ihosphorpenta chlorid oder teilweise hydrolysiertes Phosphortrichlorid,
die durch Mischen von Wasser mit der Phosphorverbindung hergestellt werden, oder
teilweise alkoholisier-
tes Phosphoroxychlorid, -pentachlorid oder
-trichlorid, die durch Mischen eines niederen Alkohols mit 1-4 C-Atomen (z.B. Methylalkohol,
Äthylalkohol' Propylalkohol, Isopropylalkohol. Butylalkohol, t-Butylalkohol) mit
der Phosphorverbindung hergestellt werden. Von diesen Phosphorylierungsmitteln ergeben
Pyrophosphoryltetrachlorid, Phosphoroxychlorid, hydrolysiertes oder alkoholisiertes
Phosphoroxychlorid die besten Resultate.
-
Diese Verbindungen können allein oder in Kombination verwendet werden.
-
Das Verfahren gemäß der Errindung wird durchgefUhrt, indem man das
Phosphorylierungsmittel zum Ribonucleosid gibt, das in Nitrilverbindungen gelöst
oder suspendiert ist, die Phosphorylierung stattfinden läßt und dann das erhaltene
Produkt hydrolysiert.
-
Die vorstehend genannten Ribonucleoside, Nitrilverbindungen oder Phosphorylierungsmittel
müssen nicht in reiner Form verwendet werden.
-
Die verwendeten Mengen der Nitrilverbindungen und des Phosphorylierungsmittels
sind verschieden Je nach der Art des Ribonucleosids, der Nitrilverbindungen oder
Phosphorylierungsmittel. Im allgemeinen wird das Phosphorylierungsmittel in einer
Menge von etwa 1-30 Mol verwendet, wobei die optimale Menge etwa 2-5 MQl, bezargen
auf das Ribonucleosid, beträgt.
-
Die Nitrilverbindungen werden in einer Menge von wenigstens etwa 10
Mol, bezogen auf das Ribonucleosid, und gewöhnlich in einer Menge von etwa 10-500
Mol pro Mol Ribonucleosid verwendet, wobei die optimale Menge etwa 15-50 Mol beträgt.
-
Die Reaktion verläuft glatt bei Rawntemperatur. Gegebenenfalls kann
während der Reaktion erhitzt oder gekUhlt werden.
-
Bei Verwendung von flüssigen Nitrilverbindungen ist kein Lösungsmittel
erforderlich, da hierbei die Nvitrilverbindung als Lösungsmittel wirkt. Dagegen
kann bei Verwendung von festen Nitrilverbindungen ein geeignetes Lösungsmittel,
wie Benzol, Xylol, Dioxan oder Essigsäureester, zusammen mit dem Nitril verwendet
werden.
-
Insbesondere kann bei Verwendung einer festen Nitrilverbindung zusammen
mit Benzol als Lösungsmittel die Menge der Nitrilverbindung verringert werden.
-
Bei dieser Reaktion wird nur die 51-Hydroxylgruppe des Ribonucleosids
selektiv unter Bildung von 5'-Ribonucleotid phosphoryiiert. Das erhaltene Produkt
wird dann der Hydrolyse unterworfen.
-
Die Hydrolyse wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, indem
beispielsweise das Reaktionsgemisch in Wasser, vorzugswiese gekühltes Wasser, gegossen
wird, oder indem der pH-Wert des in der ersten Stufe erhaltenen Reaktionsgemisches
auf einen Wert im schwach sauren Bereich, zweckmäßig auf etwa 1-2 eingestellt wird,
indem eine Alkaliverbindung, (z.B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Natriumcarbonat,
Kaliumcarbonat) zugesetzt wird. Hierbei wird das gewünschte 5'-Ribonucleotid geildet.
-
Wie bereits erwähnt, läßt sich gemäß der Erfindung 5'-Ribonucleotid
leicht in kurzer Zeit nach einem einfachen Verfahren und im Vergleich zu den bekannten
Verfahren unter sehr milden Bedingungen in hoher Reinheit und guter Ausbeute herstellen.
-
Beispiel 1 Zu einer Suspension von 1,08 g Inosin in 60 ml Acetonitril
wurden 2 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 0-50C
gegeben. Das Gemisch
wurde bei dieser Temperatur 0,5 Std. stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde
in 400 ml Eiswasser gegossen und das Gemisch mit einer wässrigen Normallösng von
Natriumhydroxyd auf PH 2 eingestellt. Die Analyse der so eingestellten Lösung durch
Papierelektrophorese (Boratpuffer, p11 9,2) ergab, daß Inosin-5'-monophosphat in
einer Ausbeute von 93% gebildet worden war.
-
Die Lösung wurde dann an einer Säule adsorbiert, die mit 20 g Aktivkohle
gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,7%igen wässrigen
Natriumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf pH 8,6 eingestellt und eingeengt,
wobei 1,35 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosion-5-monophosphat (gerechnet
als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 86%.
-
Beispiel 2 Zu einer Lösung von 1,2 g Uridin in 350 ml Acetonitril
wurden 10 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 0-50C gegeben. Das Gemisch. wurde bei
dieser Temperatur 0,5 Stunden stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde unter
vermindertem Druck auf 100 ml eingeengt. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches
auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise ergab 1,56 Kristalle von Uridin-51-monophosphat
(gerechnet als Anhydrid). Ausbeute 85%.
-
Beispiel 3 Zu einer Lösung von 1,35 g Inosin in 150 ml Benzonitril
wurden 5 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 0-5°C gegeben. Das Gemisch wurde bei
dieser Temperatur 0,5 Stunden stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde in 400
ml Eiswasser gegossen und mit ether ausgeschüttelt, um das Benzonitril in die ptherschicht
zu Uberführen. Die Ätherschicht wurde mit Wasser gewaschen. Die mit dem Waschwasser
vereinigte wässrige Schicht wurde mit einer wässrigen Normallösung von
von
Natriumhydroxyd auf PH 2 eingestellt. Die Analyse der so eingestellten Lösung durch
Papierelektrophorese (Boratpuffer, PH 9,2) ergab, daß Inosin-5'-monophosphat in
einer Ausbeute von 92% gebildet worden war.
-
Beispiel 4 Zu einer Lösung von 1,35 g Inosin in einem Gemisch von
75 g Malononitril und 75 ml Athylacetat wurden 5 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei
0-5°C gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 20 Minuten stehen gelassen.
-
Das Reaktionsgemisch wurde in 400 ml Eiswasser gegossen, Das Gemisch
wurde mit einer wässrigen Normallösung von Natriumhydroxyd auf PH 2 eingestellt.
Die Analyse der Lösung durch Papierelektrophorese (Citratpuffer, PH 5,8) ergab,
daß Inosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 88% gebildet worden war. Die Lösung
wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei lf57 g Kristalle
des Dinatriumsqlzes von Inosin-5'-monophosphat gerechnet als Anhydrid) gebildet
wurden. Ausbeute 80%.
-
Beispiel 5 Zu einer Suspension von 0,267 b Adenosin in 10 ml Acetonitril
wurden 0,5 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 0-5°C gegeben. Das Gemisch wurde bei
dieser Temperatur 0,5 Std. stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde auf die in
Beispiel beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 0,314 Kristalle des Dinatriumsalzes
von Adenosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. -Ausbeute
80%.
-
Beispiel £ Zu einer Suspension von 1,2 g Cytidin in 50 ml Acetonitril
wurden 2,5 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 0-5°C gegeben. Das Gemisch wurde rei
dieser Temperatur
0,5 Std. stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch
wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 1,53 g Kristalle
des Dinatriumsalzes von CySidin-5t-monophoæphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten
wurden. Ausbeute 83%.
-
Beispiel 7 Zu einer Suspension von 0,53 g Inosin in 7,5 ml Acetonitril
wurde teilweise hydrolysiertes Phosphoroxychlorid, das durch Mischen von 4,5 ml
Phosphoroxychlorid und 0,01 ml Wasser hergestellt worden war, bei 0-50C gegeben.
Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden stehen gelassen, wobei eine Reaktion
stattfand. Anschließend wurde auf die in Beispeil 1 beschriebene Weise aufgearbeitet.
-
Die Anlalyse des Produkts durch Papierelektrophorese (Boratpuffer,
pH9s2) ergab, daß Inosin-5s--monophosphat selektiv gebildet worden war.
-
Beispiel 8 Zu einer Suspension von 1,97 g Guanosin in 36 ml Acetonitril
wurden 5,4 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 0-5°C gegeben. Das Gemisch wurde bei
dieser Temperatur 0,5 Std. gerührt. Die Aufarbeitung des Gemisches auf die in Beispiel
1 beschriebene Weise ergab 2,0 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Guanosin-5'-monophosphat
(gerechnet als Anhydrid). Ausbeute 70%.