DE1620562A1

DE1620562A1 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden

Info

Publication number: DE1620562A1
Application number: DE19661620562
Authority: DE
Inventors: Mikio Honjo; Kin-Ichi Imai
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1965-08-26
Filing date: 1966-08-25
Publication date: 1970-04-16
Also published as: IT990477B; US3382232A; NL7113306A; NL6611995A; GB1157666A; BE686049A

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHONWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES

KÖLN 1, DEtCHMANNHAUS

Köln, den 18·8_βΐ9ββ Fu/Ax

Takeda Chemioal Industries, Ltd,» 27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka

Verfahren zux Herstellung γοη

Die Erfindung "bezieht sieh auf ein Yerfatetn lung Ton 5³°-Hi"boam©le©ia±ä©a, das daduroö.

ist₉ aaß man et is ©ntspreoiienden Eiloa.-a©l®©siäe mit ©ia@M speziellen Biosphosylierungsmittel in &egenwa,rt von. organiseiiea gäurea oder in Q-egsawart von M dungsn umsetzt uad das er&alt@fi© Produkt

In letzter Zeit traröe der Byatlias© ύοά 5^S e^helslich© iaxfeerksaalseit -g@widm@t_e \7®il äi©

l2.©l©©-feii=-©0@asfa© im

¥?@rd©n di© Blastffipjisals© vea. lü.el©oeiä auf G-niad 1Μ~©3? QfeGs^kteris-fcisohea -läliiglseitj, claa gesclnaaök έΜ. fiae ij?ea© Toa latomagg« naß. GeaaSai'öi an s"feaiges?a₃ si® Xmteqb. h®i &qt? H©rStel

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steht @ia ©©aieali von Mfeoaueleosid^⁵ -3⁸ ^S^-diphospaalSo 2&ip ©-©lektiren Herstellung vosa nucleotiden aus d®n ©ntaprschenden Ribonucleoaiden war @m

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daher notwendig, die Hydroxylgruppen in der 2·- und 3¹-Stellung vor der Phosphorylierung in der 5'-Stellung mit gewissen Substituenten zu blockieren.

Die "bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von 5^!-Ribonuoleotiden aus den entsprechenden Ribonucleosiden bestehen somit darin, daß man die 2'- und 3'-Hydroxylgruppen des Hibofleanteils mit Aeylgruppen (a»Bo Acetyl- und Benzoylresten) oder der Ieopropylidengruppe blockiert und ansohließend die freie 5»-Hydroxylgruppe mit einem geeigneten Mittel phospliesyliert, worauf man die schützenden Gruppen entfernt»

Die bisher bekannten Verfahren lassen sich jedoch nicht vorteilhaft für die Herstellung von 5'-Bibonuoleotiden aus de», entsprechenden Hibonucleosiden im großtechnischen Maßstab anwenden^ weil sie viele umständliche Stufen, insbesondere die Maßnahme der Blockierung der 2'·- und 3'-Bydroacylgpuppaa. und der Entfernung der schützenden Gruppen leaner 1st die Produktausbeute niedrig.

Is wurd© aas. iiüerraeaheaderweise gefunden₈ daß nur die

grti-ppQ la Ί©γ- 5^f-Stellimg von Ribonucleesiden iir plaasplio^rliert wird, -ohne daß ein Schutz der Hydroi?flg5?iipp©a ia der 2*- und 3*-"Stellung vor der Phoephosyliemmg ο?£*©σ?ο.©3?11@Η isi^; _f wenn das Ribonuoleosid mit tiiWKi .^c^isiiQS^lierciagamilitel i& Gegenwart gewisser Ester ΤΟ.Ώ. gnri&^lceaoii' &Msqr öder Mitroverbindungen umgesetzt iiiifi öse pi3?lÄBl-feoao 3?^Miik-t der Hvdrolyse unterworfen wird.

Beit' T@2?fs?2;iros gQ3tI Se?⁰ KL'findyJig werden die 5*~Ribonucleo~

tld© ibx rmiQv isiDhmr^Q nna. in öiß£s©lier Weiüe ohne Sohuta der I^fsi5fo>5f-Ig5?!i|jgGfe iE ä@s? 2»- vjl& 3^f«^tellung erhalten· Ites Tepicl^oa läßt gioii ^rpteiliisfii S=U -y*i@i!.iiieoh.@n Maßstab f_s gIq BisatSaili^fea TGSrX-ßiiyeüssftuf^n, tuB* Schute 5Γΐ£?5?ίΐ^ρβΕί uß.a »iie latferoiing der entfallen·

9810/1876 ^{BAD 0RIGINAL}

!Für das Verfahren gemäß der Erfindung können Bibonucl·©- side verwendet werden, die Purinbasen (z.B. Adenin, Hypoxanthin, Guanin usw·), Pyrimidinbasen (a.Bo Cytosin, TTracil, Thymin uswo) oder Pyridinbasen (ζ·Β· Niootinsäureamid) enthalten. Dabei ist es gleichgültig, ob diese natürlichen oder synthetischen Ursprungs sind«

Als Ester organischer Säuren werden beim Verfahren gemäß der Erfindung Ester von organischen Carbonsäuren mit 2-7 C-Atomen, z.B. von aliphatischen organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Propionsäure, Acrylsäure, Oxalsäure) und aromatischen organischen Säuren (z.B. Benzoesäure), verwendet. Bevorzugt werden niedere aliphatisch^ Ester (z.B. Methyl-, Äthyl-, Propyl- und Butylester)_%dieser organischen Carbonsäurenj gegebenenfalls können auch höhere aliphstische Ester (z.B. Laurylester, Palmitylester uswo) oder .aromatische Ester (z.B. Phenylester) verwendet werden.

Als Nitroverbindungen eignen sich für das Verfahren gemäß der Erfindung nitrokohlenwasserstoffe mit 1-7 C-Atomen, z.B. aliphatische Mononitroverbindungen, wie Mtromethan, Nitroäthan, aliphatisohe Polynitroverbindungen, wie Tetranitromethan, 1,3-Dinitropropan, und aromatische Kitroverbind uugen, wie« Hitrobenzol,, Dinitrobenzol und m-Sitrotoluol. Diese Ester organischer Säuren und diese NItroverbindungen können erfolgreich allein oder in verschiedenen Kombinationen eingesetzt werden_e

Von den Estern von organischen Carbonsäuren führen insbesondere Äthylacetat, Methylacrylat und Äthylbenaoat zu den besten Ergebnissen. Von den Nitroverbindungen werden aliphatische oder aromatische Mononitroverbindungen bevorzugt, wobei die besten Ergebnisse mit Nitromethan und Kitrobenaol erhalten werden.

Als Phosphorylierungsmittel eignen sich für das Verfahren 009016/1875

BAD ORIGiNAL

gemäß der Erfindung beispielsweise Phosphortriehlorid, Phosphoroxychlorid, Phosphorpentaohlorid, Pyrophosphoryltetraohlorid, teilhydrolysiertes Phosphoroxychlorid, -pentachlorid oder -trichlorid, die durch Mischen von Wasser mit entsprechenden Phosphorverbindungen hergestellt werden, oder teilweise alkoholysiertes Phosphoroxychiorid, -pentaehlorid oder —triohlorid, die durch Mischen eines niederen Alkohols mit 1-4 C-Atomen (z.B. Methylalkohol, Äthylalkohol, Propylalkohol, Isopropylalkohol, Butylalkohol und t-Butylalkohol) mit der entsprechenden Phosphorverbindung hergestellt werden« Von diesen Phosphorylierungsmitteln führen Pyrophosphoryltetraohlorid und Phosphoroxychlorid au den besten Ergebnissen» Diese Verbindungen können allein oder in Kombination verwendet werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt, indem man das Phosphorylierungsmittel zum Ribonucleosid gibt, das in den Estern der organischen Säure oder in den Nitroverbindungen gelöst oder suspendiert ist, die Phosphorylierung stattfinden läßt und dann das erhaltene Produkt hydrolysiert·

Die vorstehend genannten Ribonucleoside, Ester von organischen Säuren, Nitroverbindungen und Phosphorylierungsmittel müssen nicht unbedingt in reiner Form verwendet werden.

Die verwendeten Mengen der Ester organischer Säuren, Nitroverbindungen und Phosphorylierungsmittel sind verschieden je nach der Art des Ribonucleosids, des Esters, der Nitroverbindungen oder der Phosphorylierungsmittel. Im allgemeinen wird das Phosphorylierungsmittel in einer Menge von etwa 1-30 Mol verwendet, wobei die optimale Menge bei Verwendung von Estern organischer Säuren etwa 2-10 Mol und bei Verwendung von Nitroverbindungen etwa 2—15 Mol, bezogen auf das Ribonucleosid, beträgt.

Die Ester organischer Säuren oder die Nitroverbindungen 009816/1875

BAD ORIGINAL

werden in einer Menge von wenigstens 40 Mol pro Mol Ribo_ nuoleosid verwendet· Da allgemeinen beträgt ihre Menge etwa 40-600 Mol, wobei die optimale Menge etwa 5O»1OO Mol pro Mol Ribonuoleosid beträgt,

innerhalb von etwa 1 bis 4- Stunden Die Reaktion verläuft leicht bei Raumtemperatur/. Gegefeenen-

falls kann während der Reaktion erhitzt oder gekühlt werden.

Bei Verwendung flüssiger Ester von organischen Säuron oder flüssiger Nitroverbindungen ist kein Lösungsmittel ©rforderlich, da diese Verbindungen als Lösungsmittel wirken« Dagegen wird bei Verwendung einer festen Verbindung @in geeignetes Lösungsmittel, wie Benzol, Xylol und !Eoluol, zusammen mit der Verbindung gebraucht·

Bei dieser Reaktion wird nur die 5'-Hydroxylgruppe des Ribonueleosids selektiv phosphoryliert. Bas erhalten® Produkt wird dann der Hydrolyse unterworfen, bei der das 5'-Ribonuoleotid gebildet wird·

Die Hydrolyse wird in an sich bekannter Weise dursixgeführt, indem beispielsweise das Reaktionsgemisch in Wasser, Torzugsweise gekühltes Wasser, gegossen wird, oder indem ans* powert des ia der ersten Stufe erhaltenen Reak/feioasge» misök©s auf einen Wert im schwaeh sauren Bereieh₈ mäßig auf etwa 1—2 .eingestellt wird,

bindung (s.B-_o IatKLrahydro^rd,

earTboaat und Esliim©arbonat) z

das gewünsoht® 5⁵"Eifeoim@l©©tia gebildete

Wie "be^Qi^Jm ©rw&featg laas©a. aich gemäß 5⁸-Bifeoi»2.@X@©tii.@ leioht aa©h ©in©m
unter Bediaguag©a_g ä±@ gegenüber d©n

BAD

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Beispiel 1

Zu einer Suspension von 1,35 Gew.-Teilen Inoain in 150 Raumteilen Äthylaceta* wurden 5 Raumteile iyropnosphoryltetraehlorid bei 0-5⁰C gegeben· Das Gemisch wurde bei der gleichen Temperatur 2 Stunden gerührte Das Reaktionsgemisch wurde in 250 Raumteile Eiswasser gegossen· Die wässrige Schicht wurde von der Xthylaoetatslabiht abgetrennt und mit einer 1-normalen wässrigen Natriumhydroxydlösung auf p„ 2 eingestellt· Die Analyse der so eingestellten Lösung durch Papier elektrophorese (Boratpuffer, p-g, 9,2) ergab, daß Inosin-5*-monophosphat in einer Ausbeute von gebildet worden war·

Die Lösung wurde dann an einer Säule von 20 Gew.-Teilen Aktivkohle adsorbiert· Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,Taigen wässrigen Natriumhydroxydlösung eluiert· Das Eluat wurde auf ρ_Η 8,6 eingestellt und eingeengt, wobei 1_S57 Gew.-Teile kristallines Dinatriumsal» von Ihosin-S^monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden· Auebeute 80%.

Beispiel 2

Zu einer Suspension von 1,2 Gew.-Teilen Adenosin in 150 Raumteilen Äthylacetat wurden 5 Raumteile I^rrophosph·- ryltetraehlorid bei 0-5⁰C gegeben· Das Gemisch wurde bei der gleisteil Temperatur 1 Stunde gerührt· Die Aufarbeitung des Heaktioasgomisohes auf die in Beispiel 1 beschriebene Veins ergab I₅,68 G&w.-Teile Kristalle des Dinatriumsalaes roa ^Ädeaögia«=5ⁱ~mon®phosphat (gerechnet als Anhydrid). Ausbeute Suff«

Beispiel 3

• Zu einer Suepension von 1,2 Gew.-Teiltn Uridin in 300 Raumteilen Xthylaoetat wurden 10 Raumteile Pyrophosphoryltetraohlorid bei 0-5⁰C gegeben· Das Gemisch wurde bei der

gleichen Temperatur 2 Stunden gerührt, wobei eine Reaktion 009816/187S bad original

mm *T mm

stattfand, und anschließend auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet· Die Analyse des Produkts durch Papierelektrophorese (Boratpuffer, p_H 9,2) ergab, daß Uridin-S'-monophosphat in einer Ausbeute von 7Ofi gebildet worden war,

Beispiel 4

Zu einer Suspension von 1,35 Gew.-Teilen Inosin in 150 Eaumteilen Äthylbenzoat wurden 5 Baumteile Pyrophosphoryltetrachlorid bei 0-5⁰O gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei der gleichen Temperatur gerührt, wobei eine Reaktion stattfand, und anschließend auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Die Analyse des Produkts durch Papierelektrophorese (Boratpuffer, p_H 9»2) ergab, daß Inosin-^-monophosphat in einer Ausbeute von 83?£ gebildet worden war.

Beispiel 5

Zu einer Suspension von 1,35 Gew.-Teilen Adenosin in 1.50 Baumteilen Methylacrylat wurden 5 Raumteile P^rrophosphoryltetrachlorid bei 0-5⁰O gegeben. Das Gemisoh wurde 1 Stunde bei der gleichen Temperatur gerührt, wobei eine Reaktion stattfand, und anschließend auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Die Analyse des Produkts durch Papierelektrophorese (Boratpuffer, p_H 9»2) ergab, daß Adenosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 9556 gebildet worden war.

Beispiel 6

Zu einer Suspension von 1,35 Gew.-Teilen Inosin in IiOO Raumteilen Äthylaoetat wurden 50 Raumteile Phasphoroxyohlorid bei 0-5⁰O gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 45-5O⁰G gerührt, wobei eine Reaktion stattfand, und anschließend auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Die Analyse des Produkts durch Papierelektrophoreae (Boratpffer, P_H 9f2) ergab, daß Inosin-S'-monophosphat selektiv gebildet worden war.

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Beispiel 7

Zu einer Suspension τοη 1,42 Gew„~Teilen Guanosin in 150 Raumteilen Äthylaoetat wurden 5 Raumteile Pyrophosphoryl« tetrachlorid bei 0-5⁰G gegeben· Das Gemisch wurde 4 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt, wobei eine Reaktion stattfand, und anschließend auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitete Die Analyse des Produkts durch Papierelektrophorese (Boratpuffer, p_H 9_f2) ergab, daß Guanosin-5^f-monophosphat selektiv gebildet worden war.

Beispiel 8

Zu einer Suspension von 1,2 Gew_o-Teilen Cytidin in 150 Raumteilen Äthylacetat wurden 5 Raumteile Pyrophoephoryltetrachlorid bei 0-5⁰C gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 1,38 Gew.-Teile Kristalle des Dinatriumsalzes von Gytidin~5^f-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 75$.

Beispiel 9^

Zu einer Suspension von 1,35 Gew.-Teilen Inosin in 150 Raumteilen ITitrobenzol wurden 5 Raumteile Pyrophosphoryl t et raohlo rid bei 0-5⁰O gegeben. Das Gemisch wurde 2 Std. bei der gleichen Temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 250 Raumteile Eiswasser gegossen und das Gemisch mit 250 Raumteilen Äther ausgeschüttelt, um das Kitrobenzol in die Ätherschicht zu überführen. Die Ätherschicht wurde mit Wasser gewaschen. Die mit dem Waschwasser vereinigte wässrige Schicht wurde mit einer 1-normalen wässrigen Natriumhydroxydlösung auf p_H 2 eingestellt.

Die Analyse des Produkts durch Papierelektrophorese (Boratpuffer, p_H 9»2) ergab, daß Inosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 82# gebildet worden war. Die Lösung wurde an einer Säule adsorbiert, die mit 20 Gew.-Teilen

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Aktivkohle gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,7#igen wässrigen Natriumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf p_H 8,6 eingestellt und eingeengt, wobei 1,49 Gew.-Teile Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-S'-monophosphat (gereohnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 76$.

Beispiel 1Q

Zu einer Suspension von 1,35 Gew.-Teilen Adenosin in 150 Raumteilen Uitrobenzol wurden 5 Raumteile Pyrophosphoryltetrachlorid bei 5-1O⁰O gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die in Beispiel 7 beschrieben® Weise aufgearbeitet, wobei 1,57 Gew.-Teile Kristalle des Dinatriumsalzes τοη Adenosin~5^f-monopiosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden· Ausbeute 80j£.

Beispiel 11

Zu einer Suspension von 1,2 Gew.-Teilen Uridin in 300 Raum*· teilen Kltromethan wurden 10 Raumteile PyrophospiLoryltetrachlorid bei 0-5⁰C gegeben· Das Gemisch wurde 2 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt, wobei eine Reaktion stattfand, und anschließend auf die in Beispiel 7 feesoliriebene Weise aufgearbeitet, nie Analyse des Produkts öursfe. Papierelektrophorese (Bomtpuffer, p„ 9>2) ergafe, iaS üridiisip»5^f-monophosphat in ein.@r Ausbeute von 55$ gebildet worden war·

Beispiel 12

Zu ©iaer Suepensioa von 1_S35 Gew_o~Teilen Inosia. in teil©a Nitroisen^ol wurden 5 Eaumt®il® PhospMorsa^ bei 0»5°0 gegeben* Das G>®m±s@n wurde 2 SttmcLan feel gleiehsn Temperatur gerührt, wobei ein© fi®akti©a stattfand_v und ans©hli®B©nd auf die in Beispiel J feoschriefeaae Weis« aufgearbeitet, Dia Analyse das Produkts durch Papierelektro« phorese (BoratFeffer, p_H 9_f2) ergab, daß Inoain«5«-monsphoe« phat selektiv gebildet worden war·

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden durch Phosphorylierung der entsprechenden Ribonucleoside, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phosphorylierung in Gegenwart von Carbonsäureestern oder organischen Nitroverbindungen durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonsäureester Ester von organischen Säuren mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere Äthylacetat, Methylacrylat oder Äthylbenzoat, und als organische Nitroverbindung Nitrokohlenwasserstoffe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere Nitrobenzol oder Nitromethan, einsetzt.

j5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der molare Anteil der Ester der organischen Säuren oder der organischen Nitroverbindungen zu dem Ribonucleo· sid etwa 40 bis etwa 600, insbesondere etwa 50 bis etwa 100, beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ribonucleosid Inosin, Guanosin, Adenosin, Cytidin oder Uridin einsetzt.

5« Verfahren imsh Anepruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß luan als Phosphorylierungsmittel Pyrophosphoryltetra- oder Phosphoroxychlorid einsetzt.

6. Verfahren nacsh Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet» daß Aus polare Verhältnis von Phosphorylierungsmittel "ssu Rifc^iUQleoeid etwa 2 bis etwa 15 beträgt.

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