DE1119278B

DE1119278B - Verfahren zur Phosphorylierung von Nucleosiden

Info

Publication number: DE1119278B
Application number: DED29518A
Authority: DE
Inventors: Dr Erich Thilo; Dr Herbert Grunze
Original assignee: Akademie der Wissenschaften der DDR
Current assignee: Akademie der Wissenschaften der DDR
Priority date: 1958-12-03
Filing date: 1958-12-03
Publication date: 1961-12-14

Description

Verfahren zur Phosphorylierung von Nucleosiden Die Reaktion zwischen Alkoholen und dem Pyrophosphorylchlorid führt gemäß der deutschen Patentschrift 1 082 586 nach dem allgemeinen Reaktionsschema ROH + PsO3Cl4 ) ROPOC12 + HOPOC12 primär zur Bildung eines äquimolekularen Gemisches von Dichlorphosphorsäureestern und freier Dichlorphosphorsäure.
In analoger Reaktion gelingt die Phosphorylierung von Nucleosiden mit Pyrophosphorylchlorid, denn das Pyrophosphorylchlorid vermag nicht nur mit alkoholischen C-OH-Gruppen unter Ausbildung einer C-O-P-Bindung zu reagieren, sondern tritt auch mit den C-OH-Gruppen von Nucleosiden in Reaktion.
Nach Michelson und Todd (»Journal of the Chemical Society of London«, 1949, S. 2476) kann man Guanosin-5'-phosphat aus 2': 3'-Isopropylidenguanosin durch Umsetzung mit Phosphoroxychlorid nur in 200/,iger Ausbeute herstellen. Khorana und Mitarbeiter (»Journal of the American Chemical Society«, Bd. 79 [1957], S. 3747 bis 3755) konnten das Guanosin-5'-phosphat zwar in etwa 70 °/Oiger Ausbeute gewinnen, jedoch liegen die Nachteile dieses Verfahrens in der verhältnismäßig mühevollen Abspaltung der p-Nitrophenylreste nach Durchführung der Phosphorylierung und in den außerordentlich zeitraubenden Methoden, die zur endgültigen Isolierung des Guanosin-5'-phosphats angewandt werden müssen.
Das beanspruchte Verfahren zur Herstellung der Nucleotide mittels Pyrophosphorylchlorid an Stelle von Phosphoroxychlorid bietet den Vorteil, daß die Phosphorylierung bereits bei tiefen Temperaturen erfolgt (im Gegensatz zur P-Cl-Bindung des Phosphoroxychlorids wird die P-O-P-Bindung des Pyrophosphorylchlorids bereits bei Temperaturen unter 0° C von C-OH-Gruppen gespalten) und daß sich aus den primär gebildeten Dichlorphosphorsäureestern der Nucleoside die Nucleosid-5'-phosphate durch einfache Hydrolyse mit Wasser darstellen lassen.
Die verfahrensgemäße Phosphorylierung von Nucleosiden wird in der Weise ausgeführt, daß man das Nucleosid, dessen C-OH-Gruppen, soweit sie nicht phosphoryliert werden sollen, durch eine Isopropylidengruppe geschützt sind, in der Kälte mit überschüssigem Pyrophosphorylchlorid versetzt und rührt, bis eine homogene Lösung entstanden ist. Versetzt man diese Lösung mit überschüssigem Wasser, so werden sämtliche P-Cl-Bindungen der Dichlorphosphorsäureester der Nucleoside und der Dichlor- phosphorsäure hydrolysiert, und es entsteht gemäß dem Reaktionsschema ROPOC12 + HOPOCl2 + 4H2O ROPO(OH)2 + PO(OH)3 + 4HCl ein Gemisch aus primärem Phosphorsäureester, Phosphorsäure und Salzsäure in wäßriger Lösung.
Hierauf spaltet man den Isopropylidenrest im schwach sauren Bereich in der Wärme ab. Aus diesem Gemisch läßt sich die Phosphorsäure durch Magnesiamixtur ausfällen, und die primären Phosphorsäureester lassen sich in Form geeigneter Salze (Calciumsalz, Bariumsalz) isolieren. Man kann auch die Abtrennung der primären Phosphorsäureester von der Phosphorsäure und der Salzsäure mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes vornehmen.
Das Guanosin-5'-phosphat und das Adenosin-5'-phosphat werden nach Elution vom Austauscherharz als Bariumsalze gefällt.
Ausführungsbeispiele 1. Herstellung von Guanosin-5'-phosphat 4mMol Isopropylidenguanosin (1,296 g) wurden auf - 30" C gekühlt und mit 40 mMol Pyrophosphorylchlorid (5,56 cm3) tropfenweise versetzt. Unter Rühren und langsamer Temperaturerhöhung auf + 200 C entstand eine homogene Lösung. Die Lösung wurde auf - 100 C abgekühlt und vorsichtig mit 20 cm3 Wasser versetzt. Die Lösung, die nunmehr Isopropylidenguanosin-5'-phosphat, Phosphorsäure und Salzsäure enthielt, wurde mit Natronlauge bis zu einem p-Wert von 2,7 abgestumpft und der Isopropylidenrest durch Kochen abgespalten. Nach der Neutralisation der Lösung mit Natronlauge wurde sie mit dem gleichen Volumen 2 n-Natronlauge versetzt und die Lösung auf eine Anionenaustauschersäule (Dowex 1 in der Chloridform) gegeben. Dann wurde mit 1 n-Natronlauge gewaschen, bis im Eluat kein anorganisches Phosphat mehr nachweisbar war.
Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Guanosin-5'-phosphat mit 1 n-Salzsäure eluiert, die Lösung mit Lithiumhydroxyd auf den p-Wert von 8,6 eingestellt und mit Bariumacetat versetzt. Nach Zusatz des doppelten Volumens Alkohol fiel das Bariumsalz des Guanosin-5'-phosphats als voluminöser Niederschlag aus, der zunächst mit 50°/Oigem Alkohol, dann mit reinem Alkohol und mit Äther gewaschen und im evakuierten Exsikkator getrocknet wurde.
Aus der eingeengten Mutterlauge wurde in gleicher Weise weiteres Bariumsalz isoliert.
Die Bestimmung der UV-Absorption ergab einen Gehalt von 3,40 mMol an phosphorylierter Guanosinverbindung.
Die Ausbeute an Guanosin-5'-phosphat betrug 70 bis 800/0. Das so hergestellte Guanosin-5'-phosphat ergab bei der papierchromatographischen Untersuchung in 5 verschiedenen Lösungsmitteln identische Rr-Werte mit einem Vergleichspräparat.
2. Darstellung von Uridin-5'-phosphat 3mMol Isopropylidenuridin (0,86 g) wurden auf 300 C abgekühlt und tropfenweise mit 9 mMol Pyrophosphorylchlorid (1,25 cm3) versetzt. Unter Rühren des Gemisches wurde die Temperatur langsam auf + 20° C erhöht, wobei vollständige Lösung eintrat. Zur Hydrolyse der P-CI-Bindungen des Isopropylidenuridindichlorphosphats und der P-O-P-und P-Cl-Bindungen des überschüssig vorhandenen Pyrophosphorylchlorides wurde das Reaktionsgemisch auf - 100 C gekühlt und danach vorsichtig mit 20 cm3 Wasser versetzt, die Lösung mit Lithiumhydroxyd auf einen pH-Wert von 2,7 eingestellt und zur Abspaltung des Isopropylidenrestes 20 Minuten auf 1000 C erhitzt. Die Lösung wurde mit Lithiumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt und das anorganische Phosphat mit Bariumacetat ausgefällt. Aus dem Filtrat wurde das Uridin-5'-phosphat durch Zugabe von Alkohol gefällt, mit Alkohol und Äther gewaschen und im Vakuum-Exsikkator getrocknet.
Die Messung der UV-Absorption ergab einen Gehalt von 2,35mMol an phosphorylierter Uridinverbindung.
Die papierchromatographische Untersuchung zeigte, daß kein nichtphosphoryliertes Uridin mehr vorhanden war und daß das dargestellte Uridin-5'-phosphat in 5 verschiedenen Lösungsmitteln identische R-Werte und im Hochspannungselektropherogramm dieselbe Wanderungsgeschwindigkeit wie ein käufliches Vergleichspräparat aufwies.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Phosphorylierung von Nucleosiden, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nucleosid, dessen C-OH-Gruppen, soweit sie nicht phosphoryliert werden sollen, durch eine Isopropylidengruppe geschützt sind, in der Kälte mit überschüssigem Pyrophosphorylchlorid behandelt, das Reaktionsgemisch mit überschüssigem Wasser versetzt und anschließend im schwach sauren Bereich in der Wärme aus dem Reaktionsprodukt die Isopropylidengruppe abspaltet und das dabei entstandene Nucleotid durch Ausfällen der Nebenprodukte als Salze oder durch Abtrennung mittels Anionenaustauscher reinigt und in Form eines Salzes isoliert.

In Betracht gezogene Druckschriften: »Journal of the American Chemical Society«, Bd. 79 (1957), S. 3747 bis 3755.