DE1301318B

DE1301318B - Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden

Info

Publication number: DE1301318B
Application number: DEA49561A
Authority: DE
Inventors: Yoshikawa Masaharu; Kato Tetsuya; Kusashio Koji
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1964-06-26
Filing date: 1965-06-24
Publication date: 1969-08-21
Also published as: CH427837A; NL6508163A; FR1601055A; US3347846A; GB1036297A; NL130793C

Description

Zur Isolierung des erhaltenen 5'-Ribonucleotids aus der Reaktionsmischung können übliche Methoden, Alkoholen mit Phosphoroxychlorid umgesetzt. Unter 20 wie Konzentrieren, Lösungsmittelextraktion oder Beden dort angewandten Reaktionsbedingungen: großer handlung mit Ionenaustauscherharz, benutzt werden. Phosphoroxychloridüberschuß bei Reaktionstempera- Bei dem Verfahren gemäß Erfindung wird als End-

turen zwischen 0 und 30 ⁰C, bilden sich hierbei — wenn produkt nur das Orthophosphat des entsprechenden überhaupt — höchstens die sauerreagierenden Mono- Ribonucleosids erhalten; das Pyrophosphat oder PoIyalkyl- bzw. Dialkylphosphorsäureesterchloride, die nur 25 phosphat konnte als Nebenprodukt nicht festgestellt bei Anwesenheit großer Phosphoroxychloridmengen werden.

eine Katalysatorwirkung ausüben. In größerer Menge Beispiel 1

angewandt, d. h. bei Anwesenheit geringer Phosphor-

oxychloridmengen, treten sie mit dem 2',3'-O-ge- Zu einer Mischung von 5,0 ecm Trimethylphosphat

schützten Ribonucleosid unter Bildung der entspre- 30 und 0,60 ecm Phosphoroxychlorid von —5°C gab chenden Nebenprodukte: 5'-Monoalkyl- bzw. 5'-Di- man 0,92 g 2',3'-O-Isopropyliden-uridin, ließ 9 Stunalkylphosphorsäureester, in Reaktion. den reagieren, setzte dann der Reaktionslösung 30 ecm

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ver- Äthyläther zu, filtrierte den ausgefallenen Niederwendeten neutralen Phosphorsäuretrialkylester stellen schlag ab, löste ihn in 10 ecm kaltem Wasser, stellte überraschenderweise sehr wirksame Katalysatoren dar, 35 den pH-Wert der wäßrigen Lösung mit Natronlauge die die Phosphorylierungsdauer bis auf 20 Minuten auf 1,5 ein und erhitzte die Lösung auf 70⁰C, wobei abzukürzen vermögen; sie lassen sich ohne Schwierig- die Isopropylidengruppe innerhalb von 30 Minuten keiten z. B. durch Extraktion aus dem Reaktions- abgespalten wurde.

medium zurückgewinnen und treten nicht mit dem In der hydrolysierten Lösung bildete sich 5'-Uridyl-

2',3'-O-geschützten Ribonucleosid in Reaktion, kön- 40 säure in einer Menge von 1,00 g, was einer Ausbeute nen also unbeschadet auch in größerer Menge ange- von 95% entsprach. Dann stellte man den pH-Wert wandt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren hat der Lösung mit Natronlauge auf 8,0 ein und fällte gegenüber dem bekannten Verfahren den Vorteil, daß mit 30 ecm Äthanol 1,13 g Dinatrium-5'-uridylat in bei kürzerer Umsetzungszeit und im allgemeinen ge- kristalliner Form aus der Lösung aus (Ausbeute 88 %). ringerem Phosphoroxychloridzusatz bessere Ausbeu- 45 Das Dinatrium-5'-uridylat wurde aus Wasser und ten als beim bekannten Verfahren erzielt werden Äthanol umkristallisiert,
können.

Beispiele für Phosphorsäuretrialkylester, die gemäß
Erfindung eingesetzt werden können, sind die Phosphorsäure-trimethyl-, -triäthyl-, tripropyl-, tri-n-butyl- 50
und -tri-iso-butyl-ester. Die Menge, in der sie angewandt werden, hängt von der in das Reaktionssystem
eingeführten Menge an Phosphorylierungsmittel ab.
Wird — auf das Ribonucleosid bezogen — das Phosphorylierungsmittel in äquimolarer Menge angewandt, 55 in der hydrolysierten Lösung gebildet, wie die Analyse wird der Phosphorsäuretrialkylester im Überschuß ergab.

Aus der Lösung erhielt man 1,19 g Dinatrium-5'-adenylat, was einer Ausbeute von 84% entsprach. Nach Umkristallisation aus Wasser und Äthanol erhielt man reines kristallines Dinatrium-5'-adenylat.

Beispiel 2

1,00 g 2',3'-O-Isopropyliden-adenosin wurde bei —15°C mit der gleichen Menge Trimethylphosphat und Phosphoroxychlorid wie im Beispiel 1 umgesetzt und nach vierstündiger Reaktion die erhaltene Reaktionslösung in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 weiter ausgearbeitet. 1,00 g 5'-Adenylsäure hatten sich

eingesetzt; wird dagegen das Phosphorylierungsmittel im Überschuß von einigen Mol angewandt, wird der Phosphorsäuretrialkylester in äquimolarer Menge oder im Überschuß eingesetzt.

Als Ausgangsmaterial können gemäß Erfindung 2',3'-O-geschützte Ribonucleotide, z. B. Purin-ribonucleoside, wie Adenosin, Xanthosin, Guanosin oder Inosin, Pyrimidin-ribonucleoside, wie Uridin, Cytidin,

Beispiel 3

Einer Mischung von 6 ecm Trimethylphosphat und und Imidazol-ribonucleoside, wie 5-Amino-4-carb- 65 4,8 ecm Phosphoroxychlorid setzte man 2,1 g 2',3'-O-amoyl-l-/?-D-ribofuranosylimidazol, in dem die 2'- und Isopropylidenguanosin zu und ließ sie bei 5° C reagie-3'-Stellungen durch Acylgruppen, wie Acetyl- oder ren. Die Reaktionsausbeute erreichte nach 20 Minuten Benzoylgruppen, oder Alkylidengruppen, wie Iso- Reaktionsdauer 88%.

Die Reaktionslösung wurde wie im Beispiel 1 weiter aufgearbeitet. Man erhielt 2,5 g rohes kristallines Dinatrium-5'-guanylat, was einer Ausbeute von 82% entsprach.

Beispiel 4

Einer Mischung von 10 ecm Triäthylphosphat und 0,72 ecm Phosphoroxychlorid gab man 2,1 g 2',3'-O-Isopropyliden-guanosin unter Kühlung auf —15° C zu, ließ 1 Stunde reagieren, goß die Reaktionslösung in 50 ecm Eiswasser, stellte den pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 1,5 ein und erhitzte die Lösung zur Abspaltung der Isopropylidengruppe 45 Minuten auf 75⁰C. 2,0 g 5'-Guanylsäure wurden durch Analyse in der Lösung festgestellt (85 %).

Der pH-Wert der hydrolysierten Lösung wurde mit Natriumhydroxyd auf 8,0 eingestellt und die Lösung unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 2,5 g Dinatrium-5'-guanylat (80%) erhalten.

20 Beispiel 5

1,94 g 5-Amino-4-carbamoyl-l-(2',3'-O-isopropyliden)-/S-D-ribofuranosyl-imidazol gab man zu einer Mischung von 10 ecm Triäthylphosphat und 0,90 ecm Phosphoroxychlorid und ließ bei —5°C 8 Stunden reagieren.

Die Reaktionsmischung wurde dann wie im Beispiel 4 weiter aufgearbeitet, wobei man 2,39 g rohes, kristallines Dinatrium-5'-monophosphat des 5-Amino-4-carbamoyl-l-/5-D-ribofuranosyl-imidazols erhielt (75%).

Beispiel 6

Eine Mischung von 10 ecm Trimethylphosphat und 3,6 ecm Tetrachlorpyrophosphat wurde auf —5°C gekühlt, danach 1,93 g 2',3'-O-lsobutyliden-cytidin zugegeben und 20 Stunden reagieren gelassen. Den bei Zugabe von 50 ecm Äthyläther gebildeten Niederschlag zentrifugierte man ab, löste ihn in 30 ecm Eiswasser und stellte den pH-Wert der wäßrigen Lösung auf 1,5 ein, um die Isobutylidengruppe abzuhydrolysieren. Die Lösung ließ man über Nacht stehen, stellte den pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 8,0 ein, engte die Lösung auf etwa 20 ecm ein und setzte 10 ecm Äthanol zu. Es fielen 2,68 g rohes kristallines Dinatrium-5'-cytidylat aus, was einer Ausbeute von 82% entsprach.

Beispiel 7

2,0 g 2',3'-O-Isobutyliden-inosin gab man zu einer Mischung von 10 ecm Tri-n-butylphosphat und 1,25 ecm Tetrachlorpyrophosphat, das auf —5° C gekühlt worden war, und ließ 4 Stunden reagieren.

Die Reaktionsmischung wurde wie im Beispiel 1 weiter aufgearbeitet. 5'-Inosinsäure hatte sich in einer Ausbeute von 96% gebildet, wie die Analyse ergab. Aus der Reaktionsmischung wurden 3,5 g rohes, kristallines Dinatrium-5'-inosinat 7,5 Hydrat erhalten (88%).

Beispiele

2,26 g 2',3'-O-Cyclohexyliden-inosin setzte man einer Mischung von 10 ecm Phosphoroxychlorid und 1,50 ecm Trimethylphosphat, das zuvor auf 5° C gekühlt worden war, zu und ließ 30 Minuten reagieren.

Die Reaktionsmischung wurde dann in analoger Weise wie im Beispiel 1 weiter aufgearbeitet, wobei man 3,49 g Dinatrium-5'-inosinat 7,5 Hydrat erhielt (Ausbeute: 87%).

Beispiel 9

2,1 g 2',3'-O-Isopropyliden-guanosin wurden mit 10 ecm Phosphoroxychlorid, das zuvor auf 5⁰C abgekühlt worden war, umgesetzt und die Ausbeute an 2',3'-OIsopropyliden-guanyldichlorid in den Proben, die während der Reaktion an einzelnen Punkten den Reaktionsmischungen entnommen und hydrolysiert worden waren, mittels Papierchromatographie bestimmt und als Ausbeute von 5'-Guanylsäure angegeben. Außer diesen Testen wurde die Reaktion in Gegenwart von 1,5 ecm Trimethylphosphat durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1
Zusatz von Trimethylphosphat

Nicht zugesetzt
Zugesetzt

V-Guanylsäureausbeute in % nach
I Std. ι 3 Std. I 6 Std.

6
64

84

14
87

Beispiel 10

Es wurden die gleichen Teste wie im Beispiel 9 unter Verwendung von 2,0 g 2',3'-O-Isopropylideninosin, 10 ecm Phosphoroxychlorid und 1,5 ecm Trin-butylphosphat durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2
Zusatz von Tri-n-butylphosphat

	0,5	5'-Inosinsäureausbeute in	IStd.	2 Std.	3	% nach	86
		Std.				Std. I 4 Std.	86
Nicht			26	70
zugesetzt..		9	86	88		81
Zugesetzt ...	71	89

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 5'-Ribonucleotiden durch Umsetzung von 2',3'-O-geschützten Ribonucleosiden mit Phosphoroxychlorid oder Tetrachlorpyrophosphat in Gegenwart von Reaktionsprodukten aliphatischer Alkohole mit Phosphoroxychlorid und Hydrolyse zunächst des erhaltenen 2',3'-O-geschützten Ribonucleosid-S'-phosphorsäureesterdichlorids und anschließend des 2',3'-O-geschützten 5'-Ribonucleotids, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsprodukt aliphatische Alkohole mit Phosphoroxychlorid einen Phosphorsäuretrialkylester verwendet.