DE2059429C2 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern durch Umsetzung eines Nucleosidphosphats mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart eines Phosphorsäureesters.

Es ist bereits bekannt, Nucleosiddiphosphatester durch Umsetzung des Nucleosidphosphats mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart eines Phorphorsäureesters in Pyridin oder Formamid als Lösungsmittel herzustellen. Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß es eine Reaktionsdauer von 7 Tagen erfordert, zahlreiche Nebenprodukte liefert und nur unbefriedigende Ausbeuten bis etwa 45% ergibt. Nach einem anderen Vorschlag wird vom Nucleosid-5'-phosphoramid als Dicyclohexylguanidiniumsalz ausgegangen und letzteres durch 16-stündiges Erhitzen in o-Chlorphenol bei 100° C mit einem Phosphorsäureester kondensiert. Bei diesem Verfahren wird zwar die Reaktionsdauer abgekürzt, die Ausbeuten sind jedoch ebenso unbefriedigend wie bei dem zuvor erwähnten Verfahren.

Neben diesem chemischen Verfahren wurde auch bereits die enzymatische Herstellung verschiedener Nucleosiddiphosphatester durch Umsetzung der entsprechenden Nucleosidtriphosphate mit Phosphorsäureestern in Gegenwart entsprechender Enzyme beschrieben. Dieses Verfahren ist für eine technische Herstellung der gewünschten Produkte ungeeignet.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur chemischen Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern, welches die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist und mit guten Ausbeuten ohne Bildung wesentlicher Mengen an störenden Nebenprodukten innerhalb kurzer Zeit zu den gewünschten Verbindungen führt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Nucleosiddiphosphatesters durch Umsetzung eines Nucleosidmonophosphats mit einem Phosphorsäureester in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid besteht darin, daß man eine methanolische Lösung einer Nucleosidmonophosphorsäure, welche Dicyclohexylcarbodiimid und einen Lösungsvermittler enthält, langsam mit einer methanolischen Lösung eines Phosphorsäureesters, die auf einen pH-Wert zwischen 1 und 6,5, vorzugsweise 4 bis 5 eingestellt worden ist, zusammenbringt. Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise bei Raumtemperatur oder geringfügig erhöhter Temperatur und führt innerhalb einiger Stunden zu Ausbeuten bis zu 90% und darüber.

Besonders überraschend ist, daß unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Nucleosid-5-phosphatester mit dem Lösungsmittel nicht oder nur in sehr geringen Mengen gebildet werden, da J. Moffat und H. G. Khorana in J. Am. Chem. Soc. 83, 649 (1961), unter ähnlichen Bedingungen die praktisch quantitative Bildung des entsprechenden Metylesters beschrieben haben. Überraschend ist weiter, daß nicht nur kaum Esterbildung mit dem Lösungsmittel auftritt, sondern auch kaum Dinucleosidpyrophosphate gebildet werden.

Die Nucleosidmonophosphorsäure kann von einem

natürlich vorkommenden oder synthetischen Nucleosid abgeleitet sein. Beispiele für geeignete natürliche Nucleoside sind Cytidin, Uridin, Thymidin, 5-Methylcytidin, 5-Hydroxymetnylcytidin, Pseudouridin, Adenosin, Guanosin, Inosin sowie die entsprechenden 2'-Desoxyverbindungea Die verwendbaren synthetischen Nucleoside stellen zumeist Derivate der oben erwähnten natürlichen Nucleoside dar.

Als zweite Komponente wird beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Phosphorsäureester verwendet. Die Phosphorsäure kann hierbei mil irgendeiner geeigneten hydroxylgruppenhaltigen organischen Verbindung verestert sein, vorausgesetzt, daß dieser Phosphorsäureester im erfindungsgemäß angewandten Lösungsmittel ausreichend löslich ist. Beispiele für geeignete hydroxylgruppenhaltige organische Verbindungen, die in Form ihrer Phosphorsäureester eingesetzt werden können, sind ein- und mehrwertige Alkohole und Aminoalkohole, wie z. B. Äthanolamin, Cholin, Zucker wie z. B. Glucose, Mannose, Galactose, Ribose, Glycerinaldehyd sowie die zugehörigen Ketosen und Aminozucker. Bevorzugte Phosphorsäureester für das Verfahren der Erfin-

dung sind Cholinphosphat, Äthanolaminphosphorsäure, Glucose-1-phosphat, GIucose-6-phosphat, Galactose-1-phosphat und Mannose-1-phosphat, Glucosamin-1-phosphat, Galactosamin-1 -phosphat usw., Mannosamin-1 -phosphat und entsprechende N-Acetylverbindüngen.

Als Lösungsmittel wird Methanol zusammen mit Lösungsvermittlern verwendet.

Geeignete Lösungsvermittler sind z. B. Piperidin, Cyclohexylajnin und Anilin sowie vorzugsweise Morpho-Hn.

Als Säure für die Einstellung des pH-Wertes in den erforderlichen Bereich zwischen 1 und 6,5 eignen sich grundsätzlich sowohl anorganische als auch organische Säuren, die in der methanolischen Lösung löslich sind.

Bevorzugt werden die Halogenwasserstoffsäuren, insbesondere Chlorwasserstoffsäure. Infolge der Wassertoleranz des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Säuren, insbesondere auch die Halogenwasserstoffsäure, in wasserhaltiger Form eingesetzt werden, beispielsweise als konzentrierte Salzsäure. Geeignete Säuren sind solche, die nicht zur Ausfällung eines Reaktionspartners führen oder irreversibel mit diesem reagieren (z. B. Schwefelsäure, Salpetersäure).

Die Phosphorsäureester können in Form ihrer Salze verwendet werden, insbesondere der käuflichen Alkali- und Erdalkalisalze. Als besonders geeignet haben sich die Calciumsalze erwiesen. Es wird angenommen, daß die Calciumionen hierbei lösungsvermittelnde Eigen-

schäften entwickeln. Aber auch Natrium-, Kalium-, Lithium-, Strontium-, Magnesium- und Bariumsalze und Salze von organischen Aminen erwiesen sich als geeignet Die Calciumsalze können auch als Mischsalze verwendet werden, beispielsweise als Mischsalze mit Halogenwasserstoffsäuren wie z. B. Cholinphosphatcalciumchlorid. Hierin ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zu sehen, da viele der einzusetzenden Reagentien in Form ihrer Calciumsalze teilweise als Calciumchloridsalze im Handel erhältlich sind und in dieser Form, ohne vorherige Trocknung, direkt eingesetzt werden können.

Wie bereits angegeben, ist es wesentlich, daß die Lösung des Phosphorsäureesters einen sauren pH-Wert aufweist Die besten Ergebnisse werden bei pH-Werten zwischen 4 und 5 erzielt Je nach den verwendeten Ausgangsmaterialien können aber auch niedrigere pH-Werte vorteilhaft sein. Unterhalb von pH 4 steigt jedoch die Tendenz zur Bildung des Methylesters.

Die Reaktionstemperatur ist an sich unkritisch, und die Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen 0 und etwa 80" durchgeführt werden. Bevorzugt werden Temperaturen zwischen 20 und 60°C.Wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die langsame Zugabe der sauren Phosphorsäureesterlösung zu der Lösung von Nucleosidphosphorsäure und Dicyclohexylcarbodiimid in Methanol. Vorzugsweise erfolgt diese Zugabe durch Eintropfen der Phosphorsäureesterlösung in eine gut gerührte Nucleosidphosphorsäurelösung.

Die Reinigung und Aufarbeitung der erhaltenen Produkte ist einfach, da sie bereits verhältnismäßig rein anfallen und im allgemeinen nur Spuren von Verunreinigungen enthalten. In vielen Fällen kristallisiert das Produkt im Lauf der Reaktion bereits direkt aus, z. B. in Form des Calciumsalzes. Die Fällung kann durch Zugabe eines die Löslichkeit des Produktes vermindernden weiteren Lösungsmittels, z. B. von Isopropanol, unterstützt werden.

Ein besonderer Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in seiner Einfachheit. Es läßt sich als Eintopfverfahren in relativ kurzer Zeit mit denkbar einfachen Apparaturen durchführen. Die Produkte lassen sich sehr leicht gewinnen und reinigen. Es wird nur ein einfaches und billiges Lösungsmittel verwendet, und infolge einer gewissen Wassertoleranz braucht dieses Lösungsmittel nicht besonders getrocknet zu werden. Damit entfällt auch der sonst übliche große Zeitaufwand zur Entfernung von Wasser aus dem Reaktionsmilieu mittels azeotroper Destillation, Behandlung mit Molekularsieben usw. Auf den Vorteil, daß die Ausgangsprodukte zumeist in Form der handelsüblichen Salze eingesetzt werden können, wurde bereits hingewiesen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Produkte sind physiologisch interessant und finden daher sowohl als Arzneimittel wie auch in der Forschung Verwendung. Zahlreiche der erhältlichen Verbindungen spielen eine große Rolle im physiologischen Zellgeschehen, beispielsweise bei der Biosynthese von Phosphatiden, von Zellwandstrukturen und dergl. So erfolgt die Biosynthese von Phosphatiden von Basen wie Lecithin, Kephalin und Sphingomyelin durch Aktivierung der Base, bei den übrigen Verbindungen mit weniger basischen Resten wie Serin, Inosit, Cardiolipin durch Aktivierung des Diglycerids. Die Aktivierung besteht dabei in allen Fällen in der Bildung der entsprechenden Cytidindiphosphatverbindung, welche den aktivierten Rest dann weiter übertragen kann. Bei einer Reihe von Krankheiten mit Phosphatidbeteiligung treten die Phospholipide vermindert auf, z. B. bei den »Glykolipid-Deseases«, Sphingomyelinase (Morbus Niemann-Bieck) u. a. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliches Cytidindiphosphatcholin wurde beispielsweise erfolgreich bei Hirnverletzungen als Lecithinvorläufer verabreicht und führte zu bemerkenswerten Verbesserungen der klinischen Symptome. Die Oberlebensrate bei Gehirnschädigungen konnte durch Behandlung mit

ίο dieser Substanz erheblich gesteigert werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1
U ridindiphosphatglucose

IO g Uridin-5'-monophosphat (U-5'-MP) als freie Säure (ca. 30 mM) werden in 500 ml reinem Methanol unter Zugabe von 7,5 ml Morpholin in Lösung gebracht und nach Zusatz von 10 g Dicylohexylcarbodiimid auf 50°C erwärmt. Zu dieser Lösung werden 90 mMol Glucose-1-phosphat, Morpholinsalz, in 500 ml Methanol gelöst und mit konz. Salzsäure auf pH = 4 eingestellt, langsam zugetropft. Nach 12- bis 15-stündiger Reaktionszeit bei 50° C werden unter gutem Rühren 500 ml Isopropanol zugegeben, der ausgefallene Niederschlag abzentrifugiert, in 250 ml Wasser gelöst, neutralisiert und auf eine IMAC-A-17-Säule (500 ml Inhalt, Formiatform) gegeben und mit einem linearen Gradienten von 0—0,5 N Ammoniumformiat, pH = 4, eluiert. Die Fraktionen mit UDP-glucose, die bei etwa 0,4 N Ammoniumformiat von der Säule kommen, werden über eine 2-1-Kohlesäule sofort entsalzt. Die Elution von der Kohle erfolgt mit Isopropanol: H2O : Ätznatron = 50 :50 :0,5. Die Eluate werden mit Natronlauge auf pH 7,2 gebracht, die Lösung im Vakuum konzentriert und das Natriumsalz von UDP-glucose mit dem 1 Ofachen Volumen Methanol gefällt.

Ausbeute: 8,5 bis 9 g (ca. 50% der Theorie bezogen auf eingesetztes U-5'-MP).

Analog wird mit Galactose-1-phosphat, Morpholinsalz, die entsprechende UDP-galactose erhalten.

Beispiel 2
Adenosindiphosphatgalactose

lSgGalactose-l-phosphat, Morpholinsalz, werden in 500 ml Methanol gelöst und durch Zusatz von konz. Salzsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 4 eingestellt. Diese Lösung wird langsam zu 200 ml einer 5O⁰C-warmen Methanollösung getropft, die 5 g Adenosin-5'-monophosphat (A-5'-MP), freie Säure, 3,5 ml Morpholin und 5 g Dicyclohexylcarbodiimid enthält. Nach einer Reaktionszeit von 15 Std. bei 5O⁰C und bei einem pH-Wert von 4—4,5 werden unter gutem Rühren 250 ml Isopropanol zugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert, in 200 ml destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert auf 7 eingestellt und anschließend auf einer lonenaustauschersäule (500 ml Inhalt; Typ Dowex 1X2, Formialform) aufgezogen. Das Produkt wird mit 0,7 N Natriumformiat eluiert und wie in Beispiel 1 über Kohle weiter aufgearbeitet. Die Ausbeute an ADP-galactose, Natriumsalz, beträgt 4,5 g (ca. 50% der Theorie, bezogen auf eingesetztes A-5'-MP).

Beispiel 3
Cytidindiphosphat-Äthanolamin

14,5 g Äthanolaminphosphorsäure, ca. 100 mMol, und 15 g Calciumchlorid (CaCI₂ · 2H₂O) werden in ca. 55 ml destilliertem Wasser gelöst, mit ca. 5 ml konzentrierter Salzsäure angesäuert und mit Methanol auf 500 ml aufgefüllt Diese Lösung wird langsam in eine 50^c -warme Methanollösup? (250 ml) eingetropft, die 11g Cytidin-5'-monophosphat (C-5'-MP), freie Säure, 8 ml Morpholin und 11 g Dicyclohexylcarbodiimid enthält Nach ca. 15 Std. Reaktionszeit bei 50" werden 300 ml Isopropanol zugegeben, der Niederschlag abfiltriert, in Wasser gelöst, neutralisiert und auf eine Anionenaustauscher-Säule (Typ Dowex 1X2, Formiatform, 50—100 mesh, 1000 ml Inhalt), chromatographiert Nach einem Vorwasch wird mit 0,02 M Ameisensäure das CDP-Äthanolamin eluiert. Die CDP-Äthanolamin-haltigen Fraktionen werden konzentriert, mit Natronlauge neutralisiert und schließlich durch Zusatz von Äthanol kristallisiert. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit Äthanol gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: ca. 12 g (70% der Theorie bezogen auf eingesetztes C-5'- M P).

Beispiel 4

2 g Cytidinphosphorsäure werden in 100 ml reinem Methanol unter Zugabe von 1,5 ml Morpholin in Lösung gebracht und nach Zugabe von 2 g Dicyclohexylcarbodiimid auf ca. 50° C erwärmt.

Obiger Reaktionslösung wird langsam eine Lösung von 5 g Cholinphosphat-calciumchlorid in 1751 Methanol, die 2,0 ml 36%ige Salzsäure enthält, zugetropft. Nach einer Reaktionszeit von 12 bis 15 Stunden bei 50° C werden unter gutem Rühren 250 ml Isopropanol zugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird abzentrifugiert, in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Chromatographiesäule mit 250 ml Anionenaustauscher Dowex 1 χ 2 in Formiatform gezogen. Die Säule wird mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen und mit 0,05 N Ameisensäure eluiert. Die Cytidindiphosphatcholin-haltigen Fraktionen werden bis zur Trockne konzentriert, in wenig Wasser gelöst, mit Natronlauge neutralisiert und durch Zusatz von Äthanol kristallisiert.

Ausbeute:3,2gCytidindiphosphatcholin— Na -4H₂O (90% der Theorie).

Beispiel 5

5 g Guanogin-5-monophosphat als freie Säure, werden in 100 ml dest. H₂O und 5 ml Morpholin gelöst und auf ca. 15 ml konzentriert. Dem öligen Konzentrat werden 100 ml Methanol, 2 ml Morpholin und 8 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugesetzt. Unter leichtem Rühren wird dem Reaktionsgemisch bei 50—55⁰C langsam eine Lösung von 15 g Glucose-1-phosphat, Morpholinsalz, in 500 ml Methanol, mit konz. HCl auf pH 4 eingestellt, zugetropft. Nach Beendigung der G-1-P-Zugabe wird der pH-Wert der Reaktionslösung mit konz. HCl auf 4,5 eingestellt. Nach weiteren 10 bis 15 Stunden bei pH 4,5 isi die Reaktion beendet. Die Reakiiuiislüsung wird im Vakuum auf ca. 200 ml konzentriert und gebildete Guanosindiphosphat-glucose durch Zugabe von 400 ml Isopropanol gefällt. Der Niederschlag wird in H2O gelöst, neutralisiert, und wie unter Beispiel 1 beschrieben, über eine IMAC-A 17-Säule gereinigt, über eine Kohlesäule entsalzt und mit Methanol gefällt.

Ausbeute: 3,5 g(40% der Theorie) GDP-gIucose-Na₂.

Claims (3)

1. Patentansprüche:

   t. Verfahren zur Herstellung von Nucleosiddiphosphatestern durch Umsetzung eines Nucleosidmonophosphats mit einem Phosphorsäureester in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid, dadurch gekennzeichnet, daß eine methanolische Lösung von Nucleosidmonophosphorsäure und Dicylohexylcarbodiimid, die einen Lösungsvermittler enthält langsam mit einer methanolischen Lösung eines Phosphorsäureesters, die auf einen pH-Wert zwischen 1 und 6,5 eingestellt worden ist, zusammengebracht wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur zwischen 0 und 80⁰C gearbeitet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsvermittler Morpholin verwendet wird.