DE2637598C3

DE2637598C3 - Orthorhombisches Monolithiumsalz des β-Nicotinamid-adenindinucleotids und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2637598C3
Application number: DE2637598A
Authority: DE
Inventors: Dr.rer.nat. Günter Weimann
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1976-08-20
Filing date: 1976-08-20
Publication date: 1981-04-02
Also published as: DE2637598B2; JPS5434759B2; DE2637598A1; DK145826C; FR2362159B1; SU932992A3; NL7707022A; SE442118B; DK145826B; US4148994A; NL171809B; GB1561954A; NL171809C; HU179125B; DK351477A; IT1081815B; JPS5325598A; FR2362159A1; SE7707449L

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß /J-Nicotinamidadenin-dinucleotid in Form d°r freien Säure oder eines ihrer Salze in an sich bekannter Weise in eine verdünnte, wäßrige Lösung des Lithiumsalzes des /J-Nicotinamid-adenin-dinucleotids übergeführt, auf einen pH-Wert zwischen 3 und 7, vorzugsweise zwischen 3,7 und 4,0 eingestellt, bei einer Temperatur zwischen 10 und 50⁰C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bis zur beginnenden Trübung versetzt und vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen + 4 und +30° C kristallisiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril oder Dioxan verwendet wird.

/J-Nicotinamid-adenin-dinucleotid (=/J-NAD) kommt als Coenzym zahlreicher Dehydrogenasen in allen lebenden Organismen vor und nimmt dort bei biochemischen Redox-Prozessen eine Schlüsselfunktion ein. Die Verbindung wurde 1904 von Harden und Young bei deren Arbeiten über die alkoholische Gärung entdeckt und durch Warburg und Christian 1934 in ihrer chemischen Konstitution aufgeklärt. In neuerer Zeit hat /3-NAD vor allem als Meßparameter in der enzymatischen Analyse bei der Bestimmung von Enzymaktivitäten und Substratkonzentrationen für die klinische Diagnose ständig an Bedeutung gewonnen. Der Umfang der industriellen NAD-Produktion hat dementsprechend weltweit stark zugenommen.

Große Störungen und fehlerhafte Ergebnisse werden in der enzymatischen Analytik mit NAD jedoch dann beobachtet, wenn das eingesetzte NAD kontaminiert ist (z. B. Dalziel, J. Biol. Chem. 238, 1538 [1963]), da sogar Fragmente des NAD-Moleküls selbst starke kompetitive Inhibitoren des Coenzyms sind. Deshalb wurde schon früher versucht, besonders reines NAD durch Kristallisation herzustellen. Walle η f e 1 s und Christian gelang erstmals die Kristallisation von NAD in Form des Chininsalzes (K. WaI-lenfels und W. Christian in S. P. Colowick und N. O. Kaplan in Methodes in Enzymology Vol. 3, Academic Press, New York, 1957, S. 882). Winer (A.D. Winer, J. Biol.Chem.239, P. C. 3598 [1964]) berichtete später über die Kristallisation von NAD in Form der freien Säure.

Keines dieser Verfahren zur Kristallisation von /J-NAD hat jedoch praktische Bedeutung erlangt, da sie wegen schlecht standardisierbarer Parameter nicht reproduzierbar, in der Durchführung zu aufwendig, hinsichtlich de· Ausbeute zu verlustreich und hinsichtlich

der Produktgüte nicht befriedigend waren.

Bei ciüen heute praktizierten Verfahren zur Herstellung von NAD liegt in der Endstufe eine Lösung vor, die durch Verfahren wie z. B. Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Sprühtrocknung und/oder Gefriertrocknung in eine feste Form gebracht wird. Das nach einem dieser Verfahren gewonnene NAD ist amorph, sehr hygroskopisch und zerfließt an der Luft. Die Instabilität des amorphen NAD erfordert besondere, meist kostenintensive Vorkehrungen (Luftausschluß, Schutzgas und dergleichen) bei Lagerung, Versand und Verarbeitung. Trotz besonderer Vorkehrungen lassen sich aber Schwankungen der Produktqualität nicht vermeiden, wodurch oft erhebliche Schwierigkeiten auftreten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden und ein unter Normalbedingungen stabiles, kristallisiertes /J-NAD-SaIz zu schaffen, das einfach, reproduzierbar und mit guter Ausbeute hergestellt werden kann.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch das orthorhombische Monolithiumsalz des /3-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-dihydrats mit der Raumgruppe P2j 2. 2., den Zelldimensionen a = 10,073 ±0,003 A,
b = 15,839 ±0,004 A,
c = 17,821 ±0,004 A und den Winkeln
α=β = γ = 90° gelöst.

Die Aufgabe wird ferner durch ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Lithiumsalzes des jS-NAD gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß /J-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze in an sich bekannter Weise in eine verdünnte, wäßrige Lösung des Lithiumsalzes des /J-Nicotinamid-adenin-dinucleotids übergeführt, auf einen pH-Wert zwischen 3 und 7, vorzugsweise zwischen 3,7 und 4,0 eingestelit, bei einer Temperatur zwischen 10 und 50° C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bis zur beginnenden Trübung versetzt und vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen +4 und +30° C kristallisiert wird.

Als mit Wasser mischbares, organisches Lösungsmittel kann beim erfindungsgemäßen Verfahren grundsätzlich jedes Lösungsmittel, das diese Eigenschaften aufweist, verwendet werden. Bevorzugt verwendet werden jedoch niedere Alkohole, Ketone, Nitrile und zyklische Äther, insbesondere Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril oder Dioxan.

Falls bei der Herstellung des Lithiumsalzes des ß-NAD nicht bereits vom gefällten, sprühgetrockneten und/oder lyophilisierten amorphen Lithiumsalz des /3-NAD ausgegangen werden kann, kann das NAD in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze leicht in üblicher Weise in das /J-NAD-Lithium übergeführt werden. NAD in Form der freien Säure kann beispielsweise durch Passage über einen mit Lithiumionen beladenen Ionenaustauscher oder durch vorsichtiges Einstellen des pH-Wertes mit verdünntem Lithiumhydroxid in das Lithiumsalz umgewandelt werden.

Das erfindungsgemäße Lithiumsalz weist die Nachteile der bisher isolierten, bekannten NAD-Derivate nicht auf; es ist nicht hygroskopisch, rieselfähig, lagerstabiler und ergibt in der chemischen und enzymatischen Analyse einen Gehalt von 100% (± 0,2%), bezogen auf /3-NAD. Das Salz ist weiß und völlig

geruchlos. Die üblichen Hauptverunreinigungen von handelsüblichem j8-NAD, insbesondere a-NAD und ADP-Ribose sind in dem erfindungsgemäßen Produkt allenfalls noch in Spuren nachzuweisen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß die Ausbeuten an Lithiumsalz des /J-NAD nahezu quantitativ sind. Die nach diesem Verfahren hergestellten Produkte ergeben in der Enzymkinetik im Vergleich zu den besten NAD-Handelspräparaten einen um 10 bis 20% höheren Wert. Zudem ist das erfindungsgemäße Verfahren technisch weniger aufwendig als die bekannten Methoden zur Isolierung von festen NAD-Derivaten und somit wirtschaftlicher.

Das Monolithiumsalz des /S-NAD-Dihydrats kann - außer in der oben beschriebenen Weise - auch aus reinem Wasser kristallin erhalten werden, wenn man die NAD-Lösung bei Konzentrationen von 100 mg/ ml bis 1000 mg/ml, vorzugsweise von 500 mg/ml, einige Zeit bei einem pH-Wert von etwa 3,7 bei Raumtemperatur stehen läßt. Prinzipiell läßt sich die Umkristallisation durch Erwärmen auf höhere Temperaturen (bis 60 ° C) und anschließendes langsames Abkühlen auf Raumtemperatur herbeiführen, wenngleich die Ausbeuten an Reinprodukt nach diesem Verfahren wegen der Empfindlichkeit der Substanzen sinken.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

1 g /3-NAD-Lithiumsalz (hergestellt durch Passage einer Lösung der freien Säure über Dowex 50 in der Lithiumform und anschließende Lyophilisation) wird in 2 ml Wasser gelöst, bei Raumtemperatur unter Rühren tropfenweise mit 1,2 ml Aceton bis zur gerade noch verschwindenden Trübung versetzt und bei 20 bis 25 ° C der Kristallisation überlassen. Das auskristallisierte Produkt wird nach 30 Stunden abgesaugt, zweimal mit wenig Aceton-Wasser (1:2) gewaschen und über P₂O₅ im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 900 mg (90% des Einsatzes an Lyophilisat).

Beispiel 2

1 g lyophilisiertes/3-NAD-Lithiumsalz wird in 2 ml Wasser gelöst und bei Raumtemperatur unter Rühren tropfenweise mit 3,6 ml Methanol bis zur gerade noch verschwindenden Trübung versetzt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Nach Trocknung erhält man 900 mg (90% des Einsatzes) kristallisiertes Lithiumsalz.

Beispiel 3

1 g,/3-NAD in Form der lyophilisierten freien Säure wird in 0,75 ml H₂O gelöst und unter Rühren durch tropfenweise Zugabe von 1,3 ml 1 N-Lithiumhydroxid auf pH 4 eingestellt. Dann fügt man 2 ml Methanol zu und läßt ca. 30 Stunden bei 20 bis 25 ° C stehen. Nach Aufarbeitung wie unter Beispiel 1 beschrieben,

werden 900 mg (90% des Einsatzes) kristallisiertes /3-NAD-Lithiumsalz erhalten.

Beispiel 4

1 glyophilisiertes/3-NAD-Lithiumsalz wird in 2 ml Wasser gelöst und, wie unter Beispiel 1 beschrieben, mit 0,8 ml Isopropanol versetzt. Nach Absaugen, Waschen und Trocknen werden 800 mg (80% des Einsatzes) kristallisiertes Lithiumsalz erhalten.

Beispiel 5

0,5 mg lyophilisiertes /3-NAD-Lithiumsalz werden in 1 ml Wasser gelöst und, wie unter Beispiel 1 beschrieben mit 0,85 ml Dioxan versetzt. Die Kristallisationsausbeute beträgt 70% des Einsatzes an Lyophilisat.

Beispiel 6

0,5 g lyophilisiertes /3-NAD-Lithiumsalz werden in 1 ml Wasser gelöst und, wie unter Beispiel 1 beschrieben, mit 0,4 m] Acetonitril langsam versetzt. Das kristallisierte Lithiumsalz wird in einer Ausbeute von 80%, bezogen auf den Einsatz an Lyophilisat, erhalten.

Beispiel 7

0,5 g lyophilisiertes /3-NAD-Lithiumsalz werden in 1 ml Wasser gelösi und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach 5 bis 6 Tagen beginnt die Abscheidung ίο von Kristallen; man läßt zur Vervollständigung der Kristallisation noch weitere 3 bis 4 Tage bei Raumtemperatur stehen. Die Ausbeute beträgt 40%, bezogen auf den Einsatz an Lyophilisat.

Analyse des orthorhombischen Monolithiumsalzes:

^J> Summenformel: C,,H,₆N₇O_MP₂Li · 2H₂O

Molgewicht: 705,4

NAD (enzymatisch mit
_w ADH): 93,5%

Wasser: 5,5%

Lithium: 1,17%

Fp: 203 bis 203,5° (Z.). unkorrigiert

Elementaranalyse:

₄. Gefunden: C 35,28%, H 3,99%, N 13,59%,

P 8,73%

Berechnet: C 35,76%, H 4,28%, N 13,90%,

P 8,78%

Kristallographische Daten:
-₍₎ Kristallsystem: orthorhombisch

Winkel: α, β, γ: alle 90°

Raumgruppe: P2, 2, 2,

Zelldimensionen:

a = 10,073 Ä ± 0,003
-, b= 15,839 A ±0,004
" c= 17,821 Ä + 0,004

Kristalldichte: 1,65 g/cm.

Der Kristall besteht aus einer Formeleinheit in der asymmetrischen Einheit.

Claims

Patentansprüche:

1. Orthorhombisches Monolitihiumsalz des /J-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-dihydrats mit der Raumgruppe P2 2, 2,, den Zelldimensionen a = 10,073 ±0,003 A,

ö = 15,839 ±0,004 A,

c = 17,821 ±0,004 A und Winkeln