CH639398A5 - Crystallised metal salts of beta-nicotinamide adenine dinucleotide and process for their preparation - Google Patents

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CH639398A5
CH639398A5 CH1010177A CH1010177A CH639398A5 CH 639398 A5 CH639398 A5 CH 639398A5 CH 1010177 A CH1010177 A CH 1010177A CH 1010177 A CH1010177 A CH 1010177A CH 639398 A5 CH639398 A5 CH 639398A5
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crystallized
nicotinamide adenine
salts
adenine dinucleotide
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CH1010177A
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Inventor
Klaus Muehlegger
Guenter Dr Weimann
Michael D Nelboeck-Hochstetter
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16Purine radicals
    • C07H19/20Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C07H19/207Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids the phosphoric or polyphosphoric acids being esterified by a further hydroxylic compound, e.g. flavine adenine dinucleotide or nicotinamide-adenine dinucleotide

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Abstract

An aqueous solution of beta -NAD lithium salt is adjusted to a pH between 3 and 7 and while stirring at room temperature, a water-miscible organic solvent is added dropwise until the turbidity just still disappears. It is then crystallised at 20 to 25 DEG C and about 900 mg of lyophilisate are obtained after filtering off with suction, washing and drying. The salts are important in enzymatic analysis.

Description

       

  
 

**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.

 



   PATENTANSPRÜCHE
1. Kristallisierte Metallsalze des   ss-Nicotinamid-adenin-    dinucleotids.



   2. Metallsalze nach Anspruch 1 als kristallisierte Alkalisalze.



   3. Metailsalze nach Anspruch 1 oder 2 als orthorhombisches Monolithiumsalz des   ss-Nicotinamid-adenin-dinu-    cleotid-dihydrats mit der Raumgruppe   P21 2i2i,    den Zelldimensionen a =   10,0731    0,003A, b =   15,8391      0,004Ä,    c = 17,821   +    0,004A und Winkeln   clL=P=y=90".   



   4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass   B-Nicotinamid-adenin-dinucleotid    in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze in eine verdünnte, wässrige Lösung des Metallsalzes des   f3-Nicotinamid-adenin-dinucleotids    übergeführt, auf einen pH-Wert zwischen 3 und 7 eingestellt, bei einer Temperatur zwischen 10 und   50"C    mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bis zur beginnenden Trübung versetzt und kristallisiert wird.



   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel beispielsweise Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril oder Dioxan verwendet wird.



   6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 3,7 und 4,0 eingestellt wird.



   7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei Raumtemperatur mit dem organischen Lösungsmittel versetzt wird.



   8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei einer Temperatur zwischen +4 und   +30"C    kristallisiert wird.



   Die Erfindung betrifft kristallisierte Metallsalze des   ss-Nicotinamid-adenin-dinucleotids      (=p-NAD)    und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.



   ss-NAD kommt als Coenzym zahlreicher Dehydrogenasen in allen lebenden Organismen vor und nimmt dort bei biochemischen Redox-Prozessen eine Schlüsselfunktion ein. Die Verbindung wurde 1904 von Harden und Young bei deren Arbeiten über die alkoholische Gärung entdeckt und durch Warburg und Christian 1934 in ihrer chemischen Konstitution aufgeklärt. In neuerer Zeit hat   ss-NAD    vor allem als Messparameter in der enzymatischen Analyse bei der Bestimmung von Enzymaktivitäten und Substratkonzentrationen für die klinische Diagnostik ständig an Bedeutung gewonnen.



  Der Umfang der industriellen NAD-Produktion hat dementsprechend weltweit stark zugenommen.



   Grosse Störungen und fehlerhafte Ergebnisse werden in der enzymatischen Analytik mit NAD jedoch dann beobachtet, wenn das eingesetzte NAD kontaminiert ist (z.B. Dalziel, J. Biol.   Chem. 238, 1538    (1963)), da sogar Fragmente des NAD-Moleküls selbst starke kompetitive Inhibitoren des Coenzyms sind. Deshalb wurde schon früher versucht, besonders reines NAD durch Kristallisation herzustellen.



  Wallenfels und Christian gelang erstmals die Kristallisation von NAD in Form des Chininsalzes (K. Wallenfels und W. Christian in S.P. Colowick und N.O. Kaplan in Methodes in Enzymology Vol. 3, Academic Press, New York, 1957,   S. 882).    Winer (A.D. Winer, J. Biol. Chem. 239,   P.C. 3598    (1964)) berichtete später über die Kristallisation von NAD in Form der freien Säure.



   Keines dieser Verfahren zur Kristallisation von ss-NAD hat jedoch praktische Bedeutung erlangt, da sie wegen schlecht standardisierbarer Parameter nicht reproduzierbar, in der Durchführung zu aufwendig, hinsichtlich der Ausbeute zu verlustreich und hinsichtlich der Produktgüte nicht befriedigend waren.



   Bei allen heute praktizierten Verfahren zur Herstellung von NAD liegt in der Endstufe eine Lösung vor, die durch Verfahren wie z.B. Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Sprühtrocknung und/oder Gefriertrocknung in eine feste Form gebracht wird. Das nach einem dieser Verfahren gewonnene NAD ist amorph, sehr hygroskopisch und zerfliesst an der Luft. Die Instabilität des amorphen NAD erfordert besondere, meist kostenintensive Vorkehrungen (Luftausschluss, Schutzgas und dergleichen) bei Lagerung, Versand und Verarbeitung. Trotz besonderer Vorkehrungen lassen sich aber Schwankungen der Produktqualität nicht vermeiden, wodurch oft erhebliche Schwierigkeiten auftreten.



   Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden und unter Normalbedingungen stabile, kristallisierte   ss-NAD-Derivate    zu schaffen, die einfach, reproduzierbar und mit guter Ausbeute hergestellt werden können.



   Diese Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch kristallisierte Metallsalze des   ss-Nicotinamid-adenin-dinucleotids    gelöst. Vorzugsweise liegen die Metallsalze nach der Erfindung als Alkalisalze vor.



   Besonders vorteilhaft wird die genannte Aufgabe z.B.



  durch orthorhombisches Monolithiumsalz des   ss-Nicoti-    namid-adenin-dinucleotid-dihydrats mit der Raumgruppe P21 2   2"    den   Zelldimensionen    a =   10,0731      0,003Ä,    b =   15,83910,004 A, c = 17,821 + 0,004Aund den den Winkeln      a=P=y=90"    gelöst.



   Die Aufgabe kann ferner durch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Metallsalze des   ss-NAD    gelöst werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass   ss-Nicotinamid-    adenin-dinucleotid in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze in eine verdünnte, wässrige Lösung des Metallsalzes des ss-Nicotinamid-adenin-dinucleotids übergeführt, auf einen pH-Wert zwischen 3 und 7 eingestellt, bei einer Temperatur zwischen 10 und   50"C    mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bis zur beginnenden Trübung versetzt und kristallisiert wird.



   Als mit Wasser mischbares, organisches Lösungsmittel kann beim erfindungsgemässen Verfahren grundsätzlich jedes Lösungsmittel, das diese Eigenschaften aufweist, verwendet werden. Bevorzugt verwendet werden jedoch niedere Alkohole, Ketone, Nitrile und zyklische Äther, insbesondere Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril oder Dioxan.



   Der pH-Wert wird vorzugsweise zwischen 3,7 und 4,0 eingestellt. Vorzugsweise wird bei Raumtemperatur mit dem organischen Lösungsmittel versetzt. Die Kristallisation erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur zwischen +4 und   +30"C.   



   Falls bei der Herstellung des Metallsalzes des   t3-NAD    nicht bereits vom entsprechenden gefällten, sprühgetrockneten und/oder lyophilisierten amorphen Metallsalz des   ss-NAD    ausgegangen werden kann, kann das NAD in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze leicht in üblicher Weise in das ss-NAD-Metallsalz übergeführt werden. NAD in Form der freien Säure kann beispielsweise durch Passage über einen mit den entsprechenden Metallionen beladenen Ionenaustauscher (Typ Dowex 50 oder   I.R. 120)    oder durch vorsichtiges Einstellen des entsprechenden pH-Wertes mit verdünntem Hydroxid in das Metallsalz umgewandelt werden.

 

  NAD-Salze werden ebenfalls durch Behandlung mit beispielsweise einem mit Metallionen beladenen Ionenaustauscher in das gewünschte   ss-NAD-Salz    übergeführt.



   Zur Herstellung des besonders bevorzugten orthorhombischen Monolithiumsalzes des   ss-NAD-Dihydrats    wird   z.B.     



  dementsprechend von amorphem Monolithiumsalz des



     B-NAD    oder von   ss-NAD    in Form der freien Säure ausgegangen. Die freie Säure wird z.B. durch Passage über einen mit Lithiumionen beladenen lonenaustauscher oder durch vorsichtiges Einstellen des pH-Wertes mit verdünntem Lithiumhydroxid in das Lithiumsalz umgewandelt.



   Die erfindungsgemässen Metallsalze weisen die Nachteile der bisher isolierten, bekannten NAD-Derivate nicht auf; sie sind z.B. nicht-hygroskopisch, rieselfähig, lagerstabiler und ergeben z.B. in der chemischen und enzymatischen Analyse einen Gehalt von   100%      (+    0,2%), bezogen auf P-NAD. Die Salze sind weiss und völlig geruchlos. Die üblichen Hauptverunreinigungen von handelsüblichem   f3-NAD,    insbesondere a-NAD und ADP-Ribose sind in den erfindungsgemässen Produkten z.B. allenfalls noch in Spuren nachzuweisen.



   Das Herstellungsverfahren der erfindungsgemässen Metallsalze hat den Vorteil, das beispielsweise die Ausbeuten an Metallsalzen des   p-NAD    nahezu quantitativ sind. Die nach diesem Verfahren hergestellten Produkte ergeben z.B. in der Enzymkinetik im Vergleich zu den besten NAD-Handelspräparaten einen um 10 bis 20% höheren Wert. Zudem ist das Herstellungsverfahren der erfindungsgemässen Metallsalze z.B. technisch weniger aufwendig als die bekannten Methoden zur Isolierung von festen NAD-Derivaten und somit wirtschaftlicher.



   Das Monolithiumsalz des   ss-NAD-Dihydrats    kann - ausser in der oben beschriebenen Weise - auch aus reinem Wasser kristallin erhalten werden, wenn man die NAD-Lösung z.B.



  bei Konzentrationen von 100 mg/ml bis 1000 mg/ml, vorzugsweise von 500 mg/ml, einige Zeit bei einem pH-Wert von etwa 3,7 bei Raumtemperatur stehen lässt. Prinzipiell lässt sich die Umkristallisation z.B. durch Erwärmen auf höhere Temperaturen (bis   60"C)    und anschliessendes langsames Abkühlen auf Raumtemperatur herbeiführen, wenngleich die Ausbeuten an Reinprodukt nach diesem Verfahren wegen der Empfindlichkeit der Substanzen sinken.



   Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.



   Beispiel 1
1 g   ss-NAD-Lithiumsalz    (hergestellt durch Passage einer Lösung der freien Säure über Dowex 50 in der Lithiumform und anschliessende Lyophilisation) wird in 2 ml Wasser gelöst, bei Raumtemperatur unter Rühren tropfenweise mit   1.7    ml Aceton bis zur gerade noch verschwindenden Trübung versetzt und bei 20 bis   25"C    der Kristallisation überlassen.



  Das auskristallisierte Produkt wird nach 30 Stunden abgesaugt, zweimal mit wenig   Aceton-Wasser (1:2)    gewaschen und über P2Os im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 900 mg (90% des Einsatzes an Lyophilisat).



   Beispiel 2
1 g lyophilisiertes   ss-NAD-Lithiumsalz    wird in 2 ml Wasser gelöst und bei Raumtemperatur unter Rühren tropfenweise mit 3,6 ml Methanol bis zur gerade noch verschwindenden Trübung versetzt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Nach Trocknung erhält man 900 mg (90% des Einsatzes) kristallisiertes Lithiumsalz.



   Beispiel 3
1 g   ss-NAD    in Form der lyophilisierten freien Säure wird in 0,75 ml H20 gelöst und unter Rühren durch tropfenweise Zugabe von 1,3 ml 1 N-Lithiumhydroxid auf pH 4 eingestellt.



  Dann fügt man 2 ml Methanol zu und lässt ca. 30 Stunden bei 20 bis   25"C    stehen. Nach Aufarbeitung wie unter Beispiel 1 beschrieben, werden 900 mg (90% des Einsatzes) kristallisiertes   ss-NAD-Lithiumsalz    erhalten.



   Beispiel 4
1 g lyophilisiertes   ss-NAD-Lithiumsalz    wird in 2 ml Wasser gelöst und, wie unter Beispiel 1 beschrieben, mit 0,8 ml Isopropanol versetzt. Nach Absaugen, Waschen und Trocknen werden 800 mg (80% des Einsatzes) kristallisiertes Lithiumsalz erhalten.



   Beispiel 5
0,5 mg lyophilisiertes   ss-NAD-Lithiumsalz    werden in 1 ml Wasser gelöst und, wie unter Beispiel 1 beschrieben, mit 0,85 ml Dioxan versetzt. Die Kristallisationsausbeute beträgt 70% des Einsatzes an Lyophilisat.



   Beispiel 6
0,5 lyophilisiertes   p-NAD-Lithiumsalz    werden in 1 ml Wasser gelöst und, wie unter Beispiel 1 beschrieben, mit 0,4 ml Acetonitril langsam versetzt. Das kristallisierte Lithiumsalz wird in einer Ausbeute von 80%, bezogen auf den Einsatz an Lyophilisat, erhalten.



   Beispiel 7
0,5 g lyophilisiertes   ss-NAD-Lithiumsalz    werden in 1 ml Wasser gelöst und bei Raumtemperatur stehen gelassen.



  Nach 5 bis 6 Tagen beginnt die Abscheidung von Kristallen; man lässt zur Vervollständigung der Kristallisation noch weitere 3 bis 4 Tage bei Raumtemperatur stehen. Die Ausbeute beträgt 40%, bezogen auf den Einsatz an Lyophilisat.



   Analyse des orthorhombischen Monolithiumsalzes: Summenformel:   C2lH26N7Ol4P2Li.2H2O    Molgewicht: 705,4 NAD (enzymatisch mit ADH): 93,5% Wasser: 5,5%   Lithium: 1,17%    Fp: 203 bis   203,5     (Z.), unkorrigiert Elementaranalyse: Gef.: C   35,28%;    H 3,99%; N 13,59%; P 8,73% Ber.: C   35,76%;    H 4,28%; N   13,90'S;    P 8,78% Kristallographische Daten: Kristallsystem: orthorhombisch Winkel: a,   ss,    y: alle   90"    Raumgruppe:   P2,2,2,    Zelldimensionen: a =   10,073als    0,003 b =   15,839auf    0,004 c = 17,821   Ä+    0,004 Kristalldichte: 1,65 g/ccm.

 

   Der Kristall besteht aus einer Formeleinheit in der asymmetrischen Einheit. 



  
 

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   PATENT CLAIMS
1. Crystallized metal salts of ss-nicotinamide adenine dinucleotide.



   2. Metal salts according to claim 1 as crystallized alkali salts.



   3. Metal salts according to claim 1 or 2 as orthorhombic monolithium salt of ss-nicotinamide adenine dinucleotide dihydrate with space group P21 2i2i, the cell dimensions a = 10.0731 0.003A, b = 15.8391 0.004Ä, c = 17.821 + 0.004A and angles clL = P = y = 90 ".



   4. A process for the preparation of the compounds according to any one of claims 1 to 3, characterized in that B-nicotinamide adenine dinucleotide in the form of the free acid or one of its salts in a dilute, aqueous solution of the metal salt of f3-nicotinamide adenine transferred dinucleotides, adjusted to a pH between 3 and 7, mixed with a water-miscible organic solvent at a temperature between 10 and 50 "C until the onset of turbidity and crystallized.



   5. The method according to claim 4, characterized in that, for example, methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, acetone, acetonitrile or dioxane is used as the water-miscible organic solvent.



   6. The method according to claim 4 or 5, characterized in that the pH is adjusted between 3.7 and 4.0.



   7. The method according to any one of claims 4 to 6, characterized in that the organic solvent is added at room temperature.



   8. The method according to any one of claims 4 to 7, characterized in that is crystallized at a temperature between +4 and +30 "C.



   The invention relates to crystallized metal salts of ss-nicotinamide adenine dinucleotide (= p-NAD) and a process for their preparation.



   ss-NAD occurs as a coenzyme of numerous dehydrogenases in all living organisms and plays a key role in biochemical redox processes. The compound was discovered in 1904 by Harden and Young during their work on alcoholic fermentation, and Warburg and Christian in 1934 clarified their chemical constitution. Recently, ss-NAD has become increasingly important as a measurement parameter in enzymatic analysis for determining enzyme activities and substrate concentrations for clinical diagnostics.



  The volume of industrial NAD production has accordingly increased significantly worldwide.



   However, major disturbances and erroneous results are observed in enzymatic analysis with NAD if the NAD used is contaminated (eg Dalziel, J. Biol. Chem. 238, 1538 (1963)), since even fragments of the NAD molecule itself are very competitive Are inhibitors of the coenzyme. For this reason, attempts have previously been made to produce particularly pure NAD by crystallization.



  Wallenfels and Christian successfully crystallized NAD in the form of the quinine salt (K. Wallenfels and W. Christian in S.P. Colowick and N.O. Kaplan in Methodes in Enzymology Vol. 3, Academic Press, New York, 1957, p. 882). Winer (A.D. Winer, J. Biol. Chem. 239, P.C. 3598 (1964)) later reported the crystallization of NAD in the form of the free acid.



   However, none of these methods for the crystallization of ss-NAD has gained practical importance, since they were not reproducible due to parameters that are difficult to standardize, were too complex to carry out, were too lossy in terms of yield and were unsatisfactory in terms of product quality.



   In all processes for the production of NAD practiced today, there is a solution in the final stage which can be achieved by processes such as Precipitation with organic solvents, spray drying and / or freeze drying is brought into a solid form. The NAD obtained by one of these processes is amorphous, very hygroscopic and dissolves in the air. The instability of the amorphous NAD requires special, usually cost-intensive precautions (exclusion of air, protective gas and the like) during storage, shipping and processing. Despite special precautions, fluctuations in product quality cannot be avoided, which often leads to considerable difficulties.



   The invention has for its object to avoid these disadvantages and to create stable, crystallized ss-NAD derivatives under normal conditions, which can be produced easily, reproducibly and with good yield.



   This object is achieved according to the invention by crystallized metal salts of ss-nicotinamide adenine dinucleotide. The metal salts according to the invention are preferably present as alkali salts.



   The mentioned task becomes particularly advantageous e.g.



  by orthorhombic monolithium salt of the ss-nicotinamide adenine dinucleotide dihydrate with the space group P21 2 2 "the cell dimensions a = 10.0731 0.003Ä, b = 15.83910.004 A, c = 17.821 + 0.004A and the angles a = P = y = 90 "solved.



   The object can also be achieved by a process for producing the metal salts of ss-NAD according to the invention, which is characterized in that ss-nicotinamide adenine dinucleotide in the form of the free acid or one of its salts in a dilute, aqueous solution of the metal salt of ss-nicotinamide adenine dinucleotide transferred, adjusted to a pH between 3 and 7, mixed with a water-miscible organic solvent at a temperature between 10 and 50 "C until the onset of turbidity and crystallized.



   In principle, any solvent which has these properties can be used as the water-miscible organic solvent in the process according to the invention. However, preference is given to using lower alcohols, ketones, nitriles and cyclic ethers, in particular methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, acetone, acetonitrile or dioxane.



   The pH is preferably adjusted between 3.7 and 4.0. The organic solvent is preferably added at room temperature. The crystallization is preferably carried out at a temperature between +4 and +30 "C.



   If it is not possible to start from the corresponding precipitated, spray-dried and / or lyophilized amorphous metal salt of the ss-NAD in the preparation of the metal salt of the t3-NAD, the NAD in the form of the free acid or one of its salts can easily be introduced into the ss -NAD metal salt can be transferred. NAD in the form of the free acid can, for example, be converted into the metal salt by passage through an ion exchanger (type Dowex 50 or I.R. 120) loaded with the corresponding metal ions or by careful adjustment of the corresponding pH with dilute hydroxide.

 

  NAD salts are also converted into the desired ss-NAD salt by treatment with, for example, an ion exchanger loaded with metal ions.



   For the preparation of the particularly preferred orthorhombic monolithium salt of the ss-NAD dihydrate, e.g.



  accordingly from amorphous monolithium salt of



     B-NAD or ss-NAD in the form of the free acid. The free acid is e.g. converted into the lithium salt by passage through an ion exchanger loaded with lithium ions or by carefully adjusting the pH with dilute lithium hydroxide.



   The metal salts according to the invention do not have the disadvantages of the previously isolated, known NAD derivatives; they are e.g. non-hygroscopic, free-flowing, storage-stable and result e.g. in the chemical and enzymatic analysis a content of 100% (+ 0.2%), based on P-NAD. The salts are white and completely odorless. The usual main impurities of commercially available f3-NAD, in particular a-NAD and ADP-ribose, are found in the products according to the invention e.g. if necessary, to be traced.



   The production process of the metal salts according to the invention has the advantage that, for example, the yields of metal salts of p-NAD are almost quantitative. The products produced by this process result in e.g. in enzyme kinetics 10 to 20% higher than the best NAD commercial products. In addition, the production process of the metal salts according to the invention is e.g. technically less expensive than the known methods for the isolation of solid NAD derivatives and thus more economical.



   The monolithium salt of the ss-NAD dihydrate can - in addition to the manner described above - also be obtained in crystalline form from pure water if the NAD solution is e.g.



  at concentrations from 100 mg / ml to 1000 mg / ml, preferably from 500 mg / ml, for some time at a pH of about 3.7 at room temperature. In principle, recrystallization can e.g. bring about by heating to higher temperatures (up to 60 "C) and then slowly cooling to room temperature, although the yields of pure product according to this process decrease because of the sensitivity of the substances.



   The invention is further illustrated by the following examples.



   example 1
1 g of ss-NAD lithium salt (prepared by passing a solution of the free acid over Dowex 50 in the lithium form and then lyophilizing) is dissolved in 2 ml of water, 1.7 ml of acetone are added dropwise at room temperature while stirring until the cloudiness just disappears and left to crystallize at 20 to 25 "C.



  The product which has crystallized out is filtered off with suction after 30 hours, washed twice with a little acetone-water (1: 2) and dried over P2Os in vacuo. The yield is 900 mg (90% of the use of lyophilisate).



   Example 2
1 g of lyophilized ss-NAD lithium salt is dissolved in 2 ml of water and 3.6 ml of methanol are added dropwise at room temperature with stirring until the cloudiness just disappears and, as described in Example 1, worked up. After drying, 900 mg (90% of the use) of crystallized lithium salt are obtained.



   Example 3
1 g of ss-NAD in the form of the lyophilized free acid is dissolved in 0.75 ml of H20 and adjusted to pH 4 with stirring by dropwise addition of 1.3 ml of 1N lithium hydroxide.



  Then 2 ml of methanol are added and the mixture is left to stand for about 30 hours at 20 to 25 ° C. After working up as described in Example 1, 900 mg (90% of the use) of crystallized ss-NAD lithium salt are obtained.



   Example 4
1 g of lyophilized ss-NAD lithium salt is dissolved in 2 ml of water and, as described in Example 1, mixed with 0.8 ml of isopropanol. After suction, washing and drying, 800 mg (80% of the use) of crystallized lithium salt are obtained.



   Example 5
0.5 mg of lyophilized ss-NAD lithium salt are dissolved in 1 ml of water and, as described in Example 1, mixed with 0.85 ml of dioxane. The crystallization yield is 70% of the use of lyophilisate.



   Example 6
0.5 lyophilized p-NAD lithium salt is dissolved in 1 ml of water and, as described in Example 1, slowly mixed with 0.4 ml of acetonitrile. The crystallized lithium salt is obtained in a yield of 80%, based on the use of lyophilisate.



   Example 7
0.5 g of lyophilized ss-NAD lithium salt are dissolved in 1 ml of water and left to stand at room temperature.



  The deposition of crystals begins after 5 to 6 days; the mixture is left to stand for a further 3 to 4 days at room temperature to complete the crystallization. The yield is 40%, based on the use of lyophilisate.



   Analysis of the orthorhombic monolithium salt: empirical formula: C2lH26N7Ol4P2Li.2H2O molecular weight: 705.4 NAD (enzymatic with ADH): 93.5% water: 5.5% lithium: 1.17% mp: 203 to 203.5 (Z.), uncorrected elementary analysis: found: C 35.28%; H 3.99%; N 13.59%; P 8.73% Calc .: C 35.76%; H 4.28%; N 13.90'S; P 8.78% crystallographic data: crystal system: orthorhombic angle: a, ss, y: all 90 "space group: P2,2,2, cell dimensions: a = 10,073 as 0.003 b = 15.839 to 0.004 c = 17.821 Ä + 0.004 crystal density: 1.65 g / ccm.

 

   The crystal consists of a formula unit in the asymmetrical unit.


    

Claims (8)

PATENTANSPRÜCHE 1. Kristallisierte Metallsalze des ss-Nicotinamid-adenin- dinucleotids.  PATENT CLAIMS 1. Crystallized metal salts of ss-nicotinamide adenine dinucleotide. 2. Metallsalze nach Anspruch 1 als kristallisierte Alkalisalze.  2. Metal salts according to claim 1 as crystallized alkali salts. 3. Metailsalze nach Anspruch 1 oder 2 als orthorhombisches Monolithiumsalz des ss-Nicotinamid-adenin-dinu- cleotid-dihydrats mit der Raumgruppe P21 2i2i, den Zelldimensionen a = 10,0731 0,003A, b = 15,8391 0,004Ä, c = 17,821 + 0,004A und Winkeln clL=P=y=90".  3. Metal salts according to claim 1 or 2 as orthorhombic monolithium salt of ss-nicotinamide adenine dinucleotide dihydrate with space group P21 2i2i, the cell dimensions a = 10.0731 0.003A, b = 15.8391 0.004Ä, c = 17.821 + 0.004A and angles clL = P = y = 90 ". 4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass B-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze in eine verdünnte, wässrige Lösung des Metallsalzes des f3-Nicotinamid-adenin-dinucleotids übergeführt, auf einen pH-Wert zwischen 3 und 7 eingestellt, bei einer Temperatur zwischen 10 und 50"C mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bis zur beginnenden Trübung versetzt und kristallisiert wird.  4. A process for the preparation of the compounds according to any one of claims 1 to 3, characterized in that B-nicotinamide adenine dinucleotide in the form of the free acid or one of its salts in a dilute, aqueous solution of the metal salt of f3-nicotinamide adenine transferred dinucleotides, adjusted to a pH between 3 and 7, mixed with a water-miscible organic solvent at a temperature between 10 and 50 "C until the onset of turbidity and crystallized. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel beispielsweise Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril oder Dioxan verwendet wird.  5. The method according to claim 4, characterized in that, for example, methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, acetone, acetonitrile or dioxane is used as the water-miscible organic solvent. 6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 3,7 und 4,0 eingestellt wird.  6. The method according to claim 4 or 5, characterized in that the pH is adjusted between 3.7 and 4.0. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei Raumtemperatur mit dem organischen Lösungsmittel versetzt wird.  7. The method according to any one of claims 4 to 6, characterized in that the organic solvent is added at room temperature. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei einer Temperatur zwischen +4 und +30"C kristallisiert wird.  8. The method according to any one of claims 4 to 7, characterized in that is crystallized at a temperature between +4 and +30 "C. Die Erfindung betrifft kristallisierte Metallsalze des ss-Nicotinamid-adenin-dinucleotids (=p-NAD) und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.  The invention relates to crystallized metal salts of ss-nicotinamide adenine dinucleotide (= p-NAD) and a process for their preparation. ss-NAD kommt als Coenzym zahlreicher Dehydrogenasen in allen lebenden Organismen vor und nimmt dort bei biochemischen Redox-Prozessen eine Schlüsselfunktion ein. Die Verbindung wurde 1904 von Harden und Young bei deren Arbeiten über die alkoholische Gärung entdeckt und durch Warburg und Christian 1934 in ihrer chemischen Konstitution aufgeklärt. In neuerer Zeit hat ss-NAD vor allem als Messparameter in der enzymatischen Analyse bei der Bestimmung von Enzymaktivitäten und Substratkonzentrationen für die klinische Diagnostik ständig an Bedeutung gewonnen.  ss-NAD occurs as a coenzyme of numerous dehydrogenases in all living organisms and plays a key role in biochemical redox processes. The compound was discovered in 1904 by Harden and Young during their work on alcoholic fermentation, and Warburg and Christian in 1934 clarified their chemical constitution. Recently, ss-NAD has become increasingly important as a measurement parameter in enzymatic analysis for determining enzyme activities and substrate concentrations for clinical diagnostics. Der Umfang der industriellen NAD-Produktion hat dementsprechend weltweit stark zugenommen. The volume of industrial NAD production has accordingly increased significantly worldwide. Grosse Störungen und fehlerhafte Ergebnisse werden in der enzymatischen Analytik mit NAD jedoch dann beobachtet, wenn das eingesetzte NAD kontaminiert ist (z.B. Dalziel, J. Biol. Chem. 238, 1538 (1963)), da sogar Fragmente des NAD-Moleküls selbst starke kompetitive Inhibitoren des Coenzyms sind. Deshalb wurde schon früher versucht, besonders reines NAD durch Kristallisation herzustellen.  However, major disturbances and erroneous results are observed in enzymatic analysis with NAD if the NAD used is contaminated (eg Dalziel, J. Biol. Chem. 238, 1538 (1963)), since even fragments of the NAD molecule itself are very competitive Are inhibitors of the coenzyme. For this reason, attempts have previously been made to produce particularly pure NAD by crystallization. Wallenfels und Christian gelang erstmals die Kristallisation von NAD in Form des Chininsalzes (K. Wallenfels und W. Christian in S.P. Colowick und N.O. Kaplan in Methodes in Enzymology Vol. 3, Academic Press, New York, 1957, S. 882). Winer (A.D. Winer, J. Biol. Chem. 239, P.C. 3598 (1964)) berichtete später über die Kristallisation von NAD in Form der freien Säure. Wallenfels and Christian successfully crystallized NAD in the form of the quinine salt (K. Wallenfels and W. Christian in S.P. Colowick and N.O. Kaplan in Methodes in Enzymology Vol. 3, Academic Press, New York, 1957, p. 882). Winer (A.D. Winer, J. Biol. Chem. 239, P.C. 3598 (1964)) later reported the crystallization of NAD in the form of the free acid. Keines dieser Verfahren zur Kristallisation von ss-NAD hat jedoch praktische Bedeutung erlangt, da sie wegen schlecht standardisierbarer Parameter nicht reproduzierbar, in der Durchführung zu aufwendig, hinsichtlich der Ausbeute zu verlustreich und hinsichtlich der Produktgüte nicht befriedigend waren.  However, none of these methods for the crystallization of ss-NAD has gained practical importance, since they were not reproducible due to parameters that are difficult to standardize, were too complex to carry out, were too lossy in terms of yield and were unsatisfactory in terms of product quality. Bei allen heute praktizierten Verfahren zur Herstellung von NAD liegt in der Endstufe eine Lösung vor, die durch Verfahren wie z.B. Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Sprühtrocknung und/oder Gefriertrocknung in eine feste Form gebracht wird. Das nach einem dieser Verfahren gewonnene NAD ist amorph, sehr hygroskopisch und zerfliesst an der Luft. Die Instabilität des amorphen NAD erfordert besondere, meist kostenintensive Vorkehrungen (Luftausschluss, Schutzgas und dergleichen) bei Lagerung, Versand und Verarbeitung. Trotz besonderer Vorkehrungen lassen sich aber Schwankungen der Produktqualität nicht vermeiden, wodurch oft erhebliche Schwierigkeiten auftreten.  In all processes for the production of NAD practiced today, there is a solution in the final stage which can be achieved by processes such as Precipitation with organic solvents, spray drying and / or freeze drying is brought into a solid form. The NAD obtained by one of these processes is amorphous, very hygroscopic and dissolves in the air. The instability of the amorphous NAD requires special, usually cost-intensive precautions (exclusion of air, protective gas and the like) during storage, shipping and processing. Despite special precautions, fluctuations in product quality cannot be avoided, which often leads to considerable difficulties. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden und unter Normalbedingungen stabile, kristallisierte ss-NAD-Derivate zu schaffen, die einfach, reproduzierbar und mit guter Ausbeute hergestellt werden können.  The invention has for its object to avoid these disadvantages and to create stable, crystallized ss-NAD derivatives under normal conditions, which can be produced easily, reproducibly and with good yield. Diese Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch kristallisierte Metallsalze des ss-Nicotinamid-adenin-dinucleotids gelöst. Vorzugsweise liegen die Metallsalze nach der Erfindung als Alkalisalze vor.  This object is achieved according to the invention by crystallized metal salts of ss-nicotinamide adenine dinucleotide. The metal salts according to the invention are preferably present as alkali salts. Besonders vorteilhaft wird die genannte Aufgabe z.B.  The mentioned task becomes particularly advantageous e.g. durch orthorhombisches Monolithiumsalz des ss-Nicoti- namid-adenin-dinucleotid-dihydrats mit der Raumgruppe P21 2 2" den Zelldimensionen a = 10,0731 0,003Ä, b = 15,83910,004 A, c = 17,821 + 0,004Aund den den Winkeln a=P=y=90" gelöst. by orthorhombic monolithium salt of the ss-nicotinamide adenine dinucleotide dihydrate with the space group P21 2 2 "the cell dimensions a = 10.0731 0.003Ä, b = 15.83910.004 A, c = 17.821 + 0.004A and the angles a = P = y = 90 "solved. Die Aufgabe kann ferner durch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Metallsalze des ss-NAD gelöst werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ss-Nicotinamid- adenin-dinucleotid in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze in eine verdünnte, wässrige Lösung des Metallsalzes des ss-Nicotinamid-adenin-dinucleotids übergeführt, auf einen pH-Wert zwischen 3 und 7 eingestellt, bei einer Temperatur zwischen 10 und 50"C mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bis zur beginnenden Trübung versetzt und kristallisiert wird.  The object can also be achieved by a process for producing the metal salts of ss-NAD according to the invention, which is characterized in that ss-nicotinamide adenine dinucleotide in the form of the free acid or one of its salts in a dilute, aqueous solution of the metal salt of ss-nicotinamide adenine dinucleotide transferred, adjusted to a pH between 3 and 7, mixed with a water-miscible organic solvent at a temperature between 10 and 50 "C until the onset of turbidity and crystallized. Als mit Wasser mischbares, organisches Lösungsmittel kann beim erfindungsgemässen Verfahren grundsätzlich jedes Lösungsmittel, das diese Eigenschaften aufweist, verwendet werden. Bevorzugt verwendet werden jedoch niedere Alkohole, Ketone, Nitrile und zyklische Äther, insbesondere Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril oder Dioxan.  In principle, any solvent which has these properties can be used as the water-miscible organic solvent in the process according to the invention. However, preference is given to using lower alcohols, ketones, nitriles and cyclic ethers, in particular methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, acetone, acetonitrile or dioxane. Der pH-Wert wird vorzugsweise zwischen 3,7 und 4,0 eingestellt. Vorzugsweise wird bei Raumtemperatur mit dem organischen Lösungsmittel versetzt. Die Kristallisation erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur zwischen +4 und +30"C.  The pH is preferably adjusted between 3.7 and 4.0. The organic solvent is preferably added at room temperature. The crystallization is preferably carried out at a temperature between +4 and +30 "C. Falls bei der Herstellung des Metallsalzes des t3-NAD nicht bereits vom entsprechenden gefällten, sprühgetrockneten und/oder lyophilisierten amorphen Metallsalz des ss-NAD ausgegangen werden kann, kann das NAD in Form der freien Säure oder eines ihrer Salze leicht in üblicher Weise in das ss-NAD-Metallsalz übergeführt werden. NAD in Form der freien Säure kann beispielsweise durch Passage über einen mit den entsprechenden Metallionen beladenen Ionenaustauscher (Typ Dowex 50 oder I.R. 120) oder durch vorsichtiges Einstellen des entsprechenden pH-Wertes mit verdünntem Hydroxid in das Metallsalz umgewandelt werden.  If it is not possible to start from the corresponding precipitated, spray-dried and / or lyophilized amorphous metal salt of the ss-NAD in the preparation of the metal salt of the t3-NAD, the NAD in the form of the free acid or one of its salts can easily be introduced into the ss -NAD metal salt can be transferred. NAD in the form of the free acid can, for example, be converted into the metal salt by passage through an ion exchanger (type Dowex 50 or I.R. 120) loaded with the corresponding metal ions or by careful adjustment of the corresponding pH with dilute hydroxide.   NAD-Salze werden ebenfalls durch Behandlung mit beispielsweise einem mit Metallionen beladenen Ionenaustauscher in das gewünschte ss-NAD-Salz übergeführt. NAD salts are also converted into the desired ss-NAD salt by treatment with, for example, an ion exchanger loaded with metal ions. Zur Herstellung des besonders bevorzugten orthorhombischen Monolithiumsalzes des ss-NAD-Dihydrats wird z.B. **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.  For the preparation of the particularly preferred orthorhombic monolithium salt of the ss-NAD dihydrate, e.g. ** WARNING ** End of CLMS field could overlap beginning of DESC **.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1997019190A1 (en) * 1995-11-22 1997-05-29 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilised coenzyme solutions and the use thereof for the determination of dehydrogenases or the substrates thereof in an alkaline medium

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