DE1517777C3 - Verfahren zur Herstellung von Uricase aus einer mit Harnsäure auf Uricase eingestellten Hefe der Art Candida utilis - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Uricase aus einer mit Harnsäure auf Uricase eingestellten Hefe der Art Candida utilisInfo
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Description
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Züchtung kann bei einem pH-Wert von etwa 6 und bei einer Temperatur von 25 bis 30° C unter aeroben
Bedingungen durchgeführt werden. Die zur Züchtung erforderliche Zeit beträgt gewöhnlich · etwa 30 bis
72 Stunden. Wie üblich kann das Medium auch eine kleine Menge an Mineralien, wie Magnesiumsulfat,
dibasisches Kaliumphosphat u. dgl. enthalten.
Nach der Züchtung werden die Zellen abgetrennt und aus dem Medium gesammelt. Dies kann auf
jede zweckmäßige Weise erfolgen, wie beispielsweise Abtrennung durch Zentrifugieren oder Filtrieren,
und anschließendes Waschen mit Wasser.
Die so gezüchtete Hefe wird dann in an sich bekannter Weise auf Harnsäure eingestellt. Diese
Einstellung kann durchgeführt werden, indem die Hefezellen mit einem wäßrigen Medium behandelt
werden, welches das gleiche sein kann, wie es bei der vorhergehenden Züchtung der Hefe verwendet
wurde, das jedoch Harnsäure als Quelle für Stickstoff
enthalten muß. Auch die Züchtungsbedingungen der Einstellung können die gleichen sein wie diejenigen
der anfänglichen Hefezüchtung.
Die so auf Harnsäure eingestellte Hefe wird dann ' gefroren werden, um sie für eine beliebige lange Zeitspanne
zu lagern. Die Temperatur muß irgendeine Temperatur sein, die tiefer liegt als diejenige, bei welcher
die nassen Hefezellen gefrieren. So werden die Hefezellen bei einer Temperatur von. —10°C oder darunter
gefroren.
Die Zellen der gefrorenen Hefe können zu jedem gewünschten Zeitpunkt zur Extraktion von Uricase
verwendet werden. Zur Extraktion wird die gefrorene Hefe aufgetaut und einer Autodigerierung durch
Zugabe einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 oder höher, vorzugsweise 7,0 bis 9,15,
und einer Konzentration von 1Z20- bis 1/amolar unterzogen
und dabei das Gemisch bei einer Temperatur von 15 bis 35°C, vorzugsweise etwa 25°C, stehengelassen. Schließlich wird der Extrakt von dem
Gemisch abgetrennt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird als Phosphatpufferlösung eine Lösung
von dibasischem Kalium- oder Natriumphosphat von einem pH-Wert von 7,0 bis 9,15 verwendet.
Uricase kann aus dem Extrakt, ,nachdem dieser von dem Autodigerierungsgemisch mit den Abfallzellen
durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt wurde, in jeder bekannten Weise gewonnen und
gewünschtenfalls gereinigt werden, beispielsweise durch
Aussalzen, Dialyse oder Gefriertrocknung. So wird beispielsweise, der Uricaseextrakt mit Ammoniumsulfat
versetzt, bis er zu 0,3 gesättigt ist, um Verunreinigungen auszufällen, die entfernt werden. Das
Filtrat wird weiter mit Ammoniumsulfat versetzt, um Uricase auszufällen, die gesammelt und der
Dialyse unterworfen wird. Die dialysierte Flüssigkeit wird gefriergetrocknet, um Uricasepulver zu erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert:
Mit Candida utilis 6020 (an der Universität Osaka erhältlich), wurde ein synthetisches Kulturmedium
vom pH 6,5 beimpft, das aus 5°/0 Glucose, 25°/0
Asparagin, 1% Kaliumphosphat (dibasisches Salz), 3°/0 Magnesiumsulfat und 4°/0 Ammoniumsulfat
bestand, wonach die Züchtung bei 25° C 3 Tage lang durchgeführt wurde. Dann wurden die Zellen
durch Zentrifugieren gesammelt, mit reinem Wasser gewaschen und dann zur Anpassung an Harnsäure
in 100 ml eines Züchtungsmediums, das 4 g Glucose, 100 mg dibasisches Kaliumphosphat, 200 mg Magnesiumsulfat
und 10 mg Harnsäure je Gramm/Zellen (in feuchtem Zustand) enthielt, etwa 4 Stunden zur
Einstellung auf Harnsäure geschüttelt. Die Einstellungszeit, die Zersetzungswirkung auf Harnsäure
(Uricaseaktivität) der Zellen und die Veränderung der spezifischen Aktivität der extrahierten Uricase
für die entsprechende Zeit waren wie in Tabelle I angegeben. Es wurde gefunden, daß die richtige
Einstellungszeit 120 bis 300 Minuten bzw. 180 bis 240 Minuten betrug.
Uricaseaktivität
(7o)
Spezifische
Aktivität (°/0)
Aktivität (°/0)
| Einstellungszeit (Minuten) | 120 | 180 | 240 |
| 60 | -83 | 90 | 100 |
| 58 | 87 | 100 | 93 |
| 53 |
51 einer m/10-Phosphatpufferlösung vom pH 8,0
wurden zu 1 kg auf Harnsäure eingestellter Candida utilis (in feuchtem Zustand), die bei —20° C gelagert
war, zugegeben, und das Gemisch wurde etwa 16 Stunden lang bei 25 0C der Autodigerierung
belassen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und mit kaltem Wasser gewaschen.
Nach Sammeln der überstehenden Flüssigkeit wurden 8,5 1 eines Uricaseextraktes mit einer Uricaseaktivität
von 0,34 E/ml, einer Gesamtaktivität von 2900 E und einer spezifischen. Aktivität (Aktivität je Adsorptionseinheit
bei 280 ΐημ und 1 cm Sichtweg) von 0,035, erhalten.
Die Beziehung zwischen der Extraktions-Autodigerierungszeit und der Uricaseaktivität ist in
Tabelle II angegeben. Die maximale Extraktion hat sich oach etwa 16 Stunden ergeben.
Extraktionszeit (Stunden)
4 I 8 I 16 I 24 I 48
4 I 8 I 16 I 24 I 48
Uricaseaktivität (%) 30 68 100 "72
Der Extrakt wurde dann fraktioniert mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, so daß sich eine Sättigung
von 0,3 bis 0,8 ergab, und mit einer Cellophanmembran dialysiert. Beim Gefriertrocknen der dialysierten
Flüssigkeit wurden 16,333 g eines Uricasepulvers mit einer Uricaseaktivität von 0,155 E/mg
und einer Gesamtaktivität von 2530 E erhalten.
Die oben angegebene Einheit (E) ist diejenige Aktivität, welche Harnsäure mit einer Geschwindigkeit
von ΙμΜοΙ/min in Boratpufferlösung von
pH 8,5 bei 250C in Allantoin überführt.
Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch das Autodigerieren unter Zusatz von 51 einer 0,5 m-Phosphatpufferlösung
mit einem pH-Wert von 9,15 zu lkg nasser Zellen, welche bei — 200C vorher
eingefroren waren, durchgeführt wurde. Der ver-
wendete, auf Harnsäure eingestellte Candida-utilis-Stamm
entsprach demjenigen vom Beispiel 1.
Das Gemisch wurde zur Autodigerierung 24 Stunden bei 15° C stehengelassen. Dann wurden die
Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und mit .kaltem Wasser gewaschen. Das Filtrat und das
Waschwasser wurden gesammelt, wobei 8,51 eines Uricaseextraktes mit einer Uricaseaktivität von
0,22 E/ml einer Gesamtaktivität von 1885 Einheiten und einer spezifischen Aktivität von 0,073 erhalten
wurde. ■ · ;
Die Beziehung zwischen der Extraktions-(Autodigerierungs-)zeit und der Uricaseaktivität ist in der
folgenden Tabelle III aufgeführt, wobei die maximale Extraktion bei 24 Stunden erreicht wurde.
Uricaseaktivität (%)
Extraktionszeit (Stunden) 8 j 16 j 24 j 48 I 72
100
93.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Uricase aus triumsulfat, Natriumzitrat oder Natriumlactat ergab
einer mit Harnsäure auf Uricase eingestellten 5 sich keine Extraktionswirkung. Nur die Zugabe einer
Hefe der Art Candida utilis, dadurch ge- Phosphatpufferlösung unter den genannten spezi-.
kennzeichnet, daß die eingestellte Hefe fischen Bedingungen ist wirksam.
zuerst eingefroren und dann aufgetaut wird, die Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine ausaufgetaute
Hefe einer Autodigerierung durch gezeichnete Methode zur Extraktion von Uricase Zugabe einer Phosphatpufferlösung mit einem io in industriellem Maßstab. Alle anderen ExtraktionspH-Wert
von 6,5 oder höher, vorzugsweise 7,0 methoden besitzen niedrigere Ausbeuten oder erforbis
9,15, und einer Konzentration von V20- bis dern komplizierte, mühsame Verfahrensschritte.
Vainolar unterzogen und dabei das Gemisch bei So wurden verschiedene Extraktionsmethoden untereiner
Temperatur von 15 bis 35° C stehengelassen sucht, nämlich
wird und schließlich der Extrakt vom Gemisch 15' j die Hefe Wurde unter Verwendung eines Glasabgetrennt
wird. · pulvers zur Zerstörung der Zellen zerkleinert;
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 2 die Hefe. wurde .„ einem potter-Elvehien-Homozeichnet,
daß als Phosphatpufferlosung eine Lo- ~ genisator zerstört, und '
sung von dibasischem Kalium- oder Natrium- - ;. TT * .·/. ...
phosphat von einem pH-Wert von 7,0 bis 9,15 20 3· die. Hefe wurde eingefroren und aufgetaut,
verwendet wird. ' . Bei der Durchführung dieser Methoden wurde
■ · gefunden, daß sie eine niedrigere Ausbeute ergeben
und/oder Verfahrensschritte und Vorrichtungen erfor-
- dern, welche in technischem Maßstab unpraktisch
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel- 25 sind, so daß sie praktisch kommerziell und industriell
lung von Uricase aus einer mit Harnsäure auf Uricase nicht durchgeführt werden können. Im Gegensatz
eingestellten Hefe der Art Candida utilis. zu der aus »Science« 1. c. bekannten Arbeitsweise,
Uricase ist ein Enzym, das zur Heilung von durch bei welcher eine Hughes-Presse und ein Arbeiten
Störungen des Harnsäurestoffwechsels hervorgeru- bei Trockeneistemperatur erforderlich sind, genügt
fener Gicht wirksam ist und ferner zur Bestimmung 30 es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, eine Einvon
Harnsäure im Blut und Urin verwendet wird. friervorrichtung bei —10°C zum Einfrieren der Hefe
Uricase wurde bis jetzt erzeugt, indem es aus zu verwenden. Alle nachfolgenden Operationen köninneren
Organen von Tieren, wie Rinderniere und nen bei normaler Zimmertemperatur durchgeführt
Schweineleber, extrahiert wurde, jedoch sind die werden, so daß das Verfahren zur Herstellung von
tierischen Organe so schwierig als Ausgangsmaterial 35 Uricase in großem Maßstab angewandt werden kann,
zu erhalten, daß keine Massenproduktion von Uricase Es ist an sich bekannt, daß ein Enzym aus Hefe
möglich war. Ferner haben Untersuchungen gezeigt, extrahiert werden kann, wenn die Zellen mechanisch
daß Uricase in einigen Arten von Bakterien und" zerstört sind. Eine solche Arbeitsweise ist jedoch für
Hefen vorliegt. Aus »Science«, Bd. 124 (1956), S. 125/ industrielle bzw. technische Zwecke nicht praktikabel.
126, ist es bereits bekannt, eine Hefe der Gattung 40 Darüber hinaus werden bei einer solchen Arbeits-Torulopis
utilis (Candida utilis) durch Behandeln weise noch andere. Substanzen als das gewünschte
mit einem Harnsäure enthaltenden wäßrigen Medium Enzym extrahiert, z. B. andere Enzyme, Proteine,
so einzustellen, daß Uricase gebildet wird. Ferner Nukleinsäuren, Zucker und niedermolekulare Subist
aus der USA.-Patentschrift 2 773 002 eine Selbst- stanzen, so daß eine Reinigungsstufe angeschlossen
digerierung von Hefezellen bekannt. Bei dem aus 45 werden muß, die unter Umständen äußerst schwierig
»Science« 1. c. bekannten Verfahren wurden die sein kann.
Uricaseaktivitäten in den Hefeextrakten mit einem Die Autodigerierung von Hefe ist ebenfalls an
Boratpuffer von pH = 9,5 bestimmt, wobei der sich bekannt. Es wurde jedoch gefunden, daß die
Hefeextrakt mit Hilfe einer bei. Trockeneistempe- Autodigerierung unter den speziellen erfindungs-"
ratur betriebenen Hughes-Presse erhalten wurde. 50 gemäßen Bedingungen wesentlich für die wirksame
Es wurde nun gefunden, daß man unter ganz und selektive Extraktion von Uricase ist. Aus diesem
bestimmten Bedingungen in einfacher Weise Uricase Grunde ist die Kombination von Einfrieren und
aus einer mit Harnsäure auf Uricase eingestellten Auftauen und einer speziellen Autodigerierung we-Hefe
der Art Candida utilis herstellen kann. sentlich, um die Extraktion von Uricase in tech-
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung 55 nischem Maßstab wirkungsvoll durchführen zu könen.
von Uricase aus einer mit Harnsäure auf Uricase Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung
eingestellten Hefe der Art Candida utilis ist dadurch kann jede Hefe verwendet werden, die zur Gattung
gekennzeichnet, daß die eingestellte Hefe zuerst ein- Candida utilis gehört.
gefroren und dann aufgetaut wird, die aufgetaute Die Züchtung der Hefe kann in einer Weise durchHefe
einer Autodigerierung durch Zugabe einer 60 geführt werden, die an sich zur Züchtung von Hefen,
Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 die zur Gattung Candida utilis gehört, bekannt ist.
oder höher, vorzugsweise 7,0 bis 9,15, und einer So wird z. B. ein Medium verwendet, das eine Quelle
Konzentration von V20- bis 1/2molar unterzogen und für Kohlenstoff, wie Glucose, Rohrzucker, Melasse,
dabei das Gemisch bei einer Temperatur von 15 bis Sulfitzellstoffablauge, Maisquellwasser od. dgl. und
35° C stehengelassen wird und schließlich der Extrakt 65 eine Quelle für Stickstoff, wie eine Aminosäure oder
vom Gemisch abgetrennt wird. -säuren, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Am-
Die oben aufgeführten Stufen des erfindungs- moniak, Harnstoff od. dgl., enthält. Es kann auch
gemäßen Verfahrens sind erforderlich, um Uricase ein synthetisches Medium verwendet werden. Die
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
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