DE1442118A1 - Verfahren zur Herstellung von milchkoagulierendem Ferment durch Zuechten von Schimmelpilzen - Google Patents

Description

U42118

Di. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NIEAAANN DR. A*. KÖHLER DIPL-ING. C. GERNHARDT

MÖNCHEN HAMBURG

55547« . 8000 Mönchen is, 23· September 196

ΤΕΙΒΘβΑΜΜΕ: ΚΛβΡΑΤΕΝΤ NUSSBAUMSTRASSEtO

W, Io 813/62 7/frS P 14 42 118.

Meito Sangyo Kabushiki Kaisha Kikuidori, Nishi-ku, Fagoya (Japan)

Yerfahren zur Herstellung von milchkoagulierendem Ferment durch Züchten von Schlmmelpilz-en

Die Erfindung bezieht^ sich auf ein Verfahren zwc Herstellung eine's¹ neuen milchkoagulierenden Perments aurch Züchten von Schimmelpilzen in Nährmedien.

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NM

In dor nachstehenden Beachreibung wird dao .durch Züchtung eier vorstehend genannten Pilze erhaltene lailohköaßU-lieronde Ferment alo »laikrobiologiaohes Labfenaent" bozeich.·* net. " .

Das bisher bekannte Labfermont atm Koagulieren von ftiloh v/ird ;aus den 4· Magen dos Kalbea gewonnen· Bieseo Foment "beait^t oine lcrSftigo Aktivität sur Kosgulierung von Kiloh und es findet in v/ei tea umfang bed der Käseherstellung Verwendung ♦ Des Ausgangaiaatorial· au seiner herstellung otöht . jedoch nicht in unbeschränkten Kennen aur Veriügung und ist teuer·

• Ihs, allßähseinen koagulieren Proteasen Milch. Sowohl l'roteaßen tierisolien Ursprungs, vyie Pepöin, *£xyp&Ln_t Chyraotrypain» K^thepoin usw. als auch diejenigen pflanzlichen < Ursprünge, näa\liolv Papain_t I³icin_t Broßtölain usw. beöitzen bis au eine» gewissen <^3?Äd Killchkoa^ulierende Aktivität· A(JiU die koii£julierenaö Aktivität dar durch Bakterien eraeugten' Iroteaeen» $·Β· Pa-eudOTdonae fluorescens, Jäaoilluis oubtilia und Ü^rratia «areeeoene ist bereits bekannt« Diese Proteaaen wirken jedoch auf Proteine stark spaltend» sie aei-

BAD 909811/1026 '

gen eine niedrige Aktivität zur Koagulierung des Proteine und sie kommen zur praktischen Verwendung als milohkoagu-

■'·.'■ lierende Permente nicht in Betracht.

Weiterhin ist ein Ferment bekannt, welches die- Gerinnung von Milch hervorruft und welches man duroh Züchten dee Pilzes Hucor rouxii auf einem geeigneten Hahrmedium, vorzugsweise auf Reis,erzeugen kann·

Das durch Züchten von Muoor rouxii erhältliche Ferment hat jedoch nur eine niedrige milchkoagulierende Aktivitat, so daß es zur praktischen Verwendung anstelle von aus dem Kälbermagen stammenden Lab nicht in Betraoht kommt.

BAD ORIGINAU 909811/1026

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neues Es ist Hauptzweok der Erfindung, ein/milchkoagulieren-

des mikrobiologisches labferment sehr niedriger Proteasenaktivität, jedoch beachtlich hoher milchkoagulierender Aktivität durch Züchtung von Schimmelpilzen herzustellen.

Ein weiterer Zweck der Erfindung ist die Isolierung des mikrobiologischen Labferments aus dem Medium und die Herstellung dieses Fermentes in fertiger Form.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß man in technischem Ausmaß und auf billigem Wege ein neues milchkoagulierendes Ferment, d.h. ein mikrobiologisches Labferment, mit sehr niedriger Proteasenaktivität, jedoch hoher milchkoagulierender Aktivität herstellen kann, wenn man Muoor pusillus Lindt, dessen Varietäten oder natürlichen und künstlichen Mutanten, welche die meisten der typischen Eigenschaften des Stammpilzes besitzen, verwendet. Bisher war man der Meinung, daß diese Pilze keine milohkoagulierenden Fermente von praktischem Wert erzeugen.

BAD ORiGlNAL

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Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von milolikoagulierendem Ferment duroh'-.Züohten von Sohimmelpilzen in Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen und organische Salze enthaltenden Nährmedien bei üblichen Temperaturen und pH-Werten ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Schimmelpilz Mucor pusillus Lindt bzw. dessen Mutanten verwendet.

Wie bereits angegeben, ist es bekannt, daß Muoor rouxii auf einem geeigneten Nährmedium, vorzugsweise Reis, ein die Koagulierung hervorrufendes Ferment bildet. Es war jedoch nicht zu erwarten, daß Mucor pusillus Lindt ein milchkoagulierendes Ferment mit sehr niedriger Eroteasenaktivität und beachtlich hoher milchkoagulierender Aktivität in hoher Ausbeute in dem Medium erzeugt. Weiterhin wurde festgestellt, daß von den Pilzen der Gattung Mucor, zu denen eine große Anzahl von Species gehört, zahlreiche der Species keine Fermente der gewünschten Labfermentaktivität bilden. Weiterhin zeigt Muoor pusillus Lindt deutlich unterschiedliche Eigenschaften gegenüber Mucor rouxii. In einer Koji-Schräg-

BAD ORiGiNAL 909811/1026

1U2118 - t -

öü&rkultur bei J)O⁰G zoi^t i.Iucor puoüilluü Lindt .Vorhultenj I)Io »uniichot v/oiiiüo j.Kolonio färbt »ioli nach BiI-dung von öporaitgion #rau o.'icr grauuraun* Me Höhender ^Kolonie lot niedriger als 2 bill. Die .Spor&nßiophorttn -oiad aunächat durchalolitig tuvd iiirtioa und versweig-eu· sich nioht» AnachliQBöend vorawoi^ön aie eich unter Bildung von öporan- ^ien an den öpitseu. Die 5 Ms 20 liikron breiten ilporiui&io-· phoron nohwon uoi üpr Hoifö oine graue Farbe an» In don iaoißtün Piillon ??rf olg* <äi^ö Bildung von .üeheiäewänden in diör Vdiha der Spiteen. Die Sporaii^ion kokon «inen Quertsohnitt von ^O biß 90 Hikron und aehcn outweder grau oder graubraun au«* Dio Columellaö Bind iiollbruun und entv/oder β ir oder birnonl'ornig mit oinoia Lüngfödurehjaeaijtir von 10 bis 50 Mikron« iiporangloplioren Bind rund und beeitaen einen jJux'cli-

von 2,5 bis 4 wikron« Es werden weder Chla&ydo» sporen nooh 2ygosporen boobaolitet· Diejenigen Pilze, die _j unter andureii Kulturbedingungen ijözüchtet vnirden, wurden nicht betiobrieben^ doch "üüu&zQn diejenigon_f welche.in einem Kulturmedium wie Malaagar oder Kortoffolagar geaUolitet wurden, praktieoh die ^leioUeu'Eigenschaften· Me li&uptunterechißde iswiöouen den oharalcteriötißchön Kigenoohaf ten von Uuaor pudfillus Xjlndt und Muoor rouxli sind in der den Tabelle I ausomsiöngösteilt: " ...

■ ' . BAD ORIGINAL

9098 11/1026 " ·

Charakteristische Iiiftenschaften von llucor pus-illns Lin3t und Ilucor rouxli

PiIg

Höhe det· Kolonie, rci

"5"UcLs-

Sporan^Iosporen temper

Pora I?uroji;3eGc?.»r (f.-Ό ChI;isa.vdosTjQren tür" ⁰C

co ο cc

* pussillus Lindt

rouxii

2 '

gut

wenig

rund

ei- oäer
kugelför-

2*5 - 4

4-5

koine

viele

15-5

CO

Nachstehend wird das Verfahren gemäß der Erfindung be- , schrieben, durch welches ein Pilz aus der Gruppe Mucor pusillus Lindt, der zur Gattung Mucoi¹ gehör.t, sowie dessen Varietäten und natürlichen und künstlichen Mutanten, welche äie meisten der typischen Eigenschaften des Stammpilzes aufweisen, gezüchtet werden, wobei in dem Medium mikrobiologisches Labferment gebildet wird. Dieses Ferment wird hierauf konzentriert und isoliert'. Unter dem Ausdruck Konzentrieren, Isolieren und Gewinnen des mikrobiologischen Labfermentes ist das Verfahren zur Überführung dieses Fermentes in einen reineren Zustand als seinen Rohzustand oder in einen Zustand gemeint, in welchem es in höherer Konzentration oder höherer Reinheit vorliegt. Das gemäß der Erfindung zur Züchtung der Pilze verwendete Medium kann jedes geeignete künstliche oder natürliche Medium sein, sofern es mindestens eine Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff und anorganische Salze enthält. Als Kohlenstoffquelle können die. Monosaccharide, Disaccharide und Polysaccharide verwendet werden, welohe durch die Pilze assimiliert werden können, z.B. Rohrzucker, Lactose, Glucose oder Stärke. In gleicher Weise können als Stickstoffquelle eine große Anzahl von Stickstoffverbindungen verwendet werden, sofern sie assimilierbar sind, wie anorganische Ammoniumsalze, Aminosäuren und eine große Anzahl anderer Eiweißstoffe. Zu den anorganischen Salzen gehören z.B. Phosphate, Magnesium-

' BAD OPJGsNAL 909811/1026

oalao, Caloiuicsalso und zaiilreicho anor^anlaclio S Judonfallo kanu dio Stickotofl"- oder Kqhlenetofiuuello -,ίβα natürlichen oder kilna tliohcm .Medium© von J odor Art eein, oofern j*le von dom verwendeten %ilz gebraucht werden kann»· Alü ein horvorzugtes ilcdium kann V/eiaonlcloio . . . verwöndot worden. Sülbstvorständlioh hängen die hlon^ön ■ an Xohlonstoff- und Stiokstoffquellen und die Suaamiaön-'ö doe'^ediumo von dor AnpaüaunößfUliigkcit dea aur de» rdkrobiolo^iüchen Lab-föruantaa verwendeten Pilzes ab. .

Obgleich diö Süciitungötömperatur von dora jeweils verwendeten ?ili! abhäiigt, eignet sich in allgeaoinen oino Tomperatur awisohön 20° und 4O⁰C. Gewönnlich führt inan die 2üoiitmii5 etwa 2 bi« 7 2a^ö teit Hilfe einer flüssigen Kultur oder öiiior festen Kultur boi pH 3 bis 8» insbesondere $l\ 5 biö 7 und voraugevraiae unter aurobon Üadingungen durcli· .la Falle einer flUsaigen Kultur kann jaan eine Oborfliichenkultur verwendön« Besaore Ergebnisse v/erdcn mit Schuttolkulturen oder ßubaerskulturen eriialten. Als ürgebnis dor -2üGhtung wird das ailohkoagulierende zaikrobiolo-,gißoiio Labfercient i«i Kedluia gebildet· 2ur Isolierung des Pöraönta aus dora Kulturaiüdium wird es in Pailö einer festen Kultur ait tfaaser oder einer wäaorigen. Lösung extraliiert·

BAD ORIGiNAL 909811/102 6

In Pall« ο !nor flüssigen Kultur wird rtas üycol abgetrennt j man erhält ein© f eimhth&lti^ Lb'r>unß· Ale wäöüri&e Liiaun-(jcn können ßolcLo verwandet worden, die iJalao wlo Natriumchlorid* Kaliumchlorid usw., tJäuran» wie Saliseüure Zitro«'

nonaUurti, Soüigßäura, uüvv· enthalten» sov;iu verschiüdene andorü Sypen von Pufforliteunggn.

Diö das aikrobiologißch© Jjabfersaent enthaltende Löoung kann hierauf eingeengt oder verfestigt werden» indem wan Köinigungabehändlungön, wie Fallung j-it organischen Lööunseoitteln_# ÄuüßalÄon» L'in<mgen unter varRindörtera Druoic» Keinigung ßdt Hilfe von lonenaustauöoli&rn uew« duronführt· Als sur ?ällun£c verwendete Lösxüißanittel können Eiit Waeoer mischbare organische'Lösungsmittel, wio Methanol Äthanol» Isopropanol, Aceton usw." verwendet werden· Zuia Aussalzen kann jedes Salz .verwendet ~xteraen_t welches sich leioht in \faeaer löat» vae Aimaaniumaulfat» !»atriumtiulfat,

uew*
^emäß dsr Erfindung hergestellte mikrobiologische

basit&t jEigenschaftön, dia sich deutlich von den bisher bekannten i'roteason tierischen oder pflanzlichen Ur£ij>run&B oder solcher Proteaoenj die von anderen Kikroban gebildet werden» untorechoiden. z/

ORfGfNAL

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1442 T18'

ΰαο nikrobiolo^iocho Labferr.ont beaitat cine kräftige lailohkoußttlieror.do Aktivität,'; doch iutsuino I'roteaoenaktivitiit ßöhr schwach· . . .

Die milchkoagulierenie Aktivität des isikrobiologiochen liabferriontöü aoigt ahnlich v/ie daa Juabftjrraent miß dera 4« "Kiirbürin&ßGn oi:io starke Aktivität in sauren pH*

Kit stQigendora pH nirast seine Aktivität ab, Ia alkali-

sehen pH-Boreich iüt dio Aktivität

Bei dör -^rBtülluug von ^utifk beträg"t" der s gehalt, der in dio wolke übergeht, nach 150 Minuten etwa 20 i> (Leütinint n&oh Kjöldahl)· Ifa eouitdae Moment eich praktißch ßloich vorhält v/icj Labfcrmont, wird das Caeoin 4or Miloh vorteilhaft verwendet. Bei der Boßtimmung der Proteaoenaktivitat deo.jaikrobiolosißchöii ijabfernenteis nach. Anöoii unter Verwendung der enteprochenden Iwenge an ?orwenten, wolohe die gleiche nilclikoaguliörende Aktivität • zeigen, beträft die Absorption bei 660 t?.^ im Pallo der sauren ^rotoaee aua Aepergillus ssaitoi 0,641 (optiä3o)ie DicUte) und von Labforsient 0,059» v/Mhrend die von nikro-Labfermont waniger ala 0,102 botri'/jt» Dies

, daß das Labr&raent ^emUß der Erfindung von voll-

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ständig anderer Art ist als die übliche Protease, da; seine . BilChkoagu-liereTide ARti.vitäx ungewöhnlich t-tark im Vergleich zu seiner Pro teasenaktivität ist«

Da das gemäß der E.rzünduT\f>; hergestellte xn'ikrobiologi-SChe5 FerioeJfit .durch Züchtung von Mikroben erhalten, wird, kann mafi es auf billigem Wage in großtechnischem Maßstab herstelJeit. Ls ist vielseitiger Anwendung fähig, z.B. zxir Herstellung von Desserts, Eiscreme und für andere Zwecke, z.B. zuj: Herstellung von Konfekt.

BAD

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H42118 - 13 -

Erfindung wird naohötehend anhand von Beispielen nHher fr^äutert.

r Beiapiel 1

1§ 'If41© Weiüsenkleie wurden »it 7 Teilen Wasser ver*

« Naoh dem Voriaiuohen wurde die Mat» ο θ '15 Minuten bei gekocht. Dio itooae wurde nach dom Abkülilen mit at atom von Mucor pusillua Lindt (IAiM F-27) ansölmpft ⁰ inkubiert. Am dritten. Xag erreichte die milch-

Aktivität ihr Maximum. Die V/elaenkleie wurde So ml Waaser ,je Io g veraotat und 1 fttunde bei

atehea gelassen,· Ilior^ur wurde daa Kyoel I u»4 «an erhielt 4o ml der B&krobiol& Labfarment enthaltondon Lüoung. Di& oilchkoEmulierende

«iiasaa Extrakt θ ο betrug 6oo Soxhlet %%m \$M$s Lösung pulverisierter entrahmter weloh« 5,Aqo Mol OüloiUBiQhlorid enthielt· Somit erhielt man &ua Io β V/eiaonkloio 32 ooo Einheiten mikrobiologisohe sailoI^Goaiiulierendea Ferment. Hierauf wurde dieser Extrakt »it Ataiaoniumaulfat auf einen Hättigurigs^rad von o,22 bie o_t66 aua^eealaen. PraktiBch die gesamte Aktivität ging iit|$&· Ballung über. Weitorhia kann eine Fällung mit einer Aktivität von 78$, Qo'f>t, ·6ο^ bzw. 75$ mit Hilfe organiso&er der nachstehend genannten Konzentrationen

BAD ORIGINAL 90981 1 /1026 Γ" ..

worden: Äthanol ?ο#» Mothanol 75#» Aceton 66$

und luopropanol 7o#· DIo Aktivität des auf diese Weise

'·«'■
erhaltenen raikrobioloüiüchoa Puriaeatoo betrug loo itoxhlet·» £inheitdn/{sgi während die ICälbermagonlabformentva.bletten der Ohr* Hansens Laboratory, Inc eine Aktivität von 2oο

' Bolspiel 2

Ein lo$ pulverieierte,- entrahmte Ktloh, I^ Oluoooe ?), o_tl5i Hefe extrakt, l/2oo Mol GaOl₂ enthaltende a Medium wurde mit einemStamra von Mucor pua.iilue Iiindt (IAU F-27). beimpit, Kaoh 4 Xagea Scnütteln ter Kultur bei 3o°C wurde da» 1.Iy ο el abfiltriert, und man erhielt eine Fermetttlösung· Eie Aktivität dieeer Permentiöeung betrug 115 Soxklet-Einnoiton/ral; ßoriit entapraoh. 1 ml ο,ο5 Kg Labförmonttabletton. Aus dieser Lüuung wurde in ähnlicher Woiue wie In Beispiel 1 ein goreinigtea festes Fermeutpräparat

Bei3Piel \

2ine Sporönauspenoion von Muoor puaiilua Lindt (XAM ^27) \mrde einer Beatrahlunß mit HUntgenetrahlen von 37 4oo Röntgen unterworfen· Haoh U.er Bestrahlung betrug die Lebensfähigkeit der Sporen 1$· 33er aus ά&η Sporen

■ .. Λ · BAD ORfGIfML

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nit "to le der Monooporon-ZUohtungQciothode orhaltono S wurde untor don gloiohon Kultui^bedin&ungGn, wie Bio in Beispiel 1 boüohriouön sind, gezüchtet und extrahiert.

Aktivität des Extrakts "betruß 2ooo Soxhlot-Einheiton/nl.

Sine äporensuspension von Mucor puai.llus Lindt (IAK F-27) wurde der Bestrahlung mit einer 15 W-Laiape für pitraviolettaterilisatlon 12ο Sekunden lang in einem Abstand von 3o cm unterworfen.

Nach der Bestrahlung betrug die Sporenlebensfähigkeit ο ,liv. Die Sporon wurden der gleichen Arbeitaweise wie in Beispiel 3 zur Herstellung eines Extrakte unterworfen· Die Aktivität des so erhaltenen Extrakte betrug 3ooo ; öoxhlet-Eiixheiten/ml.

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Claims (1)

1. Patentanspruch

   Verfahren zur Herstellung von milchkoagulierendem Ferment durch Züchten von-Schimmelpilzen in Kohlehydrate, Stiokstoffsubstanzen und organische Salze enthaltenden Hahrmedien bei üblichen Temperaturen und pH-Werten, daduroh gekennzeichnet, daß man als Schimmelpilz Muoor pusilLus Lindt bzw. dessen Mutanten verwendet»

   9 09 8 11 /102 §_e3

   Unterlagen- --