DE1642656A1 - Hochaktive Uratoxydase und ihre Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung boferiift eine neue Uratoxydase (allgemein Oricase genannt) von hoher .Aktivität sowie ein Verfahren zu ihrer Horst ellung.

Bekanntlich ir-?t dir» Harnsäure eines der Hauptprodukte beim Stoffwechsel der .Purinbanen und der diese enthaltenden Stoffe, wie der Ijuklf-inaäuren» Infolge eines Fehlers im Stoffwechsel oder in der Ausscheidung von Harnsäure können Anhäufungen dienes Stoffes im Blut und in den G-eweben erzeugt

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werden, wodurch zahlreiche Krankheiten, insbesondere Gicht, verschiedene Formen von Rheumatismus, Steine im Niere-Blasen-System, verschiedene Gewebeänderungen, insbesondere im Herzgefäßsystem verursacht v/erden. ... -

Derartige Krankheiten sind häufig, da die Ausscheidung der Harnsäure durch ihre sehr geringe Löslichkeit erschwert wird; dies hat zur Folge, da^ die Harnsäure, wenn ihre Konzentration aus irgendeinem Grund zunimmt, unlöslich vird und Ablagerungen bildet.

Ein Merkmal der erfindungsgemäßen Uricase besteht darin, daß sie von Mikroorganismen erzeugt wird, die entweder zu den Bakterien, insbesondere der Gattung Bacillus, oder zu Pilzen, insbesondere der Gattungen Mucor, Rhizopus, Absidia, Fusarium, Alternaria, Penicillium, Aspergillus und Microsporium oder Hefen, insbesondere Geotrichum, gehören.

Ferner kann sie auch aus Bakterien der Gattungen Pseudomonas., Cloatridium, Micrococcus und Bacterium, aus Pilzen der Gattung ftieurospora und aus Hefen der Gattungen Saccharomyces, Torula und Candida hergestellt verden.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung der Uricase aus Bakterien und Pilzen folgender Arten:

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BAD ORIGINAL

Ί b A 2 6 5 6

Streptomyces cellulosae und Strept. nulfureus, Bacillus, megatherium, E. subtilis und B. cereus, Aspergillus flavus, Asp, oryzae, Asp. tamarii, Asp. terricola, Asp, luchuensis, Asp. niger, Asp. nydowi,. Asp. nidulann, Asp. wentii, Asp. fonsecaeuB, Asp. clavatus, Asp. ustus, Asp* terreus und Asp* ochraceus, Penicillium frequentans, Pen. granulatum, Pen. griseum, Pen. canescens, Pen. spinulosum, Pen. ttomii, Pen. waksmani, Pen. raistrickii, Pen. expansum, Pen. purpurescens, Pen, funiculosum, Pen. spiculisporum, Pen. velutinurn, Pen. purpurogenum, Ten. lilaGinurri, "en. rutirum, Cephalosporiura, Alternaria tenuis, Fusarium solani, Fus« moniliforme, Pus. coeruleum, Pus. ox^/sporum und Pus. orthoceras, Stemphylium macrosporoideum, Macrosporium apiospermum, Absidia glauca, Mucor mucedo, Mucor hiemalis und Kucor racemosus, Rhizopus arrhizus und Basidiomycete, sowie geotrichum candidum.

Im folgenden werden Beispiele von geeigneten Microorganismen aufgezählt; hinter jeden Ivamen and erstens die von der Anmelderin den Stämmen ihrer Kollektionen gegebenen Nummern und zweitens in Klammern die Registernuramern der American Type Culture Collection (A.T.C.C.) angegeben. . .

a) Bakterien;

Streptomyces cellulosae Krainsky 3313 ( 2il8fe ), Streptomyces sulfureus Krainsky 105 ( 21185 ), Bacillus

. . 109821/1511 ~⁴~

_8AD

■'■'■■ - 4 - ■■;". , ;. ■ ■ ' ■: ' \ ;

megatherium de Barry 1552* ( 21180 ), Bacillus megatherium de Barry 1551 ( £1181 ' ), Bacillus subtilis Cohn 5221 ( 21183 )> Bacillus cereus Frankland, Frankland 1665 ( 21182 )i

t>) Nicht zu den Hefen gehörige Pilze;

Aspergillus flavus Link 601 ( 2003? ), A.f, Link 602 ( 20038 )» A. f. Link 603 ( 20039 ), A. f. Link 604 ( 200*0 ), A. f. Link 605 (200*1 >, A. f* Link 606 ( 200*2 "■)» A. f. Link 608 (2üO*3 ), A. f. Link 609 ( £00** )» A. f. Link 620 (200*5 ), A. f. Link 623 ( £00*6 ) » -A-. £· Link 624 ( 200*7 ) , A. f. Link 625 ( 200*8 )> Aspergillus oryzae Cohn 626 ( 200*9 ), A.o. Cohn 627 ( 20G5U ), A.o. Cohn 628 ( 2OO5I ), A.o. Cohn 629 ( 20052 ), A.o. Cohn 6>f,/AspergilluR tamarii Kita 636 (2005* )» • Asp. terricola Marchal 638 ( 20055 ), Asp. Iuohuensis Inui 651 (. ), Asp. niger "Van Tieghem 561 ( 20057 ), Asp. sydowi Bainier und Sartory 661 ( 2005$ >» Asp. nidulans Wint.682 '.(

), Asp. wentli.^ehmer 579 ( 20060 ), Asp. fonsecaeus Bainier 808 ( 20061 ), Asp. clavatus Blochwitz 549 (20062 )> Asp, ustus Thorn und Church 575 ( 20063 )» Asp. terreus Thorn=1960 ( 2006* ), Asp, ochraceus Wilhelm 585 (

109821/1511 . Λ⁵~ _s., _ BADORtGlNAt

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— 5 — '

Pe nie 111 ium frequent ans We st ling 499 ( 20066 - ), Pen. granulatum 503 ('20067. ),· Pen. griseum Thorn 505 ( 201)68 ) j Pen. canscens Söpp 485 ( 2ÖÖ69 . ) » Sen* spinulosum Thorn 521 ( 2007O . ), Pen. thomii Maire 525 .( ZQbH ), Pen. waksmani ZaIeski 531 ( (2OU72 ), Pen. raistrickii (Smith) 517 ( aoo73 ), Pen. expansum Thorn 597-. ( 2007% ), Pen. purpurescens Sopp 540 ( 2ÖM75 ), Pen. funieulosum Thorn 545 (20076) )Pen. spiculisporum Lehman 547 ( 20082 )> Pen. velutinum (Van Bey ma) 527 ( 20081 )> ^Pel1· purpur·« genum St oil 515 ( 2OO77 . ) ■» Pen. spinulosum Thorn 522 (" 2OO78 ), Pen. lilacinum Thorn 535 ( 4G079 '-),'-Pen, rubrum St·!! 525 ( 2OQgO )> Cephalos.porium sp. Corda 901 ( 2Ο&83 ), Alternaria tenuis Wees 225 ( (ZiH)Qb ) > A.t.■ 415. ( ) , Fusarium solani Appel

& Wollenweber 478 ( füt)86 )> Pus. moniliforme Sheldon 727 ( 2ÜÜ87 )> Pus. Goeruleum Saccardo 725 ■( 300&8) ), Pus. txysporum Schelechtendahl 735 ("■ 2tiO$f )» Stemphylium macrospo-roideum Sacoar-d-o 700 ( 200$0 )> Maorosporium apiospermum' 655 ( H

orthoceras Appel & Wollenweber 729 ( f©ofJ| )* dia glauca+(Hagem) 1801 ( 20Öf3 )* Mueor mücedt 3re feld 1202 ( ) , Mucoj? hiemalia Wehmer 1205 (

), Muctr raoeffloatis Freanius 1209 t fOtjf4 )»

s 2

SAD

Rhizapus arrhizus Pisher 1212 .( 2υα$7 ), Basidiomycete sp. 1500 ( 2ÜQ98 ).

c) Hefem ■

G-eatrichum eandidum Link 801 ( 20099 ) *■·

* Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung und zur Reinigung einer üricase mikrobiologischen Ursprungs, mittels dessen man das Produkt in einer hochaktiven Form erhält. In Uricaseneinheiten gemäß der weiter unten, gegebenen Definition^ausgedrückt, beträgt die Aktivität im allgemeinen 10 bis 500 Einheiten pre Milligramm. Am Ende der Beschreibung wird das Aktivitätsm.eßv£jffahre.ix noch eingehend behandelt werden. ~"

DSs erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß der Erzeu- r germikroorganismus entweder in einer wenig oder nicht mit Sporen versehenen Tauchvorkultur in jedem beliebigen entsprechend umgerührten und belüfteten flüssigen Medium, das eine reich- ₌ liehe Entwicklung des Mikroorganismus gestattet, bei Temperaturen zwischen 20 und 35*0 während eines Zeitraums von 4 bis 12 Tagen, oder durch Züchtung auf jedem beliebigen festen Medium gezüchtet wird, wobei man bei Temperaturen zwischen-.20 und 35 G und während eines Zeitraums von -6 bis 15 Tagen Sporen erhält, .

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BAD ORiQlNA_L

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mit dem auf diese Weise hergestellten Inoculum ein Urate-Ionen enthaltender Erzeugernährhoden beimpft und die Züchtung bei einer Tenperatur zwischen 20 und 35 0 durchgeführt wird,

vorzugsweise bei der maximalen Produktion die Mikrobenmasse von der flüssigen Phase getrennt und die Uricase aus mindestens einem der beiden abgetrennten Medien extrahiert wird und

die Rohuricase gereinigt wird.

Die Tauchvorkultur zur Herstellung des Inoculum kann insbesondere in einem Czapeck-Dox-Medium oder in einem Sabouraud-Hedium durchgeführt werden.; die zu denselben Zwecken auf festem Medium vorgenommene Kultur kann auf gemalztem Reis durch geführt v/erden.

Zur Extraktion der endοcellularen Uricase aus der Mikroben— masse kann diese Masse insbesondere gemäß einem Merkmal der Erfindung eingefroren und zerkleinert werden und anschließend eine Fest-Plüssig-Extralrtion durchgeführt werden.

Einen bevorzugten, sehr aktiven Stamm erhiilt man aus einer angereicherten Kultur der Gattung Aspergillus und der Art HLavus* Bas Verfahren läßt sich jedoch auch auf die anderen i'iikroorganismen, welche■endacellulare TJricasen erzeugen, insbesondere, jedoch nicht auo schließlich", .auf die oben aufge»

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zählten Mikroorganismen, anwenden« Ein entsprechendes Verfahren kann für die Mikroorganismen, welche exocellulare Uricasen erzeugen, zur Anwendung kommen; hierbei werden die KuI-turfiltrate auf dieselbe Weise wie die cellularen Extrakte der endocellulare TJricasen erzeugenden Mikroorganismen behandelt.

KuItürmedien;

™ Die Medien müssen alle organischen und mineralischen Elementes die zu einer guten Entwicklung des Mikroorganismus und su einer reichlichen Produktion an TJricase erforderlich sind, enthalten. ■

Sie enthalten folgende Stoffe;

eine Kohlenstoffquelle, beispieleweise einfache Zucker, wie Glukose oder Saccharose, in einer Konzentration von 1 bis 10 Gew.~fo (in bezug auf die Gesamtheit des Kulturmediums) entweder für sich oder im Gemisch,-

eine Stickstoffquelle im allgemeinen in Form anorganisch gebundenen Stickstoffs, wie Ämmoniumchlorid oder Ammoniumaulfat, alkalische ijTitrate, usw., in einer Konzentration von 1 bis 10 6

mineralische Elemente wie Phosphor, Magnesium, Kalium, Natri-

um, Calcium, Eisen sowie auch andere Elemente, im allgemeinen in Konzentrationen zwischen 0_s0001 und O₅5 GeW₀-56, sowie Harn-

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säure in einer Dosis von 0,01 bis 0,2°/" als Induktor.

Diese Grundbestandteile können durch oligodynamisehe Substanzen, wie aminierte Säuren, Vitauine und Vachstunisfaktoren, Nukleotide, mineralische 01igoeleinente,wle Mangan, Molybdän, Kupfer, Kobalt und Zink, vervollständigt werden. Diese Substanzen können je nach ihrer üTatur beispielsweise von Hefeextrakten, IlydrolyseprOdukten, tierisches? oder pflanzlicheic Proteinen oder von iiineralsalzen herrühren. Sie können in Konzentrationen von 0,0001 bis 0,5$ vorliegen.

Diese verschiedenen, zuvor sterilisierten Bestandteile können entweder zum Zeitpunkt der Herstellung des Kulturmediums vor der Beimpfung oder zumindest teilweise während der Züchtung eingebracht v/erden5 bei manchen Bestandteilen geschieht dies aufgrund ihrer besonderen Bedeutung während der_Enzymsynthese, Diese Bestandteile sind beispielsweise die stickstoff- und phosphorhaltigen Bestandteile und die Harnsäure.

Kulturbedingungen s · _.■■.".-.

Die Kulturen werden im allgemeinen als Tiefkulturen unter Rühren und Belüftung durchgeführt. Es kann je nach der verwendeten Anlage mit 10 bis 200 Umdrehungen pro Minute gerührt Werdens ^i^e Belüftung wird im allgemeinen mit einem Durchsatz

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BAD ORlGlNAU

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von 0,05 bis 0,5 Liter Luft pro 'Liter Medium und Minute vorgenommen. Eine ausreichende Durchrührung kann auch mittels Durchperlenlassen der Luft erreicht werden.-Rühr- luid Belüftungs."bedingungen, die zu einer zu schnellen und zu intensiven Entwicklung des Hycels '·· führen, sind im allgemeinen der optimalen Enzymproduktion abträglich.

* Das "Medium wird... während der gesamten Züchtungszeit auf einer Temperatur zwischen 20 und 35 , vorzugsweise 30°, und auf einem pH—Wert von 4 "bis 8, vorzugsweise 6,5, gehalten.

Dauer der Kultur;

Die Kultur wird vorzugsweise fortgeführt, bis' die Enzymaktivität ihr Optimum erreicht, welches durch die weiter unten nach den Beispielen beschriebene Methode bestimmt wird. Es empfiehlt sich die Züchtung so zu führen, daß die optimale Enzymaktivität einer anhaltenden Aktivität und. nicht"einer Vielleicht höheren, jedoch vorübergehenden Aktivität entspricht; im allgemeinen erreicht die Kultur ihr Aktivitätsmaximum in einer Zeit von 15 bis 60 Stunden5 diese Zeit vari-. iert je nach Art der Medien, der Stämme und nach den Bedingungen, unter denen die Kultur vorgenommen wird. ·

Extraktion des Enzyms; _

Nach Beendigung der Züchtung wird die'"Kultur zur Abtrennung

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des Mycels filtriert; dieses wird Hit Wasser gewaschen undanschließend zur "Extraktion.-der Xlrioase gemahlen. Die Zerkleinerung kann erfindungsgemäß durch Einfrieren des HyceIs auf eine niedrige Temperatur mittels Trockeneis oder auf jede "beliebige andere ifeiB'j, die ein rasches und .vollständiges Einfrieren der Kycelmasse gestattet, vorgenoMmen v/erden. Man arbeitet vorzugsweise zwischen -15 und -30 .G. Das Mycel wird anschließend in einem Gerät zeifcleinert, das eine vollständi- , ge Trennung, der einzelnen Bestand teile des Mycels ohne Veränderung, des !faizyms gestattet.

Das zerkleinerte lrodukt wird i.iit eine Puff er sub stanz enthaltendem Wasser oder mit ammoniakalkischeui ¥asser aufgenommen, das zur Enzymexti-aktion niit Vorteil auf einen pH-\«^rei-t von 7 "bis 10, vorzugsweise auf 8_S5_S gebracht v/ird. Die Extraktion kann "bei einer Temperatur Lint tr 30⁰C auf "belieMge Iveise durchgeführt v/erden. I'erner kann den Extrakten zur Stabilitätsverbesserung ein Komplexbildner in einer Konzentration \on ungefähr 0,001 !'i.oljteispielev/eise Äthylendiamintetraessigsäure, im allgemeinen in Porm des iiatriuinsalzes zugegeben verden. Anschließend v/ird die Suspension gefiltert und abgetrennt.

Reinigung d.es Enzyms; - _t

Der hierbei erhaltene llycelextrakt enthält die Uricase, außerdem jedoch auch, gelöst oder im kolloidalen Zustand, zahlrei-.

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BAD

ehe Proteine und andere Stoffej es kann erforderlich sein; . diese durch Ausfällen mittels Salzen, mit welchen sie Komplexe bilden, zu "beseitigen. Als geeignete Fallungsmittel sind beispielsweise die Calciumsalze, wie das Chlorid oder Bleisalze, wie das Acetat, zu nennen,mit deren Hilfe eine große Zahl von Verunreinigungen in I'orm unlöslicher Verbindungen abgeschieden werden. Da der Extrakt selbst ein sehr gärbares Medium darstellt und damit leicht veränderlich ist, kann ihm ein Antibioticum, wie Chloramphenicol oder ein Antiseptikum, beispielsweise Batriumazid in einem Anteil von 10 bis 500 ■ jucg/ml_r und zwar im allgemeinen tOOjacg/ml beigegeben werden.

Da die Uricäse im Wasser-löslich",...in organischen Lösemitteln und in konzentrierten wäßrigen Lösungen von Mineralsalzen, wie Ammoniumsulfat hingegen unlöslich ist, kann sie leicht entweder durch Ausfällung mit einer mit !fässer^mischbaren organischen Flüssigkeit, wie beispielsweise Äthanol, Methanol oder Isopropanol oder auch vorzugsweise Aceton in einer Menge von 0,5 bis 3 Volumenteilen pro. Volumenteil Extrakt oder durch Aussalzen, insbesondere mit Ammoniumsulfat in gesättigter Lösung bei Raumtemperatur in Mengen von 0,5 bis 3 VoIumentellen pro Volumen Extrakt gewonnen werden.

Gegebenenfalls kann der Mycelextrakt zuvor bei verhindertem

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: _ 13 - ■.:■■■"

Druck bei einer !Temperatur unterhalb 40 C konzentriert werden.

Der dadurch erhaltene niederschlag wird beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt. Die in ihm enthaltene organische !Flüssigkeit muß rasch im Vakuum und ohne Erwärmung abgezogen werden, !"ach dem Filtrieren: oder Zentrifugieren kann er zur Lyophilisierung mit Vasser aufgenommen werden, wobei man ein halbgereinigtes Produkt erhält. TJm ein steriles Produkt zu

• Filfer - ■ .

erhalten, kann auf Membranen oder auf/lterζen /vor der Lyophi-

lislerung abgefiltert werden.

die Ausfällung durch Aussalzen vorgenommen wird, dann können die Salze entweder durch Dialyse oder durch pLeinlgung mit einem entsprechenden Molekularsieb, beispielsweise einem Dextran- oder Polyacrylamidgel abgetrennt werden.

Ferner ist es auch möglich, diese beiden l/Orgänge miteinander zu kombinieren und den wäßrigen Extrakt,der durch Aufnehmen des rohen niit Aceton ausgefällten lliederäehlägs mit eine~r Pufferlösung uit eineai pH von 8,5 erhalten wird, a-uszusalzen»

kann eine noch stärkere Peinigung vorgenomxien warjäen, indem man die bereits g^reinigten-Produkte durch .cyclische odor nichteyelisehe SäulenchriomEtagraphiem -unter

von Substanzen, welche die Ausscheidung·der Verunreinigungen,-insbesondere der noch in den Extrakten befindlichen Proteine, gestatten, behandelt. Hierzu können beispielsweise Cellulosederivate, .Dextrane sowie JP0.l3rac.ry !amide verwendet werden.. Die liluierung kann mit kontinuierlichen oder diskontinuierlichen pH- ader Moiarltatsgradienten durchgeführt werden.

"Die erfindungsgemäß gewonnene Uricase stellt ein amorphes farbloses oder leicht gelbliches Pulver dar, das in ¥asser und in den gebräuchlichen Puffern löslich ist?, seine Löslichkeit ist in alkalischem Medium größer-als in saurem. Die üri— ease ist in den gebräuchlichen Lösemitteln wie Äthanol, Methanol, Aceton, Äther und Chlorofarm, unlöslich. Sie hat bei einem pH-'ert von 8,5 und einer temperatur von 30 . ihre optimaleAktivität,'die jedoch auch noch bei 57 C sehr hoch ist. Hire Aktivität \drd durch die Kationen su Zn , Cd ,

ϊίη⁺⁺, Fe⁺⁺⁺, Co⁺⁺, ÜTi⁺⁺, Al⁺⁺⁺, bei Konzentrationen von 1Ö~⁴

—5 Ii _ß

bis 10 Hol und Hg IjbI der Konzentration von 10 . Mol partiell geJaeiiMt.. Cu "⁺ ist gering he,.iiiiend (30^ Heminung bei 10

Mol), Calcium, Uatrium, Kalium, Magnesium und mngan sind

— 1
bis au einer Xonz en tr a ti on von 10 wenig oder nicht heTnmf;nd._

Die Antonen ,Borat, Carbonat, Acetat, Citxat, Hitrat, Chlorid und Phosp'ha.t sind bei geringen und miirtloren Iionzuntrationen ohne Wirkung auf die Uricas.e; bei Konzentrat ionen von unge-

BAO ORIGINAL

fähr-10" Mol können die Anionen Nitrat und Chlorid jedoch partiell hemmend werden.

Die Uricase ist ohne Wirkung auf Coffein, Theotoromin, Theophyllin, Xanthin, 8-Chlorxanthin, 2,8-Dithio-6-hydroxy-purin usw., d.h. auf die wichtigsten "biologischen Stoffe,, deren chemische Struktur der der Harnsäure- nahekommt. Dieses Enzym kann somit also als äußerst: spezifisch angesehen v/erden.

In Lösung wird die üricasenwirkung durch das tierische Blutserum geschützt. " -■ -

Anhand folgender Beispiele wird , die neue Uricase und ihre Herstellung näher erläutert.

Beispiel 1

Stamm: Aspergillus flavus oryzae Wr. 624

Inoculum: Sporulierte Kultur, die 9 Tage lang in-zwei 1-Liter Plaschen auf Reis bei 28⁰C gewachsen ist und anschließend mit 2 1 physiologischer Kochsalzlösung mit 6 g/l NaCl aufgenommen wurde. . -

KuItürme d ium;

Grlu_cose (Ilaisglucose) 40 kg

Natriumnitrat 3 kg

Kaliumphosphat 0,750 kg

iionokaliuiapho-aphat 0,250 kg

Calciumcarboriat 109821/1511 1kg

Magnesiumsulfat ( 7 H₂O) 0,500 kg

Eisen-II-Sulfat ( 7 H₂O) 1g

Kobaltsulfat ( 7 H₂O) 10 g

Hefeextrakt 1 kg

löslicher Maisextrakt 0,300 kg

Harnsäure · ·· 0,600 kg Wasser bis 1000 1

pH-Wert des Mediums? 6*45

Sterilisierung des Mediumsί 30 Min. bei 120⁰C. Fach Abkühlung Beimpfung mit dem oben beschriebenen Inoculum. Kultur; Während der Kultur wird die Temperatur des Mediums auf 28° - 1° gehalten, das Medium wird mit steriler Luft belüftet, diie mit einem Durchsatz von 0,3 l/inin pro liter Medium von unten her eingeleitet \\rird. Nach 24 Stunden Kultur unter den oben beschriebenen Bedingungen erhalt man 20 kg Mycel mit einem Gehalt von 150 E/g. Das Mycel wird init 40 1 sterilem, destilliertem Wasser gewaschen und anschließend rasch auf -20° Eingefroren. ■

Abtrennung des Enzyms?

Das auf -20° eingefrorene Mycel wird zerkleinert und anschließend mit 40 1 ammoniakalkalischem Wasser mit einem pH von 9. aufgenommen. Nach Konzentrierung bei Unterdruck auf ein Vier,-tel seines Volumens und Ausfällung durch zwei Volumina Aceton

-17-.

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'" ^^H BAD ORIGINAL

erhält man 380 g Rohprodukt mit einem Gehalt von 7000 E/g. Dieses Produkt wird mit 3,8 1 einer wäßrigen Natriumcarbonatlösung (0,002 Mol) aufgenommen. Diese lösung wird abzentrifugiert und anschließend mit-demselben Volumen wäßriger gesättigter Ammoniumsulfatlösung behandelt» Der erhaltene Niederschlag wird abzentrifugiert und anschließend mit wäßriger Natriumcarbonatlösung (0,002 Mol) aufgenommen. Der verbleibende unlösliche Teil wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Der restliche Teil wird dann auf einer mit Natriumcarbonat (0,002 Mol) gepufferten Sephadex G 25 -Kolonne entmineralisiertund die aktiven Eluate werden zur Sterilisierung über eine Membran "Millipqr GS" geführt und anschließend lyophilisiert. . - "" · .

Man erhält 57 g Produkt mit einem Gehalt von 49 000 E/g.

Beispiel 2

Stamm: Aspergillus flavus oryzao Nr, 624

Inoculum: Zur Herstellung des Inoculums werden 2 1 flüssiges Sabouraud-Medium mit einer Agar-Agazi-KuItür (culture gelos&e) auf Gzapeclc-iDox-Kedium besät» Nach 40 Std» dient diese Kultur zum Inokulieren eines Fermenters in einer Menge von 1OQ welcher dasselbe Medium enthält. Nach 30 Stunden Kultur bei 28° wird di4seszweite Inoculum zum Beimpfen des eigentlichen Züchtungsmediums verwendet. -

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- 18 - ■.■;.'■ ;

Kulturmedium: .

GrIu^cose (flaisglucose) ■ Saccharose

Natriumnitrat

Kaliumphosphat

Monokaliumphosphat

Calciumcarbonat

Magnesiumsulfat 7 H₂O

Eisen-II-Sulfat 7 H₂O

Löslicher Maisextrakt Malzextrakt

öaseinhydrolysat

Kupfersμlfat

Harnsäure 2 kg

Wasser bis zu 3000 1

Sterilisierung des Mediums : 1 Stunde bei120°.

Fach Abkühlen Beimpfen mit dem oben beschriebenen Inoculum.

Kultur: Während der Kultur wird das Medium auf einer Temperatur von 30° - 1° gehalten und mittels einer Schraube, mit 150 TJpm umgerührt. Es wird mit steriler Luft mit einem Durchsatz von 0,2 l/l Medium/Min, belüftet. Nach 31 Stunden Kultur wird dem Medium 2 kg Natriumnitrat, 0,5 kg Hefeautolysat und 0,5 kg Harnsäure beigegeben, wobei alle diese Stoffe ste-

-19-1 0Ö8 21/15It

100	kg	kg	kg
15	kg '	kg'	kg
6	kg		300 kg
2	,250		T
0	,750	.3
3	kg '	1
1	kg	1
		°'
		1

rilisiert sind. Nach 43 Stunden Kultur erhält man 60 kg.My.cel mit einem Gehalt von 140 E/g. Das I¹Iy.gei wird rait sterilem de- · stillierteiii Wasser gewaschen und anschließend rasch auf -20° , eingefroren. ■ . - · '

Abtrennung des Enzyms:

Das eingefrorene'Mycel wird zerkleinert und anschließend durch 120 1 ammoniakalkalischeni Wasser mit einem pH von 9 extrahiert. Der ,.pH-Wert wird nach dem Filtrieren- wieder auf 9 eingestellt und das Volumen des Extraktes wird durch Konzentration "bei Unterdruck wieder auf 40 1 eingestellt. Das kon-' zentrierte Produkt wird Mittels einer wäßrigen, basischen Bleiacetatlösung mit 10 Gew.-^ Blei geklärt. Wach dem Zentrifugieren wird der oben schwimmende Teil, der die Üriease enthält, mit 48 1 wäßriger gesättigter Ammoniumsulfatlösung ver- setzt. Der durch Zentrifugieren abgetrennte niederschlag wird mit 2,5 1 wäßriger Natriumearbonatlösung (0,002 Mol) aufgenoiiimen und anschließend über eine "Sephadex G 25" -Säule geführt. Die aktiven Eluate werden lyophilisiert und man erhält 54 g eines Produktes mit einem Gehalt von 91 000 E/g.

Beispiel 3

Man geht wie in Beispiel 2 Vor und erhält 58 g eines Produktes mit einem Gehalt von 87 000 E/g. Dieses Produkt wird in

-20-

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Ammoniumcarbonat (0,01 Mol) gelöst; die Lösung wird über eine mit einer wäßrigen Ammoniumcarbonatiösüng (0,01 Mol) mit einem pH ,von 9" gepufferte D.E.A.E.-Cellulose-Säule geführt. Die Säule wird anschließend mit einer Aimnoniunicarbonatlösung (0,05 Hol) gewaschen» Die 'Uricase wird durch Erhöhung der Molarität des Puffers durch einen kontinuierlichen Elutionsgradienten eluiert. Man erhält in flüssiger Form das Äquivalent von 4^7 g eines Produktes mit einem Gehalt von 340 000

VeV - :■;"

Beispiel 4 ■ ■'*■

4,7 g des in:Beispiel 3 erhaltenen gereinigten Produktes werden, auf folgende Weise noch stärker gereinigt:

Die aktivsten, durch Eluierung durch Chromatographie auf einer D.E.A.B.-Cellulose-Säule erhaltenen Fraktionen, werden bis "au^f ein Sechstel ihres Volumens bei Unterdruck konzentriert, das konzentrierte Produkt wird über eine,, "Sephadex-G 100'^:-!>äule. geführt.' Durch Selektion der aktivsten Eluate erhält man in flüssiger Porm das Äquivalent von 1,1g eines Produktes mit einem Gehalt von 520 000 E/g»

In den Beispielen 3 und 4 wurde die Aktivität spezifisch ausgedrückt , indem man die Gesamtaktivität auf die nach der Microbiuretmethode bestimmte l'ionge der in der Lösung en thai te-

1 0 98 21/1511

BAD ORIGINAL

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nen Proteine bezieht, während sie sich in den Beispielen 1 und 2 auf das Trockengewicht bezieht«. - '

Die neue llricase gestattet die rasche^ spezifische und intensive Ausscheidung der Harnsäure und der im tierischen Organismus vorhandenen ürate durch tFmforiüung in in Wasser lösliches Allantoin. Sie kann insbesondere als Reagenz zum Feststellen und Dosieren von Harnsäure verwendet werden....

Yerf ahren zur Dosierung^ der TJrlcase^ .

Im folgenden wird das von der Anmelderin entwickelte und benutzte Verfahren zur Dosierung der Urätoxydase oder ITricase beschrieben* ,. . ,

1. Arbeitsprinzipi

Die ITricase mikrabiologisehen Ilrsprungs katalysiert die Oxydation der Harnsäure zu Allantoin unter Anwesenheit von Sauer* •stoff nach der Reaktion';

[γ

TIratoxydase H

-22-tt 109821/1511 . .

1642658

Man. mißt die Aktivität, indem Dian die unter den nachstehend beschriebenen Arbeitsbedingungen zur QxydationLder Hälfte der in 3aa Reaktionsmedium eingebrachten Harnsäure erforderliche Menge an Üricase bestiuunt.

Die Dosierung beruht auf der Verringerung der optischen Dichte einer Harnsäurelösung nach Inkubation mit dem Enzympräparat. ™ Die Harnsäure hat in saurer Lösung ein Absorptionsmaximum im UV-Licht bei285 ψ. \ .

Da die optische Dichte bei den Dosierungsbedingungen der Harnsäure-konzentrat! on./£ropor ti on^^^ kann hiermit die ■verwendete Harnsäure gemessen und damit die Enzymaktivität bestimmt werden,■ '

Die' Aktivitätseinheitder TJricase ist die Enzymmenge, die den Abbau der Hälfte des ursprünglich unter den Dosierungsbedingungen eingebrachten Substrats, d.h. der Harnsäure bewirkt.

2, Reagenzieni

a) gereinigte Harnsäure Hr. β 671 " C grade¹¹¹ des Califoinia Biochemical Research;,

b) Tris-Chydr.oxymethyljaminomethan (abgekürzt ^IC5?ris"}_t • . pur iss. Produkt von i^vluka,

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10&821 /1 si t ::

BADORIQ[MAl

c) Complexon III (Diηatriumsalζ der Äthylendiamino-tetraessigsäure) p.a., Bezugszähl 20 302,

d) Salzsäure p.a., Bezugszahl 20 252.

A. Herstellung der Reagenzien -

a) Mutterlösung aus Tris + "Öomplexon ΊΓΙ".

Man löst 6,05 g Tris in ungefähr 100 ml desMiller tem. Wasser und andererseits 373 ^mB öomj5le3con ill in 50 ml Wasser| die ■beiden lösungen werden miteinander vermischt. t*nd rait destilliertem Wasser auf 5ÖÖ-ml aufgefüllte.

b) 0,05 Molare auf pH 8,5-gepufferte Tris-IÖsung 250 ml der Mutterlösung (a) wird mit ungefähr 150 ml destilliertem Wasser versetzt, worauf der pH-Wert mit 0,2.n SaIssäure auf S,5 eingestellt wird; sodann gießt man in einen JO^ ml-Meßkolben um und füllt Jiit destilliertem Wasser auf 500 ml auf»

c) Harnsäuremutterlösung >

Man löst 100 mg Harnsäure in 50 ml Mutterlösung (a), gibt 30ml destilliertes Wasser hinzu und stellt den pH~Wert~auf 8,5 ein. Dann gießt man in einen 100 ml-Meßkolben um und füllt-mit destilliertem Wasser auf 100 ml auf* Diese Mutterlösung kann eine Woclie lang kühl aufbewahrt werden;; ^v .. .

d) Subs tr at Io sung von 100 /ieg/ΐαΐ. --..·. Man verdünnt die vorhergehende xluttorlösung mit dem luffer mit

. ' - ;. ·■-■- -24-10 9821/15 T1

OBfGiNAL

pH 8,5 -(Lösung nur innerhalb eines Tages verwendbar) aiii das Zehnfache. . ·

e) Enzymlösungs

Man stellt den Gehalt auf ungefähr 0,5 E/ml ein.

B, Technik '

In vier 10 ml-Küvetten wird folgendes eingebracht:

Küvette Nx. 1 ':". Ü£._2 Nx^Jl Hr., 4 ■

tuff er Tri s 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml Enzyiiilösung -·-- —. 2 inl 2 ml

Die Küvßtten werden ins Wasserbad gestellt und nach einer ■Vorinkubation von 5 Min. wird in die ICüvetten Kr. 2 und 4 1 ml der Harnsäurelösung mit 100 jacg/ml eingebracht. Die Küvetten werden dann 10 Hin. lang bei 30° zum Inkubieren gebracht und die Reaktion wird durch Zusetzen von Salzsäure (6, 2 Mol) gestoppt. ...-■■■ "'

Im ■.tir-Spektrophotometer werden die Küvetten 2 und 4 bei einer Wellenlänge von 285ψχ mit ihren jeweiligen Vergleichskävetten 1 und 3 verglichen.

Die Küvetten 1 und 2 können als Vcrgleichsküvetten To für eine

■ ' ■ —25—

109821/151 I

1042656

Reih§von Dosierungendienern Die Gläser 3 und 4 stellen die eigentliche Dosierung dar» ' -

Q. j

Man verwendet eine Eichkurve einer üriease mit einem Gehalt, der 50 oder 100E/mg äquivalent ist. Diese Kurve wurde durch eine vollständigere Dosierung mit Hilfe von vier Enzymverdünnungen ermittelt» -

Bei dieser Kurve gibt die-Abszisse die Enzymfconzentration und die Ordinate die nach Einwirkung der in den verdünnten lösungen enthaltenen Uricase erhaltene optische Dichte an.

Man trägt also iir dieser Kurve die dem ITersuch entsprechende optische Dichte ein und bestimmt auf der Abszisse die Terdtiiinung des Eichproduktes, die eine zu den 2 ml der verwendeten, verdünnten Lösung äquivalente Aktivität bewirkt. Die Aktivität der Lösung oder des Eingangsproduktes^fcannanschließend

schnell errechnet werden. ! .

Beispiel; ] '■-.'■'." "_ : - Γ

Eichproduk-f; i'rodulct mit 50 E/ag. \ —

Konzentration der verwendeten Eichlösung 1Oßig/mX ι0,5 u/ml, Nach Verdünnung auf 1/i000 beträgt die nach Einwirkung von

■ : .: .■■: ;.' : . ; . ■■, - ;"■ -26--109821/1511

2 ml der verdünnten Ldsung .erhaltene optische Dichte 0·,5Ό0» -

Diese optische Dichte entspricht .'auf der Eichkurve der Wirkung von 1 ml Eichlösung. ." .-

Man hat alsos 0.5 u χ 1 χ 1000 _QC-_n ,.,/_ιηΊ

—*——-r-™————-- - - ₌ ^5U U/1111.

Dieses schnelle Dotierverfahren kann =zur Dosierung der Produkte im Laufe ihrer Herstellung sowie zur Dosierung der Endprodukte verwendet werden. Ein vollständigeres Dosierverfahren, bei dem "beispielsweise vier Verdünnungen-verwendet werden und mit dem die Wirkungskurve jedes Produktes, ermittelt werden kann, kann zur„endgültigen Dosierung der gereinigten Produkte verwendet werden."

Die neue: Uricase, insbesondere das gemäß den oben beschriebe— nen Beispielen hergestellte Produkt, kann zur Konservierung und zum Gebrauch in einem sterilen Medium unter denUibliohen Bedingungen Iyophilisiert werden, indem man von einer wäßrigen Lösung ausgeht, die auf einem sterilisierenden Filter, wie Milliporfilter, sterilisiert x^urde.

Die pharmakologisehen Eigenschaften der oben bescliriebenen Fricase mikrobiologischen Ursprungs wurden durch folgende Arbeiten festgestellt;

.'■.■■ . -27- -;_

; ν : 109821/1511 .

8AD OBiGiNAL

1642658

¹ ■■.■;■■■- - 27 - · ■■".-■■■

1) Bei der intraperitcmealen und intravenösen Verabreichung beim Huhn wurde eine eindeutige Wirkung.-auf die Urikämie festgestellt. Insbesondere mit einer intravenös verabreichten Dosis von 20 bis 30"Einheiten/kg erhält man eine Senkung der Urikämie von ungefähr löf«, die mindestens 2 Stunden-anhält. Die Fig; 1 (i.p. Verabreichung der Ur ic eise) und 2 (i.Vi Verabreichung) zeigen diese Ergebnisse in ForJii einer graphischen Darstellung, bei der die in Prozent ihres Ausgängswertes angegebene Senkung der Urikämie auf des* Ordiiiate und die in Stunden ausgedrückte Zeit auf der Abszisse aufgetragen ist»

2) Die Uricase wurde dem Hund verabreicht. Da diese Art jedoch keine Harnsäure im Blut besitzt, wurde hierbei die Uricasenaktivität im Plasma nach dem Injizieren der Uricase untersucht. Man stellte fest, daß das Enzym mehr als 24 Stunden im Blut bestehen blieb, gleichgültig;ob es intravenös, intramuskulär oder subkutan verabreicht v/urdey.

■Der Hund hat keine Urikämie, da er von Natur aus Uricase in seiner Leber besitzt; deshalb wurde die Untersuchung der von Pilzen oder Bakterien abstammenden Uricase bei Hunden durchgeführt, bei denen eine anormale Urikämie durch Ausschließen der leber aus dem Blutkreislauf erzeugt wurde. Hierbei tritt tatsächlich sofort eine starke Urikämie auf umd man stellte

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' ' - 28 - "■.■■■ . \

feet/ ä&ß durch Verabreichung einer von Pilzen oder Bakterien stammenden Üricase eine Starke Senkung oder sogar eine Aufhellung dieser ÜrÜöämie bewirkt wird, wie es den Fig.. 3 bis 6 zu &fttohiaöft iöfc; Me Hg» 3 bis 5* bei denen die Zeit (in Std. ausgedrückt) auf der" AbößisöK (logäritttmlöeher Maßstab) und die Zahl der Urieasenaktivitätseinheit pro ml Plasma auf der Ordinate' aufgetragen ist, zeigen die tfricasenaktivität des Plasmas eines nicht anestäsierten, mit der neuen Üricase behandelten Hundes, die in Dosen von 38 (i,v,), 76 (i,m.) und 152 (b.c.) Einheiten pro kg. verabreicht wurde* Fig. 6 zeigt die Vfirlamg der neuen Uric as© (110 Einheiten/kg, i.v.) auf die Urikämie beim Hund bei Ausschluß der lieber aus dem Blutkreislauf. Die Urikämie (in ^eg/ial ausgedrückt} ist auf der Ordinate und die Zeit (in Hin. ausgeärtickt) ist auf der Abszisse aufgetragen,

3) Die Üricase hat beim Hund keine bemerkenswerte Wirkung auf den Blutdruck, die Herzfrequenz, die Heraelefctrogertese, die Druckreaktionen auf die verschiedenen chemischen Mittel, sov/ie auf die Atembewegungen. Ferner hat sie beim Hund keine Wirkung auf die Wässer- oder Iiineraldiurese.

4) Da die Üricase proteinischer Natur ist, verhält sie sich wie ein Antigen.-Bei den verschiedenen Versuchen, die zur

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BA ORIGINAL

Tint er Buchung ihres AntigenveriaÖgens angestellt wurden _r würden nie allergisierend©,sondern ausschließlich nur iminunisieren» de Mgenschaften festgestellt. Ein Kaninchen, das mit der Uricase, welcher das freund'schs Hilfsmittel peigegeben wurde, hyperiinmunisiert wurden reagiert mit der Bildungvon Antikörpern, die durch die liethode Ouchterlony (194-8, Acta, Path* liicrob. Soandinav, 2,6, 1949_y S. 507) leicht nachweisbar sind»

Aus einer Gruppe von Versuchen, die beim Huhn und beim Hund vorgenoiomen wurden, kann abgeleitet werden, daß in zeitlichen Abständen (ein Mal pro Woche) vorgenommene Uricaseninjektionen das Auftreten einer Immunität bewirken, die in einigen Monaten verschwindet. Dagegen bewirken tägliche Injektionen keine oder nur eine geringe Immunität» die eintägig ist* Sie Immunität ist umso geringer, je höher die Injizierte tfricaeen*· dosis ist. ". ■

5) Die akute Toxizität der Uricase 4st gleich null» Bine der Maus auf intravenösem Weg injizierte Dosis von W 000^ Einheit ten/kg ergibt kein pathologisches Symptom»

β) Die zahlreichen Iiiimuno;logioversuc|he_t bei denen den Tiere» ITricäse in irerschiedenen Dosen und |n linterschiedlichem

■ . - ■ ' * ^: i -'.'.-■'.---'.'''■ ' Rhythmus verabreicht wurde, haben keinerlei besondere Anzei-*

I - : ■■■■;""'■ ■' 4 ^; ' :- " ^: ■: :■■ "

BAD ORIGINAL

chen von Schädlichkeit gezeigt.

7) Die chronische Toxizität wurde beim Hund ajit Dosen von 200 und 1000 Einheiten pro Tier und pro Tag untersucht. Die ." Uriease wurde hierbei intravenös vier Monate läng verabreicht, ohne daß bei den Tieren eine anormale Erscheinung oder eine bemerkenswerte histologische Veränderung auftrat.

w Mit der neuen Uricase, im folgenden mit ihrer Kodezahl 8129 CB bezeichnet, wurden ferner klinische Versuche j die im folgenden abgehandelt werden, angestellt.

Diese Versuche wurden- an Männern vorgenommen« Die Uricäse 8129 CB wurde intravenös verabreichtj Dosierung: pro Injektion ungefähr 1000 Einheiten» Es wurden drei Versuche durchgeführt:

Versuch ITr. 1: _;

Vier Erwachs en efi wird das Produkt verabreicht. Ihre Urikämie wird vor der ■ Injizierung und dann 1" 1/2 Std., 3 Std, 5 Std_:. und 24 Std. nacjti der Behandlung beobachtet.

Versuch Kr. 2:

Das Produkt wird drei Erwachsenen verabreicht. Ihre Urikämie wird vor der Behandlung und danach drei Tage lang alle* 24 Std.

t51

untersucht. Gleichzeitig würde¹ ah den Urineii van. 24 Std. die Ausscheidung dee Allantoins untersucht.

Versuch Nr. 5: '

Zwei gichtkranken Erwachsenen wird täglich, und zwar 6 Tage, pro Woche, eine Ampulle von TOOO Einheiten von 8129 GB verabreicht.. Die Urikämie Wurde alle 24 Std. außer samstags und sonntags gemessen. Das Urinallantoin wurde'an den Ürinen von 24 Std. außer'samstags Und sonntags bestimmt". Die Gesamtzahl der Injektionen betrug in einem.Fall 9 und im anderen Fall

Die Toleranz des Produkt es war in allen !'allen im allgemeinen tadellos.

Versuch Kr. 1: _

Die erzielten Ergebnisse sind auf Tabelle Nr, 1 (A) dargestellt. Die Urikämie senkt sich in allen Fällen in der vierundzwanzigsten Stunde um mindestens 42?δ.; , .

Versuch Nr, 2:

Die Ergebnisse sind auf Tabelle Nr. 1 (B) angegeben. 24 Std. nach Behandlung ergibt sich auch hier die in.Versuch-Nr* 1 festgestellte starke Senkung der Uriksünie. Darüberhinaus vermehrt sich das Urinallantoin stark.

In der zweiundsiebzigsten Stunde nach der Behandlung über-

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steigt die Menge des ausgeschiedenen Allantoins den Ausgangswert und die Urikämie normalisiert aich.

■Versuch

Die Ergebnisse/ sind auf Tabelle Nr. 2 dargestellt. Die AllantoinaUsscheidung in 24 Std* erreicht in drei Tagen 1500 i» des Ausgangswertes* In einem Fall bleibt die Urifcäinie auf einem sehr niedrigen Prozentsatz. Bei der zehnten Injektion

ist die Urikämie icuner noch sehr niedrig und die Menge des abgeschiedenen Allantöins bleibt hoch.

Tabelle Mr. 1

\ -33-

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BAD ORIGINAL

Tabelle 1 - Einmalige Injektion von 8129 Ca

1) Verlauf der Urllcäai· über 24 Stund·»

	\ 8129 CB V 1000 ».	"'f'Aj	Baraaäure LOg pro si Plaaaa)	uklt der Ba]	mnalunjc	24 3td.	Änderung dor ürilcäele (Proeeut do* AuegmEgewartee)	1H 4#r Behandlung	- 33.7	24 did.
		Tor dar Bohandlenβ	Bl	3 Std.	■, ■ ■■■■©■		na(		+ *.*,-	, ^^· -WeT 1 a*' j 'i
	Patienten \,		1 Stunde	37,1	5 3t d.	26,6	1 Stunde JOjilia,			- $S,6
			38,9			3Ö.5	* 13.5	* 17,5		- 46,3
CD OO ■***.. —>. cn <	: ****' ■ ■■ ■■			51*7	39,7	41,6	:.· 16,7	- 315.3		-42,7
	et«, (gleht krank)	56,8	i«M . ·	61.0	61,0
	ir·»;		67.3		6t, 0		'-'16,1'.'

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Tabelle 2 - Wiederholt· Injektion von 8129 CB Bilanz der 24 stunden vor der Injektion

	CD	-ung	Dose	Patients	Vog. G.	*	65,7	urikänie	Patlent ι	Ler. H	Urlkäml·
Dage U*	CD CO		(Ein				(/»eg Harn-			(/uog Harn- aäure/ml Plasma
		1	hei	Dlurese	Urin-	51#3	Pllima	Olurese	UrIn-	49,2
Behand-	_1		ten) IV	(al/24 3td.)	allantoln	153,8	70,2	(ml/24 3td.)	allantoln
[	cn	■" 2 ■■■■			191,5				37#8
.	\	3	1000	2650		38,2	3200	<»g/24 OM.)	32t3
		4				15*6		54,7	28
			1000	1500		6,4	3300
	5	1000	2200	216		2500	621,3
	6 \.	1000	$250	300		2500	754,3
	7 , ''':'			222,2			jF %B &» A- ^F	35,9
	8			249,6	14			34,3
	9				8,8			18,4
	10	1000			7,9			29,3 ^
13	1000			8,1		663	CTJ
	1000					777	N)
	1000					835·2	rn
1000			ifesgögangeä	693,1

■..'■ ■.,- '- . - 36■-. ■-■■· ■'■ - '-■. ■ ■■ ; ' ■

Die neue UrIcase kann in der Humantherapie zur Behandlung von Hyperurikämie und ganz allgemein zur- Lösung der mit einem Überschuß von Harnsäure oder ihrer Salze verbundenen pathologischen Probleme verwendet werden.

Sie kann in Formen hergestellt v/erden, die eine parenterale Verabreichung - insbesondere auf intravenösem, subkutanem oder intramuskulärem Wege - oder auch eine orale oder endorektale Verabreichung gestatten.

Ein Beispiel fur eine pharmazeutische"Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung ist eine wäßrige Losung, die zum Zeitpunkt des --Gebrauchs aus 1000 Einheiten lyophilisierter und steriler iJricase und aus 5 ml eines sterilen Lösungsmittels aus s·

Eiatriumbicarbonat 840 mg

Glukose . 50g

destilliertes Kasser bis zu 1000 ml

bereitet wird.

Die Lyophilisierung der Uricase wurde in einem sterilen Medium unter den üblichen Bedingungen ausgehend von einer auf einem=sterilisierenden Filter, beispielsweise Milliporfliter, sterilisierten wäßrigen Lösung- durchgeführt.

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■^ r - BADORiGiNAU

Ferner ist es auch möglich, gebrauchsfertige wäßrige Lösungen stark gereinigter Uricase mit einem einem Gehalt von 200 bis 500 E/mg zu verwenden, sofern sie "bei genügend niedriger Temperatur aufbewahrt werden. Derartige lösungen werden aus dieser stark gereinigten Uriease und einer wäßrigen Ammoniuincarbonatlösung mit Ammonium!onen in einer Konzentration von 0,1 Mol hergestelltj deren pH-Wert mittels CO₂ auf 8 gebracht wurde. Die Lösung, die beispielsweise 200 000 Uricaseneinheiten auf 1000 ml enthält, wird durch Filtrieren sterilisiert und auf sterile Weise in sterilen Ampullen in einer Menge von 5 ml pro Ampulle verteilt.

Patentansprüche

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Claims (1)

1. . Uratoxydase oder Uricase mit einem G-ehalt von 10 bis 500 Einheiten pro mg, d_adjj.rch jgekennzeiclinet^

   a) daß sie ein amorphes, farbloses oder leicht gelbliches, in ¥asser und den üblichen Puffern löslichus Pulver dar-

   .. stellt, dessen löslichkeit in alkalischem Medium größer ist als in saurem, ' ;

   b) daß sie in den gebräuchlichen lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol, Aceton, Äther und Chloroform, unlöslich ist,

   c) daß sie bei einem pH-Wert von 8,5 und einer Temperatur von 30° ihr Aktivitätsoptimum erreicht, wobei die Aktivität auch noch bei 37 hoch ist,

   d)" daß ihre Aktivität durch die Kationen Zn *", Cd

   Fe⁺⁺⁺, Co⁺⁺, ¥i⁺⁺, Al⁺⁺⁺ bei Konzentrationen von 10~⁴ Ms

   _ R .1 f.

   m 10 ^ Mol und durch Hg bei einer Konzentration τοπ 10" Mol partiell und durch Cu gering· (3Q?'^r Hemmung bei 1ö~ Hol)geheiüiat v/ird,

   e) daß ihre Aktivität durch Ca, Ka, K, lig und iih bis au

   — 1
   einer Konzentration von 10 Mol und ebenso

   f) durch die" Anionen Borat, Carbonat, Acetat, Citrat, Mitrat, Chlorid und Phosphat bei geringen und ;aittieren Konzentrationen nicht beeinträchtigt wird, wobei die Anionen

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   BAD ORIGINAL

   Fitrat und Chlorid jedoch bei Konzentrationen von unge-

   —1

   fähr 10 Mol partiell:-hauiaend werden können,

   g) und daß sie auf die Purinvorbindungen Coffein, Theobroniin, TheOphjriiln, Xanthin, 8-Chlor-xanthin und 2,8-Dithio-G-hydroxy-purin keine Virkung hat.

   2, Verfahren zur Herstellung und Reinigung _:der TJricase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von Erzeuger" stammen ausgeht, die entweder zu den Bakterien insbesondere der Gattung Bazillus oder zu den Pilzen, insbesondere aus den Gattungen Mucor, Rhizopus, Absidia, Fusari— um, Alternaria, Pen!eiIlium, Äspergillus-und Microsporium und Hefen, beispielsweise Geotrichum,. gehören und daß der Erzeugermikroorganismus bei S'emperaturen zwischen 20 und 35° entxfeder durch eine Tauch*—vorkultur, wobei der iiikroorganismus wenig oder nicht sporuliert ist, das entsprechend Ujagerührte und belüftete flüssige Medium eine reichliche Mikrobenentwicklung gestattet und die Kultur 4 bis 12 Tage lang durchgeführt wird, oder durch Kultur auf jedem beliebigen festen Medium, das die Her- ' Btfcllung von Sporen in 6 bis T5 Tagen gestattet, kultiviert wird,

   mit dem auf diese Weise hergestellten Inoculum ein Urationen enthaltender Erzeugernährboden beimpft und die

   1098 2 17 1511

   Züchtung bei einer Temperatur zwischen 20 und 35 geführt wird,

   „die Mikrobenmasse vorzugsv/eise zum Zeitpunkt der maximalen Produktion von der flüssigen Phase getrennt und die Uricase aus mindestens einem der beiden abgetrennten Teile extrahiert wird
   und daß die erhaltene Rohuricase gereinigt wird.

   3. Verfahren nach Anspruch'2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus der Gruppe Streptomyces cellulosae, Streptomyces sulfureus, Bacillus megatherium, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii« Asp« terricola, Asp._vLuchuensis, Asp. niger, Asp« sydowi, Asp. nidulans, Asp. wentii, Asp. fonsecaeus, Asr>. clavatus, Asp« ustus, Asp. terreus, Asp. ocBnraceus, Penicillium frequentans, Pen. granulatum, Pen. griseum, Pen. canescens, Pen. spinulosum, Pen. thomii, Pen. waksmani, Pen. raistrickii, Pen. expansum, Pen. purpurescens, Pen, funicuTosum, Pen. spiculisporum, Pen. velutinum, Pen» purpurogenum, Pen. lilacinum, Pen. rubrum, Cephalosporium, Alternaria tenuio, Fusarium solani, Pus. moniliforme, Pus. coeruleum, E¹Us. o'xysporum, Pus. orthoceras, Stemphylium macrosporoideum, Macrosporium apiospermum, Absidia glauca, Mucor mucedo, Mucor hiemalis, Kucor racemosus, Rhizopus arrhizus, Basidiomycete und Geotrichum candidum. gewählt wird. -41-

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   '^r"'^r'?-'!\- -1.:* BADORfGINAL

   4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium eine Kohlenstoffquelle, insbesondere ein oder mehrere einfache Zucker, wie Glukose oder Saccharose, in Konzentrationen von 1 bis 10 Gew.-%, eine Stickstoff quelle, insbesondere eine anorganische Stickstoffquelle, wie Chlorid, Ammoniumsulfat, Alkalinitrate oder ein Gemisch dieser Verbindungen, in Konzentrationen von 1 bis 10^·, mineralische Elemente, wie Phosphor, Magnesium, Kalium, Natrium, Calcium, Eisen u.dgl., in Konzentrationen von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%,sowie Harnsäure in einer Dosis von 0,01 bis 0,2% beigegeben werden, die die Rolle eines Induktors spielt und zu Beginn oder während der Kultur eingebracht wird. ■

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis A-, dadurch gekennzeichnet , daß man den Kulturen oligodynamische Substanzen, wie aminierte Sauren» Vitamine, Wachstumsfaktoren,

   Nucleotide und mineralische Öligoelemente, wie Mangan, Molybdän, Kobalt, Zink und Kupfer, beigibt, die beispielsweise von Malzextrakten, Hefeextrakten, Hydrolyseprodukten von tierischen oder pflanzlichen Eiweißstoffen geliefert werden können und in einer Menge von 0,0001 bis 0,5% vorliegen,

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch ge-

   ',■■■■■ ■ -42-109821/151 1

   16Λ2656

   -■ ■-■ - - 42 - - -

   kennzeichnet, daß das Kulturmedium wahrend der gesamten Züchtung auf 20 bis 35 gehalten wird.

   7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 "bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung so geführt wird,-daß die Enzymaktivität einem anhaltenden Aktivitätslager entspricht.

   w 8, Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycel auf eine niedere Temperatur, vorzugsweise auf -15 bis -30 , eingefroren und anschließend zerkleinert wird.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,, daß das eingefrorene und zerkleinerte Mycel mit eine Puffersubstanz enthaltendem oder ammoniakalkalischem Wasser aufgenommen wird, dessen pH-Wert zur Extraktion des Enzyms, die bei einer Temperatur unter 30 vorgenommen wird, vorteilhafterweise auf 7 bis 10, vorzugsweise jedoch auf 8,5 gebracht wird.

   10. Verfahren nach einem der Ansprüche- 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Mycel durch Ausfällung gereinigt

   wird.

   -43-109821/1511

   •sie· .r,fö?}<|y ΐ-5-.-i ■--"■■ ' "■..■...-"

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   11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß dem Myceiextrakt ein Antibiotikum, vor zugsweise Chloramphenicol, oder ein antiseptisches Mittel, beispielsweise latriumazid, beigegeben wird.

   12. Verfahren nach einem der-Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß der Extrakt bei Unterdrück und einer Temperatur unter 40 konzentriert wird.

   13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch geke nnz e ic line t, daß zum Ausfällen der Uricase vor oder nach dem Konzentrieren dem Myceiextrakt als flüssige, mit Walser mischbare organische Verbindung Äthanol, Methanol, Isopropanol oder vorzugsweise Aceton in einer Menge von 0,5 bis 3 Volumen pro Volumen Extrakt beigegeben wird. ·

   14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß dem Myceiextrakt zum Ausfällen der Uri case Ammoniumoulfat in gesättigter wäßriger Losung bei Raumtemperatur in einer Menge von 0,5 bis 3 Volumen pro Volumen Extrakt beigegeben wird.

   15. Verführen nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Uricase durch fraktioniertes ^us-

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   fällen, Fixieren und Perkolation auf Bentonit oder Tonerde oder durch cyclische-oder nicht cyclische Chromatographie auf Säulen, die vorzugsweise mit Cellulosederivaten, Dextranen oder Polyacrylamiden gefüllt werden, oder auch durch eine Kombinierung dieser Arbeitsgänge gereinigt wirdi

   BAD ORIGINAL

   ■ HC

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