DE2133181A1

DE2133181A1 - Neues Antibiotikum und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2133181A1
Application number: DE19712133181
Authority: DE
Inventors: Jinnosuke Abe; Takuji Ando; Rokuro Izumi; Kazup Matsuura; Akiho Nagata; Toshiharu Noda; Shizuoka Tagata; Teruo Take; Tetsuo Watanabe; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1970-06-30
Filing date: 1971-06-30
Publication date: 1972-02-10
Also published as: FR2100846A1; US3892732A; PL81845B1; JPS4838877B1; DE2133181C3; NL7109029A; CH558832A; SU384233A3; AT310944B; GB1312541A; CS188875B2; FR2100846B1; DK129138C; BE769237A; SE375324B; DE2133181B2; ES392755A1; DK129138B; CA981198A; NL155049B

Description

Neues Antibiotikum und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, das im Folgenden als Tuberaotinomycin-N bezeichnet ist sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung durch Fermentation und Verfahren für dessen Gewinnung aus der Fermentationsbrühe.

Es ist bekannt, dass es eine grosse Anzahl von Antibiotika gibt, die durch Boden-Organismen, speziell der Art Streptomyces produziert werden. Einige dieser Antibiotika sind klinisch als Antituberkulosemittel angewendet worden, wie beispielsweise Streptomycin, Kanamydin, Cycloserin, Viomycin und dergleichen. Es sind jedoch früher häufig Stämme von Tuberkulose-Baζillen aufgetreten, die gegen diese Antituberkulose-Antibiotika resistent sind, und dies hat in der Tuberkulose-Therapie ernste Schwierigkeiten verursacht.

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Antituberkulose-Antibiotikum zu schaffen. Diese Aufgabe wird gelöst mittels eines neuen basischen Peptids Tuberactinomycin-N. Es wurde gefunden, dass ein zur Gruppe des Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus gehörender Stamm ein Anti tuberkulöse-Antibiotikum zu produzieren vermag. Dieses wird bezeichnet als Tuberactin oder Tuberactinomycin (entsprechend J. Antibiotics, 21, 681 (I968), Britisches Patent Nr. 1,201,727). Es wurde weiterhin ein Mutant des besagten Streptomyces erforscht und untersucht, und dabei wurde gefunden, dass dieser ein neues antibiotisches Tuberactinomycin-N zu produzieren vermag, welches eine überlegene Antituberkulose-Aktivität aufweist, verglichen mit Tuberactinomycin, und zwar eine stärkere Antituberkulose-Aktivität gegenüber Tuberkelbazillen hat, die gegen Streptomycin, p-Aminosalizylsäure oder Kanamycin resistent sind. Ausserdem zeigt dieses neue Antibiotikum eine niedrige Toxizität gegen Versuchstiere.

Der besondere Vorteil des erfindungsgemassen Antibiotikums besteht darin, dass ein neues, klinisch brauchbares Mittel zur Verfügung steht, demgegenüber die Tuberkelbazillen nicht resistent sind.

Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung des neuen erfindungsgemässen Antibiotikums Tuberactinomycin-N weist folgende Verfahrensschritte auf: in einem Nährmedium wird Streptomyces griseoverticillatus var. tuberaeticus No. N 6-I5O PERM P-619 gezüchtet, dieses Nährmedium wird aerob behandelt, bis es beachtlich antibiotische Aktivität aufweist, dann wird das Antibiotikum von dem Näbcmedium abgetrennt und das Antibiotikum wird als im wesentlichen kristallines Pulver gewonnen, welches eine Antituberkulose-Aktivität besitzt.

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Der Erfindungsgegenstand sowie dessen Vorteile werden in der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen noch näher veranschaulicht. Es zeigen:

Pig. 1 ein Schaubild des Ultraviolett-Absorptionsspektrums von Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid,

Fig. 2 ein Schaubild des Infrarot-Absorptionsspektrums von Tuberactinomycin/N,

Fig. 5 eine graphische Darstellung, die das kernmagnetische Resonanzspektrum von Tuberactinomycin-N-hydrochlorid zeigt, und

Fig. 4 ein Schaubild, in welchem die analytische Aminosäure-Struktur von Tuberactinomycin-N-hydrochlorid dargestellt ist.

Der Tuberactinomycin-N produzierende Stamm kann ausgewählt werden aus Microorganismen-Arten, die zu den Streptomyces gehören, vorzugsweise wird ein Mutant-Stamm von Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL J482 verwendet, der erhalten wurde durch Nitrosoguanidin-Behandlung.

Nachfolgend wird eine allgemeine Beschreibung der taxonomischen Eigenschaften dieses Mutant-Organismus gegeben, die auf beobachteten diagnostischen Eigenschaften basiert.

(1) Das kulturelle Verhalten 1st in Tabelle I niedergelegt.

TABELIE I
Medium Untersuchte Eigenschaften

G: gut

Czapek-Dox. Agar AM: weiss bis perlrosa (3ca)

SM: hellweizenfarben (2ea)

oder bambusfarben (2gc) SP: keine

0: massig

AM: massig, weiss bis mattrosa

Asparagin-Glukose Agar (5ba) oder frischrosa (5ca)

SM: manchmal in das Medium eindringend, perlrosa (j5ca) bisquit (3ec) '

SP: keine ^09887/1904 ~

TABELIiE I - P ort setzung

Medium

Untersuchte Eigenschaften

BennettJ's Agar

G: sehr gut

AMä gut, weiss bis frischrosa (4ca) bis hellrosabeige (4ec),
Tröpfchen

SMs bambusfarben (2gc) bis graduell dunkel- bis hellbraun (5ng)

SP: keine

Bouillon Agar

Calcium malate Agar

Gelatin-Medium

G: schlecht AMs keine

SMi nahezu farblos bis kalkig (ll/2eo)

SPs keine

massig

weiss bis bisquit (Jec), kurzes Mycelium

schlechtes Wachstum, perlförmig bis schalenförmig gefärbt (j5ba)

keine

G: sehr schlecht AM! keine

inkubiert bei 24 C SMf hellbraun (4ng) oder kakaobraun

(51g)* Gelatine-Verflüssigung

SPi keine

Löffler^fs Serum

G ι massig AMs keine

SMi hellweizenfarben (2ea) oder bambusfarben (2gcj, keine Haemolyse

SP: keine

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TABELLE I - Portsetzung

Medium

Untersuchte Eigenschaften

Stärke Agar Gi massig

AM: gut, weiss bis frischrosa (4ca) bis hellrosabeige (4ec)

SM: manchmal in das Medium eindringend, frischrosa (4ca) bis hellrosabeige (4eo)

SP: keine

Kartoffelpfropfen G: massig

AM: seitlich mit weissem Mycelium bedeckt

SM: gekrümmtes Wachstum, hellweizenfarben (2ea)

SP: keine

Möhrenpfropfen G: keines

Eier-Medium

G: gut

AM: weiss bis perlfarben (2ba)

SM: -

SPi keine

Milch-Medium G: massig

AM: massig, weiss bis hellweizenfarben (2eaJ oder bisquitfarben ()

SM: an der Oberfläche Ring bildend, schwache Koagulation

SP: keine

Cellulose 0: ke ine

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TABELLE I - Portsetzung

Medium

Untersuchte Eigenschaften

Tyrosin Agar

G: massig
AM: sehr schlecht

SM: hellweizenfarben (2ea) bis zimtfarben ()

SP: keine

Hafermehl-Agar

G: sehr gut

AM: weiss bis hellbeige (4ec), mit vielen Tropfen bedeckt

SM: hellweizenfarben (2ea) bis hellwürzbraun (4lg)

SP: meist nicht vorhanden oder hell kalkig (1 1/2 ec) oder ecrufarben (2ec)

G: AM: gut

weiss bis hellrosabeige (4ec), Wassertröpfchen

SM: perlrosa (3oa oder 4ca)
SP: keine

	G:	gut
Kartoffel- Gluc öse-Agar	AMs	hellrosabeige (4ee), Wassertröpfchen
	SM:	hellamberfarben (3ic) bis zimtfarben (3Ie)
	SP:	keine
	G:	gut
Glucose-Bouillon	AM:	keine
	SM:	nahezu farblose Mycelium- Klumpen am Boden
	SP:	keine

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- 7	Medium	2133181	Fortsetzung	gut
TABELLE I -		Untersuchte Eigenschaften	hellrosabeige (4ec) bis rosabeige (4gc)
Pepton-Glucose Agar	G:	Butterscotch (j5ne) bis goldbraun (3pg)
	AM:	keine
	SM:	massig
	SP:	frisohrosa oder perlrosa (4ca)
C/lycerin-Czapek	G:	keine Färbung
	AM:	keine
	SM:
	SP:

Diese Eigenschaften wurden, ausgenommen der Versuch mit Gelatin-Medlum, bei 3Q°C und zehntägiger Züchtung beobachtet.

Die Angabe der Färbungen wurde gemSss dem "Color Harmony Manual" (Container Corp. of Araerlaa, 1958) gemacht und bei nördlichem Tageslicht beobachtet.

In Tabelle 1 bedeuten G = Wachstum, AM = Luft-Mycelium, SM = Substrat-Mycelium und SP = löslicher Farbstoff.

(2) Struktur von Hyphae-tragenden Sporen:

Ein Luft-Mycelium wird in vielen Medien gut ausgebildet, und es wurden viele primäre und sekundäre Windungen mit einer starren oder flexiblen Form beobachtet.

(3) Sporen-Struktur:

Bei einer elektronenmikroskopischen Betrachtung zeigten die Sporen glatte Oberfläche, lange elliptische oder zylindrische Form, 0,7 bis 1,5/ι χ 0,5 Ms 0,6 fi.

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(4) Färbung des Myceliums:

Die Färbung des Luft-Myceliums ist in zahlreichen Medien zu Beginn weiss, verändert sich allmählich in rosa oder beige. Manchmal ist es mit Wassertröpfchen bedeckt. Die Färbung des Sufostrat-Myceliums ist im allgemeinen gelblich-braun oder fahlbraun,

(5) Lösliches Pigment?

Es wurde in dem untersuchten Medium keine Bildung von löslichem Pigment beobachtet, ausgenommen eine hellkalkige oder ecrufarbene Färbung in dem Harnstoff-Glycerin-Medium.

(6) Physiologische Charakteristiken!

(a) Gelatine-Verflüssigung? sehr schlechtes Wachstum, positive Verflüssigung

(b) Starke-Hydrolyse s positive Hydrolyse

(c) Nitrat-Reduktion: keine

(d) Peptonisation von Milchs kaum beobachtet

(e) Cellulose-Zersetzungs keine

(f) Produktion von H₂S: keine

(g) Haemolysei negativ

(h) Melanin-Pigment-Bildungt keine

(7) Verwendung von Kohlenstoffquellen;

Glukose, Maltose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Maimose und Inosit! lässt sich verwenden (+).

Xylose, Fruktose, Thaimose,, Raffinose, Salicin und Arabinoseg lässt sich nicht verwenden {-).

Laktose,, Saccharose und Mannitol: nicht eindeutig (±).

(8) Kolonies

Grösskolonle zeigt eine Chrysanthemen-artige Form und ist mit baumwollartigem f^oelium bedeckt.

In Tabelle II sind die Verschiedenheiten veranschaulicht, die sieh beim Vergleich der taxonomischen Eigenschaften zwischen dem hier beschriebenen Streptomyces und dem Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL 3482 ergeben. Es ist aus diesem Grund der hier beschriebene Streptomyces als Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus No. N 6-1J5O bezeichnet.

TABELLE II

Streptomyces hier be schrie-

griseoverticillatus bener

var. tuberacticus Streptomyces Medium NRRL 48

Harnstoff- gutes Wachstum sehr gutes

Glycerin- Wachstum Agar

Möhrenpfropfen massig kein Wachstum

Milch keine schwache

Koagulation Koagulation

Der hier beschriebene Streptomyces wurde hinterlegt beim Institute for Microbiological Industry and Technology, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, Japan und der dort befindlichen permanenten Kulturen-Kollektion unter der Hinterlegungsnummer PERM P-619 beigegeben. Ferner wurde dieser Stamm bei dem United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division hinterlegt und dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL ... registriert.

Der zuvor beschriebene Streptomyces griseovertioillatus var. tuberacticus No. N 6-I30 ist nur ein Beispiel für im Rahmen der vorliegenden Erfindung brauchbare Mikroorganismen, und der Erfindungsgegenstand umfasst darüber hinaus die Verwendung von anderen Tubera"ctinomycin-N produzierenden Stämmen, die zu der Art Streptomyces gehören.

1Ö888 7/1SÖ4

Erf indungsgemäss wird Tubergcotinomycin-N durch Beimpfung eines geeigneten Nährmediums mit Tuberaotinomyein-N produzierenden Streptorayeesj, zum Beispiel Streptomyces griseovertieillatus var* tuberacfcicus No. N 6-1J5O, Beimpfen dieses Gemisches unter für die gebräuchliche Antibiotika-Produktion üblichen Bedingungen, und anschliessender Isolierung des Antibiotikums aus dem Nährmedium gewonnen» Die Züchtung der Mikroorganismen kann auf zahlreiche verschiedene Weise durchgeführt werden, beispielsweise in flüssigen Kulturen oder auf festen Nährböden. Der für die industrielle Herstellung von Tuberactinomycin-N vorteilhafteste Weg ist das Kulturverfahren, bei dem unter der Flussigkeitsoberflaoiie und mittels Be-' lüftung gezüchtet wird.

Nährmedien, die für die Produktion von Tuberactinomycin-N verwendbar sind* sollen eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoffj wie beispielsweise ölukose, Saccharose, Laktose, Maltose, Stärke, Dextrin, Melasse, Glycerin u.s.w., eine Quelle für assimilierbaren organischen und anorganischen Stickstoff- wie beispielsweise Kornweichflüssigkeit, Sojabohnenpulver., Ba-umwollsaatöl, Gluten, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextraktρ Hefe, Kaseinhydrolysat, und dergleichen, oder beispielsweise Ammoniumsalze, anorganische Nitrate und dergleichen enthalten. Die Medien weisen weiterhin Salze, beispielsweise Phosphat, Magnesium, " Kalzium, Kalium, Natrium, Zink, Mangan und dergleichen auf.

Bei der Durchführung der Züchtung der für die Produktion von Tuberactinomycin-N verwendeten Organismen kann die Züchtungstemperatur ganz allgemein in dem Bereich variieren, in welchem die MikDoorganismen zu wachsen vermögen und Tuberactinomycin-N produziert werden kann, vorzugsweise kann sie bei 25 - 30 C liegen.

Die Züchtungs-Zeitspanne liegt im allgemeinen bei zwei bis zehn Tagen, wobei diese Zeitspanne je nach den speziellen Arbeitsbedingungen variiert. Wenn die Kulturbrühe die höchste Potenz an antibiotischer Produktion aufweist,

sollte das Züchtung s\^rs rf afereü te endet werden. * fl O «» £ "V * i £ $ A

Aus der Kufcurbrühe wird das Taberactinomycin-N wie nachstehend im einzelnen beschrieben entfernt. Im allgemeinen ist es nicht möglich, das Produkt mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln zu extrahieren, weil es von Natur aus leicht löslich in Wasser ist. Daher wird bei industrieller Herstellung auf solche Arbeitsmaßnahmen für die Isolierung und Reinigung des Tuberactinomycins-N zurückgegriffen, die durch dessen basiche Natur sich anbieten.

Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird die gesamte Nährmedium-Masse filtriert, das Tuberaetinomycin-N wird durch Zugabe von Sulfonsäure-Fabstoff, wie beispielsweise Methylorange, Eriochrom-Violett, Alizarinrot S und dergleichen, als Farbstoff-Salz aus dem Filtrat ausgefällt. Das so gebildete Tuberactinomycin-N-Farbstoffsalz wird in einem organisdBn Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Aceton oder dergleichen suspendiert, dann wird ein anorganisches Salz von Triäthylamin, wie beispielsweise Triäthylarain-Hydrochlorid, -sulfat oder dergleichen dazugegeben, und es fällt das entsprechende anorganische Salz von Tuberactinomycin-N, beispielsweise Tuberactinomycin~N-Hycrochlorid, -sulfat oder dergleichen aus* Man kann auch so arbeiten, daß man das Farbstoffsalz von Tuberyctinomycin-N in wässriger Salzsäure, wässriger Schwefelsäure oder dergleichen löst und, nachdem man den Farbstoff durch Extraktion mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln daraus entfernt hat, die wässrige Schicht konzentriert, ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Aceton oder dergleichen dazu gibt und in dieser Weise das anorganische Salz von Tuberaetinomycin-N ausfällt.

Eine weitere Arbeitsweise, die das für industrielle Zwecke besonders vorteilhafte Verfahren darstellt, besteht darin, daß man zum Isolieren des Tuberactinomycin-N aus der Kulturbrühe Kationenaus taus c her harz einsetzt. Bei d.'.esem Verfahren wird das Tuberactinomycin-N im Ka ti onenaus taus eu.;-rhar ζ festgehalten, mit verdünnter Lösung von Schwefelsäure, Salzsäure oder dergleichen, oder auch mit verdünnter alkalischer Lösung elulert,

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und die Tuberaetinomycin-N aktiven Fraktionen werden gesammelt, neutralisiert und konzentriert, es wird ein Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Aceton oder dergleichen dazu gegeben, und dann wird das Salz von Tuberactinomycin-N als Ausfällung gewonnen. Man kann auch so vorgehen, daß man das Piltrat des Kulturmediums dialysiert oder einer Gel-Filtration unterzieht, um die Substanzen mit hohen Molekulargewichten, wie beispielsweise proteinartige Substanzen, Polysaccharide oder dergleichen, die in der Brühe vorhanden sind, zu entfernen, danach durch Zugabe einer Säure konzentriert und anschließend mittels organischem Lösungsmittel das Säuresalz von Tuberaetinomycin-N ausfällt,,

Das so gewonnene rohe Tuberaotinomycin-N-Salz wird vorzugsweise durch Umkristallisation gereinigt, und dazu löst na» in Wasser, miecht dann ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Aceton, Methylcellusolve, Dioxan, Tetrahydrofuran oder dergleichen zu_e Man kann die Reinigung auch durch Aufgeben auf eine Chromatographie-Säule, beispielsweise aus Kationenaustausoherharz, Silicagel, Cellulosepulver oder dergleichen, die als Trägerstoffe bei der Reinigung von Tuberactinomycin-N geeignet sind, eluieren und die aktiven Fraktionen sammeln, daran anschließend konzentrieren und ein Lösungsmittel zugeben und auf diese Weise das Material in Form eines Salzes eluieren.

Eine weitere Methaode für die Reinigung von Tuberactinomycin-N-SaIz besteht darin, daß die konzentrierte wässrige Lösung von Tuberactinomycin-N-Salz mit einem Überschuß von wässrigem Triäthylaminsulfat versetzt wirdö Es bildet eich dann Tuberactinomycin-N-Sulfat, und anschließend wird eine große Menge von mit Wasser mischbarem organischem Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Aceton oder dergleichen zugegeben, wodurch das Tuberactinomycin-N als Sulfat abgetrennt wird. Dieses läßt sich durch Wiederholung dieser Arbeitsvorgänge reinigen.

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Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Tuberactinfmycin-N, wie es nach den oben beschriebenen Verfahren gewonnen winde, sind folgende»
(1) Elementaranalyse

Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid:

gefunden C: 37,70$, Et 6,12$, N: 22,5O#, GIi 13,32# theoretisch berechnet für ^C25^H43^N13°10 · ^ ^HC1:

C: 37,76#, Hj 5,83#, Ns 22,9O#, Cl:

(2) Molekulargewicht^ 778,4 (durch Titrationsmethode ermittelt)

(3) Molekularformel,'durch Berechnung ermittelt aus den bei der Elementaranalyse gefundenen Werten und dem festgestellten Molekulargewicht: ^G25^H43^N13°10 * -* ^{HG1 als} Hy^drocillorid·

(4) Schmelzpunkt: 245°C (unter Zersetzung)

(5) Optische Drehung des Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid: ■ fa J I¹ - -19,1 (c-1, H₂O)

(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Hydrochlorids: veranschaulicht in Fig. 1 (Konzentration 20 7/ml)

_ : 268 m /U, e}# -» 342,5 (in Wasser) max / jLfj cm

: 269 m /U, Ef* - 320,0 (in 0,1 η HCl). max '

max

: 288 m /U, E^_cm - 215,0 (in 0,1 η NaOH)

(7) Infrarotspektrum (in KBr tablettiert)« in Fig. 2 veranschaulicht«

Charakteristische Maximal 3300, I66O, 1500, 1225 und

105p cm"¹.

(8) Löslichkeit:

Anorganische Salze von Tuberactinomycin-N, wie beispiels· weise Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid und -sulfat, sind leicht löslich in Wasser und schwer löslich in den üblichen organischen Lösungsmitteln.

(9) Färbungsreaktion:
Positiv: Ninhydrin, Biuret.

Negativ: Sakaguchi, Isatin, Pauli, Molisch·

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(D) Isolationskoeffizieten: pka-j^ = 7,25, pka₂ = 10,05,

pka^ 11

(11) Aussehens Als Hydrochlorid oder Sulfat weisses kristalli

nes Pulver*

(12) Aminosäure-Bestandteile: in Pig_e 4 veranschaulicht, Säurehydrolyae von Tuberactinomycin-N gibt Serin, DAFA (α,β-Diaminopropionsäure), 7-Qxy-ß-lysin und Capreomycindin,

(15) Kernmagnetisches Resonanzspektrum 1 in Pig, j5 veranschaulicht.

Das zuvor beschriebene Tuberactinomycin-N hat die nachfolgende chemisches Strukturt

	I *	B	9	-NH-	OH j r	H	(	m	0
	^ΝΗ2 OH NH,,		C-		QI	• ΝγΝΗ	CH,	Il NH-C-NH
			ί ι		I	_s NH
		-C-NH-CH		—-CH—c:~	T
			*. {*	I! Ü	-CH NH-	-CH

CH.-CH,-CH-CH-CH,			Nil—C—
Γ- '					C=U

		I!
	1	0	-NH-	NH
I I ^
I
		-C=C'
		\

-C
Ii
(J

Tuberactinomycin-N stellt, wie hier beschrieben und veranschaulicht, ein Peptid-Antibiotikum mit Antituberkulose-Aktivität dar, welches aus 2 Molen Serin, 1 Mol I^-c^ß-Diarainopropionsäure, 1 Mol 3-areidodehydroalanin, 1 Mol L-Capreomycidin und 1 Mol Erythro-7-hydroxy-L-ß-lysin zusammengesetzt ist, das ein Maximum der Ultraviolett-Absorption bei 268 nyu zeigt, das bei der Ninhydrin- und Biuret-Reaktion positiv und bei der Sakaguchi-Reaktion negativ reagiert,

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BAD 0RH31NAL

- 15 -

Von den bisher bekannten Antibiotika, über die berichtet worden ist, ähneln Tuberactinoraycin (Tuberactin), Viomycin, eine vioraycinartige Substanz (Arai, et.al, Antibiot. & Chemothe, 7 (8), 435 (1957) ), Phthiomycin (vergl. Maeda, K., et al., J₀ Antibiotics, Ser. A_e 6(4), 183 (1953)* Japanische Patentpubli« kation 3096/1955), Capreomycin'(vergl_β W₀M_eStark et al.. Anti« microb. Agents and Chemoth, 201 (1962) ), Vinactin (vergl. US-Patentschrift 2,633, 445) und Älboverticillin (Maedä, K. et al, J. Antibiotics, HA, 30 (1958)) dem erfindungsgemäßen Tuberactino. mycin-N hinsichtlich einiger Eigenschaften. Dieses Tuberactinomycin-N unterscheidet sich Jedoch von diesen bekannten Antibiotika wie folgtt

(1) Vergleich mit Tuberactinomycin:

Tuberactinomycin zeigt positiveSAkaguchi-Reaktion, wohingegen Tuberactinomycin-N negative Sakaguchi-Reaktion aufweist.

Tuberactinomycin-N enthält Capreomycidin als strukturelle Aminosäure, enthält dagegen nicht Tuberactidin (basische Guanidin-Verbindung), wohingegen Tuberactinomycin Capreomycindin nicht enthält, dagegen Tuberactidin enthält. Demzufolge ist Tuberactinomycin vollständig verschieden von Tuberactinomycin-N·

(2) Vergleich mit Viomycin!

Viomycin weist positive Sakaguchi-Reaktion auf, dagegen hat Tuberactinomycin-N negative Sakaguchi-Reaktion, wodurch die Differenz zwischen den beiden Antibiotika zum Ausdruck kommt.

(3) Vergleich mit Älboverticillin:

Älboverticillin wist im Ültraviolett-Spektrum kein Maximum bei 220 - 320 nyu auf. Tuberactinomycin-N zeigt dagegen ein Maximum bei 268 nyu.

(4) Vergleich mit Capreomycin*

Capreomycin enthält Alanin und ß-Lysin als strukturelle Aminosäuren, wohingegen Tuberactinomycin-N diese Aminosäuren nicht enthält, dagegen Serin und ?-Oxy-ß-lysin aufweist.

109887/ 1 9CU

(5) Vergleich mit viomycinartiger Substanz:

Das Verhältnis von DEt"* der Absorptionsmaxima in Säure und alkalischer Lösung von viomycinartiger Substanz beträgt 1,20, hingegen beträgt der entsprechende Verhältniswert für Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid l,49j und das Maximum der Ultraviolett-Absorption in 0,1 η NaOH liegt für viomycinartige Substanz bei 280 nyu, wohingegen dieses Maximum für Tuberactinomycin-N bei 288 m/U liegt. Dies macht die Unterschiede dieser beiden Antibiotika anschauliche

(6) Vergleich mit Phthiomycin:

) ' Der Verhältniswert von % _cm der Absorptionsmaxiraa in Säure und alkalischer Lösung liegt für Phthiomycin bei 1,09, wohingegen der entsprechende Verhältniswert für Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid bei 1,49 gelegen ist. Dies zeigt die Unterschiede dieser beiden Antibiotika.

(7) Vergleich mit Vinactin:

Vinpctin ist das gleiche Antibiotikum wie Viomycin ( H, Umezawa, Index of Antibiotics from Actinomycetes, S* 684, 1970, University of Tokyo Press), dementsprechend ist es ebenso verschieden gegenüber Tube#actinomycin-N·

Bei Tuberactinomycin-N handelt es sich um ein neues Antibiotikum, " das sich von den bisher bekannten Antibiotika unterscheidet.

Das Tuberactinomycin-N hat die nachfolgenden biologischen Eigenschaften*

(1) Akute Toxizität von Tuberactinomycin-N-sulfat: LDc₀ =* 385 mg/kg (ddy Stamm Mäuse, i.v«) LD₅₀ = 1240 mg/kg'(ddy Stamm Mäuse, i.m.).

(2) Antimicrobiologisches Spektrum, ermittelt durch die Verdünnungsmethode auf Agar-Streifen

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Organismus

Minimum-Konzentration für die Inhibierung (η» π r ^/ml ^

i'seudomonas aeruginosa Escherichia coli NIHJ Escherichia coli .B Proteus vulgaris OX 19 Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B Shigella dysenteriae E-I Shigella flexineri Shigella sonnei E-33 Bacillus subtilis PCI Staphylococcus aureus FDA 209 P Staphylococcus albus Staphylococcus citreus Micrococcus flavus Sarcina lutea
Sarcina lutea ATCC 1001 Mycobacterium ATCC 607 100

50

100

• 100

25 100

25 100 100

12.5 100 100

25 100 100 100

12.5

Vibrio comma (A)	> IUO
Vibrio comma (B)	> ICO
Staphylococcus aureus Yoshioka	> 100
Staphylococcus aureus Yonemoto	25

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Antituberkulose-Aktivität:

i) Verwendeter Stamm: Mycobacterium tuberculosis IL₅₇Rv

ii) Medium: Kirchner¹S halbflüssiges Medium, pH 6,9

iii) Beimpfungsmenge:" 1Ö~^ mg iv) Beobachtung: nach dreiwöchiger Incubation,

a) Konzentrationsminimum für die Inhibierung an sensitiven Stämmen: 4 mcg/ml.

b) Konzentrationsminimum für die Inhibierung an resistenten Stämmen: in der nachfolgenden Tabelle veranschaulicht.

f Minimum-Konzentration für die Inhi

bierung ( mcg/ml)

Vergleichsdroge Tuberactinomycin-N

Streptomycin-resistenter

Stamm 64 2

p-Arainosali oyls äure-

resistenter Stamm 256 4

Isonicotinsäurehydrazid-

resistenter Stamm 256 4

Viomycin-resiatenter

Stamm 64 32

Kanamyoin-resistenter

Stamm 8 4

»Cycloserin-reaistenter
Stamm 256 2

(4) Experimentell ermittelter chemotherapeutischer Effekt bei Mäusen:

Es wurden drei Gruppen von je 10 ddY Stamm Mäusen, männlich, mit einem Gewicht von 20 g, die mit pathogenen Tuberculose-Bazillen, Mycobacterium tuberculosis H^₇Rv, intravenös infiziert wArden waren, mit Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid behandelt, und dabei wurden je Maus und Tag für die eine Gruppe 0,5 mg, für die andere Gruppe 1 mg/Maus und Tag und für die dritte Gruppe 2 rag nach dreitägiger Infektion subkutan verabreicht»

109887/ 190/.

Die Behandlung wurde drei Wochen lang kontinuierlich wiederholt« Einer aus zehn lausen bestehenden weiteren Gruppe, die als Kontrollgruppe diente, wurde physiologische Salzlösung verabreicht· Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle veranschaulicht:

Einige Tage nach Infektion mit dem Stamm

Maus	Kontrolle	Gruppe II	Behandelte Mäuse	24	>42
No.	Gruppe I	20		25	tt
1	20	21	(Dosierung: mg/Maus/Tag) .0,5 1,0 2,0	>42	U
2	21	21	21	η	tt
3	21	22	22	H	tt
4	21	23	25	tt	H
5	22	28	29	tt	N
6	22	29	35	tt	It
7	23	30	>42	tt	«1
8	25	>42	η	It	tt
9	26	η	tt
10	29	η
	It

In den nachfolgenden Beispielen, die lediglich zur weiteren Illustration des Erfindungsgegenstands und dessen Herstellung dienen, ist keine Begrenzung der Erfindung zu sehen, und es sind alle Prozentangaben als Gewichteprozente zu lesen und alle Verhältniswerte für Gemische von Lösungsmitteln als Volumen-Verhältnisse zu verstehen, sofern nichts anderes gesagt ist.

Beispiel It

Zwei Liter eines wässrigen Mediums, welches 3# Glukose, 2$ Stärke, 3# Sojabohnenmehl und 1,5# Natriumchlorid enthielt, würden in gleichmäßige Teilmengen aufgeteilt und in zwanzig 500-Milliliter Erlenmeyer-Kolben gefüllt. Der pH-Wert wurde auf 6 eingestellt, es wurde 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, danach mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus N 6-130 beimpft und danach in einer Drehschüttel-Einrichtung (Radius 2,5 cm, 330 UpM) bei 30⁰C 7 Tage lang bebrütet. Es wurden 1,5 1 einer Kulturbrühe erhalten, die 2,3$0 mcg/ml an Tuberactinowycin-N enthielt.

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Die abfiltrierte Brühe wurde mit 2,5 ml/Min durch eine Harzsäule, (2,5 cm Durchmesser, 28 cm Länge) die aus 150 ml Ionenaustauscher« harz Amberlite IRC-50, Natrium-Typ (Rohm und Haas Co,, UoS₀A.) bestand, hindurchgeleitete Die Säule'wurde mit Wasser gewaschen, mit 0,5 η HOL bei einer Durchflußgeechwindigkeit von I,j5 ml/Min, eluiert«, Die Eluafce wurden in Portionen von 10 ml aufgefangenj Tuberactinomycin-N-Aktivltät wurde bei den Fraktionen Nos_e 45-63 durch Ultraviolett-Absorption und Bioversuoh ermittelt.

Die so gewonnene aktive Fraktion, etwa 200 ml, wurde mit Natriumhydroxyd neutralisiert, im Vakuum zu etwa 15 ml konzentriert, und durch Ausfällung wurden anorganische Salze daraus abgetrennte Nach Entfärbung mit Aktivkohle wurden 150 ml Methanol zugegeben, man ließ das Gemisch bei 5⁰C über Naoht stehen und sammelte die Ausfällung durch Abfiltrieren· Die Ausfällung wurde mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, und es wurde rohes Tuberactinomyoin-N-Hydrochlorid gewonnen (Menget 5,07 g, Reinheit Ausbeute« 62#)_#

Belapiel 2

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle des dort angegebenen wässrigen Mediums ein Medium verwendet, welches 3# Glukose, 2$ Stärke, 1,5# Melasse, 1,5# Sojabohnenmehl und 1,5$ Natriumchlorid enthielt und auf pH 6,0 eingestellt war. Es wurden 1,5 1 an Kulturbrühe erhalten, die 2150 mcg/ml an Tuberactinomycin-N enthielten, Tuberactinoraycin N-Hydrochlorid fiel als Rohprodukt an (erhaltene Menget 2,98 g, Reinheltt 70,5#, Ausbeutet

Beispiel 3

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle des dort angegebenen Mediums ein solches eingesetzt, welches 2# Glukose, 3# Stärke, 1,4# Trookenhefe und 0,5# Natriumchlorid enthielt, und es wurde 1 1 an Kulturbrühe mit I665 mcg/ml an Tuberaetinomycin-N erhalten. Die Menge betrug 1,55 g an rohem

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Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid (Reinheit 72#, Ausbeute

Beispiel 4

In einen 500 ml Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines wässrigen Mediums eingefüllt, welches 1# Stärke, 1% Melasse, 1# Pepton, 1# Fleischextrakt und 0,5# Natriumohlorid enthielt. Der pH-Wert würde auf 7,0 eingestellt, es wurde 30 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert, dann wurde mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus No. N 6-I3O beimpft und anschließend unter Hin- und Herschütteln, 7 cm Weglänge, I30 UpM bei 30°C während zwei Tagen bebrütet. Die Fermentationsbrühe wurde in 20 1 an sterilisiertem (bei 120°C, 30 Minuten lang) wässrigem Medium, welches l£ Stärke, l£ Melasse, 1# Pepton, IJi Fleischextrakt, 0,5# Natriumchlorid und 5 ml Antischaummittel ( Uniol D-2000, Handelsbezeichnung der Firma Nissan Oil Co., Ltd. Tokyo) enthielt und sich in einem 30 1 Fermentationebehälter befand, als Beimpfungsmittel zugegeben. Es wurde 24 Stunden lang unter Belüftung mit 20 l/Min, und Rühren mit 200 UpM gezüchtet. Nach 24-stündiger Fermentation wurde die Brühe als Beinfpungsmittel zu 200 1 eines sterilisierten wässrigen Mediums mit 3# Stärke, 2# Glukose, 4,0J< entfettetem Sojabohnenmehl, 1,5# Natriumchlorid und 100 ml Antischaummittel ( pH 6,0 vor der Sterilisation), die sich in einem 250 1 Fermentationstank aus Edelstahl befanden, hinzugegeben. Es wurde 90 Stunden lang unter Belüftung mit 100 l/Min und Rühren mit 300 UpM bei 3O⁰C gezüchtet. Dabei wurden 190 1 an Kulturbrühe gewonnen, die 2400 mcg/ml an Tuberactinomycin-N enthielten.

Der pH-Wert der Kulturbrühe wurde mit Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Anechlißend wurden 25 Volumprozent an Diatomeenerde beigegeben, und das Gemisch wurde bei vermindertem Druck filtriert. Dabei fielen I60 1 an filtrierter Brühe an. Nach dem Neutralisieren wurde das Filtrat durch eine Harzsäule aus 10 Ionenaustauscherharz IRC-50 (Na-Typ) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 l/Stunde aufgegeben, und dabei wurde das Tuberactinomycin-N, das darin enthalten war, absorbiert. Das Harz wurde

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mit Wasser gewaschen, dann mit 1 η Salzsäure bei einer Durchflußgeschwindigkeit von J 1 /Stunde eluiert. Jeweils 1,5 1 wurden als Einzelfraktionen abgetrennt, und dabei wurde das Tuberactinomycin-N in den Fraktionen Nos. 10 - 17 gefunden. Die aktive Fraktion wurde nach Neutralisieren mit Natriumhydroxyd im Vakuum zu etwa 13ΟΟ ml konzentriert, und es wurde das abgeschiedene Natriumchlorid entfernt. Das so erhaltene Konzentrat wurde mit Aktivkohle entfärbt, und es wurden unter Rühren 10,4 Methanol hinzugegeben· Man ließ das Gemisch über Nacht bei 5⁰C stehen, wobei Tuberactinomycin-N ausfiel» Das Tuberactinoraycin-N wurde mit Methanol gewaschen, über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet, und es wurde rohes Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid gewonnen (Menget 395 g, Reinheit 11,0$, Ausbeute: 72,&#).

Beispiel 5

Die Fermentation wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, und es wurden 20 1 Kulturbrühe mit 2200 mcg/ml Tuberactinomycin-N darin erhalten.

Mit Schwefelsäure wurde der pH-Wert der Brühe auf 2,0 eingestellt, dann wurde nach Zugabe einer geringen Menge an Filterhilfsmittel filtriert, und es fielen 1,76 an klarem Filtrat an. Dieses wurde auf pH 5*5 eingestellt, es wurden 16,5 g Eriochromviolett hinzu gegeben, dann wurde 1,5 Stunden lang dialysiert und anschließend die Ausfällung abfiltriert· Das auegefällte Farbstoffsalz von Tuberaotinomycin-N wurde nach Waschen mit Wasser im Vakuum getrocknet. Das so hergestellte Farbstoffsalz von Tuberactinomycin-N wurde in 350 ml eines Gemisches aus 80# Aceton und 20# Methanol suspendiert, dann wurde eine 50jf-ige Lösung von Triäthylamlnsulfat in Methanol solange hinzu gegeben, bis sich kecäne Ausfällung von Tuberactinomycin-N-sulfat mehr bildete. Nachdem das Gemisch 1,5 Stunden lang gerührt worden war, wurde die Ausfällung abfiltriert, zur Entfernung des Farbstoffes mit Aceton und Methanol gewaschen, in einer kleinen Menge an Wasser gelöst, und das Tuberactinomycin-N-sulfat wurde durch Zugabe von Methanol ausgefällt (Menges 3,09 g, Reinheit» 79#, Ausbeutet

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Beispiel 6

7,5 g an Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid, wie es gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, wurden in 75 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule hindurch geleitet, die aus 50 ml Ionenaustauscherharz Amberlite IRA-411 (Sulfonsäure-Typ) bestand, mit einer Dur chf lußges chwindigkeit von 20 ml/Std. Es wurden je 10 ml Einzelfraktionen ausgewaschen, und die Fraktionen No. 3-12 zeigten Tuberactinomycin-N-Aktivität. Diese Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, bis die Konzentration an Tuberactinomycin-N 200 mg/ml betrug. Diesem Konzentrat wurden 4 Volumina Methanol zugegeben, und die auegefällt Substanz wurde abfiltriert· Es wurde Tuberactinomycirt-N-Hydrochlorid erhalten (Menge 6,17 fe* Reinheit! 80,2#, Ausbeute:

Beispiel 7

Es wurden 100 mg an gemäß Beispiel 1 gewonnenem Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid in 5 ml einer Lösung, bestehend aus n-Butanol» Pyridini Essigsäuret Wasser (15 ι 10 : 3 ι 12, V/V) gelöst und die Lösung wurde an*einer Säule (l cm~x 130 om) aus Cellulosepulver in dem gleichen Lösungsmittelgemisch abaorgiert. Dann wurde das gleiche Lösungsmittelgemisch mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 ml/Stunde durch die Säule hlnduch geleitet« Das Eluat wurde in Fraktionen von je 3 ml aufgefangen. Tuberactinomycin-N wurde in den Fraktionen No, 39-46 gefunden» Die aktive Fraktion wurde im Vakuum auf 1 ml konzentriert. Es wurden 5 ml Methanol hinzu gegeben, und es fielen 60 mg an Tuberaotinomycin-N-Hydrochlorid an.

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Claims

- 24 Patentansprüche

lc Neues Antibiotikum, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Tuberactinomycin-N mit der chemischen Formel

Oh I

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C NH--CU C NH (J)

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CH₀-CH₁-Ch-CH-CH₁-C-NH-CH h L=O

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2 OH NH., i"H_. 1 ' NH

2 L .NH 0

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NH-C CH NH C——C=C

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handelt.

2β Antibiotikum gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tuberactinomycin-N im Gemisch mit sonstigen üblichen Zusätzen vorliegt.

3ο Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces griseoverticillatus var₀ tuberacticus FERM P-619 unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Medium gezüchtet wird, bis dieses Medium eine deutliche antibiotische Aktivität aufweist.

4, Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem die antibiotische Aktivität aufweisenden Nährmedium das Tuberactinomycin-N mit der in Anspruch 1 angegebenen Formel als im wesentlichen kristallines Pulver isoliert wird»

3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,

von 18 - 57C / smperatur des Kulturmeidums^/ und ei:

5· Verfahren nach Anspruch

daß die Züchtung bei einer Temperatur deVTCuTturme'idums⁷ und einer

Zeitspanne für das Wachsen der Organismen von etwa 2-10 Tagen dxh geführt värd

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6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5* dadurch gekennzeichnet, daß das Tuberactinomycin-N unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes vom Carbonsäure-Typ aus dem Kulturmedium isoliert wird ο

7ο Verfahren nach Anspruch 4 oder 5* dadurch gekennzeichnet, daß das Tuberactinomycin-N durch Ionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes vom Carbonsäure-Typ gereinigt wird.

8o Verfahren nach Anspruch 3 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Tuberactinomycln-N in Form eines seiner physiologisch unschädlichen Salze gewonnen wird.

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