Sposób wytwarzania nowego antybiotyku tuberaktynomycyny-N Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku pod nazwa tuberaktynomycy- na-N.W dziedzinie antybiotyków wytwarzanych przez mikroorganizmy glebowe, zwlaszcza przez rodzaj 5 Streptomyces, prowadzono juz liczne i dokladne badania. Miedzy innymi jako dzialajace na lasecz¬ ke gruzlicy, znane sa na przyklad takie antybio¬ tyki jak streptomycyna, kanamycyna, cykloseryna i wiomycyna. Te antybiotyki sa obecnie szeroko 10 stosowane w terapii gruzlicy. Ostatnio jednak wy¬ kryto rózne laseczki gruzlicy o bardzo duzej odpor¬ nosci na antybiotyki przeciwgruzlicze.Wynalazek ma na celu opracowamie sposobu wy¬ twarzania nowej substancji antybiotycznej, skutecz- 15 nej równiez przeciwko uodpornionym laseczkom gruzlicy.W toku licznych badan stwierdzono, ze promie¬ niowce obejmujace Streptomyces grissoverticillatus wytwarzaja skuteczny antybiotyk przeciwgruzliczy, 20 który nazwano tuberaktynomycyna, (J. Antibictics, 21, 681/1968). Dalsze badania wykazaly, ze wariant lub mutant wyzej wymienionego szczepu promie¬ niowca wytwarza nowy antybiotyk, który przewyz¬ sza tuberaktynomycyne dzialaniem na laseczki gru- 25 zlicy oraz dziala tak samo lub silniej przeciwko tym laseczkom gruzlicy, które wykazuja duza od¬ pornosc na znane leki, miedzy innymi na strepto¬ mycyne, kwas- p-aminoisalicylowy, kamamycyne itp.Ten nowy antybiotyk, nazwany tuberaktynomy- 30 cyna-N, charakteryzuje sie bardzo slabym toksycz¬ nym dzialaniem na zwykle laboratoryjne zwierzeta w porównaniu ze znanymi substancjami tera¬ peutycznymi podobnego rodzaju.Nowy mikroorganizm wytwarzajacy tuberaktyno- mycyne-N zostal wyizolowany z próbki gleby po¬ branej w miejscowosci Ohhito-maehi, prowincja Takata-gun, Shizuoka-kein, w poblizu góry Fuji w Japonii, a sztucznie otrzymano go dzialajac ni- trozoguanidyna jako srodkiem mutagennym na wspomniany wyzej mutant szczepu promieniowca, a mianowicie Streptomyces griseovercillatus var.FERM P-45.Taksonomiczne wlasciwosci nowego mutanta sa nastepujace: 1) Charakterystyka hodowli na róznych po¬ zywkach: Agar Czapka G: dobry AM: dobra; biala do perlowo-rózowej (3 ca) lub jasnorózowobezowa (4 ec) SM: jasnopszeniczna (2 ea) lub bambusowa (2 gc) SP: brak Agar asparaginowo-glukozowy G: umiarkowany AM: umiarkowana; biala do muszelkowTorózowej (5 ba) lub swiezorózowa (5 ca) 8184581 845 3 4 SM: podx powierzchnia pozywki; perlowo rózowa Jajko (3 ca) lub porcelanowa (3 ec) SP: brak G: dobry AM: biala do perlowej (2 ba) Agar Bennetfa 5 SM: — SP: brak G: dobry AM: dobra; biala do swiezorózowej (4 ca) do jasno- rózowobezowej (4 ec); pokryta kroplami plynu perpiracyjnego SM: bambusowa (2 gc) dó stopniowo ciemniejaca wewnatrz jasnobrazowa (4 ng) SP: brak * Agar z bulionem A: ubogi AM: brak SM: prawie bezbarwna (1. 1/2 ec) SP: brak Zelatyna (inkubowana w temperaturze 24°C) A: bardzo ubogi AM: brak SM: jasnobrazowa (4 ng) lub kakaowobrazowa (5 Ig); uplynnia zelatyne, SP: brak Agar z jablczanem wapniowym G: umiarkowany AM: krótka; biala do porcelanowej (3 ec) SM: uboga; perlowa lub muszelkowa (3 ba) SP: brak Surowica Lofflera A: umiarkowany AM: brak SM: blyszczacojasnopszeniczna (2 ea) lub bambu¬ sowa (2 gc); nie hemolizuje SP: brak Agar skrobiowy G: umiarkowany AM: dobra; biala do swiezorózowej (4 ca) lub ja¬ snorózowobezowa (4 ec) SM: czesciowo rosnie pod powierzchnia pozywki SP: brak Skos z ziemniaka G: umiarkowany AM: pózno pojawiajaca sie biala grzybnia SM: jasnopszeniczna, prosowata SP: brak Skos z marchwi G: brak wzrostu Mleko G: umiarkowany AM: wolno rosnaca biala do jasnopszenicznej (2 ea) lub porcelanowa (3 ec) SM: wzrost pierscieniowaty; nie koaguluje SP: brak Celuloza G: brak Agar tyrozynowy G: umiarkowany AM: prawie brak, SM: jasnopszeniczna (2 ea) lub cynamonowa (3 le) SP: brak Agar mocznikowo-glicerolowy G: dobry AM: biala do jasnobezowej (4 ec) pokryta kropla¬ mi plynu perspiracyjnego SM: jasnopszeniczna (2 ea) lub jasnomiodowobra- zowa (4 Ig) SP: prawie brak lub prawie bezbarwna (1. 1/2 ec) lub bielonego plótna (2 ec) Agar owsiany G: dobry AM: biala do jasnorózowobezowej (4 ec), pokryta kroplami plynu perspiracyjnego SM: perloworózowa (3 ca lub 4 ca) SP: brak Agar ziemniaczano-glukozowy G: dobry AM: jasnorózowobezowa (4 ec), pokryta kroplami plynu perspiracyjnego SP: for ale Agar bulionowo-glukozowy G: dobry AM: brak SM: prawie bezbarwna grzybnia, gleboko tworza¬ ca mase SP: brak Agar peptonowo-glukozowy G: dobry AM: jasnorózowobezowa (4 ec) do rózowobezowej (4 gc) SM: maslano-sosnowa (4 ec) do zlotobrazowej SP: brak 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60*1845 5 Agar Czapka z glicerolem Gi umiarkowany AM: swiezy do perloworózowego (4 ca) SM: przezroczysta SP: brak Symbole „G", „AM", „SM" i „SP" oznaczaja od¬ powiednio „wzroist", „grzybnia powietrzna", „grzyb¬ nia podstawowa" i „rozpuszczalny pigment".W powyzszym opisie kazda obserwacje przepro¬ wadzano na hodowli nowego mutanta w tempera¬ turze 30°C w ciagu 10 dni, jezeli nie zaznaczono inaczej. Barwy okreslano w dziennym swietle z pól¬ nocy, zgodnie z zaleceniem znajdujacym sie w „Co- lor Harmony Manual", 1958, Container Corpora¬ tion of America. (2) Budowa strzepków wytwarzajacych konidia.Grzybnia powietrzna sklada sie z licznych pier- wszorzedowych i drugorzedowych spirali uksztalto¬ wanych prosto lub faliscie. (3) Konidia.W mikroskopie elektronowym konidia mutanta stosowanego w sposobie wedlug wynalazku wykazuje gladka powierzchnie na ogól w ksztalcie wydluzo¬ nych eliptycznych graniastoslupów lub kolistych walców. Konidia maja dlugosc 0,7 \jl co 1,5 \i, szerokosc 0,5 \i do 0,6 \i. (4) Barwa szczepu.Grzybnia powietrzna ma poczatkowo odcien bia¬ ly, który moze przechodzic w odcien rózowy lub bezowy. Na powierzchni grzybni znajduja sie czesto krople plynu perspiracyjnego. Podstawowa grzyb¬ nia jest na ogól zóltobrazowa do bladobrazowej; (5) Rozpuszczalny pigment.Na agarze mocznikowo-glicerolowym wytwarzany jest pigment blady lub bielonego plótna. Na in¬ nych pozywkach nie stwierdzono obecnosci pig¬ mentu. (6) Cechy fizjologiczne.Uplynnianie zelatyny: ubogi wzrost, ale telatyne uplynnia.Hydroliza skrobi: tak.Redukcja azotanów: nie.Peptonizacja mleka: prawie nie.Rozklad celulozy: nie.Wytwarzanie H2S: nie." Hemoliza: nie.Wytwarzanie pigmentu melaninowego: nie. (7) Zuzywanie zródel wegla.Zuzywa glukoze, maltoze, skrobie, dextryne, gli¬ cerol, mannoze i inozytol.Nie zuzywa ksylozy, fruktozy, ramnozy, rafinozy, salicyny i arabinozy.Nie udalo sie okreslic zuzywania sacharozy i mannitolu, oznaczenia czasem dodatnie, czasem ujemne. (8) Kolonie.Makrokolonie: podobne do chryzantemy; Wzrost grzybni: puszysty.Wsród wymienionych wyzej taksonomicznych wlasciwosci, stwierdzono istotne róznice pomiedzy mutantem nowym i znanym mutantem strepto¬ myces griseoverticillatus var. tuberacticus. Dlatego nowy mutant nazwano Streptomyces griseoverticil- 6 latus var. tuberactious nr N6-130. Róznice miedzy tymi szczepami przedstawiono w tablicy 1.Tablica 1 5 Pozywka hodo¬ wlana Agar moczni- kowo- -glicero- lowy Skos z marchwi Mleko Str. griseo- verticillatus var. tuberacticus dobry wzrost drobny ubogi nie koaguluje Nowy mutant stosowany w sposobie wg Wynalazku lepszy wzrost brak wzrostu koaguluje slabo Nowego mutanta zdeponowano w Fermentation 20 Research Institute, Industrial Technological Agency nalezacym do Ministry of International Trade and Industry w Japonii pod numerem FERM P-619, jak równiez w U.S. Departament of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization 25 Research and Development Division pod numerem NRRL, 3986.Sposobem wedlug wynalazku tuberaktynomycy- ne-N wytwarza sie hodujac w pozywce szczep Streptomyces griseovertioillaitus var. tuberacticus 30 NRRL 3986, po czym z brzeczki wyosabnia sie tuberaktynomycyne-N. Hodowle prowadzi sie spo¬ sobami analogicznymi do stosowanych przy wytwa¬ rzaniu znanych antybiotyków. Zaleznie od potrze¬ by mozna stosowac pozywki hodowlane stale albo 35 ciekle. W skali przemyslowej korzystne jest stoso¬ wanie przeplywu powietrza przez ciekle pozywki hodowlane. Skladniki pozywek stosowane w proce¬ sie prowadzonym sposobem wedlug wynalazku mo¬ ga byc takie same jak stosowane w podobnych 40 znanych procesach. Jako zródlo wegla moze byc stosowany kazdy zwiazek wegla zuzywany przez mikroorganizm, taki, jak dekstroza, sacharoza, lak¬ toza, maltoza, skrobia, dekstryna, melasa, glicerol i podobne. Jako zródlo azotu stosuje sie dowolne, 45 znane produkty zawierajace zwiazki azotu takie, jak na przyklad maka sojowa, wyciag namokowy kukurydzy, maka z nasion bawelny, gluten, pepton, wyciag miesny, drozdze i wyciag drozdzowy, hy¬ drolizat kazeiny, sole amonowe, azotany i/lub po- 50 dobne.W pewnych przypadkach mozna stosowac fosfo¬ rany i rózne sole magnezu, potasu, sodu, cynku, zelaza, manganu i/lub podobne.Temperatura hodowli wynosi 25—35°C i moze 35 byc zmieniana tak, aby otrzymac maksymalna ilosc nowego antybiotyku tuberaktynomycyny-N. Czas hodowli na ogól wynosi 2—10 dni, w zaleznosci od warunków.Wyodrebnianie substancji antybiotycznej z cieczy 60 hodowlanej metoda ekstrakcji niehydrofilnymi rozpuszczalnikami jest praktycznie bardzo trudne, poniewaz tuberaktynomycyna-N jest latwo rozpu¬ szczalna w wodzie.W warunkach przemyslowych do wyodrebniania e& i oczyszczania tuberaktynomycyny-N wykorzystuje81845 7 sie fakt, ze jest óna substancja zasadowa. Po od¬ dzieleniu grzybni od plynu hodowlanego, do otrzy¬ manego przesaczu dodaje sie barwnik sulfonowy, taki jak fiolet eriochromowy, orani helionowy 3R, czerwien alizarynowa S, blekit syntracenowy, oranz metylowy, zielen krezotynowa itp., w celu wyod¬ rebnienia tuberaktynomycyny-N w postaci soli ad¬ dycyjnej barwników. Sól te miesza sie nastepnie z rozpuszczalnikiem organicznym takim, jak meta¬ nol, aceton lub .podobne i po dodaniu do zawiesiny odpowiednich ilosci nieorganicznych soli takich, jak siarczan lub chlorowodorek trójmetylóaminy, prze¬ prowadza tuberaktynomycyne-N w sól taka, jak siarczan tuberaktynomycyny-N, chlorowodorek tuberaktynomycyny-N itp. Mozna tez sól antybio¬ tyku z barwnikiem potraktowac nieorganicznym kwasem takim, jak kwas siarkowy, kwas solny itp., w celu otrzymania ocpowiedniej kwasnej soli tu¬ beraktynomycyny-N, po czym barwnik oddziela sie przez ekstrakcja niehydrofobowym rozpuszczalni¬ kiem. Do wodnego roztworu kwasnej soli tubera¬ ktynomycyny-N dodaje sie organicznego rozpusz¬ czalnika, np. takiego, jak metanol lub aceton, w celu wytracenia kwasnej soli tuberaktynomy¬ cyny-N.Inna korzystna metoda przemyslowa wyodrebnia¬ nia tuberaiktonomycyny-N z cieczy hodowlanej jest stosowanie zywicy kationitowej. W tym przypadku tuberaktynomycyna-N jest adsorbowana na zywicy i nastepnie odzyskiwana rozcienczonym roztworem kwasu siarkowego, solnego lub podobnego. Mozna tez eluowac antybiotyk rozcienczonym roztworem zasady i aktywne frakcje zobojetniac, odparowy¬ wac i po dodaniu odpowiedniej ilosci rozpuszczal¬ nika np. takiego jak metanol lub aceton, wytracac sól tuberaktynomycyny-N.Jeszcze inna korzystna metoda polega na tym, ze brzeczke hodowlana przesacza sie, poddaje dia¬ lizie, filtruje przez sito molekularne z zelu krze¬ mionkowego lub oczyszcza w inny sposób od wiel¬ koczasteczkowych zanieczyszczen i nastepnie trak¬ tuje kwasem, odparowuje i dodaje organicznego rozpuszczalnika takiego, jak metanol lub aceton, otrzymujac tulberaktynomycyne-N w postaci kwas¬ nej soli.W celu oczyszczenia surowej kwasnej soli tubera¬ ktynomycyny-N, sól te rozpuszcza sie w wodzie, dodaje hydrofobowy rozpuszczalnik taki, jak meta¬ nol, etanol, aceton, 2-metoksyetanol, dioksan, czte- rowodorofuran itp. lub ich mieszanine i poddaje sie rekrystalizacji.Mozna tez surowy produkt przepuszczac przez kolumne chromatografiozna, zawierajaca takie wy¬ mieniacze jonowe, jak zywica kationitowa, zel krzemionkowy, celuloza itp. Poszczególne frakcje tuberaktynomycyny-N laczy sie, odparowuje i za pomoca odpowiedniego rozpuszczalnika rozpuszcza sie sól tuberaktynomycyny-N.Korzystna metoda oczyszczania soli tuberakty¬ nomycyny-N polega na dodaniu do stezonego roz¬ tworu soli nadmiaru wodnego roztworu siarczanu trójmetyloaminy, w celu wytworzenia siarczanu tuberaktynomycyny-N, do którego dodaje sie duza ilosc metanolu, acetonu lub podobnego hydrofilo- wego rozpuszczalnika, wytracajac siarczan tubera- 8 ktynomycyny-N. £o kilkakrotnym powtórzeniu wy¬ zej wymienionych czynnosci mozna otrzymac czysty siarczan tuberaktynomycyny-N.Fizyczne i chemiczne wlasciwosci tuberaktyno- 5 mycyny-N otrzymanej sposobem wedlug wynalazku sa nastepujace.Znaleziono: C: 37,70%, H: 6,17%, N: 22,50%, gdy poddano analizie chlorowodorek tuberaktynomy¬ cyny-N. 10 Teortycznie na podstawie wzoru C25H43N13O10. 3HC1: C: 37,76%, H: 5,83%, N: 22,90%.Ciezar czasteczkowy (oznaczony miareczkowa¬ niem) wynosi 778,4.Wzór czasteczkowy chlorowodorku tuberaktyno- 15 mycyny-N okreslony z wartosci doswiadczalnych ciezaru czasteczkowego: C25H43N13O10 • 3HC1.Temperatura topnienia: 245°C (z rozkladem).Skrecalnosc wlasciwa chlorowodorku tuberakty¬ nomycyny-N: 20 01° [a] d = — 19,1°C (C = 1, H20) Widmo absorpcyjne w ultrafiolecie: (fig. 1 ry¬ sunku).Widmo chlorowodorku tuberaktynomycyny-N (ste¬ zenie 20 ^ig/ml) jest nastepujace: X£a(L:268m^Ei?m = 3425 XmiksHC1:269^:El?m=32^ ,MnNaOH:228m^El%m = 215j0 Widmo absorpcyjne w podczerwieni: (chlorowo¬ dorek). 35 Widmo chlorowodorku w JCBr (fig. 2) wykazuje maksima absorpcji przy nastepujacych liczbach falowych: 3300; 1660; 1225 i 1050 cm-i.Rozpuszczalnosc w rozpuszczalnikach: nieorga¬ niczne sole tuberaktynomycyny-N takie, jak chlo- 40 rowodorek i siarczan, sa latwo rozpuszczalne wwo¬ dzie, lecz tylko slabo lub trudno rozpuszczalne w róznych organicznych rozpuszczalnikach takich, jak metanol, etanol, n-butanol, aceton, 2-metoksy¬ etanol, ezteroiwodorofuran, dioksan i w podobnych. 45 Reakcje barwne: reakcja ninhydrynowa i Biureta dodatnie; reakcja Sakaguchi, Molischa, Pauli i iza- tynowa ujemne.Antybiotyk wykazuje nastepujace stale dysoe- jacje: 60 pKai = 7,25; pKa2 = 10,05; pK 11 Barwa: chlorowodorek i siarczan tuberaktyno- mycyny maja barwe biala.Sklad aminokwasowy: (fig. 4 rysunku).Po hydrolizie, seryna, kwas alfa, beta — dwu- 55 ammopropiooiowy, gamma — hydroksy — beta — lizyna, kapreomycydyna.Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego: widmo chlorowodorku tuberaktynomycyny-N przedstawiono na fig. 3 rysunku. 60 Wzór strukturalny chlorowodorku tuberaktyno¬ mycyny-N podano na rysunku.Tuberaktynomycyna-N w postaci chlorowodorku otrzymana sposobem wedlug wynalazku ma wlasci¬ wosci przeciwgruzlicze i wykazuje wyzej wymie- 65 nione cztery elementy: C, H, N, O, widmo absor-81845 9 pcyjne w ultrafiolecie wykazuje maksimum przy 268 m^i, dodatnia reakcje ninhydrynowa i Saka- guchi, w wyniku hydrolizy daje aminokwasy i jest antybiotykiem peptydowym.Tuberaktynomycyna moze byc porównywana z po¬ dobnymi antybiotykami takimi, jak tuberaktyna, wiomycyna, ftiomycyna — Maeda i wsp., J. of Antibiotics, seria A 6 (4), 183 (1953), winaktyna — opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2633445; kapreomycyna — W.M. Stark i wsp. — Antimicrob. Agents and Chemoth., 201 (1962); albo- wertycylina — Maeda i wsp., J. of Antibiotics, 11 A, 30 (1958); substancja podobna do wiomycy¬ ny — Arai i wsp., Arutibiot. and Chemoth. 7 (8), 435 (1957).Tuberaktynomycyna-N jest jednak substancja inna niz znane antybiotyki, co wynika z nastepu¬ jacych porównan. (a) Porównanie z tuberaktynomycyna (tuberakty¬ na). Reakcja Sakaguchi z tuberaktynomycyna daje wynik dodatni, natomiast z tuberaktynomycyna-N daje wynik ujemny. Ponadto tuberaktynomycyna-N zawiera kapreomycydyne jako wchodzacy w jej sklad aminokwas i nie zawiera tuberaktydyny, na¬ tomiast tuberaktynomycyna nie zawiera kapreomy- cydyny, a zawiera tuberaktydyne. Na tej podsta¬ wie mozna stwierdzic, ze tuberaktynomycyna-N jest substancja inna niz tuberaktynomycyna. (b) Porównanie z wiomycyna. W przeciwien¬ stwie do wiomycyny, która daje dodatnia reakcje Sakaguchi, tuberaktynomycyna-N daje reakcje ujemna i to swiadczy o róznorodnosci tych dwu substancji. (c) Porównanie z albowertycylina. Albowerty- cylina nie wykazuje maksimum w zakresie 220—320 m^i na krzywej adsorpcji w ultrafiolecie, podczas gdy tuberaktynomycyna-N wykazuje ma¬ ksimum przy 268 m^i. (d) Porównanie z kapreomycyna. Kapreomycyna zawiera alamine i beta-lizyne, natomiast tubera¬ ktynomycyna-N nie zawiera tych aminokwasów, lecz zawiera seryne i gamma — hydroksy — be¬ ta — lizyne. (e) Porównanie z substancja wiomycynopocobna.W przypadku substancji wjiomycynopodobnej stosu¬ nek ekstynkcji przy \ maks w srodowisku kwas¬ nym do ekstynkcji przy X maks w srodowisku za¬ sadowym wynosi w ultrafiolecie 1,20, podczas gdy w przypadku tuberaktynomycyny-N wynosi 1,49.W 0,1 n roztworze NaOH maksimum absorpcji w ultrafiolecie dla pierwszego zwiazku jest przy 280 m^, podczas gdy dla drugiego zwiazku jest przy 288 mu. (f) Porównanie z ftiomycyna. W przypadku ftio- mycyny stosunek ekstynkcji w ultrafiolecie okre¬ slony sposobem jak wyzej wynosi 1,09, natomiast w przypadku tuberaktynomycyny-N wynosi 1,49. (g) Porównanie z winaktyna. Winaktyna jest taka sama substancja jak wiomycyna (H. Umezawa: In- * dex of Antibiotics from Actinomycetes, str. 684, University of Tokyo Press, 1770). Róznice pomiedzy tym antybiotykiem i tuberaktynomycyna-N opisano powyzej.Na podstawie powyzszych porównan mozna stwierdzic, ze tuberaktynomycyna-N jest nowa sub- 10 stancja inna od znanych substancji antybiotycznych.Biologiczne wlasciwosci tuberaktynomycyny-N. (1) Toksycznosc tuberaktynomycyny-N: L.D50 = 384 mg/kg (myszy, dozylnie) LD50 = 1240 mg/kg (myszy, domiesniowo) (2) Zakres dzialania antybiotycznego: Minimalne Szczep testowy stezenie antybiotyku [A^/ml Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli NIHJ Escherichia coli B Proteus vulgaris OX 19 Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B Shigella dysenteriae E-l Shigella flexneri Shigella sonnei E-33 Bacillus subtilis PCI 219 Staphyloocccus aureus FDA 209 P Staphylococcus albus Staphylococcus citreus Micrococcus flavus Sarcina lutea Sarcina lutea ATCC 1001 Mycobacterium ATCC 607 Vibrio comma (A) Vibrio comma (B) Staphylococcus aureus Yosbioka Staphylococcus aureus Yonemoto U 00 50 100 100 - 25 . 1,00 25 L00 100 12, 100 100 25 HOO aoo 100 12, ioo 100 400 ( 25 (3) Dzialanie przeciwgruzlicze.I) Stosowany szczep: Mycobacterium tuberculo- sis H3-«Rv II) Pozywka hodowlana: pólplynna pozywka Kir- chnera, pH = 6,9 III) Dawka posiewowa: 10—3 mg IV) Oznaczenia po trzech tygodniach hodowli: a) najmniejsze stezenie hamujace wzrost wra¬ zliwych paleczek 4 ng/ml. b) najmniejsze stezenie hamujace wzrost róz¬ nych odpornych paleczek.Tablica 2 Antybiotyk na który paleczki sa odporne Streptomycyna Kwas p-amino sali¬ cylowy Hydrazyd kwasu izonikotynowego Wiomycyna Kanamycyna Cykloseryna Najmniejsze stezenie ha¬ mujace wzrost |x/ml Próba po¬ równawcza 64 266 256 04 8 256 Tuberakty¬ nomycyna-N f 2 4 4 32 4 2 (4) Terapeutyczne dzialanie na gruzlice.Kilka grup po 10 myszy badano, zakazajac do- i po 3 dniach podawano podskórnie w ciagu 3 ty- 66 zylnie zawiesine Mycobacterium tuberculosis H3?Rv81 845 11 godni tuberaktynomycyne-N w róznych dawkach: 0,5 mg/mysz/dzien; 1,0 mg/mysz/dzien; 2,0 mg/ mysz/dzien.Otrzymane wyniki porównywano z grupami kontrolnymi. Wyniki podano w tablicy 3. 12 w przykladzie I otrzymano 2,98 g surowego chlo¬ rowodorku tuberaktynomycyny-N o czystosci 70,5%.Wydajnosc procesu wynosila 65% wydajnosci teore¬ tycznej.Przyklad III. Przygotowano pozywke hodo- Tablica 3 . Smiertelnosc liczona w dniach po podaniu antybiotyku Mysz nr 1 2 "3 * 5 6 7 8 ¦ 0 10 Liczebnosc kontroli Grupa I 20 21 21 21 22 22 v 23 25 26 29 Grupa II 20 21 21 22 23 28 29 30 42 42 Dawki w mg/mysz/dzien 0,5 21 22 25 29 35 42 42 <42 42 ¦42 1,0 24 25 42 42 42 42 *42 42 42 42 2,0 42 42 42 - 42 42 42 42 42 42 42 1 Prz-yklad I. Pozywke hodowlana zawieraja¬ ca 3% glikozy, 2% skrobi, 3% mielonego ziarna soi i 1,5% chlorku sodowego o wartosci ph = 6,0 nalewano po 100 ml do kolb Erlenmeyera i wy¬ jalawiano w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut.Pozywke w kazdej kolbie posiewano Streptomy- ces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL 3986 i hodowano na tnzesawce obrotowej o 330 obro¬ tach/minute i mimosrodzie 25 mm, w temperatu¬ rze 30°C w ciagu 7 dni.Otrzymana brzeczke w ilosci 1,5 litra, zawiera¬ jaca 2360 ng/ml tuberaktynomycyny-N saczono i przesacz przepuszczano przez kolumne o srednicy " 2,5 cm i dlugosci 28 cm zawierajaca zywice joni¬ towa „Amberlit IRC-50" (firmy Rohm and Hass, Philadelphia, Stany Zjednoczone Ameryki). Szyb¬ kosc przeplywu wynosila 2,5 ml na minute, przy czym substancja czynna ulegala adsorpcji. Kolum¬ ne przemywano woda i nastepnie roztworem 0,5 n kwasu solnego w ilosci 1,3 ml w celu odzyskania antybiotyków. Wyciek odbierano w 10 ml porcjach.Na podstawie absorpcji w ultrafiolecie i metoda biologicznego oznaczania stwierdzono, ze czynne byly frakcje 45—63.Czynne frakcje, ogólem okolo 200 ml, zoboje¬ tniono roztworem wodorotlenku sodowego, odparo¬ wano pod zmniejsizonym cisnieniem do objetosci okolo 15 ml i przesaczono. Przesacz odbarwiono weglem aktywnym, dodano 150 ml metanolu, prze¬ trzymywano w ciagu nocy w temperaturze 5°C. Na¬ stepnie odsaczono osad, przemyto go metanolem i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem, otrzy¬ mujac surowy chlorowodorek tuberaktynomycy¬ ny-N w ilosci 3,07 g o czystosci 71%, z wydajnoscia 62% wydajnosci teoretycznej.Przyklad II. Przygotowano pozywke hodo¬ wlana zawierajaca 3% glikozy, 2% skrobi i 1,5% chlor¬ ku sodowego, wartosc pH nastawiajac na 6,0. Na tej pozywce hodowano Streptomyces griseovericillatus var. tuberacticus NRRL 3986 w sposób opisany w przykladzie I. Otrzymano ciecz hodowlana w ilosci 1,5 litra, zawierajaca 2150 [Ag/ml tubera¬ ktynomycyny-N. Z cieczy tej, w sposób opisany 25 35 45 50 55 65 wlana zawierajaca 2% glikozy, 3% skrobi, 1,4% su¬ szonych drozdzy oraz 0,5% chlorku sodowego i pro¬ wadzono hodowle w sposób opisany w przykla¬ dzie I. Z 1 litra cieczy hodowlanej zawierajacej 1665 |xg/ml tuberaktynomycyny-N, w sposób opi¬ sany w przykladzie otrzymano 1,55 g surowego chlorowodorku tuberaktynomycyny-N. Czystosc 72%, wydajnosci 67%.Przyklad IV. W kolbach Sakaguchi o po¬ jemnosci 500 ml przygotowano po 100 ml pozyw¬ ki hodowlanej zawierajacej 1% skrobi, 1% melasy, 1% peptonu, 1% wyciagu miesnego oraz 0,5% chlor¬ ku sodowego, nastawiono wartosc pH na 7,0 i wy- jalcAv*ono w temperaturze 120°C w ciagu 30 mi¬ nut. Pozywke w kazdej kolbie posiewano Strepto¬ myces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL 3986 i hodowano na trzesawce wahadlowej o 130 wahnieciach na minute i skoku 7 cm, w tempera¬ turze 30°C, w ciagu 2 dni. Otrzymanym w ten sposób plynem hodowlanym o objetosci 400 ml nie zawierajacym wolnych konidiów posiewano w fer- mentorze o pojemnosci 30 litrów posiewowa pozyw¬ ke hodowlana o objetosci 20 litrów, o skladzie i przygotowanej w sposób jak wyzej, ale do której dodano 5 ml srodka przeciwpiennego (Uniol D-2000, firmy Nissan Yushi K.K., Tokio). Hodowle prowa¬ dzono w temperaturze 30°C w ciagu 24 godzin, mieszajac za pomoca mieszadla o 200 obrotach/mi¬ nute i przepuszczajac przez pozywke jalowe po¬ wietrze w ilosci 20 litrów/minute.Otrzymana ciecza hodowlana posiewano w fer- mentorze ze stali kwasoodpornej o pojemnosci 250 litrów produkcyjna pozywke hodowlana o skladzie 3% skrobi, 2% glikozy, 1,5% melasy odtluszczonej, 1,5% maki sojowej, 0,5% chlorku sodowego i 100 ml srodka przeciwpiennego. Hodowle prowadzono w temperaturze 30°C w ciagu 90 godzin, mieszajac za pomoca mieszadla o 300 obrotach/minute i prze¬ puszczajac powietrze w ilosci 100 litrów/minute.Otrzymano 190 litrów cieczy hodowlanej zawiera¬ jacej 2400 [Ag/ml.Ciecz te zakwaszono kwasem solnym do wartosci pH = 2,0, dodano ziemi okrzemkowej i przesaczono.81845 13 14 Otrzymany przesacz zobojetniono roztworem wo¬ dorotlenku sodowego i przepuszczano porcjami 20 litrów/godzine przez kolumne zawierajaca 10 litrów zywicy Amberlit IRC-50. Po przemyciu kolumny woda odzyskiwano czynna substancje przepuszcza¬ jac przez kolumne 5 litrów l n kwasu solnego na godzine i odbierajac frakcje po 1,5 litra. Frakcje 10—17 zawieraly czynna tuberaktynomycyne-N.'Czynne frakcje polaczono, zobojetniono roztworem wodorotlenku sodowego, odparowano pod zmniej¬ szonym cisnieniem do objetosci okolo 1300 ml i przesaczono, w celu oddzielenia straconego chlor¬ ku sodowego. Przesacz odbarwiono weglem aktyw¬ nym, dodano 0,4 litra metanolu, przetrzymano przez noc w temperaturze 5°C, odsaczono osad, przemyto go metanolem i wysuszono pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Otrzymywano 395 g chlorowodorku tube- raktynomycyny o czystosci 71% z wydajnoscia 72,8%.Przyklad V. Prowadzono hodowle w sposób opisany w przykladzie II, otrzymujac 20 litrów cieczy hodowlanej o zawartosci 2200 ng tuberakty- nomycyny-Nwl ml. Ciecz te zakwaszono kwasem siarkowym do wartosci pH = 2,0 i przesaczono z do¬ datkiem srodka ulatwiajacego saczenie. Otrzymano 1,76 litra przesaczu, który nastawiono do wartosci pH = 5,5, dodano 16,5 g fioletu eriochromowego, mieszano w ciagu 1,5 godziny, odsaczono wytracona sól addycyjna barwnika z antybiotykiem, przemyto woda i wysuszono.Sucha sól addycyjna barwnika z antybiotykiem zmieszano z 350 ml mieszaniny rozpuszczalników: aceton 80% — metanol 20% i do otrzymanej zawie¬ siny dodawano 50% roztwór siarczanu trójmetylo- aminy w metanolu az do stwierdzenia stracenia siarczanu tuberaktynomycyny-N. Mieszanine reak¬ cyjna mieszano w ciagu 1,5 godziny i po oddziele¬ niu wytworzonego osadu przemyto go acetonem i metanolem, w celu usuniecia barwnika. Po roz¬ puszczeniu osadu w mozliwie najmniejszej ilosci wody, do roztworu dodawano metanol, w celu po¬ nownego stracenia siarczanu tuberaktynomycy- ; ny-N. Otrzymano 3,09 g surowego produktu o czy¬ stosci 79%, z wydajnoscia 63%.Przyklad VI. Chlorowodorek tuberaktynomy- 5 cyny-N otrzymany w sposób opisany w przykladzie V rozpuszczono w 75 ml wody destylowanej i prze¬ puszczono z predkoscia 20 ml na godzine przez zy¬ wiczny wymieniacz jonowy Amberlita IRA-411, uprzednio obsadzony jonami sulfonowymi. Zbierano frakcje po 10 ml i stwierdzono, ze najbardziej bo¬ gatymi w tuberaktynomycyne-N sa frakcje 3-31.Te frakcje polaczono i zageszczono pod zmniejszo¬ nym cisnieniem tak, aby otrzymac stezenie tube¬ raktynomycyny-N 200 mg/ml. Nastepnie dodano czterokrotny nadmiar metanolu i stracony osad obdzielono i wysuszono. Otrzymano 6,17 g siarczanu tuberaktynomycyny-N o czystosci 80,2%, z wydaj¬ noscia 92%.Przyklad VII. 100 mg chlorowodorku tube¬ raktynomycyny-N, otrzymanego w sposób podany w przykladzie I, rozpuszczono w 5 ml mieszaniny rozpuszczalników zawierajacej n-butanol: pirydyne: kwas octowy: wode (15 : 10 : 3 : 12) i przepuszczano przez kolumne 1 cm X 130 cm wypelniona celuloza nasycona taka sama mieszanina rozpuszczalników.Nastepnie przepuszczano przez kolumne taka sama mieszanina rozpuszczalników z predkoscia 100 ml/godzine i zbierano 3 ml porcje wycieku. Stwier¬ dzono, ze czynnymi byly frakcje 39-46. Czynne frakcje polaczono i zageszczono do 1 ml pod zmniejszonym cisnieniem, po czym dodano 5 ml metanolu i odsaczono stracany chlorowodorek tu¬ beraktynomycyny-N w ilosci 60 mg. PL PL PL PL