DE2533447A1

DE2533447A1 - Gardimycin, verfahren zu seiner herstellung, mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittel

Info

Publication number: DE2533447A1
Application number: DE19752533447
Authority: DE
Inventors: Carolina Coronelli; Giancarlo Lancini; Francesco Parenti; Giorgio Tamoni
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1974-07-27
Filing date: 1975-07-25
Publication date: 1976-02-19
Also published as: AR208199A1; FR2279415B1; BE831743A; ES439691A1; DE2533447C3; AT341082B; GB1470407A; DK136910C; RO65722A; YU189475A; IN141371B; FR2279415A1; NL160332C; CA1063051A; NL160332B; HU169882B; IE41640L; ATA572475A; JPS5151589A; NO142789B

Description

¹¹ Gardimycin, Verfahren zu seiner Herstellung, Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel "

Priorität: 27. Juli 1974, Großbritannien, Nr. 53 283/74

Die Erfindung betrifft eine neue Gruppe von Antibiotika, die durch Fermentation von Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes erhalten werden. Diese Verbindungen werden nachstehend Me-* tabolit A, Metabolit B und Metabolit C genannt, wobei der Metabolit B als Gardimycin bezeichnet wird. Die Mikroorganismen wurden aus Bodenproben isoliert, die in Temossi, Italien, und Garbadi Bridge, Indien, gesammelt wurden. Sie erhielten die Codenummer A/6353 bzw. A/10889. Beide Stämme wurden bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 31048 bzw. ATCC 31049 hinterlegt.

Zur Herstellung der neuen Antibiotika, insbesondere des Gardimyder Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem

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wäßrigen Nährmedium gezüchtet, das Kohlenstoff- -und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält. Im allgemeinen wird der Mikroorganismus in einem Schüttelkolben vorkultiviert, "bis sich eine erhebliche Menge an Antibiotika gebildet hat. Sodann wird diese Kultur zum Beimpfen von größeren Fermentern verwendet. Die Züchtung wird vorzugsweise bei 25 bis 35⁰C unter aeroben Bedingungen so lange fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge an Antibiotika gebildet hat. Während dieser Zeit werden nach der Agardiffusionsmethode mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt, um die Konzentration der antibiotischen Substanzen zu bestimmen. Dabei wird als Testorganismus Sarcina lutea benutzt.

Die Antibiotika können aus der Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise isoliert werden, beispielsweise durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, in denen die Antibiotika löslich und die mit dem wäßrigen Medium nicht mischbar sind. Spezielle Beispiele für verwendbare organische Lösungsmittel sind aliphatische Alkohole mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und halogenierte Kohlenwasserstoffe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt ist Butanol. Die organische Phase wird vom wäßrigen Medium abgetrennt, bis auf ein kleines Volumen eingeengt und 10 bis 15 Stunden in der Kälte stehen gelassen. Danach wird der entstandene Niederschlag abfiltriert. Die Papierchromatographie auf Whatman-P apier Nr. 1 und Dünnschicht Chromatographie auf Kieselgel des erhaltenen Rohprodukts und die nachfolgende Bioautographie (vgl. Nicolaus et al., Il Farmaco, Ed. Prat., Bd. 8 (1961), S. 350-370) mit Staphylococcus aureus als Entwicklungsmittel zeigen die Anwesenheit mindestens zwei aktiver Komponenten an, die zur

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Identifizierung als Metabolit A und Metabolit B bezeichnet werden, wobei der letztere in höheren Ausbeuten gebildet wird.

Diese zwei Komponenten haben unterschiedliche R^-Werte, die in verschiedenen Eluierungssystemen variieren· Die Metaboliten A und B können nach üblichen Methoden gereinigt und als reine Verbindungen isoliert werden, beispielsweise mehrfache Gegenstromextraktion in einem zuvor bestimmten Lösungsmittelsystem, in dem die zwei antibiotischen Verbindungen verschiedene Verteilungskoeffizienten besitzen. V/ährend dieses Schritts wird der Metabolit B als Mononatriumsalz erhalten, der mit Alkali- oder Erdalkalisalzen wiederum in andere Salze oder durch Ansäuern in die entsprechende freie Säure umgewandelt werden kann.

Bei Verwendung von Butanol als Extraktionslösungsmittel werden die Mutterlaugen des Butanolextrakts in ein inertes, nicht polares organisches Lösungsmittel, beispielsweise Leichtbenzin, gegossen. Hierbei entsteht ein weiterer Niederschlag. Nach den chromatographischen Untersuchungen und der Bioautographie,

... !.υ-· die auf die vorstehende Weise ausgeführt werden, besteht der erhaltene Peststoff im wesentlichen aus einer einzigen Verbindung, die sich von den Metaboliten A und B hinsichtlich ihrer unterschiedlichen R~-Werte in dem gleichen Eluierungssystem unterscheidet. Zur Identifizierung wird sie Metabolit C genannt.

Metabolit A und Metabolit B (d. h.'Gardimycin) und ihre Salze mit Alkali- und Erdalkalimetallen sowie Metabolit C zeigen gute

_1 £ 0 9 8 Π 8 / 1 fi ? /,

~^Ί( 2Β33447

antibakterielle Aktivität in vitro und in vivo. Gardimycin weist insbesondere in vitro eine hervorragende antibakterielle Aktivität besonders gegen gram-positive Bakterien bei Konzentrationen von 1 bis 50 j&g/ml auf. In Tabelle I sind die minimalen Hemmkonzentrationen des Antibiotikums gegenüber verschiedenen pathogenen Keimen zusammengefaßt.

Tabelle I

Stamm Minimale Hemmkonzentration

(ug/ml)

Staphylococcus aureus ATCC 538 50

Micrococcus flavus ATCC 10240 1

Streptococcus faecalis ATCC 10541 ^v 50

Streptococcus haemolyticus C 203 2

Diplococcus pneumoniae UC 41 50

Clostridium perfringens ISS 30543 2

Neisseria gonorrheae ATCC 9826 20

Eine andere hervorragende Eigenschaft des Gardimycins ist seine
Wirksamkeit gegenüber,aus Krankenhäusern isolierten Streptococcus-Stämmen. Dies geht aus Tabelle II hervor.

Tabelle II

Stamm Minimale Hemmkonzentration

(fig/ml)

Streptococcus haemolyticus 2078 1

Streptococcus haemolyticus 2087 . 1

Streptococcus viridans 2057 5

Streptococcus viridans 2085 2

L J

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Weiter zeigt Gardimycin in vivo eine hohe Aktivität "bei durch pathogene Bakterien der Gattung Diplococcus und Streptococcus infizierten Mäusen. In Tabelle III sind die ED^Q-Werte von Gardimycin gegen experimentelle Infektionen zusammengefaßt, die durch Streptococcus haemolyticus C 203 und Diplococcus pneumoniae UC 41 hervorgerufen wurden«

!Tabelle III Stamm ED^₀ mg/kg

Streptococcus haemolyticus C 203 0,75

Diplococcus pneumoniae UC 41 30

Diese günstigen antibakteriellen Eigenschaften sind mit einer sehr niedrigen akuten Toxizität verbunden. Beispielsweise beträgt die UDcq des Antibiotikums Gardimycin mehr als 1000 mg/kg bei intraperitonealer Verabfolgung und mehr als etwa 2000 mg/kg bei intravenöser Verabfolgung.

Beschreibung des Stammes A/6353 (ATCC Nr. 31048) Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Agarmedien. Auf Hafermehlagar haben die Kolonien, die einen Durchmesser von etwa 5 mm besitzen, eingekerbte Konturen, schwach radiale Furchen und eine zentrale Vertiefung. Luftmycel fehlt immer. Sporangien bilden sich reichlich auf Hafermehlagar, Glycerin-Asparagin-Agar und Czapek-Glucose-Agar, wobei Aussehen und Größe in Abhängigkeit vom Medium verschieden ist. Auf Hafermehlagar haben die Kolonien reguläre Konturen und ein kugelförmiges bis ovales Aussehen. Die

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Sporangien haben eine Größe von 15 Ms 25 ja. Die Sporen sind beweglich und kugelförmig mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2 jli. Ein gelb-bernsteinfarbenes, lösliches Pigment wird in verschiedenen Medien produziert.

Beschreibung von Actinoplanes A/10889 (ATCC Nr. 31049) Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Agar-Eahrböden. Die Oberfläche ist undurchsichtig und gewöhnlich rauh bis gerunzelt, luftmyeel fehlt gewöhnlich, jedoch werden in einigen Medien Ansätze eines Ituftmycels beobachtet. Unter dem Mikroskop zeigt das vegetative Mycel schwache Verzweigungen mit einem Durchmesser von ungefähr 1 ja. Sporangien werden mäßig nur auf Calciummalatagar gebildet, sie sind kugelig mit unregelmäßiger Oberfläche, oft gelappt und mit einem Durchmesser von 7 bis 12 u. Nach dem Aufbrechen der Wandung des Sporangiums werden die Sporen entlassen. Die Sporen sind nahezu kugelförmig und beweglich. Die Abmessungen betragen 1 bis 1,5 ju.

Einige morphologische Eigenschaften der beiden Stämme sind in Tabelle IY aasamaengefaßt.

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Tabelle IV

	Stämme	A/10889	A/6353
Sporangien Sporen Luftmycel Lösliches Pigment	nur auf CaIciummalatagar gebildet Größe: 7 x 12 u kugelig (1 bis 1,5 μ) im Ansatz beobachtet fehlt	reichlich auf einigen Agar-Nährböden gebil det, jedoch unter schiedlich in Größe und Gestalt. Auf Ha- fermehlagar ist die Größe zwischen 15-25 ρ kugelig (1,5 bis 2 u) fehlt immer gelb-bernsteinfarbe nes Pigment auf eini gen Agar-Nährböden

In Tabelle V sind die Wuchsformen von Actinoplanes k/föb'S und Actinoplanes A/10889 auf verschiedenen Standard-Nährböden zusammengefaßt, die von Shirling und Gottlieb (Intern. J. Syst. Bact., Bd. 16 (1966), S. 313-340) sowie von Waksman (The Actinomycetes, Bd. II, The Williams and Wilkins Co., (1961)) empfohlen wurden. Die bei einigen Nährböden angegebenen Zahlen beziehen sich auf die von Shirling und Gottlieb angegebenen Nährböden. Die Wuchsformen wurden nach 6- bis Htägiger Inkubation bei 30⁰C bestimmt.

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(SO O CO

- 8 Tabelle

Nährböden	Wuchsformen	A/10889	A/6353
Medium Nr. 2 (Hefeextrakt- Malzagar) ,Medium Nr, 3 (Hafermehlagar) Medium Nr. 4 (anorganische Salze-Stärke- Agar) Medium Nr. 5 (Glycerin-Aspa- ragin-Agar) Medium Nr₀ 6 (Pepton-Hefe- extrakt-Eisen- - agar) Medium Nr. 7 (Tyro sin-Agar)	reichliches Wachstum, runzelige Ober fläche, bernsteinfarben mäßiges Wachstum, glatt, undurchsich tig, cremefarben bis orange an den Kanten mäßiges Wachstum, glatte Oberfläche, tief-orange mäßiges Wachstum, glatte Oberfläche, orange spärliches Wachstum, rauhe Oberfläche, dunkelbraun, mit braunem Pigment reichliches Wachstum, krustige Ober fläche, kaffeebraun, schwach-braunes Pigment	reichliches Wachstum, schwach runzelig, hell-orange bis hell-bernsteinfarben reichliches Wachstum mit glatter und dün ner Oberfläche, hell-orange, einige Spo- rangien, hell-gelbes lösliches Pigment reichliches Wachstum mit glatter Ober fläche, orange, einige Sporangien, kana riengelbes lösliches Pigment reichliches Wachstum mit glatter Ober fläche, hell-orange, reichliche Pigmen-c- bildung, kanariengelbes lösliches Pig ment mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange reichliches Wachstum mit glatter Ober fläche, rosa-bernsteinfarben, gute Sporan- gienbildung, rosa-bernsteinfarbenes lös liches Pigment

- 9 Tabelle V - Fortsetzung

Nährböden	Wuchsformen	A/10889	A/6353
Hafermehl-Agar (nach. Waksmari) Hickey und !Dresner's Agar Czapek Glucose Agar Glucose-Aspara- gin-Agar Nähragar Kartoffelagar Bennet's Agar Calciummalat- agar Magermilch-Agar	reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, orange, Spuren eines rudimentären Luft- mycels reichliches Wachstum, runzelige Ober fläche, hellbraun kaum Wachstum, glatte Oberfläche, hell orange , Spuren eines rudimentären Luftmyeels reichliches Wachstum, krustige Ober fläche, tief-orange mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche, orange bis hellbraun reichliches Wachstum, runzelige Ober fläche, orange bis hellbraun, Spuren eines rudimentären Luftmycels reichliches Wachstum, runzelige Ober fläche , hell-orange mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche, cremefarben bis hell-orange reichliches Wachstum, runzelige Ober fläche, tief-orange	reichliches Wachstum mit glatter Ober fläche, hell-orange bis topas-gelb; gute Bildung großer Sporangien, gelbes lösliches Pigment reichliches Wachstum mit glatter Ober fläche, rosa-bernsteinfärben, reichli che Sporangienbildung reichliches Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, orange, reichliche Sp orangi enbildung reichliches Wachstum mit glatter Ober fläche, orange, einige Sporangien reichliches Wachstum mit glatter Ober fläche , orange reichliches Wachstum mit glatter Ober fläche, bernsteinfarben reichliches Wachstum mit krustiger Ober fläche , hell-orange spärliches Wachstum mit glatter Ober fläche, farblos, einige Sporangien reichliches Wachstum mit schwach kru stiger Oberfläche, tief-orange, gelbes lösliches Pigment

- 10 Tabelle V - Fortsetzung

Nährböden

Wuclisformen

A/10889 A/6355

0Ϊ O CD OO

Czapek-Agar Ei-Agar

Pepton-Glucose-Agar

Agar

Lo effler-Serum

Kartoffelnährboden

kaum Wachstum, krustige Oberfläche, hell-orange

reichliches Wachstum, glatte Oberfläche, orange

sehr spärliches Wachstum, glatte Oberfläche, hyalin

sehr spärliches Wachstum, dünn und glatt, hyalin

sehr spärliches Wachstum, glatte Oberfläche, hell-orange bis bernsteinfarben

spärliches Wachstum, runzelige Oberfläche , orange spärliches Wachstum, hell-orange, mäßige Bildung von Sporangien

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, hell-cremefarben, mäßige Bildung von Sporangien

reichliches Wachstum mit runzeliger Oberfläche, tief-orange

sehr spärliches Wachstum, dünn und glatt, farblos

spärliches Wachstum, hell-orange

spärliches Wachstum, runzelig, hellorange

Die günstigste Temperatur zur Entwicklung der Kolonien liegt im Bereich von etwa 18 Ms 42⁰C, das Temperatur optimum bei etwa 28 bis 37⁰C.

In Tabelle TI ist die Verwertung von Kohlenstoffquellen zusammengefaßt, die nach der Methode von Pridham und Gottlieb bestimmt wird.

Tabelle VI

Kohlenstoffquelle	Wachstum	A/10889	A/6353
	-	+
Inosit	+	+
Fructose	+	+
Ehamnose	+
Mannit	+	+
Xylose	-	-
Eaffinose	+	+
Arabinose	-	-
Cellulose	+	-
Salicin	+	-
Sucrose	+	+
Mannose	+	-
Lactose	+	+
Glucose (positive Kontrolle)

In Tabelle VII sind die physiologischen Eigenschaften der beiden Stämme zusammengefaßt.

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Tabelle VII

positiv	positiv
positiv	negativ
positiv	negativ
positiv	negativ
negativ	positiv
negativ	negativ
negativ	negativ
negativ	negativ
positiv	negativ
positiv	negativ

Versuch A/10889 A/6353

Stärkehydrolyse Schwefelwasserstoffbildung Melaninbildung Tyrοsinhydrolyse Caseinhydrolyse Calciummalathydrolyse Lackmusmilchkoagulation Lackmusmilchpeptonisierung Nitratreduktion Gelatineverflüssigung

Die beiden Stämme A/6353 und A/10889 werden wegen ihrer kugelförmigen Sporangien, beweglichen Sporen und der Morphologie ihrer Kolonien der Gattung Actinoplanes zugeschrieben. Sie unterscheiden sich jedoch eindeutig voneinander hinsichtlich ihres Wachstums auf verschiedenen Agarnährböden, der Bildung oder Nichtbildung löslicher Pigmente, der Kohlenstoffverwertung und der physiologischen Eigenschaften. Insbesondere zeigt der Stamm A/6353 eine sehr begrenzte Fähigkeit glykosidische Bindungen, einschließlich Sucrose, zu hydrolysieren, die, soweit beschrieben, von 3*eder Spezies der Gattung Actinoplanes verwertet wird· Der Stamm A/10889 bildet ein rudimentäres Luftmycel, was selten bei einer Spezies der Gattung Actinoplanes zu beobachten ist. Die zwei Stämme sind von allen, bisher bekannten Spezies der Gattung Actinoplanes leicht zu unterscheiden· Deshalb werden

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Ä 25334^7

die Stämme k/6353 und A/10889 als neue Spezies der Gattung Actinoplanes angesehen und Actinoplanes liguriae ATCC 31048 und Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049 genannt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung des Antibiotikums, Isolierung und Abtrennung verschiedener Metaboliten

Mit dem Stamm Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049 wird unter aeroben Bedingungen eine Vorkultur in einem wäßrigen Nährmedium hergestellt, bis eine ausreichende antibiotische Aktivität der Kulturflüssigkeit vorliegt. Ein Nährmedium für eine Schüttelkultur kann beispielsweise folgende Zusammensetzung haben:

g/Liter

Fleischextrakt	3,0
Hefeextrakt	10,0
Calciumcarbonat	4,0
Stärke	25,0
Leitungswasser	auf 1000 ml

Die Kolben werden etwa 24 Stunden bei etwa 28 bis 30⁰C geschüt telt. Anschließend werden jeweils 1 Liter der Vorkultur zum Be impen von Permentern verwendet, die jeweils 10 Liter des folgenden Nährmediums enthalten:

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	g/10 Liter	2533447
Fleischextrakt	40
Pepton	40
Hefeextrakt	10
Natriumchlorid	25
So 3 abohnenmehl	100
Glucose	500
CaIc iumcarbonat	50
Leitungswasser	auf 10 Liter

Die Ansätze werden aerob "bei 28 Ms 30⁰G inkubiert und gerührt, In Zeitabständen wird die antibiotische Aktivität mikrobiologisch nach dem Agardiffusionstest mit Sarcina lutea als Testorganismus bestimmt. Die maximale antibiotische Aktivität wird nach 96- bis 120stündiger Fermentation erreicht.

Die Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und danach mit einer Filterhilfe (Diatomeenerde) filtriert. Das Mycel wird verworfen. Das Filtrat wird mit Butanol in einer Menge entsprechend 50 % seines Volumens extrahiert. Der Butanolextrakt wird von der wäßrigen Phase abgetrennt, mit angesäuerter wäßriger Lösung (pH 4,0) gewaschen, auf etwa 1/10 seines ursprünglichen Volumens eingedampft und 10 bis 12 Stunden bei einer Temperatur von 3 bis 6⁰C stehen gelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Butanol gewaschen und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute 3g·

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Chromatographische Untersuchungen des Niederschlags auf Whatman Papier Nr. 1 oder Kieselgel und anschließende Bioautographie der Flecken mit Staphylococcus aureus als TestOrganismus weisen auf die Gegenwart von zwei Komponenten hin, die als Metabolit A und Metabolit B (Gardimycin) bezeichnet werden. In Abhängigkeit von der Natur des verwendeten Eluierungssystems besitzen sie verschiedene R~-Werte.

Das Rohgemisch wird zur weiteren Reinigung in etwa 30 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird etwa 16 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert und sodann unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt. Es werden 1,5 g Rohprodukt erhalten, das noch aus einem Gemisch von Metabolit A und Gardimycin besteht. Die zwei Antibiotika werden durch mehrere Gegenstromextraktionen getrennt und gereinigt. Dies ist aufgrund der verschiedenen Verteilungskoeffizienten des Metabolits A und Gardimycin in einem zuvor bestimmten Lösungsmittelsystem möglich. Das verwendete Lösungsmittelsystem besteht aus Butanol: M/15 Natrium-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2): Hexan in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 : 0,1* Die Verteilungskoeffizienten des Metaboliten A und Gardimycin in diesem Lösungsmittelsystem betragen 0,3 bzw. 0,8. Nach 100 Extraktionen werden 0,45 g Gardimycin als Mononatriumsalz erhalten.

Die Mutterlaugen, die aus dem Butanolextrakt nach dem Ausfällen des Metabolitengemisches A und B erhalten werden, werden auf ein kleines Volumen eingeengt und dann in einen Überschuß von Petroläther gegossen. Der entstandene Niederschlag wird abfil-

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triert. Mach den chromatographls chen Untersuchungen, die unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend ausgeführt wurden, besteht diese Eraktion aus einem Produkt, das sich in den gleichen Eluierungssystemen von den Metaboliten A und B hinsichtlich seines R~-Wertes unterscheidet. Diese JFraktion wird als Metabolit C bezeichnet. Die unterschiedlichen chromatographischen Ergebnisse der drei Metaboliten in verschiedenen Eluierungssystemen sind in Tabelle YIII zusammengefaßt.

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Tabelle VIII

	Papierchromatographie auf Whatman -Papier Nr. 1j die Flecke werden durch Bioautographie mit Staphylococcus aureus sichtbar gemacht	R_f-Werte	Metabolit A	Metabolit B (Gardimycin) )	Metabolit 0
	Eluierungssystem		0,00	0,15	0,85
	1) Butanol. .gesättigt mit M/15 Phosphatpuffer (pH 6,0)	0,75	0,80	0,95
	2) Butanol, gesättigt mit Wasser, das 2 % p- Toluolsulfonsäure enthält	0,15	0,10	0,85
φ	3) Butanol, gesättigt mit Wasser, das 2 % Ammoniak enthält	0,65	0,80	0,00
CD do	4) M/15 Phosphatpuffer (pH 6,0), gesättigt mit Butanol	0,00	0,80	0,00
α»	5) 20 %±ge wäßrige Natriumchloridlösung	0,70	0,65	0,90
GJ	6) Butanol:Methanol:Wasser » 40:10:20 mit 0,75 % Methylorange	0,85	0,60	0,90
	7) Butanol:Methanol:Wasser = 40:10:20	0,80	0,80	0,65
	8) Aceton:Wasser =1:1	0,00	0,00	0,75
	9) A'thylacetat, gesättigt mit Wasser
	Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel; die Flecke werden durch Schwefelsäure, Vanillin und Bioautographie mit Staphylococcus aureus sichtbar gemacht Eluierungssystem	0,30	0,70	0,00
	Ammoniak:Äthanol:Wasser = 1:8:1

Der Metabolit B wird als Mononatriumsalz untersucht.

^Γ · - 18 - "■

' : Beispiel 2

Der Stamm Actinoplanes liguriae ATCG 31048 wird gemäß Beispiel 1 aerob 130 Ms 170 Stunden bei Temperaturen von etwa 28 bis 30⁰C gezüchtet. Es werden 1,4 g des Metabolitengemisch.es A und B (Gardimycin) erhalten. Das Vorliegen der beiden Metaboliten wird mit Hilfe der gleichen, in Beispiel 1 angeführten chromatographischen Untersuchungen entdeckt. Die Reinigung und Trennung der beiden Metaboliten wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Es werden 0,2 g Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes erhalten.

Physikochemische Eigenschaften des Gardimycins in Form seines Mononatriumsalζ e s

Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes ist ein amorphes weißes Pulver mit amphoterem Charakter und einem isoelektrischen Punkt von 4,2, der durch Elektrofokussierung bestimmt wird. Mach starker 16stundiger Hydrolyse in 6 N Salzsäure bei 120°C im Bombenrohr können folgende Aminosäuren nachgewiesen werden: Valin, Serin, Glycin, Glutaminsäure, Isoleucin, Leucin und Alanin. Nach 15stündiger Hydrolyse mit Bariumhydroxid bei 110⁰C im Bombenrohr und chromatographischer Analyse der Hydrolyseprodukte kann Tryptopiian nachgewiesen werden. Die vorstehend genannten Aminosäuren liegen in folgendem Verhältnis vor:

Aminosäuren Verhältnis (Näherung)

Valin 2

Serin 1

Glycin 2

L '■■'■' J

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Aminosäuren

Glutaminsäure Isoleucin Leucin Alanin Tryptophan

25334	Ll	-	Verhältnis (Näherung)
•	- 19	1
		2
		1
		1
		1

Darüber hinaus deutet die Analyse der Produkte der sauren Hydrolyse auf die Gegenwart weiterer Aminosäuren von unbestimmter Struktur, wobei einige Schwefel enthalten sind_r hin.

Weiterhin ist Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:

1) Schmelzpunkt:

2) Molekulargewicht:

3) Elementaranalyse:

4) UV-Absorptionst>anden:

260⁰C (Zers.)
2005 - 2168
C : 48,7 - 48,6 % H : 6,7 - 6,6 % N : 11,8 - 12,2 % S : 5,3 - 5,5 % Na: 1,1 %
H₂O: 3,6 - 3,3 % In jedem der nachstehend angeführten Lösungsmittelsysteme "besitzt Gardimycin folgende Werte:

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	2533U7	E¹ ^% 1 cm	26
	- 20 -	-	24
Lösungsmittel	max ^^nm''
Methanol	273 (Schulter)	26
	280	22
	299
O,1N Natronlauge	273 (Schulter)	26
	279	22
	288	24
0,1N Salzsäure	273 (Schulter)	20
	279
	288
Phosphatpuffer (pH 7,38)	'273 (Schulter) 279
	288

Die vollständigen Spektren sind in Fig. 1 wiedergegeben.

5) Infrarotspektrum: Charakteristische Banden werden in

Nujöl bei folgenden Wellenzahlen beobachtet:

3280, 2920 - 2840 (Nu^öl), 1650, 1520, 1455 (Nujjol), 1375 (Nu j öl), 1260, 1045, 990 und 720.

Das Spektrum ist in Fig. 2 wiedergegeben.

6) Spezifischer Drehwert: Γ(*]ψ = -44° (c = 0,5 % in Di

methylformamid)

7) Löslichkeit: Löslich in Wasser, wäßriger Natriuml_ bicarbonatlösung, verdünnten wäßrigen

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- 21 -

Lösungen von Alkalihydroxiden, heißem Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Eisessig; unlöslich in verdünnten Mineralsäuren, Benzol, Aceton, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Alkanolen mit 2 Ms 6 Kohlenstoffatomen und Tetrahydrofuran 8) Charakteristische Reaktionen:

3?ehling	positiv
Tollens	positiv
KMnO₄	positiv
H₂SO. konz.	positiv
Ninhydrin	negativ
PeCl₃	negativ
Millon	negativ
Schiff	negativ
Maltol	negativ
9) pK -Werte:	Die pK_a

Die pK -Werte (potentiometrisch "beet

stimmt) in Wasser 7,1 und in Äthylenglykolmonomethyläther : Wasser (16:4) 8,5.

10) Ausgehend vom Mononatriumsalz des Gardimycins können folgende Verbindungen hergestellt werden:
a) Gardimycin in Form der freien Säure

g des Gardimycinmononatriumsalzes werden in 150 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit lOprozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und dann zweimal mit 75 ml wassergesättigtem Butanol extrahiert,

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■ ■ ψ

Die Butanol-Bxfcrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck "bei 45⁰O auf ein Volumen entsprechend 1/20 des Ausgangsvolumens eingeengt. Nach 12stündigem Stehen bei 4⁰C wird die entstandene Fällung abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und bei 40 bis 45⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0,95 g Produkt erhalten, das sich beim Erhitzen auf etwa 250 bis 300⁰C zersetzt.

b) Gardimycin in Form seines Dinatriumsalzes

1,0 g des Gardimycinmononatriumsalzes werden in 150 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit N/10 Natronlauge auf einen pH-Wert von 9,6 eingestellt und danach lyophilisiert. Es werden 0,9 g des Produktes mit einem Schmelzpunkt von 250 C erhalten.

c) Gardimycin in Form seines Calciumsalzes

0,3 g <ies Gardimycinmononatriumsalzes werden in 20 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird langsam unter Rühren mit mehreren Anteilen einer gesättigten Calciumchloridlösung bis zum völligen Ausfällen versetzt. Der erhaltene Feststoff, wird abfiltriert, unter vermindertem Druck getrocknet und in 10 ml Aceton gelöst. Die Acetonlösung wird in 200 ml Diäthyläther eingegossen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und unter vermindertem Druck bei 40 bis 45⁰C getrocknet. Es werden 0,2 g des Produktes erhalten, das sich bei 330 bis 340⁰C zersetzt.

Claims

Patentansprüche 1, Gardimycin, gekennzeichnet als Mononatriumsalz durch a) einen Schmelzpunkt von 26O0C (Zers.)» b) ein Molekulargewicht von 2005 - 2168, c) eine Elementaranalyse: O : 48,7 - 48,6 % H : 6,7 - 6,6 % N : 11,8 - 12,2 % S : 5,3 - 5,5 % Na: 1,1 % H2O: 3,6 - 3,3 % d) charakteristische W-Absorptionsbanden in folgenden Lösungsmitteln (Fig. 1): Lösungsmittel-^- max ^11131'ΤΛ t/vE1cmMethanol273 (Schulter)2802629924O,1N Natronlauge273 (Schulter)27926288220,1N Salzsäure273 (Schulter)2792628822Pho sphatpuffer (pH 7,38)273 (Schulter) 2792428820 0 9 8 Π 8 / 1 Π ? U - ■"-'ms Γ 2533U7 e) charakteristische IR-Banden in Fujol (Fig. 2) bei 3280, 2920-2840(NuJOl), 1650, 1520, 1455 (Nujol), 1375 (Nujol), 1260, 1045, 990 und 720 cm"1; f) einen spezifischen Drehwert E&J-q - -44° (c = 0,5 % in Dimethylformamid); g) Löslichkeit: In Wasser, wäßriger Natriumbicarbonatlösung, verdünnten wäßrigen Lösungen von Alkalihydroxiden, heißem Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Eisessig; unlöslich in verdünnten Mineralsäuren, Benzol, Aceton, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Alkanolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und Tetrahydrofuran; h) charakteristische Eeaktionen: Fehling positiv Tollens positiv KMnO. positiv H2SO,konz. positiv Ninhydrin negativ FeCl^ negativ Millon - negativ '. Schiff negativ - Maltol negativ i) pK -Werte (potentiometrisch bestimmt) von 7,1 in Wasser und 8,5 in Äthylenglykolmonomethylather : Wasser (16 : 4) j) einen isoelektrischen Punkt (durch Elektrofokussierung bestimmt) von 4,2 k) R£-Werte: PapierChromatographie auf Whatman -Papier Nr. 1, wobei die Flecke durch Bioautographie mit Staphylococcus aureus erkenn-L_ bar gemacht werden. ' J 609808/1024 2 c ο ο / ι 1J Eluierungssystem R^-Werxe Butanol, gesättigt mit M/15 Phosphatpuffer, pH 6,0* 0,15 Butanol, gesättigt mit Wasser, das 2 % p-Toluolsulfonsäure enthält 0,80 Butanol, gesättigt mit Wasser, das 2 % Ammoniak enthält 0,10 M/15 Phosphatpuffer (pH 6,0), gesättigt mit Butanol 0,80 20prozentige wäßrige Natriumchloridlösung 0,80 Butanol : Methanl : Wasser (40 : 10 : 20) mit 0,75 % Methylorange 0,65 Butanol : Methanol : Wasser (40 : 10 : 20) 0,60 Aceton : Wasser (1:1) 0,80 Äthylacetat, gesättigt mit Wasser 0 Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel, wobei die Flecke mit Schwefelsäure und Vanillin und Bioautographie mit Staphylococcus aureus erkennbar gemacht werden Eluierungssystem R~-Wert Ammoniak : Äthanol : Wasser (1:8:1) 0,70

1) ein angenähertes Verhältnis von identifizierten Aminosäuren: Aminosäuren Verhältnis (Näherung)

Valin 2

Serin 1

Glycin 2

Glutaminsäure 1

Isoleucin ■ 2

Leucin 1

Alanin 1

L Tryptophan 1 '

609808/1024

2. Verbindung nach Anspruch 1 in Form der freien Säure.

3. Verbindung nach Anspruch 1 in Form des Dinantriumsalzes

4. Verbindung nach Anspruch 1 in Form des Calciumsalzes.

5. . Verfahren zur Herstellung von Gardimycin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049 oder Actinoplanes liguriae ATCC 31048 oder deren auf übliche Weise erhaltene Mutanten oder Varianten unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, züchtet, aus der Kulturflüssigkeit das Gardimycin (Metabo lit B) nach üblichen Methoden von einem antibiotisch aktiven Metabolit A und C trennt und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer basischen Alkali- oder Erdalkalimetallverbindung in ein Salz überführt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 35⁰C durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung 96 bis 170 Stunden durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum aus der Kulturflüssigkeit mit einem Alkohol mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen extrahiert.

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2533U7

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkohol Butanol verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gardimycin aus drei Fraktionen durch Kristallisieren und Gegenstromextraktion abtrennt.

11. Arzneimittel, bestehend aus Gardimycin oder dessen Alkalioder Erdalkalimetallsalz nach Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

12. Actinoplanes garbadinensis ATCC 51049 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 5.

13. Actinoplanes liguriae ATCC 31048 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 5·

J •ß 0 9 8 0 B / 1 0 2 i