JPS6031472B2 - 酸性ウリカ−ゼ - Google Patents
酸性ウリカ−ゼInfo
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- JPS6031472B2 JPS6031472B2 JP53153648A JP15364878A JPS6031472B2 JP S6031472 B2 JPS6031472 B2 JP S6031472B2 JP 53153648 A JP53153648 A JP 53153648A JP 15364878 A JP15364878 A JP 15364878A JP S6031472 B2 JPS6031472 B2 JP S6031472B2
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
- C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
-
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
本発明は酸性域に作用至適ｐＨを有するウリカーゼ（以
下酸性ウリカーゼという）および発酵法によるその製造
法、酸性ウリカーゼを使用する尿酸の定量方法、および
酸性ゥリカーゼを含む尿酸定量用組成物に関する。 ウリカーゼ（ＥＣＩ．７．３．３）は尿酸の酸化的加水
分解、すなわち尿酸のアラントィン、過酸化水素および
炭酸ガスへの酸化的加水分解を触媒する酵素である。 ウリカーゼは診断用試薬として皿中、尿中等の尿酸含有
量の測定に使用される。従来ゥリカーゼとしては中性ま
たはアルカリ性で作用するものが知られている。 例えばアルタナリア・テニワス（ＭｔｅｒＭｎａにｎｕ
ｉｓ）の生産するウリカーゼの至薄ｐＨは７．０である
〔Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌへ ｖｏｌ．１７、２
５５（１９５２）〕。 またラツト肝臓〔Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｊｓＶｙ、ｖｏｌ．
１３、８８８（１９７４）〕、アスベルギルス・フラバ
ス（船ｐｅｒＳＩｌｕｓ ｆｌａｖ瓜）〔Ｃ．Ｒ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｊ．、ｖｏ１２６４、２２４４（１９６７）
〕、キヤンデイダ・ウチルス（Ｃａｎｄｉ舷 ｕｔｉｌ
ｕｓ）〔Ａ餌ｊｃ．Ｂｉｏｌ．、Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ、
３ふ８１３（１９７１）〕、アースロバクタ−・パセン
ス（Ａｎｈｒｏｂａｃにｒ ｐａｓｃｅｎｓ）〔Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ＄．Ａｃｔａ、ｖｏｌ．１５１、
５４（１９６８）〕、アルカリゲネス・ユウトロフス（
Ｎｃａｌｉ袋ｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）〔〜ｃｈ．Ｍ
ｉｋｒｏｂｉｃｌ．、ｖｏｌ．６０、１６０（１９６８
）〕、バチルス・フアチデオサス（母ｃｉｌｌｕｓ ね
ｓｔｉｄｉｏｓ雌）〔ＡＭＩ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３８
、６５（１９７０）〕、１力ルデイア・アルバ（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａａｌｂａ）（特公昭５１−７７４９号）、ス
トレプトミセス・ｓｐ．（Ｓｔｒｅｐのｍｙｃｅｓ ｓ
ｐ．）〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ．
３３、１２８２（１９６９）〕、ェンテロパクター・ク
ロアカエ（Ｅｎにｒｏ舷ｃｔｅｒｃｌｏａｓａｅ）（特
関昭５４−１１２９６号公報）などの生産するゥＩＪカ
ーゼの至適ｐＨはすべて８．５〜９．５の範囲に認めら
れる。またトリコスポロン・クタニウム（Ｔｒｉｃｈｏ
ｓｐｏｒｏｎｃｕｔａ肥ｕｍ）（袴関昭５４一１１９０
８６号公報）の生産するウリカーゼの至適ＰＨは８．０
付近に示される。これまでに酸性条件で至適ｐＨを有す
るウリカーゼは全く見し、出されていない。 次にウリカーゼを使用する尿酸の定量法としては尿酸に
ゥＩＪカーゼを作用させて■ 生成する過酸化水素と呈
色試薬（例えば４ーアミノアンチピリンとフェノール、
４−アミノアンチピリンとＮ・Ｎージメチルアニリンな
ど）とをパーオキシダーゼの存在下反応させて生成する
色素（酵素比色法中、ウリカーゼ、パーオキシターゼ法
）、■ 生成する過酸化水素とアルコール（メタノール
、エタノール）とをカタラーゼの存在下反応させてアル
デヒド（ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド）を生成
させ、該アルデヒド、アセチルアセトンおよびアンモニ
アを縮合反応させて生成する色素（酵素比色法中、ワリ
カーゼ、カタラーゼ法）、■ 生成する過酸化水素とア
ルコール（メタノール、エタノール）とをカタラーゼの
存在下反応させてアルデヒド（ホルムアルデヒド、アセ
トアルデヒド）を生成させ、該アルデヒドと還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とをア
ルコールデヒドロゲナーゼの存在下反応させてＮＡＤを
生成せしめるに際し、減少するＮＡＤＨ（紫外部吸収法
）、■ 減少する尿酸（紫外部吸収法）、または■ 消
費される酵素を定量することにより尿酸を定量する方法
がある。 従来ゥＩＪカーゼ・パーオキシダーゼ法（臨床病理１５
、１４８（１９６８）、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍ；ｃ
ａ Ａｃｔａ、３１、４２１（１９７１）：ＣＩｉｎ．
Ｃｈｅｍ．、１７、１１５４（１９７１）など〕は中性
もしくはアルカリ性に至適舟を有するウリカーゼを用い
る関係上中性もしくはアルカリ性で行われていた。 しかしながら、星色試験中には酸性城で発色の感度の高
い色素を生成する呈色試薬があり、従来のウリカーゼ・
パーオキシダーゼ法ではこのよくな呈色試薬を使用でき
なかった。また酵素反応をアルカリ性や中性で行う場合
には酸性域よりも血色秦等の影響が大きいという問題点
があった。 本発明者らは上記の種々の観点から酸性ウリカーゼを生
産する能力を有する微生物を広範囲にわたり検索した結
果、ストレプトミセス属に属する微生物中に、酸性ウリ
カーゼを生産する能力を有する菌株を見し、出し、さら
に酸性ウリカーゼの尿酸定量法への応用を検討して本発
明を完成するに至った。次に本発明をさらに詳しく説明
する。 本発明による酸性ウリカーゼ標品に性質は以下の通りで
ある。 酸性ゥリカーゼ標品としては実施例１で得られたものを
使用した。なおウリカーゼ活性の測定は主として後述の
４ＡＡ−ＥＭＡＥ法によって行った。 またウリカーゼ活性は上記測定条件下で１分間に１仏ｍ
ｏｌｅの尿酸を分解する酵素力価をｌｕとした。
下酸性ウリカーゼという）および発酵法によるその製造
法、酸性ウリカーゼを使用する尿酸の定量方法、および
酸性ゥリカーゼを含む尿酸定量用組成物に関する。 ウリカーゼ（ＥＣＩ．７．３．３）は尿酸の酸化的加水
分解、すなわち尿酸のアラントィン、過酸化水素および
炭酸ガスへの酸化的加水分解を触媒する酵素である。 ウリカーゼは診断用試薬として皿中、尿中等の尿酸含有
量の測定に使用される。従来ゥリカーゼとしては中性ま
たはアルカリ性で作用するものが知られている。 例えばアルタナリア・テニワス（ＭｔｅｒＭｎａにｎｕ
ｉｓ）の生産するウリカーゼの至薄ｐＨは７．０である
〔Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌへ ｖｏｌ．１７、２
５５（１９５２）〕。 またラツト肝臓〔Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｊｓＶｙ、ｖｏｌ．
１３、８８８（１９７４）〕、アスベルギルス・フラバ
ス（船ｐｅｒＳＩｌｕｓ ｆｌａｖ瓜）〔Ｃ．Ｒ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｊ．、ｖｏ１２６４、２２４４（１９６７）
〕、キヤンデイダ・ウチルス（Ｃａｎｄｉ舷 ｕｔｉｌ
ｕｓ）〔Ａ餌ｊｃ．Ｂｉｏｌ．、Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ、
３ふ８１３（１９７１）〕、アースロバクタ−・パセン
ス（Ａｎｈｒｏｂａｃにｒ ｐａｓｃｅｎｓ）〔Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ＄．Ａｃｔａ、ｖｏｌ．１５１、
５４（１９６８）〕、アルカリゲネス・ユウトロフス（
Ｎｃａｌｉ袋ｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）〔〜ｃｈ．Ｍ
ｉｋｒｏｂｉｃｌ．、ｖｏｌ．６０、１６０（１９６８
）〕、バチルス・フアチデオサス（母ｃｉｌｌｕｓ ね
ｓｔｉｄｉｏｓ雌）〔ＡＭＩ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３８
、６５（１９７０）〕、１力ルデイア・アルバ（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａａｌｂａ）（特公昭５１−７７４９号）、ス
トレプトミセス・ｓｐ．（Ｓｔｒｅｐのｍｙｃｅｓ ｓ
ｐ．）〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ．
３３、１２８２（１９６９）〕、ェンテロパクター・ク
ロアカエ（Ｅｎにｒｏ舷ｃｔｅｒｃｌｏａｓａｅ）（特
関昭５４−１１２９６号公報）などの生産するゥＩＪカ
ーゼの至適ｐＨはすべて８．５〜９．５の範囲に認めら
れる。またトリコスポロン・クタニウム（Ｔｒｉｃｈｏ
ｓｐｏｒｏｎｃｕｔａ肥ｕｍ）（袴関昭５４一１１９０
８６号公報）の生産するウリカーゼの至適ＰＨは８．０
付近に示される。これまでに酸性条件で至適ｐＨを有す
るウリカーゼは全く見し、出されていない。 次にウリカーゼを使用する尿酸の定量法としては尿酸に
ゥＩＪカーゼを作用させて■ 生成する過酸化水素と呈
色試薬（例えば４ーアミノアンチピリンとフェノール、
４−アミノアンチピリンとＮ・Ｎージメチルアニリンな
ど）とをパーオキシダーゼの存在下反応させて生成する
色素（酵素比色法中、ウリカーゼ、パーオキシターゼ法
）、■ 生成する過酸化水素とアルコール（メタノール
、エタノール）とをカタラーゼの存在下反応させてアル
デヒド（ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド）を生成
させ、該アルデヒド、アセチルアセトンおよびアンモニ
アを縮合反応させて生成する色素（酵素比色法中、ワリ
カーゼ、カタラーゼ法）、■ 生成する過酸化水素とア
ルコール（メタノール、エタノール）とをカタラーゼの
存在下反応させてアルデヒド（ホルムアルデヒド、アセ
トアルデヒド）を生成させ、該アルデヒドと還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とをア
ルコールデヒドロゲナーゼの存在下反応させてＮＡＤを
生成せしめるに際し、減少するＮＡＤＨ（紫外部吸収法
）、■ 減少する尿酸（紫外部吸収法）、または■ 消
費される酵素を定量することにより尿酸を定量する方法
がある。 従来ゥＩＪカーゼ・パーオキシダーゼ法（臨床病理１５
、１４８（１９６８）、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍ；ｃ
ａ Ａｃｔａ、３１、４２１（１９７１）：ＣＩｉｎ．
Ｃｈｅｍ．、１７、１１５４（１９７１）など〕は中性
もしくはアルカリ性に至適舟を有するウリカーゼを用い
る関係上中性もしくはアルカリ性で行われていた。 しかしながら、星色試験中には酸性城で発色の感度の高
い色素を生成する呈色試薬があり、従来のウリカーゼ・
パーオキシダーゼ法ではこのよくな呈色試薬を使用でき
なかった。また酵素反応をアルカリ性や中性で行う場合
には酸性域よりも血色秦等の影響が大きいという問題点
があった。 本発明者らは上記の種々の観点から酸性ウリカーゼを生
産する能力を有する微生物を広範囲にわたり検索した結
果、ストレプトミセス属に属する微生物中に、酸性ウリ
カーゼを生産する能力を有する菌株を見し、出し、さら
に酸性ウリカーゼの尿酸定量法への応用を検討して本発
明を完成するに至った。次に本発明をさらに詳しく説明
する。 本発明による酸性ウリカーゼ標品に性質は以下の通りで
ある。 酸性ゥリカーゼ標品としては実施例１で得られたものを
使用した。なおウリカーゼ活性の測定は主として後述の
４ＡＡ−ＥＭＡＥ法によって行った。 またウリカーゼ活性は上記測定条件下で１分間に１仏ｍ
ｏｌｅの尿酸を分解する酵素力価をｌｕとした。
【１）作用
本酵素は次の反応を触媒する。
■ 至薄ｐＨ
酵素標品をｐＨ５．０での活性が２０のｕ′の‘になる
ように、第１図に示す種々のＰＨのバッファーに溶解し
、酵素溶液とした。 バッファーとしてはＰＨ３〜７ではＭ／１０ホウ砂−Ｍ
／１０コハク酸／ゞッフア−を、ＰＨ７以上では必要に
応じてＭ／１０ホゥ砂−Ｍ／５リン酸−カリを使用した
。後記必Ａ−ＥＭＡＥ法で｛ａー液の代りに第１図に示
す種々のｐＨのバッファーを用いる外は同様に処理して
酵素活性を測定した。ｐＨ５．０での活性を１００とし
た場合の各ｐＨにおける相対活性を第１図に示す。ＰＨ
４．７〜５．１に至適ｐＨ力ま認められた。‘３１安定
ｐＨ範囲酸素標品を第２図に示す種々の−での活性が０
．４ｕ／の‘になるようにバッファーに熔解した。 なお、バッファーとしてはＰＨ７．０〜９．０の範囲で
はＭ／１０ホウ砂−Ｍ／５リン酸ーカリ、ｐＨ３．０〜
７．０の範囲ではＭ／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸を
使用した。ついで各酸素溶液を２９ｑ０で１６時間保っ
たのち、Ｍ／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸（ｐＨ５．
０）の緩衝液を用いて２０倍に希釈し、ＰＨ５．の寸近
とした。 これらの酵素溶液を用い、４ＡＡ−ＥＭＡＥ法によって
酵素活性を測定した。 もっとも活性の高い活性値を１００とした場合の各ＰＨ
における相対活性を第２図に示す。第２図で−−はＭ／
１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸バッファーの場合を、」
」はＭ／１０ホウ砂−Ｍ／５リン酸バッファーの場合を
示す。本酵素はｐＨ７．０以上で安定であった。なお、
鞍素活・性の測定を改良紫外部吸収法（特顔昭５３一２
４４８２号）で行った場合も同様の結果を得た。 ■ 至適温度酵素標品を０．０か／机【になるようにＭ
／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸バッファー（ＰＨ５．
０）に溶解して酵素溶液とした。 酵素反応の温度を第３図のごと〈とする以外はぜＡ−Ｅ
ＭＡＥ法と同機にして酵素活性を測定した。もっとも活
性の高い値を１００とした場合の各温度における相対活
性を第３図に示す。本酵素の至適温度は６０〜６５００
であることが判明した。 ‘５｝ 安定温度範囲 酵素標品を０．０狐／叫になるようにＭ／１０ホウ砂−
Ｍ／１０コハク酸バッファー（ＰＨ５．０）に溶解し、
第４図に示す各温度に３０分間保持したのち、３７０と
し４ＡＡ−ＥＭＡＥ法により酵素活性を測定した。 もっとも活性の高い値を１００とした場合の各温度にお
ける相対活性を第４図に示す。本酵素は５０００までの
温度では３０分の処理によっても失活は認められず、６
０午０、３０分の処理によっても約９０％の活性が残存
していた。ｔ６｝ 基質特異性酵素標品を０．０狐ノの
‘になるようにＭ／１０ホゥ砂−Ｍ／１０コハク酸バッ
ファー（ｐＨ５．０）に溶解する。 基質として第１表に示すものを用いる以外は４ＡＡ−Ｅ
ＭＡＥ法と同様にして酵素活性を測定した。尿酸を基質
とする場合の活性を１００とした場合の各基質での相対
活性を第１表に示す。本酵素はアデニン、グアニン、キ
サンチン、ピポキサンチン、テオプロミン、テオフィリ
ンには全く活性を示さなかった。第１表 【７１分子量 Ａｎｄｒｅ桃の方法に基づき、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
１００を用いて測定した結果、１５８００であった。 次にウリカーゼ活性の測定に用いた４ＡＡ−ＥＭＡＥ法
の詳細を以下に示す。‘ィー 試薬 ‘ａ｝ バッファー：Ｍ／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク
酸バッファー（ｐＨ５．０）を使用した。 ‘ｂ｝ ＥＤＴＡ水溶液：エチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム・二水物２８の９を１００Ｍの純水に熔解した
。 ｛ｃ｝ 発色液：４ＡＡ４０の９、ＥＭＡＥＩＯの９、
パーオキシダーゼ５０血（ｐ川ｐ川ｏ鱗１１ｉｎｕｎｉ
ｔ）をイオン交換水に溶解して１００の土とした。 ‘ｄ｝ 尿酸溶液：尿酸２０の夕を純水にとかし１００
の‘とした。 【０１ 測定操作 ｛ａ’液０．６５の【、｛ｂ）液０．２机上、‘ｃ｝液
０．６５の‘にウリカーゼ活性を測定すべき酵素溶液０
．５の上を加えて、３７０で約５分間予備保温したのち
、【ｄ）液１の‘を加え、３７０で５分間反応させ、た
だちに氷冷して５５仇肌での吸光度を測定する。 対照として尿酸溶液の代りに脱イオン水１の‘を使用し
て同様の操作を餅行して行い吸光度を側定する。両吸光
度差をもとにして発生日２０２量を計算し、日２０２量
をもとに尿酸の分解量を算出する。本発明の酸性ウリカ
ーゼはストレプトミセス属に属し、酸性ウリカーゼ生産
能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に酸性
ウリカーゼを生成せしめ、これを採取することによって
製造される。 本発明に使用される微生物としてはストレプトミセス属
に属し、酸性ウリカーゼ生産能を有する微生物であれば
いずれの微生物でもよい。 好適な微生物としてはストレプトミセス・ガンミシカス
（Ｓｔｒｅｐのｍｙｃｅｓｇａｎｎ−ｍｙｃｉｃｕｓ）
に属し、酸性ゥリカーゼ生産能を有する微生物があげら
れる。具体的にはストレプトミセス・ガンミシカスＡＴ
ＣＣ２７４３４があげられる。本菌株の菌学的性質はｌ
ｎｔｅｍ．Ｊ．Ｓ＄ｔ．母ｃｔｅｒｉｏｌ．２２、３０
０（１９７２）に記載されている。本発明に使用する栄
養塔地としては炭素源、窒素源、無機質、および必要に
応じ使用菌株の必要とする徴量栄養素を程よく含有する
ものであれば天然培地、合成塔地のいずれかでもよい。 炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜、デキ
ストリン、デンプン、グリセリンなどの炭水化物；尿酸
などが用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ソー
ダ、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機
窒素化合物が用いられる。窒素源としてはまたべプトン
、肉エキス、酵母エキス、コ−ンスチープリカー、大豆
粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュフルベジタ
ブルプロティンなどの窒素含有天然物も使用できる。 無機物としてはリン酸ーカリウム、リン酸二カリウム、
硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜
鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムな
どが用いられる。 その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応
じ使用する。次に本発明においては椿地中に尿酸をウリ
カーゼの誘導物質として存在せしめることなくウリカー
ゼを生産することが可能であるが、尿酸の存在によって
、ウリカーゼの生成量を増加せしめることができる場合
がある。 培養法としては液体培養法（振鑑培養法もしくは通気櫨
梓培養法）がよく、工業的には通気健梓培養法がもっと
も適している。 培養温度は２２〜４０℃の範囲で行なうことができるが
、２５〜３５ｑ０が好適である。ｐＨは中性付近にある
ことが望ましい。培養期間は条件によって変ってくるが
、通常１〜３日程度であり、ゥＩＪカーゼの生成が確認
されたとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養
を停止する。本酵素は主として菌体中に生成蓄積する。
培養物中からのゥリカーゼの採取は次のように行なう。
培養終了後、培養物中から菌体を遠心分離などにより取
得し、ついでこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液か
ら遠心分離等によって上情液を得る。 上蒲液を通常酵素精製に用いられる方法、たとえば塩析
、有機溶媒沈殿透析、イオン交換セルロースクロマト、
セフアデツクスクロマト、ハイド。フオーピッククロマ
トなどの方法にて処理する。かくして精製ウリカーゼを
得ることができる。本発明はさらに酸性ゥリカーゼを使
用する尿酸の定量方法に関する。 すなわち本発明の酸性ウリカーゼは従来のゥリカーゼを
使用する尿酸の定量法（酸素比色法、紫外部吸収法、消
費酸素量より定量する方法）のすべてに適用すここがで
きる。しかしながら酸性ウリカーゼの利点はウリカーゼ
・パーオキシダーゼ法に適用する際にもっともよく発揮
される。この場合の方法は、尿酸に酸性ウリカーゼを作
用させて過酸化水素を生成せしめて、該過酸化水素と呈
色試薬とをパーオキシダ−ゼの存在下反応させて生成す
る色素の量を測定することにより尿酸を定量する方法で
ある。酸性ウリカーゼの使用により上記尿酸定量の一連
の反応を酸性域で行うことが可能となる。ウリカーゼ・
パーオキシダーゼ法を酸性ウリカーゼを用いて酸性城で
行う場合の利点として、■発色の感度の高い色素を生成
する呈色試薬が使用できること〔かかる呈色試薬の使用
により検体（例えば血清）の使用量を減ずることができ
る〕、■酵素反応を酸性域で行うことにより血色素等の
影響を小さくすることができ、したがって測定値の精度
をあげることができることがあげられる。上記２点につ
いてさらに詳しく説明する。ウリカーゼ・パーオキシダ
ーゼ法は通常の場合、呈色試薬として少なくとも２成分
よりなる試薬を用いて、これを酸化的に縮合させて色素
を生成させることにより行なわれる。 色素の発色度は色素の分子吸光係数によって表わすこと
ができる。 すなわち分子吸光係数の大なるほど発色度（発色の感度
）は高い。発色度が高いほど検体量は少なくてすむ。過
酸化水素と呈色試薬とをパーオキシダ−ゼの存在下反応
させて生ずる色素の分子吸光係数を測定するに際し、皇
色試薬およびｐＨを種々変えて得られる分子吸光係数（
×１ぴ）を第２表に示す。 第２表注：（１｝ 測定波長は色素の最大吸収波長と一
致させた。 （２ー ４ＡＡ：４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ
ＤＭＡ：Ｎ・Ｎ−ＤｉｍｅｔｈｙｌａｉｌｊｎｅＥＭＡ
Ｅ：Ｎ−Ｅ比ｙｌ−Ｎ−ｍｅｔａ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅ
ｙｌ − Ｎ′ −ａｃｅｔｙｌｅｔｈｙ
ｌｅｎｅｄｌａｍｉｎｅ（特豚昭５３−９３８３５号）
、特開昭５５一２０４７１号Ｍ旧ＴＨ：３一Ｍｅｔｒｙ
ｌ−２一皮ｎｚｏｔｈｉａ−ｚｏｌｊｎｅ−ｈｙｄｒａ
ｚｏｎ一日ＣＩ｛３’ ※１：反応進行せず（色素生成
せず）、測定不能 ※２：日２０２なしに反応が進行するの で意義がない。 第２表から明らかなごと〈ぜＡ−ｐｈｅｎｏｌによる色
素は中性から弱アルカリ性領域で安定な発色を示すが、
吸光係数が小さい。 ４ＡＡ−ＤＭＡによる色素は酸性領域から中性領域で安
定であり吸光係数も４ＡＡ−ｐｈｅｎｏｌより高い。 ４ＡＡ−ＥＭＡＥによる色素は酸性からアルカリ性の広
い領域で安定であり、吸光度は４ＡＡ−ＤＭＡよりさら
に高い。 Ｍ旧ＴＨ−ＤＭＡによる色素は酸性領域で比較的安定で
、４者の中ではもっとも高い吸光係数を示し、例えばｐ
Ｈ５．０ではぜＡ−ＥＭＡＥと比較しても２倍近くにな
る。さて、検体中の妨害物質（タンパク質、還元物質、
アミン等）の影響および採血量等を考慮して、測定のた
めの血清の使用量は一般になるべく少なくできることが
望ましい。 そこで検体量が少なくて精度よく尿酸を定量するにはで
きるだけ吸光係数の高い色素を生成せしめる星色試薬を
使用して発色の感度を増加せしめる必要がある。 この点本発明によれば酸性領域で発色の感度の高い色素
を生成する呈色試薬（例えばＭＢＴＨ一ＤＭＡ）が使用
できるという利点がある。次に第２表に示したような呈
色試験をはじめ一般の呈色試薬の使用に際しては、ヘモ
グロビン、ピリルビン等の血色素が吸光度に影響を与え
るが、これらの影響は酸性領域では中性またはアルカリ
性領域よりも小さくなる。 上記点も測定を酸性城で行うことができる本発明の利点
である。なおウリカーゼによる尿酸から過酸化水素の生
成反応を中性もしくはアルカリ性で行わせ酸性領域で発
色させる方法は繁雑であり精度も低くなる。次に本発明
の尿酸定量方法をさらに詳しく説明する。 本発明による尿酸の定量は以下の工程に従って行われる
。 上記反応（反応１および０）は通常測定に必要な成分を
反応開始時から存在させて適当な酸性城で一回の操作で
行うが、反応１、ロを別々に行うこともできる。 まず最初に１回の操作で行う場合について説明する。【
１｝ 酵素、呈色試薬および必要に応じて界面活性剤、
安定化剤等を緩衝液に含有させてなる試薬液を調製する
。 ｛２） 尿酸舎量を測定するための試料（検体）を一定
量とり、これと一定量の試薬液とを混合して混合溶液と
する。 剛 適当な温度で適当な時間反応を行う。 【４ー 反応後、色素の生成により着色した反応液の可
視部吸収を測定する。 ｛５） 吸光度から、日２０２生成量を、日２０２生成
量から検体中の尿酸量を算出する。 または尿酸の純品を試料として前記操作を行い、尿酸濃
度と比色定量値との相関を示す検量線を作成しておき、
検量線より検体中の尿酸量を算出する。次に上記一連の
操作をさらに詳しく説明する。まず酸性ウリカーゼ、パ
ーオキシダーゼ、呈色試薬および必要に応じて界面活性
剤、安定化剤等を緩衝液に含有させてなる試薬液を調製
する。酸性ウリカーゼおよびパーオキシダーゼの反応液
中の濃度としてはそれぞれ０．０２〜２０ｕ／の【およ
び０．２〜２０肌（ｐｕｒｐｍｏ−餌１１ｉｎ皿ｉｔ）
／の【が好ましい。呈色試薬としては２成分系よりなる
ものが通常であるが、１成分よりなるものであっても差
支えない。呈色試薬の具体例としては４ＡＡ−ｐｈｅｎ
ｏｌ、４ＡＡ−ＤＭＡ、４ＡＡ−ＥＭＡＥ、ＭＥＴＨ−
ＤＭＡ、ＭＢＴＨ−ｐｈｅｎｏｌ、４ＡＡ−ＯＥＡ（Ｄ
ＥＡ：Ｄｉｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ ）、仏Ａ‐ＤＢ
Ａ（ＤＢＭ：Ｄｉｂｕｔｙｌａｉｌｉｎｅ）、ＭＢＴＨ
−ＤＥＡ、ＭＢＴＨ−ＤＢＡ、じｕｃｏｃびｓｔａｌｖ
ｉｏｌｅｓ、ＳＳ酸などがあげられる。 本発明の効果を十分発揮せしめるにはもちろん酸性城で
安定かつ発色度の高い色素を生成する呈色試薬例えばＭ
ＢＴＨ−ＤＭＡ、４ＡＡ−ＥＭＡＥ、４ＡＡ−ＤＭＡ等
の使用が好ましい。呈色試験の反応液中の濃度は０．２
〜２０ｍｍｏｌ／そが好ましい。 ２成分系の場合一方の成分に対する他方の成分の使用量
比は０．１〜１ぴ音モルが好ましい。 試料が油性の場合水との混和性を良好にするために界面
活性剤を加える。 これらの界面活性剤としてはポリエチレングリコール、
ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルなど
であげられる。その反応液中の濃度は０．０１〜５タ′
夕が適当である。 なお試料が血清の場合には通常界面活性剤の使用が好ま
しい。また酵素等の安定化剤として、ＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミン四酢酸）二ナトリウム等を用いるのが好まし
い。 緩衝液としてはホウ酸バッファー、リン酸バッファー、
トリス塩酸バルフアー、トリスマレェート・カセィソー
ダバッフア一、クエン酸・リン酸二ナトリウムバッファ
ー、コハク酸・ホウ砂バッファー、リン酸・ホウ砂バッ
ファーなどが用いられる。 これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度としては０．００５〜
０．５ｈｏｌ／そが好適である。 尿酸を含有する試料といま血清、尿、食品中の尿酸など
があげられる。試料に対する試薬液の量は試料中の尿酸
含量により、変化させればよい。 試料に対する試薬液の使用比率は検出操作が正確に行え
る域内で各試料につき適切な量を設する。例えば試料が
血清の場合は試薬液量３の‘に対し、血清１〜１００山
その割合で使用するのがよい。試薬液の使用量は０．１
〜１０の【で行うのが適当である。酵素反応は２０〜７
５００（好ましくは３５〜７０こ○）、ｐＨ３〜６（好
ましくは４〜５）で１〜３分行う。 酵素反応後、色素の生成により星色した液の可視部吸収
を色素の最大吸収波長またはその近傍で分光光度計など
を用いて測定する。反応１、ロを別々に行う場合には酸
性ウリカーゼ、呈色試薬（反応ロで加える場合は不要）
、および必要に応じて界面活性剤、安定化剤等を緩衝液
に含有させてなる試薬液を用いて反応１を進行させ、つ
いでこれにパーオキシダーゼおよび星色試薬（反応１で
加えない場合）を加えて反応ロを進行させる。 反応０のｐＨは３〜９〔好ましくは３〜６（特に４〜５
）〕で行うのが適当である。他の反応条件は反応１、０
とも前記１回の操作で行う場合と同様である。本発明は
また本発明の尿酸の定量方法を使用するに際して用いら
れる定量用組成物に関する。 さらに詳しくは酸性ウリカーゼ、パーオキシダーゼ、呈
色試薬および緩衝液からなる尿酸定量用組成物に関する
。該組成物には必要に応じ、界面活性剤、安定化剤等を
加えてもよい。組成物中の各成分、各成分の使用量、組
成物を用いての尿酸の定量は上記尿酸の定量方法に述べ
たとおりである。次に本発明の実施例を示す。実施例
１ 種菌としてストレブトミセス・ガンミシカスＡＴＣＣ２
７４３４を使用した。 グルコース２夕／ｄ‘、肉エキス１タ′の、コーンステ
イープリカ−０．５夕／ｄ上、ベプトン０．５夕／ｄ【
、酵母エキ ス０．１ 夕／ｄ‘、ＫＨ２Ｐ０４０．１
夕／ｄ‘、ＭｇＳ０４・７日２０ ０．０５夕／ｄ‘
、ＦｅＳ０４・７日２０ ０．１の９／ｄ‘よりなる種
培養培地（殺菌前ｐＨ７．２）３００の‘を２ク客三角
フラスコに入れ、該培地に前記菌株を１白金耳接種し、
３０℃で４幼時間振盤培養した。 培養液のすべてを３０そ客ジャーファーメンター中の同
上培地１８そに加え、３０００、２５び．ｐ．ｍ．通気
０．５〆／夕（培地）／ｍｉｎで本培養を行い、３０時
間で培養を終了した。培養終了液を遠心分離して菌体９
５０夕（緑重量）を得た。この菌体に０．０８Ｍホウ酸
バッファー（ｐＨ７．８）１０夕を加え再度遠心分離し
た。函体を０．０則４ホウ酸バッファー（Ｍ／８０ホウ
砂−Ｍ／２０ホウ酸バッファー）（母７．８）５夕に懸
濁したのち、ダイノ・ラボラトリー・ミル（Ｄ肌ｏいｂ
ｏｒａｔｏひ Ｍｍ）ＫＤＬ型（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａ
ｃｈｏｆｅｎｌｎｃへＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製）にて
菌体を破砕し、菌体破砕液を得た。 菌体破砕液を遠心分離して上清液を得た。この上清液中
のゥリカーゼ活性は６．２５ｕ／ｄ‘であった（上清液
４．５そ、全活性２８１．２５ｕ）。この上清液に硫安
を添加して硫安３０％飽和とし、沈殿物を遠心分離によ
り除き、上蒲液を得、さらに硫安を添加して硫安６０％
飽和とし、沈殿物を遠心分離により集めた。この沈殿物
を０．０９Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）１．０〆
にとかし、同バッファー５０そを用いセロフアンチュー
プを透析膜として、５℃で一夜透析を行った。透析チュ
ーブ内液にアセトンを添加し、３０％（Ｎ／Ｖ）アセト
ン溶液とし、生成する沈殿物を遠心分離により除き、上
清液を得、さらにアセトンを添加して、６０％Ｎ／Ｖ）
アセトン溶液にした後、遠心分離によって沈殿物を得た
。この沈殿物を０．０８Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．
８）３６０の上にとかし、５０その上記バッファーを用
い、セロフアンチューブを透析膜として、５℃で一夜透
析を行った。透析チューブ内液を６０℃、３粉テカロ熱
してカタラーゼを失活させた。処理液を０．２ＭのＮａ
ＣＩで平衡にしたＤＥＡＥ−セフアデックスＡ５０（弱
塩基性Ｓｅｐｈａｄｅｘイオン交換体、Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘはデキストラン誘導体よりナこる分子節の商標名；Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ ｌ船．
、Ｕ．Ｓ．Ａ）（１０００の‘）を充填したカラムに通
塔し、０．０８Ｍホウ酸バッファー（Ｐｌｌ７．８）１
そで洗浄後、０．２ＭのＮａＣＩを含む上記のホウ酸バ
ッファー１そと０．７ＭのＮａＣＩを含む上記のホウ酸
バッファー１そで濃度勾配溶出を行った。溶出液を２０
夕ずつ分画し、ウリカーゼ熔出区分を集め、硫安６０％
飽和とし、沈殿物を遠心分離により集めた。この沈殿物
を０．０５Ｖホゥ酸バッファー（ＰＨ７．８）９０舷に
溶解し、同バッファーで平衡化したセフアデックスＧ２
００（４．２×９８．５肌）の力ラムにチヤージし、同
じバッファーで溶出した。ウリカーゼ溶出画分を硫安６
０％飽和とし生成する沈殿物を遠心分離により集め、３
５の上の０．０８Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）に
溶解した。酵素溶液をもう一度同バッファーで平衡化し
たセフアデツクスＧ２００のカラム（２．８×６９．５
肌）に通塔し、同バッファーで綾出した。溶出区分を集
めて硫安６０％飽和とし、生成した沈殿を遠心分離で集
め、０．０５Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）２５の
‘に溶解し、約２０その０．０８Ｍホウ酸バッファー（
ｐＨ７．８）を用い、セロフアンチューブを透析膜とし
て５℃で一夜透析した。透析チューブ内液を０．０８Ｍ
ホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）で平衡化したＤＥＡＥ
−セルロース２００の‘を充填したカラムにチャージし
、同バッファー２００の上で洗浄後、同バッファー５０
０奴‘と０．７ＭＮａＣＩを含む０．０９Ｍホウ酸バッ
ファー（ｐＨ７．８）５００の‘で濃度勾配溶出を行っ
た。溶出液を１０夕ずつ分画し、ゥＩＪカーゼ熔出区分
を集め、硫安６０％飽和とし、沈殿物を遠心分離により
集めた。この沈殿物を約２０の上の０．０９Ｍホウ酸バ
ッファー（ｐＨ７．８）に溶解し、同バッファー】０そ
を用い、セロフアンチユーブを透析膜として５℃で一夜
透析した。透析チューブ内液を凍結乾燥し、酸性ゥＩＪ
カーゼの粉末を得た（比活性３．７４ｕノの９蛋白）。 菌体破砕液を遠心分離して得られた上清液からの活性収
率２０．３％。なお、この酵素標品の性質は前に示した
通りである。 実施例 ２ ＜Ｍ旧ＴＨ−ＤＭＡを用いた尿酸の定量＞｛ィ｝ 試薬 ｛ａ）バッファー：Ｍ／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸
バッファー‐（ｐＨ４．０またはｐＨ５．０）（ｂ｝
１．５の夕／私ＥＤＴＡ・二ナトリウム・二水物 ‘ｃ）５％Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００（界面活性剤の
商品名；ポリエチレングリコールアルキルフエニルエー
テル；Ｒｏｈｍ＆ＨａａｓＣｏ．）｛ｄ｝ １・５の３
／肌とＭＢＴＨ｛ｅ）１．０の９／叫ＤＭＡ ｛ｆ｝ ２０肌（パーブロガリン単位）／泌パーオキシ
ダーゼ咳）２血／の【酸性ウリカーゼ〔０．０８いホウ
酸バッフアー（ＰＨ７．５）〕仇旅屯水 （ｉ）尿酸水溶液（２、５または１０の９／ｄ‘）【ｏ
｝ 操作‘ａ｝液（ｐＨ４．０または５．０）２４０の
‘、｛ｂ｝液０．０５奴、ｔｃー液０．０５の上、‘ｄ
｝液０．１０の‘、｛ｅー液０．１０の‘、的液０．１
０地、（ｇ）液０．１０の【および（ｈ）液０．０５の
上または０．０８の‘を混合し、３７００で５分間予備
保温したのち、（ｉ）液０．０５叫または０．０２のと
（全体で３．０の上とする）を加え、３７００で５分間
反応させたのち、分光光度計により、５５Ｍｍの吸光度
を測定した。 対照は（ｉ）液の代りに純水を加えたものについて同様
の処理をして５５０ｎ仇の吸光度を測定した。両者の吸
光度差をもとに発生した日２０２量を求め。 日２０２量をもとに尿酸の量を算出した。結果を第３表
に示す。第 ３ 表 第３表から明らかなごとく、本発明による尿酸の定量方
法は、一段階の反応できわめて徴量、すなわち試験した
範囲では０．４ムタから５．０ムタの尿酸をきわめて高
い精度で定量できる非常に有効な方法である。
ように、第１図に示す種々のＰＨのバッファーに溶解し
、酵素溶液とした。 バッファーとしてはＰＨ３〜７ではＭ／１０ホウ砂−Ｍ
／１０コハク酸／ゞッフア−を、ＰＨ７以上では必要に
応じてＭ／１０ホゥ砂−Ｍ／５リン酸−カリを使用した
。後記必Ａ−ＥＭＡＥ法で｛ａー液の代りに第１図に示
す種々のｐＨのバッファーを用いる外は同様に処理して
酵素活性を測定した。ｐＨ５．０での活性を１００とし
た場合の各ｐＨにおける相対活性を第１図に示す。ＰＨ
４．７〜５．１に至適ｐＨ力ま認められた。‘３１安定
ｐＨ範囲酸素標品を第２図に示す種々の−での活性が０
．４ｕ／の‘になるようにバッファーに熔解した。 なお、バッファーとしてはＰＨ７．０〜９．０の範囲で
はＭ／１０ホウ砂−Ｍ／５リン酸ーカリ、ｐＨ３．０〜
７．０の範囲ではＭ／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸を
使用した。ついで各酸素溶液を２９ｑ０で１６時間保っ
たのち、Ｍ／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸（ｐＨ５．
０）の緩衝液を用いて２０倍に希釈し、ＰＨ５．の寸近
とした。 これらの酵素溶液を用い、４ＡＡ−ＥＭＡＥ法によって
酵素活性を測定した。 もっとも活性の高い活性値を１００とした場合の各ＰＨ
における相対活性を第２図に示す。第２図で−−はＭ／
１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸バッファーの場合を、」
」はＭ／１０ホウ砂−Ｍ／５リン酸バッファーの場合を
示す。本酵素はｐＨ７．０以上で安定であった。なお、
鞍素活・性の測定を改良紫外部吸収法（特顔昭５３一２
４４８２号）で行った場合も同様の結果を得た。 ■ 至適温度酵素標品を０．０か／机【になるようにＭ
／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸バッファー（ＰＨ５．
０）に溶解して酵素溶液とした。 酵素反応の温度を第３図のごと〈とする以外はぜＡ−Ｅ
ＭＡＥ法と同機にして酵素活性を測定した。もっとも活
性の高い値を１００とした場合の各温度における相対活
性を第３図に示す。本酵素の至適温度は６０〜６５００
であることが判明した。 ‘５｝ 安定温度範囲 酵素標品を０．０狐／叫になるようにＭ／１０ホウ砂−
Ｍ／１０コハク酸バッファー（ＰＨ５．０）に溶解し、
第４図に示す各温度に３０分間保持したのち、３７０と
し４ＡＡ−ＥＭＡＥ法により酵素活性を測定した。 もっとも活性の高い値を１００とした場合の各温度にお
ける相対活性を第４図に示す。本酵素は５０００までの
温度では３０分の処理によっても失活は認められず、６
０午０、３０分の処理によっても約９０％の活性が残存
していた。ｔ６｝ 基質特異性酵素標品を０．０狐ノの
‘になるようにＭ／１０ホゥ砂−Ｍ／１０コハク酸バッ
ファー（ｐＨ５．０）に溶解する。 基質として第１表に示すものを用いる以外は４ＡＡ−Ｅ
ＭＡＥ法と同様にして酵素活性を測定した。尿酸を基質
とする場合の活性を１００とした場合の各基質での相対
活性を第１表に示す。本酵素はアデニン、グアニン、キ
サンチン、ピポキサンチン、テオプロミン、テオフィリ
ンには全く活性を示さなかった。第１表 【７１分子量 Ａｎｄｒｅ桃の方法に基づき、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
１００を用いて測定した結果、１５８００であった。 次にウリカーゼ活性の測定に用いた４ＡＡ−ＥＭＡＥ法
の詳細を以下に示す。‘ィー 試薬 ‘ａ｝ バッファー：Ｍ／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク
酸バッファー（ｐＨ５．０）を使用した。 ‘ｂ｝ ＥＤＴＡ水溶液：エチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム・二水物２８の９を１００Ｍの純水に熔解した
。 ｛ｃ｝ 発色液：４ＡＡ４０の９、ＥＭＡＥＩＯの９、
パーオキシダーゼ５０血（ｐ川ｐ川ｏ鱗１１ｉｎｕｎｉ
ｔ）をイオン交換水に溶解して１００の土とした。 ‘ｄ｝ 尿酸溶液：尿酸２０の夕を純水にとかし１００
の‘とした。 【０１ 測定操作 ｛ａ’液０．６５の【、｛ｂ）液０．２机上、‘ｃ｝液
０．６５の‘にウリカーゼ活性を測定すべき酵素溶液０
．５の上を加えて、３７０で約５分間予備保温したのち
、【ｄ）液１の‘を加え、３７０で５分間反応させ、た
だちに氷冷して５５仇肌での吸光度を測定する。 対照として尿酸溶液の代りに脱イオン水１の‘を使用し
て同様の操作を餅行して行い吸光度を側定する。両吸光
度差をもとにして発生日２０２量を計算し、日２０２量
をもとに尿酸の分解量を算出する。本発明の酸性ウリカ
ーゼはストレプトミセス属に属し、酸性ウリカーゼ生産
能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に酸性
ウリカーゼを生成せしめ、これを採取することによって
製造される。 本発明に使用される微生物としてはストレプトミセス属
に属し、酸性ウリカーゼ生産能を有する微生物であれば
いずれの微生物でもよい。 好適な微生物としてはストレプトミセス・ガンミシカス
（Ｓｔｒｅｐのｍｙｃｅｓｇａｎｎ−ｍｙｃｉｃｕｓ）
に属し、酸性ゥリカーゼ生産能を有する微生物があげら
れる。具体的にはストレプトミセス・ガンミシカスＡＴ
ＣＣ２７４３４があげられる。本菌株の菌学的性質はｌ
ｎｔｅｍ．Ｊ．Ｓ＄ｔ．母ｃｔｅｒｉｏｌ．２２、３０
０（１９７２）に記載されている。本発明に使用する栄
養塔地としては炭素源、窒素源、無機質、および必要に
応じ使用菌株の必要とする徴量栄養素を程よく含有する
ものであれば天然培地、合成塔地のいずれかでもよい。 炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜、デキ
ストリン、デンプン、グリセリンなどの炭水化物；尿酸
などが用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ソー
ダ、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機
窒素化合物が用いられる。窒素源としてはまたべプトン
、肉エキス、酵母エキス、コ−ンスチープリカー、大豆
粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュフルベジタ
ブルプロティンなどの窒素含有天然物も使用できる。 無機物としてはリン酸ーカリウム、リン酸二カリウム、
硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜
鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムな
どが用いられる。 その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応
じ使用する。次に本発明においては椿地中に尿酸をウリ
カーゼの誘導物質として存在せしめることなくウリカー
ゼを生産することが可能であるが、尿酸の存在によって
、ウリカーゼの生成量を増加せしめることができる場合
がある。 培養法としては液体培養法（振鑑培養法もしくは通気櫨
梓培養法）がよく、工業的には通気健梓培養法がもっと
も適している。 培養温度は２２〜４０℃の範囲で行なうことができるが
、２５〜３５ｑ０が好適である。ｐＨは中性付近にある
ことが望ましい。培養期間は条件によって変ってくるが
、通常１〜３日程度であり、ゥＩＪカーゼの生成が確認
されたとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養
を停止する。本酵素は主として菌体中に生成蓄積する。
培養物中からのゥリカーゼの採取は次のように行なう。
培養終了後、培養物中から菌体を遠心分離などにより取
得し、ついでこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液か
ら遠心分離等によって上情液を得る。 上蒲液を通常酵素精製に用いられる方法、たとえば塩析
、有機溶媒沈殿透析、イオン交換セルロースクロマト、
セフアデツクスクロマト、ハイド。フオーピッククロマ
トなどの方法にて処理する。かくして精製ウリカーゼを
得ることができる。本発明はさらに酸性ゥリカーゼを使
用する尿酸の定量方法に関する。 すなわち本発明の酸性ウリカーゼは従来のゥリカーゼを
使用する尿酸の定量法（酸素比色法、紫外部吸収法、消
費酸素量より定量する方法）のすべてに適用すここがで
きる。しかしながら酸性ウリカーゼの利点はウリカーゼ
・パーオキシダーゼ法に適用する際にもっともよく発揮
される。この場合の方法は、尿酸に酸性ウリカーゼを作
用させて過酸化水素を生成せしめて、該過酸化水素と呈
色試薬とをパーオキシダ−ゼの存在下反応させて生成す
る色素の量を測定することにより尿酸を定量する方法で
ある。酸性ウリカーゼの使用により上記尿酸定量の一連
の反応を酸性域で行うことが可能となる。ウリカーゼ・
パーオキシダーゼ法を酸性ウリカーゼを用いて酸性城で
行う場合の利点として、■発色の感度の高い色素を生成
する呈色試薬が使用できること〔かかる呈色試薬の使用
により検体（例えば血清）の使用量を減ずることができ
る〕、■酵素反応を酸性域で行うことにより血色素等の
影響を小さくすることができ、したがって測定値の精度
をあげることができることがあげられる。上記２点につ
いてさらに詳しく説明する。ウリカーゼ・パーオキシダ
ーゼ法は通常の場合、呈色試薬として少なくとも２成分
よりなる試薬を用いて、これを酸化的に縮合させて色素
を生成させることにより行なわれる。 色素の発色度は色素の分子吸光係数によって表わすこと
ができる。 すなわち分子吸光係数の大なるほど発色度（発色の感度
）は高い。発色度が高いほど検体量は少なくてすむ。過
酸化水素と呈色試薬とをパーオキシダ−ゼの存在下反応
させて生ずる色素の分子吸光係数を測定するに際し、皇
色試薬およびｐＨを種々変えて得られる分子吸光係数（
×１ぴ）を第２表に示す。 第２表注：（１｝ 測定波長は色素の最大吸収波長と一
致させた。 （２ー ４ＡＡ：４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ
ＤＭＡ：Ｎ・Ｎ−ＤｉｍｅｔｈｙｌａｉｌｊｎｅＥＭＡ
Ｅ：Ｎ−Ｅ比ｙｌ−Ｎ−ｍｅｔａ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅ
ｙｌ − Ｎ′ −ａｃｅｔｙｌｅｔｈｙ
ｌｅｎｅｄｌａｍｉｎｅ（特豚昭５３−９３８３５号）
、特開昭５５一２０４７１号Ｍ旧ＴＨ：３一Ｍｅｔｒｙ
ｌ−２一皮ｎｚｏｔｈｉａ−ｚｏｌｊｎｅ−ｈｙｄｒａ
ｚｏｎ一日ＣＩ｛３’ ※１：反応進行せず（色素生成
せず）、測定不能 ※２：日２０２なしに反応が進行するの で意義がない。 第２表から明らかなごと〈ぜＡ−ｐｈｅｎｏｌによる色
素は中性から弱アルカリ性領域で安定な発色を示すが、
吸光係数が小さい。 ４ＡＡ−ＤＭＡによる色素は酸性領域から中性領域で安
定であり吸光係数も４ＡＡ−ｐｈｅｎｏｌより高い。 ４ＡＡ−ＥＭＡＥによる色素は酸性からアルカリ性の広
い領域で安定であり、吸光度は４ＡＡ−ＤＭＡよりさら
に高い。 Ｍ旧ＴＨ−ＤＭＡによる色素は酸性領域で比較的安定で
、４者の中ではもっとも高い吸光係数を示し、例えばｐ
Ｈ５．０ではぜＡ−ＥＭＡＥと比較しても２倍近くにな
る。さて、検体中の妨害物質（タンパク質、還元物質、
アミン等）の影響および採血量等を考慮して、測定のた
めの血清の使用量は一般になるべく少なくできることが
望ましい。 そこで検体量が少なくて精度よく尿酸を定量するにはで
きるだけ吸光係数の高い色素を生成せしめる星色試薬を
使用して発色の感度を増加せしめる必要がある。 この点本発明によれば酸性領域で発色の感度の高い色素
を生成する呈色試薬（例えばＭＢＴＨ一ＤＭＡ）が使用
できるという利点がある。次に第２表に示したような呈
色試験をはじめ一般の呈色試薬の使用に際しては、ヘモ
グロビン、ピリルビン等の血色素が吸光度に影響を与え
るが、これらの影響は酸性領域では中性またはアルカリ
性領域よりも小さくなる。 上記点も測定を酸性城で行うことができる本発明の利点
である。なおウリカーゼによる尿酸から過酸化水素の生
成反応を中性もしくはアルカリ性で行わせ酸性領域で発
色させる方法は繁雑であり精度も低くなる。次に本発明
の尿酸定量方法をさらに詳しく説明する。 本発明による尿酸の定量は以下の工程に従って行われる
。 上記反応（反応１および０）は通常測定に必要な成分を
反応開始時から存在させて適当な酸性城で一回の操作で
行うが、反応１、ロを別々に行うこともできる。 まず最初に１回の操作で行う場合について説明する。【
１｝ 酵素、呈色試薬および必要に応じて界面活性剤、
安定化剤等を緩衝液に含有させてなる試薬液を調製する
。 ｛２） 尿酸舎量を測定するための試料（検体）を一定
量とり、これと一定量の試薬液とを混合して混合溶液と
する。 剛 適当な温度で適当な時間反応を行う。 【４ー 反応後、色素の生成により着色した反応液の可
視部吸収を測定する。 ｛５） 吸光度から、日２０２生成量を、日２０２生成
量から検体中の尿酸量を算出する。 または尿酸の純品を試料として前記操作を行い、尿酸濃
度と比色定量値との相関を示す検量線を作成しておき、
検量線より検体中の尿酸量を算出する。次に上記一連の
操作をさらに詳しく説明する。まず酸性ウリカーゼ、パ
ーオキシダーゼ、呈色試薬および必要に応じて界面活性
剤、安定化剤等を緩衝液に含有させてなる試薬液を調製
する。酸性ウリカーゼおよびパーオキシダーゼの反応液
中の濃度としてはそれぞれ０．０２〜２０ｕ／の【およ
び０．２〜２０肌（ｐｕｒｐｍｏ−餌１１ｉｎ皿ｉｔ）
／の【が好ましい。呈色試薬としては２成分系よりなる
ものが通常であるが、１成分よりなるものであっても差
支えない。呈色試薬の具体例としては４ＡＡ−ｐｈｅｎ
ｏｌ、４ＡＡ−ＤＭＡ、４ＡＡ−ＥＭＡＥ、ＭＥＴＨ−
ＤＭＡ、ＭＢＴＨ−ｐｈｅｎｏｌ、４ＡＡ−ＯＥＡ（Ｄ
ＥＡ：Ｄｉｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ ）、仏Ａ‐ＤＢ
Ａ（ＤＢＭ：Ｄｉｂｕｔｙｌａｉｌｉｎｅ）、ＭＢＴＨ
−ＤＥＡ、ＭＢＴＨ−ＤＢＡ、じｕｃｏｃびｓｔａｌｖ
ｉｏｌｅｓ、ＳＳ酸などがあげられる。 本発明の効果を十分発揮せしめるにはもちろん酸性城で
安定かつ発色度の高い色素を生成する呈色試薬例えばＭ
ＢＴＨ−ＤＭＡ、４ＡＡ−ＥＭＡＥ、４ＡＡ−ＤＭＡ等
の使用が好ましい。呈色試験の反応液中の濃度は０．２
〜２０ｍｍｏｌ／そが好ましい。 ２成分系の場合一方の成分に対する他方の成分の使用量
比は０．１〜１ぴ音モルが好ましい。 試料が油性の場合水との混和性を良好にするために界面
活性剤を加える。 これらの界面活性剤としてはポリエチレングリコール、
ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルなど
であげられる。その反応液中の濃度は０．０１〜５タ′
夕が適当である。 なお試料が血清の場合には通常界面活性剤の使用が好ま
しい。また酵素等の安定化剤として、ＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミン四酢酸）二ナトリウム等を用いるのが好まし
い。 緩衝液としてはホウ酸バッファー、リン酸バッファー、
トリス塩酸バルフアー、トリスマレェート・カセィソー
ダバッフア一、クエン酸・リン酸二ナトリウムバッファ
ー、コハク酸・ホウ砂バッファー、リン酸・ホウ砂バッ
ファーなどが用いられる。 これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度としては０．００５〜
０．５ｈｏｌ／そが好適である。 尿酸を含有する試料といま血清、尿、食品中の尿酸など
があげられる。試料に対する試薬液の量は試料中の尿酸
含量により、変化させればよい。 試料に対する試薬液の使用比率は検出操作が正確に行え
る域内で各試料につき適切な量を設する。例えば試料が
血清の場合は試薬液量３の‘に対し、血清１〜１００山
その割合で使用するのがよい。試薬液の使用量は０．１
〜１０の【で行うのが適当である。酵素反応は２０〜７
５００（好ましくは３５〜７０こ○）、ｐＨ３〜６（好
ましくは４〜５）で１〜３分行う。 酵素反応後、色素の生成により星色した液の可視部吸収
を色素の最大吸収波長またはその近傍で分光光度計など
を用いて測定する。反応１、ロを別々に行う場合には酸
性ウリカーゼ、呈色試薬（反応ロで加える場合は不要）
、および必要に応じて界面活性剤、安定化剤等を緩衝液
に含有させてなる試薬液を用いて反応１を進行させ、つ
いでこれにパーオキシダーゼおよび星色試薬（反応１で
加えない場合）を加えて反応ロを進行させる。 反応０のｐＨは３〜９〔好ましくは３〜６（特に４〜５
）〕で行うのが適当である。他の反応条件は反応１、０
とも前記１回の操作で行う場合と同様である。本発明は
また本発明の尿酸の定量方法を使用するに際して用いら
れる定量用組成物に関する。 さらに詳しくは酸性ウリカーゼ、パーオキシダーゼ、呈
色試薬および緩衝液からなる尿酸定量用組成物に関する
。該組成物には必要に応じ、界面活性剤、安定化剤等を
加えてもよい。組成物中の各成分、各成分の使用量、組
成物を用いての尿酸の定量は上記尿酸の定量方法に述べ
たとおりである。次に本発明の実施例を示す。実施例
１ 種菌としてストレブトミセス・ガンミシカスＡＴＣＣ２
７４３４を使用した。 グルコース２夕／ｄ‘、肉エキス１タ′の、コーンステ
イープリカ−０．５夕／ｄ上、ベプトン０．５夕／ｄ【
、酵母エキ ス０．１ 夕／ｄ‘、ＫＨ２Ｐ０４０．１
夕／ｄ‘、ＭｇＳ０４・７日２０ ０．０５夕／ｄ‘
、ＦｅＳ０４・７日２０ ０．１の９／ｄ‘よりなる種
培養培地（殺菌前ｐＨ７．２）３００の‘を２ク客三角
フラスコに入れ、該培地に前記菌株を１白金耳接種し、
３０℃で４幼時間振盤培養した。 培養液のすべてを３０そ客ジャーファーメンター中の同
上培地１８そに加え、３０００、２５び．ｐ．ｍ．通気
０．５〆／夕（培地）／ｍｉｎで本培養を行い、３０時
間で培養を終了した。培養終了液を遠心分離して菌体９
５０夕（緑重量）を得た。この菌体に０．０８Ｍホウ酸
バッファー（ｐＨ７．８）１０夕を加え再度遠心分離し
た。函体を０．０則４ホウ酸バッファー（Ｍ／８０ホウ
砂−Ｍ／２０ホウ酸バッファー）（母７．８）５夕に懸
濁したのち、ダイノ・ラボラトリー・ミル（Ｄ肌ｏいｂ
ｏｒａｔｏひ Ｍｍ）ＫＤＬ型（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａ
ｃｈｏｆｅｎｌｎｃへＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製）にて
菌体を破砕し、菌体破砕液を得た。 菌体破砕液を遠心分離して上清液を得た。この上清液中
のゥリカーゼ活性は６．２５ｕ／ｄ‘であった（上清液
４．５そ、全活性２８１．２５ｕ）。この上清液に硫安
を添加して硫安３０％飽和とし、沈殿物を遠心分離によ
り除き、上蒲液を得、さらに硫安を添加して硫安６０％
飽和とし、沈殿物を遠心分離により集めた。この沈殿物
を０．０９Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）１．０〆
にとかし、同バッファー５０そを用いセロフアンチュー
プを透析膜として、５℃で一夜透析を行った。透析チュ
ーブ内液にアセトンを添加し、３０％（Ｎ／Ｖ）アセト
ン溶液とし、生成する沈殿物を遠心分離により除き、上
清液を得、さらにアセトンを添加して、６０％Ｎ／Ｖ）
アセトン溶液にした後、遠心分離によって沈殿物を得た
。この沈殿物を０．０８Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．
８）３６０の上にとかし、５０その上記バッファーを用
い、セロフアンチューブを透析膜として、５℃で一夜透
析を行った。透析チューブ内液を６０℃、３粉テカロ熱
してカタラーゼを失活させた。処理液を０．２ＭのＮａ
ＣＩで平衡にしたＤＥＡＥ−セフアデックスＡ５０（弱
塩基性Ｓｅｐｈａｄｅｘイオン交換体、Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘはデキストラン誘導体よりナこる分子節の商標名；Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ ｌ船．
、Ｕ．Ｓ．Ａ）（１０００の‘）を充填したカラムに通
塔し、０．０８Ｍホウ酸バッファー（Ｐｌｌ７．８）１
そで洗浄後、０．２ＭのＮａＣＩを含む上記のホウ酸バ
ッファー１そと０．７ＭのＮａＣＩを含む上記のホウ酸
バッファー１そで濃度勾配溶出を行った。溶出液を２０
夕ずつ分画し、ウリカーゼ熔出区分を集め、硫安６０％
飽和とし、沈殿物を遠心分離により集めた。この沈殿物
を０．０５Ｖホゥ酸バッファー（ＰＨ７．８）９０舷に
溶解し、同バッファーで平衡化したセフアデックスＧ２
００（４．２×９８．５肌）の力ラムにチヤージし、同
じバッファーで溶出した。ウリカーゼ溶出画分を硫安６
０％飽和とし生成する沈殿物を遠心分離により集め、３
５の上の０．０８Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）に
溶解した。酵素溶液をもう一度同バッファーで平衡化し
たセフアデツクスＧ２００のカラム（２．８×６９．５
肌）に通塔し、同バッファーで綾出した。溶出区分を集
めて硫安６０％飽和とし、生成した沈殿を遠心分離で集
め、０．０５Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）２５の
‘に溶解し、約２０その０．０８Ｍホウ酸バッファー（
ｐＨ７．８）を用い、セロフアンチューブを透析膜とし
て５℃で一夜透析した。透析チューブ内液を０．０８Ｍ
ホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）で平衡化したＤＥＡＥ
−セルロース２００の‘を充填したカラムにチャージし
、同バッファー２００の上で洗浄後、同バッファー５０
０奴‘と０．７ＭＮａＣＩを含む０．０９Ｍホウ酸バッ
ファー（ｐＨ７．８）５００の‘で濃度勾配溶出を行っ
た。溶出液を１０夕ずつ分画し、ゥＩＪカーゼ熔出区分
を集め、硫安６０％飽和とし、沈殿物を遠心分離により
集めた。この沈殿物を約２０の上の０．０９Ｍホウ酸バ
ッファー（ｐＨ７．８）に溶解し、同バッファー】０そ
を用い、セロフアンチユーブを透析膜として５℃で一夜
透析した。透析チューブ内液を凍結乾燥し、酸性ゥＩＪ
カーゼの粉末を得た（比活性３．７４ｕノの９蛋白）。 菌体破砕液を遠心分離して得られた上清液からの活性収
率２０．３％。なお、この酵素標品の性質は前に示した
通りである。 実施例 ２ ＜Ｍ旧ＴＨ−ＤＭＡを用いた尿酸の定量＞｛ィ｝ 試薬 ｛ａ）バッファー：Ｍ／１０ホウ砂−Ｍ／１０コハク酸
バッファー‐（ｐＨ４．０またはｐＨ５．０）（ｂ｝
１．５の夕／私ＥＤＴＡ・二ナトリウム・二水物 ‘ｃ）５％Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００（界面活性剤の
商品名；ポリエチレングリコールアルキルフエニルエー
テル；Ｒｏｈｍ＆ＨａａｓＣｏ．）｛ｄ｝ １・５の３
／肌とＭＢＴＨ｛ｅ）１．０の９／叫ＤＭＡ ｛ｆ｝ ２０肌（パーブロガリン単位）／泌パーオキシ
ダーゼ咳）２血／の【酸性ウリカーゼ〔０．０８いホウ
酸バッフアー（ＰＨ７．５）〕仇旅屯水 （ｉ）尿酸水溶液（２、５または１０の９／ｄ‘）【ｏ
｝ 操作‘ａ｝液（ｐＨ４．０または５．０）２４０の
‘、｛ｂ｝液０．０５奴、ｔｃー液０．０５の上、‘ｄ
｝液０．１０の‘、｛ｅー液０．１０の‘、的液０．１
０地、（ｇ）液０．１０の【および（ｈ）液０．０５の
上または０．０８の‘を混合し、３７００で５分間予備
保温したのち、（ｉ）液０．０５叫または０．０２のと
（全体で３．０の上とする）を加え、３７００で５分間
反応させたのち、分光光度計により、５５Ｍｍの吸光度
を測定した。 対照は（ｉ）液の代りに純水を加えたものについて同様
の処理をして５５０ｎ仇の吸光度を測定した。両者の吸
光度差をもとに発生した日２０２量を求め。 日２０２量をもとに尿酸の量を算出した。結果を第３表
に示す。第 ３ 表 第３表から明らかなごとく、本発明による尿酸の定量方
法は、一段階の反応できわめて徴量、すなわち試験した
範囲では０．４ムタから５．０ムタの尿酸をきわめて高
い精度で定量できる非常に有効な方法である。
第１図は酸性ウリカーゼの至適ｐＨを、第２図は酸性ゥ
リカーゼの安定ｐＨ範囲を、第３図は酸性ウリカーゼの
作用至適温度を、および第４図は酸性ウリカーゼの安定
温度範囲をそれぞれ表わす。 茨ー図繁ｚ図 叢ミ図 ※↑脳
リカーゼの安定ｐＨ範囲を、第３図は酸性ウリカーゼの
作用至適温度を、および第４図は酸性ウリカーゼの安定
温度範囲をそれぞれ表わす。 茨ー図繁ｚ図 叢ミ図 ※↑脳
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記性質を有する酸性ウリカーゼ （イ）作用 尿酸に作用して尿酸をアラントイン、過酸化水素および
炭酸ガスへ酸化的に加水分解する。 （ロ）基質特異性尿酸に特異的に作用する。 （ハ）至適ｐＨ：４．７〜５．１ （ニ）安定ｐＨ：７．０以上 （ホ）至適温度：６０〜６５℃ （ヘ）分子量：１５８００（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０
０使用）２ ストレプトミセス属に属し、酸性ウリカー
ゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中
に酸性ウリカーゼを生成せしめ、これを採取することを
特徴とする酸性ウリカーゼの製造法。 ３ 尿酸に酸性ウリカーゼを作用させて過酸化水素を生
成せしめ、該過酸化水素と呈色試薬とをパーオキシダー
ゼの存在化反応させて生成する色素の量を測定すること
により尿酸を定量する方法。 ４ 酸性ウリカーゼ、パーオキシダーゼ、呈色試薬およ
び緩衝液からなる尿酸定量用組成物。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53153648A JPS6031472B2 (ja) | 1978-12-14 | 1978-12-14 | 酸性ウリカ−ゼ |
| US06/103,579 US4273874A (en) | 1978-12-14 | 1979-12-14 | Acidic uricase and process for production thereof |
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|---|---|---|---|
| JP53153648A JPS6031472B2 (ja) | 1978-12-14 | 1978-12-14 | 酸性ウリカ−ゼ |
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Family Applications (1)
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| EP (1) | EP0012446B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6031472B2 (ja) |
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- 1979-12-14 DE DE7979105194T patent/DE2965881D1/de not_active Expired
- 1979-12-14 US US06/103,579 patent/US4273874A/en not_active Expired - Lifetime
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