JPS6020994B2 - 発酵法によるキサンチン・オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるキサンチン・オキシダーゼの製造
法に関する。

さらに詳しくは、本発明はェンテロバクター属に属し、
キサソチン・オキシダーゼ生産館を有する微生物を栄養
塔地に培養し、培養物中にキサンチン・オキシダーゼを
生成せしめ、これを採取することを特徴とするキサンチ
ン・オキシダーゼの製造法に関する。キサンチン・オキ
シダーゼ（酵素番号１，２，３，２）はヒポキサンチン
をキサンチンに酸化し、さらにキサンチンを尿酸に酸化
する作用を触媒する酵素であり、各々の物質を酸化する
際に酸素を吸収し過酸化水素を生成する。かかる作用を
有する酵素をキサンチンあるいはヒポキサンチソを含有
する試料に作用させて生成する過酸化水素を色素に変換
せしめ、この色素に基ずく可視部の吸光度を測ることに
よって試料中のキサンチンあるいはヒポキサンチソが定
量できる。しかるに従来牛乳中にこの酵素の存在が知ら
れているが、牛乳に由来するヒポキサンチンオキシダー
ゼを作用させた場合、後述の実験例１で詳しく述べる如
く生成する過酸化水素を色素に変換せしめた場合に、短
時間に色素が分解されて過酸化水素に基ずく定量ができ
ず、通常生成する尿酸の量が測られている。

又微生物に由来するものとして、シュードモナス属、ェ
シェリキア属、アースロバクター属、／カルディア属等
に属する微生物から得られる酵素が弱いキサンチン・オ
キシダーゼ活性を示すことが知られている〔Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１３０，１１７５（１９７７）〕
。

しかしながらこれらは実質的に応用できる活性夕を有し
ていない。

本発明者らは発酵法によるキサンチン・オキシダーゼの
製造法について種々検討した結果、ェンテロバクター属
に属し、キサンチン・オキシダーゼ生産館を有する微生
物を栄養塔地に培養するこひとにより培養物中にキサン
チン・オキシダーゼが生成することを見出し、さらにこ
のキサンチン・オキシダーゼは前述の分析に応用して正
確に基質量を求めることができることがわかり、本発明
を完成した。

タ 以下に本発明を詳細に説明する。

本発明に使用される微生物は、ェンテロバクター属に属
し、キサンチン・オキシダーゼを生産する能力を有する
ものであればいずれの菌株でもよし・。

好適な菌株の１例としてはェンテロバクター・クロアカ
エ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）ＫＹ
３０６６（徴工研菌寄第４０７７号、ＮＲＲＬ Ｂ−１
１１５５）があげられる。エンテロバクター・クロアカ
ェの菌学的性質については、Ｂｅ鴇ｅｙｓＮｂｎ雌ｌ
ｏｆ 戊ｔｅｒｍｉ船ｔｉｖｅ 母ｃｔｅｒｉｏｌｏ期
第８巻３２５頁に記載がある。本発明に使用される栄葵
培地は炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要
とする徴量栄養素を程よく含有するものであれば合成培
地、天然塔地のいずれも使用可能である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロ
ース、糟蜜などの炭水化物、キサンチン、ヒポキサンチ
ン、グアニン、プリン、イノシン、グアノシン、キサン
トシン、５−イノシン酸二ナトリウム塩、５′ーグァニ
ル酸二ナトリウム塩などの核酸類などが用いられる。

窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、リン酸アンモニウム、キサンチン、ヒポキサンチン、
グアニン、プリン、イノシン、グアノシン、キサントシ
ン、５−イノシン酸二ナトリウム塩、５′−グアニル酸
二ナレリウム塩などの核酸類、グルタミン酸などのアミ
ノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物、ベプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ−などの
窒素含有天然物が使用できる。

無機物としては、リン酸ーカリウム、リン酸二カリウム
、硫酸マグネシウムなどが使用できる。

本発明においては、培地中にキサンチン、ヒポキサンチ
ン、グアニン、グアノシン、イ／シン、６ーィ／シン酸
二ナトリウム塩、５−グアニル酸二ナトリウム塩等を存
在せしめることにより、後述の実験例３に示される如く
無添加の場合に比してキサンチン・オキシダーゼの生成
量を増加せしめることができる。培地中の各核酸濃度と
しては０．２〜３．０夕／ｄ‘の範囲が好ましい。培養
は通常振濠培養あるいは通気蝿洋培養で行う。培養温度
は２０〜３０午○、好適には２５〜３０ｑｏで行なう。
培地のｐＨは６．０〜９．５好窒には６．５〜９．０の
範囲にあることが望ましい。培養期間は１〜３日、通常
は１〜２日間で完了する。かくして培養することにより
、培養物中、主として菌体中にキサンチン・オキシダー
ゼが生成蓄積する。

培養物中からキサンチン・オキシダーゼの採取は次のご
とく行なう。

培養終了後、培養物から菌体を遠Ｄ分離などにより取得
し、ついでこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液から
遠心分離等によって上清液を得る。

上清液を通常酵素精製に用いられる方法、たとえば、塩
析、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換セルロースカラム
クロマト、セフアデツクスカラムクロマト、イオン交換
セファデックスカラムクロマト、凍結乾燥などの方法に
て処理する。かくして精製キサンチン・オキシダーゼを
採取することができる。本発明におけるキサンチン・オ
キシダーゼの活性は次の２つの方法で測定する。〔測定
法 １〕０．１Ｍトリス・塩酸バッファー（ｐＨ７．３
１、１．０の‘、１仇Ｍキサンチン水溶液０．２の‘、
キサンチン・オキシダーゼ溶液０．２泌に水１．６奴‘
を加えて全量３．０泌とし、３７０で１０分間反応させ
る。

反応後０．州塩酸１２の‘を添加し２８３ｍの吸光度を
測定する。これをＯＤ２８３値とする（この値は生成す
る尿酸量に相当する。）ブランクとして、上記組成を有
する酵素含有液を３７０とした後、０．州塩酸１２の‘
を添加したものを用いる。反応生成物である尿酸は酸性
で２８机ｍに吸収極大を有し、その分子吸光係数は１．
２斑×１ぴである（Ａ岬ｌｙｔｉｃａＩＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｅｔひ３８ ６５１９７０）から、キサンチン・オキ
シダーゼの単位（Ｕ）はＯＤ２８３×０．６０６×酵素
の希釈率 として表示される。

キサンチン・オキシダーゼの単位は３７０、ｐＨ７．３
において１分間に１仏 ｍｏｌｅの尿酸を生成する酵素
量を１単位とする。〔頚９定法 Ｄ〕 ０．１Ｍトリス・塩酸バッファー（ｐＨ７．３）１．０
の‘、発色液〔４ーアミノアンチピリン、フェノールを
各々１０ｍｍｏｌ／そ含む０．１Ｍトリス・塩酸バッフ
ァー（ＦＨ７．３）にパーオキシダーゼを該溶液１００
の‘当り４４５Ｕ含有させたもの〕０．５の【、１瓜ｈ
Ｍキサンチン水溶液０．２の‘、キサンチン・オキシダ
ーゼ溶液０．１の‘、水１．２の‘より成る全量３．０
の‘の酵素含有液を３７０で１０分間反応後、５０仇ｍ
の吸光度を測定する。

この反応によって生成するキノンィミン色素の分子吸光
係数を５．３３×１ぴ（ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ
ｔび２０ ４７０１９７４）とし、３７℃、ＰＨ７．３
において、１分間に１仏ｍｏｌｅの過酸化水素を生成す
る酵素量を１単位（Ｕ）とすると、キサンチン・オキシ
ダーゼの単位はＯＤ５ｏｏ×０．５偽×酵素の希釈率 として表示される。

本発明によって得られるキサンチン・オキシダーゼはヒ
ポキサンチンを酸素を受容体として酸化し、化学量論的
にキサンチンおよび過酸化水素を生成し、キサンチンを
酸素を受容体として、酸化して化学量論的に尿酸および
過酸化水素を生成する。

Ｚ本発明で得ら
れるキサンチン・オキシダーゼのその他の性質は以下に
示される。【１’安定ｐＨ範囲 酵素標品を種々の柵（４．０，４．４，４．８，５．０
，５４，５８，６．０，６２，６４，６．６，６．８，
７．０，７．２，Ｚ７．４ ７．７，７．９，８．１，
８．３ ８．５）を有する０．２Ｍ酢酸バッファーと５
皿Ｍホウ砂バッファーに４９ｍＵ／舷になるように溶解
し、各ｐＨの酵素溶液を得る。

ついで、これらの溶液を６０ｑｏに３０分間保ち、冷却
後処理液のキサンチン・オキシダーゼ活性を測定法１に
よって測定する。結果を第１図に示す。第１図から、本
キサンチン・オキシダーゼの安定餌範囲は６２〜６．８
であることがわかる。｛２ｌ 至適ｐＨ 酵素標品を種々のｐＨ（４．３，４．６，５０，５．２
，５．６，５．８，６．１，６．３，６．４，６．５，
６．８，６．９，７．１．７．３，７．５，７．７，７
．９，８．１，８．３，８．５，８．７，８．９，９．
１，９．３）を有する０．２Ｍ酢酸バッファーと５仇ｈ
Ｍホウ砂バッファー２．０舷に０．２５Ｕ／舷のキサン
チン・オキシダーゼ溶液０．２の‘を添加し、キサンチ
ンを基質として酵素反応を行ない、０．が塩酸で反応を
止めた後、２総血の吸光度を測定する。

結果を第２図から本キサンチン・オキシダーゼの至適ｐ
Ｈは７．１付近にあることがわかる。‘３｝ 至適温度 ５仇Ｍホウ砂バッファー（ＰＨ７．０）２．０叫に０．
２５Ｕ′私の酵素溶液０．２Ｍを添加し、キサンチンを
基質として各温度（５，２０，２５ ３０，３５ ４０
４５，５０，６０００）で１０分間反応し、０．が塩酸
で反応を止めた後、２胸肌の吸光度を測定する。

結果を第３図に示す。第３図から、本キサンチン・オキ
シダーゼの至適温度は３５〜４軍○付近にあることがわ
かる。

【４’基質特異性キサソチン・オキシダーゼは０．２５
Ｕ／の【のものを用い、各種の基質は９ｈＭ水溶液０．
１の‘を用いる以外は測定法０と同様にして、生成する
過酸化水素量を測定する。

キサンチンを基質として際の測定値を１００とし、各基
質の活性を相対活性で示す。結果を第１表に示す。第１
表 第１表より、本キサンチソ・オキシダーゼはキサンチン
、ヒポキサンチン、グアニン、プリン、２ーオキシプリ
ンに活性を有することがわかる。

｛５１ 耐熱性５伽Ｍホウ砂バッファー（ＰＨ６６）２
．０私に０．２２Ｕ／の‘のキサンチン・オキシダーゼ
溶液０．５Ｍを添加し、各温度（５，３０，３５，４０
，４５，５，６０’７０，８０℃）で、３０分間処理し
た後、５分間氷冷し、残存活性を測定法１で測定する。

結果を第４図に示す。第４図より、本キサンチン・オキ
シダーゼは５０℃、３０分間処理後も１００％の活性も
有することがわかる。

■ 阻害剤０ キサンチン・オキシダーゼ溶液０．２５
Ｕ′肌のものを用い、種々の酵素活性阻害物質を添加す
る以外は、測定法１と同様にしてキサンチン・オキシダ
ーゼ活性を測定する。

結果を第２表に示す。第２表※Ｐ−クロルマーキュリ安
息香酸ナトリウム塩第２表よりＣにそ、Ｃ地Ｚ２・班２
０、ＡｇＮ０３、ＦｅＳ０４・７日２０、ＰＣＭ旧、Ｌ
ーアスコルビン酸がキサンチン・オキシダーゼの阻害物
質であることがわかる。

上記性質の特定される本発明に係るキサンチン・オキシ
ダーゼは牛乳に由来するそれと比較して作用する基質の
定量において極めて優れている。

即ち牛乳に由釆するキサンチン・オキシダ−ゼを作用し
うる基質に酸素を電子受容体として作用させたとき生成
する過酸化水素を発色係に移行せしめて色素に変換して
も呈色の安定性が悪く、過酸化水素を発色系に移行せし
めて質を定量することはできない。しかいこ本発明に係
るキサンチン・オキシダーゼは後述の実験例１に示す如
く極めて安定した呈色が得られる。本発明に係るキサン
チン・オキシダーゼはキサンチンもしくはヒポキサンチ
ン又はこれらを生成する系に作用させて生成する過酸化
水素を側定することによって作用させた基質の定量が容
易にできる。

その例としてキサンチン、ヒポキサンチンの定量のみな
らず無機リンの定量等があげられる。

濠機リンの定量は無機リンとィノシンにプリンヌクレオ
サイド・ホスホリラーゼを作用させてリボース−１‐ホ
スフェートとヒポキサンチンを生成せしめ、このヒポキ
サンチンにキサンチン・オキシダーゼを作用せしめるこ
とによって行われ０る。さらに本発明に係るキサンチン
・オキシダーゼは後述の実験例２に示される如く酸素を
最良の電子受容体とするものである。

以下に本発明に係るキサンチン・オキシダーゼタのヒポ
キサンチンに作用させた実験（実験例１）、種々の受容
体に対する活性（実験例２）およびキサンチン・オキシ
ダーゼ製造における培地中のヒボキサンチン濃度変化に
よる活性に与える影響についての実験（実験例３）を示
す。

０実験例 １ 過酸化水素測定の反応組成は、０．１Ｍトリス・塩酸バ
ッファー（ｐＨ７．３）１．０叫、１伽Ｍヒポキサンチ
ン水溶液０．１の‘、発色液０．５の‘、キサンチン・
オキシダーゼを水で全量３．０の‘とする。

牛乳より得たキサンチン・オキシダーゼ（節ｅｈｒｉｎ
鞍ｒ−ＮＥｎＭｅｉｍ社製）は、反応液３．０必中に０
．４の９、実施例１で得たキサンチン・オキシダーゼは
０．１５Ｕ用いる。上記組成より成る酵素含有液を３７
０で反応させ、生成するキノンィミン色素を経時的に５
０仇皿の吸光度で測定する。尿酸測定の反応液組成は、
０．１Ｍトリス・塩酸バツフアー（ｐＨ７．３）１．０
の‘、ＩＱｈＭヒポキサンチン水溶液０．１の【過酸化
水素測定の場合と同量のキサンチン・オキシダーゼ、水
で全量３．０の‘とする。

３７０で反応し、生成する尿酸を２９桝ｍの吸光度で経
時的に測定する。

結果を第５図、第６図に示す。第５図より、牛乳に由来
するキサンチン・オキシダーゼでは尿酸の生成が経時的
に続いているにもかかわらず、色素生成は４分３の妙を
最大として徐々に低下している。

これに対し、本発明に係るキサンチン・オキシダーゼで
は、この現象は見られず尿酸生成と色素生成はほぼ平行
しており、色素の消失は認められない（第６図）。実験
例 ２ １皿Ｍキサンチン水溶液０．１５の‘、１０血Ｍトリス
・塩酸バッファー（ｐＨ７．３）１．０Ｍ、水０．６５
Ｍ、第３表に示した種々の電子受容体１Ｍより成る反応
混合物および実施例１で得られたキサンチン・オキシダ
ーゼ溶液を３７０に保ち、各々に窒素ガスを３〜４分間
通じて溶存酸素を反応混合物およびキサンチン・オキシ
ダーゼから除く。

この後、反応混合物２．８の‘‘こキサンチン・オキシ
ダーゼ（０．２５Ｕ／泌）０．２叫を添加して反応を開
始し、１９秒ごとに吸光度の変化を読み、キサンチン・
オキシダーゼ添加後３０〜９の妙間の１分間の値を測定
値とする。

酸素を電子受容体とする場合には、窒素ガスを通じずに
反応溶液中の溶存酸素を受容体とし反応産物である尿酸
を２９則ｍで測定する。結果を第３表に示す。第３表 ・※２，６‐ジクロルフエノールイントフエノールナト
リウム尚、牛乳から得られるキサンチン・オキシダ−ゼ
は、電子受容体の相対活性が、フェリシアナィド（１０
０）、酸素（８３）、インドフェノール（３５）、ＮＡ
Ｄ（く１．３）〔（ ）内は相対活性値〕（ＴＨＥＥＮ
ＺＹＭ旧Ｓ′Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ
狐ＯＸＩＤＡＴＩＯＮ−ＲＥＤＵＣＴＩＯＮ
Ｐａｒ０３ ｐ２９９ １９７５ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ
ｅｓｓ）であり、本発明によって得られるキサンチン・
オキシダーゼとはフエリシアナィド、インドフェノール
に対する活性が非常に異なつている。

実験例 ３ ヒポキサンチソ（第４表に示す濃度）、酵母エキス０．
５夕／ｄ【、コーン・スチープ・リカー０．５夕／ｄ上
、ベプトン０．１夕／ｄ【、ＫＨ２Ｐ０４０．０５タ′
ｄ上、Ｋ２ＨＰ０４０．１夕／ｄ‘、Ｍ簿０４・７日２
００．０５２／ｄ‘より成る培地（対７．２）４０Ｍを
坂口フラスコに分注し、１２ぴ０で１筋ご殺菌する。

各培地にスラントよりェンテロバクター・クロアカェＫ
Ｙ３０６６（徴工研寄託受理番号第４０７７号、ＮＲＲ
ＬＢ−１１１５５）を１白金耳接種し、３ぴ０で４斑時
間振濠培養する。培養終了後、培養物を遠心分離（１０
００仇ｐｍ、１５分、以下遠心分離はこの条件で行なう
。）して菌体を得る。これを５伽Ｍトリス・塩酸バッフ
ァー０（ｐＨ８０）２０凧【に懸濁し、超音波破砕機（
久保田製作所製 Ｕ１ｔ松ｓｏｎｉｃＧｍｅｒａのｒＫ
ＭＳ−２５０型１５０ＷＩび分処理）にかける。破砕液
を途○分離して上清液を得る。上溶液を酵素液としてキ
サンチン・オキシダータゼ活性を測定法ＤＩこよって測
定する。

結果を第４表に示す。第４表第４表の結果より、キサン
チン・オキシダーゼの譲導葡質としてのヒボキサンチン
の培地中濃度は０．２ｙ／ｄ‘以上が好適である。

次に本発明を実施例で具体的に説明する。

実施例 １ タ 酵母エキス０．５夕／ｄ‘、コーン・スチープ・リ
カー０．５夕／ｄｌベプトン０．１夕／ｄ【、ＫＨ２Ｐ
０４０．０５タ′ｄ【、Ｋ２ＨＰ０４０．１タ′の、Ｍ
ｇＳ０４・７日２００．０５夕／ｄ‘、グア／シン０．
３５タ′ｄ‘より成る種培養塔地（ｐＨ７．２）１０の
‘を７０泌客試験管に入れ、１２０ｑｏで１５ｏ分間殺
菌する。

この培地にェンテロバクタ−・クロアカェＫＹ３０６６
（徴工研菌寄第４０７７号、ＮＲＲＬＢ‐１１１５５）
を１白金耳接種し、３０℃で４観音間振函培養する。得
られる種培養液（第一種培養液）３０私を２２三角フラ
スコに入れた前記と同じ組成を有する種培養塔地３００
の‘に接種し、３０℃で４８時間振顔培養する。得られ
る種培養液（第二種培養液）９００の‘を３０メジャー
ファーメンターに入れた種培養培地と同じ組成の発酵塔
地１５夕に接種し、３０℃、３０瓜ｐｍ、通気量１〆′
夕／ｍｉｎで４０時間本培養を行なう。培養物中のキサ
ンチン・オキシダーゼは、発酵液１の‘当り０．３１Ｕ
である。培養物からのキサンチン・オキシダーゼの採取
は次のごとく行なう。培養物を遠心分離して菌体４３０
夕（湿重量）を得る。この菌体を５仇ｈＭトリス・塩酸
バッファー（ｐＨ８０）（以後用いるバッファーはすべ
てこのバッファーである。）２夕に懸濁した後、ダイノ
・ラボラトリー・ミル（Ｄ飢ｏ仏ｂｏｗｔｏひＭＩｌｌ
）ＫＤＬ型（Ｗｉｌｌｙ Ａ ＢａｃｈｏｆｅｎＩｎｃ
．ＳＭｔｚｅｒｌａｎｄ）にて、約３０分処理し菌体破
砕を行なう。得られる繭体破砕液を遠心分離して上清液
約３２を得る。上清液に硫安を添加して硫安３０％飽和
とし、生成する沈殿物を遠心分離で除く。上情液にさら
に硫安を添加して硫安５５％飽和とし生成する沈殿物を
遠心分離により得る。この沈殿物を１００の‘のバッフ
ァーに溶解し、同バッファー７Ｚに対しセロフアンチュ
−ブを透析膜として一夜透析する。透析チューブ内液を
０．か州ａＣ〆を含むバッファーで平衡化したＤＥＡＥ
ーセルロース１夕を充填したカラムにチャージし、０．
２ＭＮａＣ夕を含む同バッファー約２そで洗浄後０．２
〜０．８ＭＮａＣ〆を含むバッファー４そで濃度勾配溶
出を行う。溶出液を２０タづつ分画し、キサンチン・オ
キシダーゼ活性区分を合わせる。これに硫安を添加して
６５％飽和とし、生成する沈殿物を遠心分離により得る
。この沈殿物をバッファーに溶解し、同バッファーで平
衡化したセフアデツクスＧ−１５０１夕を充填したカラ
ムにチャージし、同バッファ−溶出、２０タづつ分画し
、サンチン・オキシダーゼ活性区分を合わせる。これに
硫安を添加し、硫安６５％飽和とし、生成する沈殿物を
遠Ｄ分離によって得る。この沈殿物をバッファーに溶解
し、再度セフアデツクスＧ−１５０１そを充填したカラ
ムにチャージし、同バッファーで溶出する。活性区分を
合わせ、硫安を添加して６５％飽和とし、沈殿物を遠Ｄ
分離によって得る。この沈殿物をバッファーに溶解し、
同バッファー３のこ対し透析する。透析チューブ内液を
０．２ＭＮａＣそを含むバッファーで平衡化したＤＥＡ
Ｅーセルロース５００の‘を充填したカラムにチャージ
し、０．２ＭＮａＣそを含む同バッファー５００の【で
洗浄後、０．２〜０．８ＭＮａＣそを含む同バッファー
２そで濃度勾配溶出を行ない、溶出液を１０タづつ分画
し、キサンチン・オキシダーゼ活性区分を合わせ、硫安
を添加して硫安６５％飽和とし、生成する沈殿を遠０分
離により得る。沈殿物をバッファーに溶解し、同バッフ
ァー３のこ対し透析する。透析チューブ内液を０．２８
ＭＮａＣ〆を含むバッファーで平衡化したＤＥＡＥー
セフアデツクスＡ−５０５００の‘を充填したカラムに
チャージし、０．２９ＭＮａＣそを含むバッファー１そ
で洗浄後、０．２５〜０．８ＭＮａＣそを含むバッファ
ー２そで濃度勾配溶出を行ない、溶出液を１０タづつ分
画し、キサンチン・オキシダーゼ活性区分を合わせる。
キサンチン・オキシダーゼ活性区分をバッファー５そで
透析後、透析チューブ内液を凍結乾燥し、キサンチン・
オキシダーゼの粉末１．５夕を得る。菌体破砕液を遠心
分離して得られた上清からの活性収率は１２．５％、比
活性７．５Ｕ／倣蛋白質である。実施例 ２ 酵母エキス０．５夕／ｄ‘、コーン・スチープ・リカー
０．５多／ｄ【、ベプトン０．１夕／ｄ【、ＫＨ２Ｐ０
４０．０５夕／ｄ‘、Ｋ２ＨＰ０４０．１タ′ｄ‘、Ｍ
タＳ０４・７日２００．０５夕／ｄ‘、ヒポキサンチン
０．２７夕／ｄ‘より成る培地（ｐＨ７．２）４０の‘
を坂口フラスコに入れ、１２０ｑｏで１５分間殺菌する
。

この培地にェンテロバクタ−・クロアカヱＫＹ３０６６
徴工研寄託受理番号第４０７７号、ＮＲＲＬ Ｂ−１１
１５５）を１白金耳接種し、３０３０で４８時間振盤培
養する。培養液を遠心分離して菌体を得、バッファー２
０の【に懸濁し、超音波破砕機にかける。破砕液を遠心
分離して上清液を得る。上清液を酵素液としてキサンチ
ン・オキシダーゼ活性を測定した結果、培養液１のと当
り、０．３１Ｕのキサンチン・オキシダーゼが蓄積する
。実施例 ３ 実施例２における培地に加えられたヒポキサンチンに代
えて次の表に示される化合物を用い実施例２と同様に実
施して培養液中に第５表に示されるキサンチン・オキシ
ダーゼが蓄積する。

第５表

【図面の簡単な説明】

第１図は本キサンチン・オキシダーゼの安定ＰＨ範囲を
、第２図は本キサンチン・オキシダーゼの至通解を、第
３図は本キサンチン・オキシダーゼの至適温度を、第４
図は本キサンチン・オキシダーゼの耐熱性を、第５図は
牛乳キサンチソ・オキシダーゼの酵素反応経過…・・・
ＯＤ斑３（尿酸生成）、」‐一ＯＤ５の（色素生成）を
、第６図はェンテロバクター・クロアカエのキサンチン
オキシダ０ーゼ反応経過・・・・・・ＯＰ側（尿酸生成
）、びリＯＤ５ｏｏ（色素生成）をそれぞれ示す。 災ー１頚 多Ｚ楓 妥３１薄 災４’８ 多け亀 多ら１句

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エンテロバクター属に属し、キサンチン・オキシダ
   ーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物
   中にキサンチン・オキシダーゼを生成せしめ、これを採
   取することを特徴とするキサンチン・オキシダーゼの製
   造法。 ２ エンテロバクター属に属する微生物が生産するキサ
   ンチン・オキシダーゼを用いてキサンチンまたはヒポキ
   サンチンを定量する方法。