JPS5843079B2 - 抗葉酸剤に対する細菌の感受性試験用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物用の培地に関し、特（こスルファメトキ
サゾール（ＳＭＸ）およびトリメトプリム（ＴＭＰ）ま
たはその伺れかのような抗葉酸抗微生物剤に対する細菌
の感受性試験ｌこ使用される培地に関するものである。

常用される培地がスルホンアミドまたはトリメトプリム
、即ち細菌における葉酸合成を阻害する薬剤、に対する
これら生物の感受性を測定するためにはしばしば不適当
であることは多年の間知られている。

この不適当さは、連続希釈法を用いたとき長く尾を引く
終点を与えることによって、また拡散法を用いたとき阻
止帯内の不完全発育によって現われる。

チミジンがスルホンアミドおよびトリメトプリムの阻止
活性の非常に強力な逆転剤であることが、ブツシュバイ
（Ｂｕｓｈｂｙ ） 〔Ｍｅｄ 。

Ｊ、Ａｕ５ｔ、５ｐｅｃｉａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ
ｔ（１９７３）１：１０〕ならびにコツホ（Ｋｏｃｈ）
およびバーチオール（Ｂｕｒｃｈａｌｌ ） ［Ａｐ
ｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７１） ２
２ ：８１２］により示された。

１９４５年にハーバ−（Ｈａｒｐｅｒ ）およびコスト
ン（Ｃｏｗｓｔｏｎ ） （Ｊ 、 Ｐａｔｈ、Ｂａｃ
ｔ、 ５７ ：５９）は分解した（ １ｙｓｅｄ ）馬
血液をわるい感受性試験培地へ添加したとき、それを申
し分のない培地に変換できることを示した。

この初期の研究および数人の他の研究者の研究以来、ス
ルホンアミドによって生ずる阻止帯内にしばしば観察さ
れる部分的発育を減らすため、抗菌感受性試験培地中に
分解した馬血液を含めることが普通に実施されるように
なった。

更に最近になって、この方法はトリメトプリムに関する
試験において同様に有効であることもまた示された〔ブ
ツシュバイ、Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ Ｍｅｄ 、
Ｊ 、 （１９６９）４５：１０；およびダーレル（Ｄ
ａｒｒｅｌ ｌ ）等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｐａｔｈ、（１９６８）２１ ：２０２〕。

ハーバ−とコーストンはａ）分解した馬血液が全血より
もスルホンアミド−培抗物質を中和するのに有効である
、ｂ）幾つかの他の種の血液は不活性である、Ｃ）分解
物の活性はインキュベーション時間および温度（３０°
まで）と共に増加する、ｄ）分解物はｐ−アミノ安息香
酸によるスルホンアミド阻止の逆転に影響しないことを
確立した。

彼等は分解した血液がスルホンアミド拮抗物質を中和す
る因子を含むと結論した。

・このいわゆるバーパー−コーストン因子は中程度の濃
度、即ち約０．１ないし１５μ９／７ｒＬｌのチミジン
を含有する培地についてのみ有効である。

０．１μｇ／１ｒＬｌ以下では、この薬剤の活性は拮抗
されず、従ってこのような少量のチミジンはそれを取去
っても観察される薬物阻害に影響を持たない。

非常に高濃度、即ち１５μ９／７ｄ！より犬、のチミジ
ンでは、バーパー−コーストン因子の活性がスルホンア
ミドおよびトリメトプリムの活性の逆転を克服するのに
十分でない。

これは多分チミジンの開裂の結果として生成する高濃度
のチミンが、はるかに活性の大きいチミジンを逆転にお
いて置き換えうるためであろう。

バーパー−コーストン因子はチミジンホスホリラーゼで
あることが報告された〔ブツシュバイ、細菌感染におけ
るトリメトプリム／スルファメトキサゾール：ウェルカ
ム・ファウンデーション・シンポジウム。

ペンシュタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）＆ソールター（
５ａｌｔｅｒ ）編、チャーチル リビンストン、エデ
インバーグ＆ロンドン、１９７３．３１−３８頁、およ
びブツシュバイ、Ｍｅｄ、Ｊ。

Ａｕ５ｔ 、５ｐｅｃｉａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
、、 １９７３．１：１０−１８］。

後者の引用文献において、「チミジンはＴＭＰ／ＳＭＸ
の容器内活性を妨害するとはいっても、それが容器内活
性に影響する程十分（こ高濃度で動物に普通存在するの
ではない」ことが指摘された。

分解した馬血液を培地に含めることの−っの欠点は、そ
れが培地に赤味がかった褐色を付与することであって、
馬血液の量が多い程色が深くなる。

この着色は、それがインキュベーション後細菌発育の帰
属を著しく妨げるので望ましくない。

例えば、液体培地の場合、増加した色が培地の透明度を
下げ光学密度測定を非常に不正確（こする。

固体培地の場合Ｃ１こは、寒天のコントラストの減少が
あり、阻止帯寸法を精密に測ることを一層困難にし、ま
た阻止帯内の不完全発育の有無を決定することを困難に
する。

その上、細菌培地への分解馬血液の添加という必要条件
は、その培地が実質的に定義不可能であることを意味し
、これは幾分か望ましくない性質である。

馬血液を使用することのもう一つの欠点は、それが世界
中で非常に限られた供給量でかつ非常（こ極く少数の供
給者から市販されていることである。

細菌由来の単離され精製された酵素チミジンホスホリラ
ーゼを種々様々な常用の発育培地へ添加すると、抗葉酸
剤に対する細菌の感受性試験用培地が改良されることが
最近発見された。

本発明の一つの方向は細菌発育培地およびそれと組み合
わせた細菌由来の精製チミジンホスホリラーゼからなる
、抗葉酸剤に対する細菌の感受性試験用組成物を提供す
るものである。

酵素チミジンホスホリラーゼの添加は、抗葉酸剤、例え
ばスルファメトキサゾールおよびトリノドブリムに対す
る細菌の感受性を試験するための多くの培地、例えばミ
ューラーーヒントンブイヨンおよび寒天、オキソイド・
センシテイビテイー・テストブイヨンおよび寒天、ウェ
ルコテスト・センシテイビテイー・テスト寒天、プレイ
ン・ハト・インフュージョンブイヨンおよび寒天、およ
びペプトン・ツヤ寒天を改善する。

チミジンホスホリラーゼはサルモネラ チフイムリウム
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
、バチルス セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅ
ｕｓ ） 、バチルス ステアロテルモフィルス（Ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍ。

ｐｈｉｌｕｓ）およびヘモフィルス インフルエンザエ
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）
といった細菌から、そして特に発育のためにチミンおよ
びメチオニンを要求する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ １ｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）の株から以前には精製されていた。

この後者の精製は沈殿、分別、幾つかのクロマトグラフ
ィ一工程および透析からなる極端に長い過程を含む〔シ
ュワルツ（５ｃｈｖｖａｒ ｔｚ ） ｐ Ｍｌｌ ９
７１、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２１ ： １９
１−１９８ ）。

しかしこの方法から採取される酵素製剤は粗製細胞抽出
物よりわずか２５倍純粋であるに過ぎない。

幾つかの細菌株、特に大腸菌のある株は適当な発育条件
下で極端に多量のチミジンホスホラーゼを生産すること
、ならびにこの酵素を、これまでに行なわれていたより
もはるかに純粋な製剤が高収量で得られるように細胞抽
出物を特別な吸着剤に加えそれを吸着剤から溶離するこ
とによって、単離し精製できることが最近発見された。

更にこの新しい単離／精製法は酵素の大規膜生産に適合
できる。

本発明の第二の方向は、粗製酵素を細菌から水性媒質中
に抽出し、そして吸着工程、クロマトグラフィ一工程お
よび透析工程を含む分別処理に該抽出物をかけることか
らなる、細菌由来の精製チミジンホスホリラーゼの製造
法を提供するものである。

この方法は、１）適当な発育条件下で高濃度のチミジン
ホスホリラーゼを生産する能力を有する菌株を選び、２
）これから得られた粗製細胞抽出物を実質的に等量のＣ
ａＨとＰＯ４：とを含むリン酸カルシウムゲル吸収剤へ
、なるへくは精製の最初の工程として、加えることを特
徴とする。

溶離剤をその後ＤＥＡＥセルロースおよび（または）セ
ルロースーエピクロルヒドリントリエタノルアミン（Ｅ
ＣＴＥＯＬＡ−セルロース）と接触させ、ＤＥＡＥ−セ
ルロースからの溶離後そしてＥＣＴＥＯＬＡ−セルロー
スへの吸着前に、水または適当な緩衝剤に対する透析を
行なうのがよい０ 大腸菌Ｂ−９６（ＡＴＣＣ１３４７３）は本発明の目的
に対して著しく有利である。

サルモネラチフイムリウム ＬＴ−２ＡＴＣＣ１５２７
７）は大量のチミジンホスホリラーゼを産生ずる細菌の
他の株の一例であり、従って本発明の実施に有用である
。

もつと熱に安定な酵素が望ましいある場合Ｑこは、Ｂ、
ステアロテルモフィルスから単離された酵素が有効であ
ることが証明された。

大腸菌株 ＡＴＣＣ１３４７３は適烏な炭素源と追加の
プリン類を含む最少基壇地中で培養できる。

他方、この細菌は酵母エキス培地Ｇこおいても培養でき
る。

次に酵素の粗製抽出物は、細菌の細胞をリン酸塩緩衝液
中で音波処理し続いて細胞砕片を遠心で除去することに
よりつくられる。

この粗製抽出物を、例えば少量のリン酸カルシウムゲル
と混合してから遠心して不要のタンパク質を除去する。

このようにして得た上澄を次に別の部分のリン酸カルシ
ウムゲルと混合してこれへ酵素を吸着させる。

酵素活性はリン酸緩衝液での順次洗浄によりゲルから溶
離できる。

次に酵素をＤＥＡＥ−セルロースに吸着させ、洗浄し、
そこから溶離する。

透析後、調製物をＥＣＴＥＯＬＡセルロースに吸着させ
そこから溶離する。

精製のあらゆる段階において、酵素活性についての溶離
液の検査は選ばれた波長で分光光度法による検定を用い
て便利に行なわれる。

このようにして精製した酵素は硫酸アンモニウム水溶液
中のけん濁液として便利に入手できるようになしうる。

この酵素は幾つかのを椎動物組織中（こも存在し、それ
から精製することができるが、哺乳動物組織中の濃度は
一般に細菌におけるよりはるかに低い。

更（こまた精製された微生物チミジンホスホラーは精製
された哺乳動物の対応量より何倍も活性が大きい。

事実馬の血液は１ＴＬｌにつき約４０ないし１００単位
のチミジンホスホリラーゼ活性（ここで定義した通り）
を含むことが見出されている。

実施例１の大腸菌音波処理品はこの濃度の１０００倍よ
り多くを含有する。

このようにして、細菌源から精製酵素を調製する経済的
方法の利点は多くかつ重要である。

酵素の一層入手容易な安価な給源であるばかりでなく、
酵素を抽出し精製する方法がはるかに経済的である。

培地に添加されるチミジンホスホリラーゼの濃度は、培
地１ｒｒＬｌ当り酵素活性約２ないし２００単位の範囲
内がよく、５ないし１００単位／ｙｄの方が一層好まし
く、そして７ないし５０単位／ｍｌが最もよい。

精製酵素の酵素活性１単位は、２５°Ｃｐ Ｈ７，４に
おいて２００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液の存在下にチ
ミジンの１ミリモル溶液からチミン１ナノモル分の生成
を触媒する酵素量である。

精製チミジンホスホリラーゼが添加された培地は各種の
生物、例えばストレプトコッカス ピオゲネス（５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ） 、黄
色ブドウ球菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓ ）、ビブリオ コンマ（Ｖｉｂｒ ｉｏ
ｃｏｍｍａ ）、エリシペロトリクス ルシオパチアエ
（Ｅｒｙｓ ｉｐｅ １ｏｔｈｒ １ｘｒｈｕｓｉｏｐ
ａｔｈｉａｅ ）、セラチア マルセセンス（５ｅｒｒ
ａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ）、クレブシエラプ
ノイモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）、Ｋｌｅｂ、エロゲネス（ａｅｒｏｇｅｎｅ
ｓ ）、Ｓａｌ、チホサ（ｔｙｐｈｏｓａ ） 、大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、シゲラ フレクスネリ（Ｓｈｉｇ
ｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ）、Ｓｈｉｇ、ダイセ
ンテリアエ（ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ ）、エンテロバ
クタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）エロゲネス、Ｅ
ｎｔｅｒｏ 、クロアカニＬ （ｃｌｏａｃａｅ ）
、チトロバクター フロインシイ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒｆｒｅｕｎｄｉ ｉ ） 、プロテウス ブルガリ
ス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ）、Ｐｒ
、ミラビレス（ｍ１ｒａｂｉｌｅｓ ）、Ｐｒ、レット
ゲ゛す（ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の抗葉酸剤２
こ対する感受性を試験するのに適している。

５ｔｒｅｐ、ファエカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ ）は著
しい例外である。

それはこの生物の場合、葉酸レダクターゼの阻害剤、例
えばトリメトプリムの活性を実質的に逆転させることに
おいてチミンがチミジンと同じ位有効だからである。

精製酵素は所望の培地へ製造あるいは調製の適当などの
段階においても添加できる。

例えば、培地のオートクレーブ処理の後、温度が約５０
５５℃（こ下がったときに無菌溶液として無菌的に加え
ることができる。

酵素の添加後は、酵素の不活性化を最小にするために、
酵素処理培地を約５１０分間より長＜５０−５５℃に保
たないように、可能な限りす早く培地を処理すべきであ
る。

本発明の第三の方向は、細菌由来のチミジンホスホリラ
ーゼの精製された調製物と細菌発育培地との混合からな
る、細菌の抗葉酸剤に対する感受性を試験するのに適し
た組成物の製造法を提供するものである。

このように製造された組成物の一つの特別な利点はそれ
が淡色かつ透明であることであって、このことは抗葉酸
剤に対する細菌の感受性の測定において、細菌の発育の
正確な評価を容易にするのである。

細菌由来のチミジンホスホリラーゼは一２０’Ｃで安定
であるが、４℃においては活性が有意な速度で減少する
ことが従来知られている。

調製品のタンパク質含量が少なくともタンパク質５ ｒ
ｎ９／ｒｒｔｌであるという条件で、調製品へ硫酸アン
モニウムを添加することにより、精製酵素組成物を分解
に対して著しく安定になしうろことがここに発見された
。

このタンパク質含量は必ずしもすべてが酵素から成る必
要はない。

例えば、１０％の硫酸アンモニウムを含むリン酸塩緩衝
液中の酵素の濃厚溶液（タンパク質５■／縦以上）は、
活性を殆どあるいは全く失なうことなく長期間にわたり
貯蔵できる。

硫酸アンモニウム水溶液中のチミジンホスホリラーゼの
安定なけん濁液もつくることができる。

次の実施例Ｏこより本発明を説明するが、本発明は如何
なる仕方においてもこれらによって制限されることはな
い。

実施例 １ チミジンホスホリラーゼの精製 Ｎａ２ＨＰ０４（１８，９ｆ／ｌ ）、ＫＨ２ＰＯ４（
６，３ｆ／ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，１０（０，２ｐ／
７り、（ＮＨ４）２ＳＯ４（２，Ｏｆ／１３）、アデノ
シン（０，５９／ｉｔ ） 、およびカサミノ酸（ｓ、
ｏ ｙ／Ａ）を含む最少基壇地中３４℃において大腸
菌Ｂ−９６（ＡＴＣＣ１３４７３）を通気した容器内で
発育させる。

６００ ｎｍにおける培地の光学密度（希釈せずに）が
２．０に達したとき細胞を遠心により採取する。

次の操作は特に断らない限り３°Ｃで行なわれる。

細胞ペースト（２５ｐ）をその重量の２倍の５ｍＭ’Ｊ
ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，０（緩衝液Ａ）中にけん
濁する。

この細胞浮遊液を５ｒｒＬｌずつ、各５０秒の冷却時間
をおいて１２秒ずつ２回音波処理する。

ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ ）モデル５１２５音波発
振器を出力セット６で用いる。

音波処理液をためておき、４８．０００ｘｇで２０分間
遠心する。

その上澄（段階Ｉ−後の表Ｉを見よ）へ２５ＴＬｌのリ
ン酸カルシウム ゲルけん濁液（乾燥固形物３１■／縦
、３℃で５箇月間熟成）をゆつより加える。

得られたけん濁液を１０分間かきまぜ、次に１２．００
０×ダで５分間遠心する。

その上澄を更に１００ＴＬｌの該リン酸カルシウム ゲ
ル けん濁液と混合し、混合物を１０分間かきまぜ、９
．７００ｘｐで１５分間遠心する。

この結果得られたゲルペレットを緩衝液Ａ（１０（７）
を用いて、再けん濁および９．７００ｘｇで１５分間の
遠心により洗浄する。

酵素活性をこのゲルペレットから２回の順次洗浄、即ち
最初は１０ ｍＭ ’）ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，
０（１００ｍ１）を用い、２回目は２０ ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液、ｐＨ８，０（１００ｍｌ ）を用いての
洗浄により溶離する。

二つの洗液を合わせる（段階■）。

処理手順の残りは２５℃で行なう。

合わせた洗液２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６，４（緩
衝液Ｂ）であらかじめ平衡させたＤＥＡＥ−セルロース
カラム（直径１．８（ｍＸ高さ６ｃｒｆＬ）に加える。

仕込まれたカラムを緩衝液Ｂ（１００ｒｒＬｌ）で洗浄
し、次に酵素をリン酸塩緩衝液の直線状勾配を用いて溶
離する。

この勾配は２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，
４（２００ｍＡりを緩衝液Ｂ（２００ｍｌ）で最初に満
した混合室へ、該室内Ｏこ一定体積を保つような速度で
、充分よく混合しつつ加えることによりつくられる。

最高酵素活性を含むフラクションをためておき（段階■
）、セルロース透析管（直径１／４“）を使用して水（
２１）に対し１時間透析する。

透析をくり返し、次に透析物を緩衝液Ａであらかじめ平
衡させたＥＣＴＥＯＬＡ−セルロースカラム（１，８ｘ
５ｃｒｎ）Ｇｃ仕込む。

仕込まれたカラムを緩衝液Ａ（１００ｍので洗浄する。

２００ ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐ Ｈ８，０（２
００ｍ０をカラム溶液が進むにつれて重力によって移し
入れた最初に緩衝液Ａ（２００ｍｌ）で満した混合溜を
使用して上のようにして調製した直線状勾配溶離剤で酵
素を溶離する。

酵素活性を含むフラクションをためておき（段階■）、
８０％硫酸アンモニウム溶液中の酵素のけん濁液を得る
のに十分量の硫酸アンモニウムを加える。

この全部の処理の結果タンパク質に関してｉｏｏ倍の比
活性増加と実質的に完全な核酸除去が得られる。

チミジンホスホリラーゼ活性はチミジンからチミンへの
ホスホロリシスに伴なう２９０ ｎｍの吸収の減少を測
定することにより分光光度法で検定される。

２９０ ｎｍおよびｐＨ７，４においてチミジンはチミ
ンより高い吸光係数を有する（△ε＝−４８０Ｍ−ＩＣ
Ｉｎ−１） 、：（７）検定混合物ハ全体積２．５−中
に２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，４と１ｍ
Ｍチミジンを含む。

酵素活性の単位は２５℃においてチミジンから１分間当
り１ナノモルのチミンの生成を触媒する量である。

表Ｉはこの実施例で述べた精製の結果を要約したもので
ある。

この手順を６０倍に規模拡大しても同様な結果が得られ
る。

実施例 ２ 固形培地 ミューラーーヒントン（Ｍｕｅ ｌ ｌｅ ｒ−Ｈｉ
ｎ ｔ ｏｎ）（ディフコ）寒天を常法によりつくり、
オートクレーブ処理する。

培地をオートクレーブから取り出し、５０−５５℃まで
放冷した後、培地１ｒＩｌｌにつき精製酵素４０単位の
最終濃度を得るのに十分量の酵素を含有する実施例１で
調製したような精製チミジンホスホリラーゼの無菌溶液
を無菌的に加える。

培地を十分に混合し、無菌ペトリ皿（こ注入し、室温ま
で放冷する。

実施例 ３ 感受性の試験 ミューラーーヒントン寒天（ウィルソン）およびプレイ
ン−ハートインフュージョン寒天（ディフコ）を常法で
調製し、オートクレーブ処理する（各３バツチ）。

オートクレーブから取り出した後、各培地の１バツチを
無菌ペトリ皿に注入する。

ネ各培地の他の２バツチは５５°Ｃまで放冷する。

次に、各々の１バツチへ５％の最終濃度を得るのに十分
な分解した馬血液を加え、各培地の最終バッチへ最終濃
度４０単位／ｍｌを得るのに十分なチミジンホスホリラ
ーゼの無菌溶液を加える。

各バッチを十分に混合し、次に無菌ペトリ皿に注ぎ込む
。

室温まで冷却後、各寒天平板を大腸菌の希釈した（１０
−’）−晩ブイヨン培養（ミューラーーヒントンブイヨ
ン）２ＴＬｌで接種する。

過剰の液体を除去し、平板を乾かす。

次に平板の表面上にＴＭＰｌ、２５■、ＴＭＰ １．
２５■＋ＳＭＸ ２３．７５■、およびＳＭＸ ２
３．７５■を含むｔ紙円板を置き、次にこれらを３７℃
で１６時間インキュベーションすると発育が完全には合
流していないローンを生ずる。

阻止帯を測定し、円板の端から未阻止コロニーの発育の
端までの距離として表示する。

表■はこの結果を要約したものである。

ミューラーーヒントン寒天は、分解した馬血液の添加に
よるとほぼ同程度まで細菌チミジンホスホリラーゼの添
加によって感受性試験に対し改善される。

しかしこの酵素は分解した馬血液よりも目立って効果的
にプレイン−ハートインフュージョン寒天を改善する。

その上、本発明方法によりつくられた実質的に無色の平
板は着色した馬血液平板よりはるかに容易にかつ迅速に
読まれ評価される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 細菌発育培地およびそれと組み合わせた細菌由来の
   精製チミジンホスホリラーゼからなる、抗葉酸剤に対す
   る細菌の感受性試験用組成物。 ２ 発育培地中のチミジンホスホリラーゼの濃度が培地
   １−につき酵素活性２ないし２００単位である特許請求
   の範囲第１項に記載の組成物。 ３ 濃度が５ないし１００単位／ＴＬｌである特許請求
   の範囲第２項に記載の組成物。 ４ 濃度が７ないし５０単位／ｍｌである特許請求の範
   囲第２項記載の組成物。 ５ チミジンホスホリラーゼを大腸菌株 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ｉ ）から得る
   特許請求の範囲第１項から第４項までの何れか一つに記
   載の組成物。 ６ 大腸菌株がＢ−９６（ＡＴＣＣ１３４７３）である
   特許請求の範囲第５項記載の組成物。 Ｔ 細菌発育培地がミューラー・ヒントンブイヨン、ミ
   ューラー・ヒントン寒天、オキソイド・センシテイビテ
   イー・テストブイヨン、オキソイドセンシティビテイー
   ・テスト寒天、ウェルコテスト・センシテイビテイー・
   テスト寒天、プレインハート・インフュージョンブイヨ
   ン、フレイン・ハート・インフュージョン寒天またはト
   リプトンツヤ寒天である特許請求の範囲第１項から第６
   項までの倒れか一つに記載の組成物。 ８ 細菌由来のチミジンホスホリラーゼの精製調製物と
   細菌発育培地とを混合することからなる、細菌発育培地
   およびそれと組合わせた細菌由来の精製チミジンホスホ
   リラーゼを含む抗葉酸剤４こ対する感受性試験用組成物
   の製造方法。 ９ 細菌発育培地およびそれと組合かせた細菌由来の精
   製チミジンホスホリラーゼを含む抗葉酸剤に対する細菌
   の感受性試験用組成物に細菌を接種し、細菌を増殖させ
   、この細菌培養物上に抗葉酸剤を含む沢紙ディスクを置
   き、この培養物を更（こインキュベートすることからな
   る、抗葉酸抗微生物剤（こ対する細菌の感受性を試験す
   る方法。