JPS58170478A - 安定化されたチミジンホスホリラ−ゼ調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は安定化されたチミジンホスホリラーゼ調製物、
特にスルファメトキサゾール（８Ｍりおよびトリメトプ
リム（ＴＭＰ）ま九紘その何れかのような抗葉酸抗微生
物剤に対する細菌の感受性試験に使用される培地に使用
できる硫酸アンモニウムを含む安定化され九チξジンホ
スホリラーゼ製剤を提供するものである。安定性を増し
たこの組成物は硫酸アンモニウム溶液中の酵素のけん濁
液である。

細菌由来のチミジンホスホリラーゼは一２０℃で安定で
あるが、４℃においては活性が有意な速度で減少するこ
とが従来知られている。−製品のタンパク質含量が少な
くともタンパク質５ＩＩ９／Ｍｌであるという条件で、
調製品へ硫酸アンモニウムを添加することによシ、精製
酵素組成物を分解に対して著しく安定になしうることか
ここに発見された。このタンパク質含量は必ずしもすべ
てが酵素から成る必要はない。例えば、１０チの硫酸ア
ンモニウムを含むリン酸塩緩衝液中の酵素の濃厚浴液（
タンパク質５ｍｇ／ｉ４１以上）は、活性を殆どあるい
は全く失なうことなく長期間にわたシ貯蔵できる。硫酸
アンモニウム水溶液中のチミジンホスホリラーゼの安定
なけん濁液もつくることができる。

常用される培地がスルホンアミドまたはトリメトプリム
、即ち細菌における葉酸合成を阻害する桑剤、に対する
これら生物の感受性を測定するためにはしばしば不適当
であることは多年の間知られている。この不適当さは、
連続希釈法を用いたとき長く尾を引く終点を与えること
によって、また拡散法を用いたとき阻止帯内の不完全発
育によって現われる。チミジンがスルホンアミドおよび
トリメトプリムの阻止活性の非常に強力な逆転剤である
ことが、ブツシュパイ（Ｂｕａｈｂｙ　）　（Ｍａｄ。

Ｊ、ムｕ＠ｔ、　５ｐｅｃｉａｌ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ
ｔ　（１９７５）　１　：１０〕ならびにコツホ（Ｋｏ
ｃｈ　）およびパーチオール（Ｂｕｒｃｈａｌｌ　）　
［ムｐｐｌｉｓｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７
１）２２：８１２）によシ示された。

１９４５４−パー（Ｈａｒｐｅｒ　）およびコース）　
　ｙ　　（Ｃｏｗｓｔ、ｏｎ　　）　　（Ｊ、　　Ｐａ
ｔｈ、　　Ｂａａｔ、、　　５　７　　：　　５　９　
）は分解した（　１ｙｓｅｃｌ　）馬血液をわるい感受
性試験培地へ添加したとき、それを申し分のない培地に
変換できることを示した。この初期の研究および数人の
他の研究者の研究以来、スルホンアミドによって生ずる
阻止帯内にしばしば観察される部分的発育を減らすため
、抗菌感受性試験培地中に分解した馬血液を含めること
砂普通に実施されるようになった。更に最近になって、
この方法はトリメトプリムに関する試験において同様に
有効であることもまた示された〔ブツシュバイ、（１９
６８）２１：２０２）。

ハーバ−とコーストンはａ）分解した馬血液が全＋ｆ＋
［りもスルホンアミド−拮抗物質を中和するのに有効で
ある。ｂ）幾つかの他の種の血液は不活性である、Ｃ）
分解物の活性はインキュベーション時間および温度（６
０°まで）と共に増加する、ｄ）分解物はｐ−アミノ安
息香酸によるスルホンアミド阻止の逆転に影響しないこ
とを確立した。彼等は分解した血液がスルホンアミド拮
抗物質を中和する因子を含むと結論した。

このいわゆるパーパー−コーストン因子は中程度の濃度
、即ち約０．１ないし１５μｇ／ｌｄのチミジンを含有
する培地についてのみ有効である。

０．１μｙ／ａｔ以下では、この薬剤の活性は拮抗され
ず、従ってこのような少量のチミジンはそれを取去って
も観察される薬物阻害に影響を持たない。

非常に高濃度、却ち１５μｇ／　ｙｄよｐ大、のチミジ
ンでは、バーパー−コーストン因子の活性がスルホンア
ミドおＬびトリメトプリムの活性の逆転を克服するのに
十分でない。これは多分チミジンの開裂の結果として生
成する高濃度のチミンが、はるかに活性の大きいチミジ
ンを逆転において置き換えうるためであろう。

バーパー−コーストン因子はチミジンホスホリラーゼで
あることが報告された〔ブツシュパイ、細菌感染におけ
るトリメトプリム／スルファメトキサゾール：ウェルカ
ム・ファウンデーション・シンポジウム。ペンシュタイ
ン（Ｂ＠ｒｎｓｔｅｉｎ　）　＆ソールター（５ａｌｔ
ｅｒ　）編、チャーチル　リピンストン、エデイツバー
ク＆ロンドン、１９７３．３１−り８頁、およびブツシ
ュバイ、Ｍｅｃｌ、　Ｊ。

Ａｕａｔ、　５ｐｅｃｉａｌ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　
、　　１９７３．１：１Ｏ−１８）。後者の引用文献に
おいて、［チミジンはＴ　Ｍ　Ｐ　／　８　Ｍ　Ｋの容
器内活性を妨害するとはいっても、それが容器内活性に
影響する程十分に高濃度で動物に普通存在するのではな
い」ことが指摘された。

分解した馬血液を培地に含めることの一つの欠点は、そ
れが培地に赤味がかった褐色を付与することであって、
馬血液の量が多い程色が深くなる。

この着色は、それがインキュペーンヨン後細菌発育の帰
属を著しく妨げるので望ましくない。例えば、液体培地
の場合、増加した色が培地の透明度を下げ光学密度測定
を非常に不正確にする。固体培地の場合には、寒天のコ
ントラストの減少があり、阻止帯寸法をＮＩ密に測るこ
とを一層困難にし、また阻止帯内の不完全発育の有無を
決定することを困難にする。その上、細菌培地への分解
馬血液の添加という必要条件は、その培地が実質的に定
義不ａＪ能であることを意味し、これは幾分か望ましく
ない性質でめる。馬血液を使用することのもう一つの欠
点は、それが世界中で非常に限られた供給蓋でかつ非常
に極く少数の供給者から市販されていることである。

細菌由来の単離され精製された酵素チミジンホスホリラ
ーゼを種々様々な常用の発育培地に添加すると、抗薬酸
剤に対する細菌の感受性試験用培地が改良されることが
最近発見された。

この改良では細菌発育培地およびそれと組み合わせた細
菌由来の精製チミジンホスホリラーゼを含む、抗葉酸剤
に対する細菌の感受性試験用組成物を使用する。

酵素チミジンホスホリラーゼの添加は、抗葉酸剤、例え
ばスルファメトキサゾールおよびトリメトプリムに対す
る細菌の感受性を試験するだめの多くの培地、例えばミ
ューラーーヒントンブイヨンおよび寒天、オキソイド・
センシティぜティー・テストブイヨンおよび寒天、ウェ
ルコテスト・センシテイピティー・テスト寒天、！レイ
ン・ハート・インフュージョンブイヨンおよび寒天、お
よびペゾトン・ツヤ寒天を改善する。

チミジンホスホリラーゼはサルモネラ　チフイムリウム
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　）
、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕａ
　）、バチルス　ステ（）ｉａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１
ｎｆｌｕｅｎｓａａａ　）といった細菌から、そして特
に発育のためにチミンおよびメチオニンを要求する大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｌ　）の株から以
前には精製されていた。この後者の精製は沈殿、分別、
幾つかのクロマトグラフィ一工程および透析からなる極
端に長い過程を含む〔シュワルツ（８ｃｈｗａｒｌ　）
　、　Ｍ、　１９７１　、Ｂｕｒ、　Ｊ。

ＢｉｏｃＭｍ、　２１　：　１９１−１９８　）。しか
しこの方法から採取される酵素製剤は粗製細胞抽出物よ
りわずか２５倍純粋であるに過ぎない。

幾つかの細菌株、特に大腸菌のある株は適当な発育条件
下で極端に多量のチミジンホスホラーゼを生産すること
、ならびにこの酵素を、これまでに行なわれていたよシ
もはるかに純粋な製剤が高収菫で得られるように細胞抽
出物を特別な吸着剤に加えそれを吸着剤から溶離するこ
とによって、単離し精製できることが最近発見された。

更にこの新しい単離／精製法は酵素の大規模生産に適合
できる。

細菌由来の精製チミジンホスホリラーゼは粗製酵素を細
自から水性媒質中に抽出し、そして吸着工程、クロマト
グラフィ一工程および透析工程を含む分別処理に該抽出
物をかけることからなる方法により製造する。この方法
は、１）適当な発育条件下で高濃度のチミジンホスホリ
ラーゼを生産する能力を有する菌株を選び、２）これか
ら得られた粗製細胞抽出物を実質的に郷量のＯａ＋＋と
ＰＯ２：とを含むリン酸カルシウムデル吸収剤へ、なる
べくは精製の最初の工程として、加えることを特徴とす
る。溶離剤をその後ＤＢムＥセルロースおよび（または
）セルロース−エピクロルヒドリントリエタノールアミ
ン（ＩＣ！ＴＥＯＬム−セルロース）と接触させ、Ｄ］
ＩｃＡＫ−セルロースがらの溶離後そしてＫＯＴＪＵＯ
Ｌム−セルロースへの吸着前に、水または適当な緩衝剤
に対する透析を行なうのがよい。

大腸菌Ｂ−９６（ＡＴＯＯ１３４７３）はこの目的に対
して著しく有利である。サルモネラテフイムリｌ；Ｆム
ＬＴ−２ＡＴＯＯ１５２７７）は大量のチミジンホスホ
リラーゼを産生ずる細微の他の株の一例であシ、従って
実施に有用である。もっと熱に安定な酵素が望ましいあ
る場合には、Ｂ。

ステアロテルモフィルスから単離された酵素が有効であ
ることが証明された。

大腸菌株ＡＴＯＯ１３４７３は適当な炭素源と追加のプ
リン類を含む最少基壇地中で培養できる。

他方、この細菌は酵母エキス培地においても培養できる
。次に酵素の粗製抽出物は、細菌の細胞をリン酸塩緩衝
液中で音波処理し続いて細胞砕片を遠心で除去すること
によりつくられる。

この粗製抽出物を、例えば少量のリン酸カルシウムデル
と混合してから遠心して不要のタンパク實を除去する。

このようにして得た上澄を次に別の部分のリン酸カルシ
ウムデルと混合してこれへｒ＃＊を吸着させる。酵素活
性はリン酸緩衝液での１−次胱浄によりデルから溶離で
きる。次に酵素をＤＥＡｌｆｌ−セルロースに吸着させ
、洗浄し、そこから溶離する。透析後、調製物をｆｆ１
ＯＴＫＯＬＡ−セルロースに吸着させそこから溶離する
。

精製のあらゆる段階において、酵素活性についての溶離
液の検査は選ばれた波長で分光光度法による検定を用い
て便利に行なわれる。

このようにして精製した酵素は硫酸アンモニウム水溶液
中、のけん濁液として便利に入手できるようになしうる
。

この酵素は幾つかのを椎動物組織中にも存在し、それか
ら精製することができるが、哺乳動物組織中の濃度は一
般に細菌におけるよりはるかに低い。

更にまた精製された微生物チミジンホスホリラーゼは精
製された哺乳動物の対応品より伺倍も活性が大きい。

事実馬の血液は１１Ｌ！につき約４０ないし１００単位
のチミジンホスホリラーゼ活性（とこで定義した通シ）
を含むことが見出されている。実施例１の大腸菌音波処
理□品はこの濃度の１０００倍より多くを含有する。こ
のようにして、細菌源から精製酵素を調製する経済的方
法の利点は多くかつ重要である酵素の一層入手、容易な
安価な給源であ□ るばか９でなく、酵素を抽出し精製する方法がはるかに
経済的である。

培地に添加されるチミジンホスホリラーゼの濃度は、培
地１ゴ当り酵素活性的２ないし２００単位の範囲内がよ
く、５ないし１００単誼／１１Ｌｌの方が一層好ましく
、そして７ないし５０単位／ｗＬｌが蛙もよい。精製酵
素の酵素活性１単位は、２５℃ｐ）１７．４において２
００　ｍＭのリン酸カリウム緩衝液の存在下にチミジン
の１ミリモル溶液からチミン１ナノモル分の生成を触媒
する酵素量である。

精製チミジンホスホリラーゼが添加された培地は各種の
生物、例えばストレプトコッカス　Ｑ（Ｋｎｔｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ　）−ｒ−口ｒネス、Ｉｎｔ＠ｒｏ、クロア
葉酸剤に対する感受性を試験するのに適している。

５ｔｒｅｐ、ファエカリス（ｆａ＠ｃａｌｉｓ　）は著
しい例外である。それはこの生物の場合、葉酸レダクタ
ーゼの阻害剤、例えばトリメトプリムの活性を実質的に
逆転させることにおいてチミンがチミジンと同じ位有効
だからである。

精製酵素は所望の培地へ製造あるいは調製の適当などの
段階においても添加できる。例えば、′培地のオートク
レーブ処理の後、温度が約５０−５５℃に下がったとき
に無菌溶液として無菌的に加えることができる。酵素の
添加後は、酵素の不活性化を最小にするために、酵素処
理培地を約５−１０分間よシ長＜５０−５５℃に保たな
いように、可能な限シす早く培地を処理すべきである。

細菌由来のチミジンホスホリラーゼの精製された調製物
と細菌発育培地とを混合することにより、細菌の抗′１
＃酸剤に対する感受性を試験するのに適した組成物が得
られる。

このように製造された組成物の一つの特別な利点はそれ
が淡色かつ透明であることであって、このことは抗薬酸
剤に対する細菌の感受性の測定において、細−の発育の
正確な評価を容易にするのである。

次の実施例により本発明を説明するが、本発明は如伺な
る仕方においてもこれらによって制限されることはない
。

実施例１ チミジンホスホリラーゼの精製 Ｎａ２ＨＰＯ４（１８，９１／　ｌ　）、ＫＨ２ＰＯ４
（６−３ｉ／ｌ）、ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ（０，２ｇ
／　ｌ　）、（Ｍｎ２）１１８０４　（２，０１／ｌ　
）、アデノシン（０，５９／ｌ　）、およびカサミノ＃
（８，ＯＮ／Ｊ）を含む妓少基壇地中６４℃において大
腸菌Ｂ−９６（ムＴｏ。

１３４７３　）を通気した容器内で発育させる。

６００　ｎｍにおける培地の光学密度（希釈せずに）が
２．０に達したとき細胞を遠心により採取する。

次の操作は特に断らない限り６℃で行なわれる。

細胞ペース）（２５ｇ）をその重量の２倍の５　ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，０（緩衝液Ａ）中にけん
濁する。この細胞浮遊液を５ｄずつ、各５０秒の冷却時
間をおいて１２秒ずつ２回音波処理する。デランソｙ　
（Ｂｒａｎ８０ｎ　）モデル５１２５音波発振器を出力
セット６で用いる。音波処理液をためておき、４８，０
００）ｌで２０分間遠心する。

その上澄（段階■−後の表Ｉを見よ）へ２５１／のリン
酸カルシウム　ｒルけん濁液（乾燥固形物３１ｗ／ｄ、
３℃で５箇月間熟成）をゆつく９加える。得られたけん
濁液を１０分間かきまぜ、次に１２，０００Ｘ＃で５分
間遠心する。その上澄を更に１００ｄの該リン酸カルシ
ウム　ｒルけん濁液と混合し、混合物を１０分間かきま
ぜ、９，７００×ｇで１５分間遠心する。この姑果得ら
れたｒルペレットを緩衝液ム（１００１１／）を用いて
、再けん濁および９，７００　Ｘ　＃で１５分間の遠心
によυ洗浄する。

酵素活性をこのｒルペレットから２回の順次洗浄、即ち
妓初はＩ　Ｑ　ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，
０（１００ＷＬりを用い、２回目は２ＱｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液、４８．０　（１００ＩＬ／）を用いての洗
浄により溶離する。二つの洗液を合わせる（段階■）。

処理千１−の残りは２５℃で行なう。合わせた洗液を２
　Ｑ　ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６，４ｃ緩衝液Ｂ）で
あらかじめ平衡させたＤＫＡＥ−セルロースカラム（直
径１．８ｃｙＸ高さ６ｃＩＲ）に加える。仕込まれたカ
ラムを緩衝液Ｂ（１００＋ｗ／）で洗浄し、次に＃３ｋ
をリン酸塩緩衝液の直線状勾配を用いて溶離する。この
勾配は２００　ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐ　６．４
　（２００ゴ）を緩衝液Ｂ（２００１１／）で峡初に満
した混合室へ、該室内に一定体積を保つような速度で、
充分よく混合しつつ加えることによりつくられる。液高
酵素活性を含むフラクションをためておき（段階■）、
セルロース透析管（直径１７４ｎ）を使用して水（２１
）に対し１時間透析する。透析をくり返し、次に透析物
を緩衝液ムであらかじめ平衡させたＫＯＴＫＯＬム−セ
ルロースカラム（１，８ｘ　５（１！ＩＩ　）に仕込む
。仕込まれたカラムを緩衝液ム（１００１１／）で洗浄
する。２０〇−リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，０（２
００ｉｕ）をカラム溶液が進むにつれて重力によって移
し入れた最初に緩衝液Ａ　（２’００　ｄ　）で満した
混合溜を使用して上のようにして調製した直線状勾配溶
離剤で酵素を溶離する。酵素活性を含むフラクションを
ためておき（段階ＩＶ）、８０チ硫酸アンモニウム溶液
中の酵素のけん濁液を得るのに十分量の硫酸アンモニウ
ムを加える。この全部の処理の結果タンパク質に関して
１００倍の比活性増加と実質的に完全な核酸除去が得ら
れる。

チミジンホスホリラーゼ活性はチミジンからチミンへの
ホスホロリンスに伴なう２９０　ｎｍの吸収の減少を測
定することによシ分光光度法で検定される。２９０　ｎ
ｍおよびｐＨ７，４においてチミジンはチミンよυ高い
吸光係数を有する　（△１−−４８０Ｍ−１ｃｍ＋−１
）この検定混合物は全体積２．５ｍ／中に２００　ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液、−７，４と１　ｍＭチミジンを
含む。酵素活性の単位は２５℃においてチミジンから１
分間当９１ナノモルのチミンの生成を触媒する量である
。

表■はこの実施例で述べた精製の結果を要約したもので
ある。この手順を６０倍に規模拡大しても同様な結果が
得られる。

参考例１ 固形培地 ミューラーーヒントｙ　（Ｍｕｒｌｌｅｒ　−Ｈｌｎｔ
ｏｎ　）（ディフコ）寒天を常法にょシっ〈シ、オート
クレーブ処理する。培地をオートクレーブから取シ出し
、５０−５５℃まで放冷した後、培地１１１！につき精
製酵素４０単位の最終濃度を得るのに十分量の酵素を含
有する実施例１で調製したような精製チミジンホスホリ
ラーゼの無菌溶液を無菌的に加える。培地を十分に混合
し、無菌ぺ）　１７皿に注入し、室温まで放冷する。

参考例２ 感受性の試験 ミューラーーヒントン寒天（ウィルソ／）およびプレイ
ン−ハートインフュージョン寒天（ディフコ）を常法で
調製し、オートクレーブ処理する（各６パツチ）。オー
トクレーブから取９出した後、各培地の１バツチを無菌
ぺ）　１７皿に注入する。

各培地の他の２バツチは５５℃まで放冷する。次ニ、各
々の１バツチへ５Ｔｏの最終濃度を得るのに十分な分解
した馬面液を加え、各培地の最終バッチへ最終濃度４０
単位１Ｉｌｌを得るのに十分なチミジンホスホリラーゼ
の無菌溶液を加える。各パッチを十分に混合し、次に無
菌ぺ）　１７皿に注ぎ込む。

室温まで冷却波、各寒天平板を大腸菌の希釈した（　１
０−４　）−晩ゾイヨン培養（ミューラーーヒントンブ
イヨン）２１／で接種する。過剰の液体を除去し、平板
を乾かす。次に平板の表面上にＴＭＰｌ、２５ＩＩ９、
ＴＭＰ　１．２　ｓａｖ＋８ＭＫ　　２３．７５１ｋｇ
、およびｓｗｘ　２３．７５■を含むＦ紙円版を置き、
次にこれらを３７℃で１６時間インキュベーションする
と発育が完全には合流していないローンを生ずる。阻止
帯を測定し、円板の端から未阻止コロニーの発育の端ま
での距離として表示する。表■はこの結果を要約したも
のである。

ミューラーーヒントン寒天は、分解した馬血液の添加に
よるのとほぼ同程度まで細菌チミジンホスホリラーゼの
添加によって感受性試験に対し改善される。しかしこの
酵素は分解した馬血液よシも目立って効果的にデレイン
ーノ・−トインフユージョン寒天を改善する。その上、
実質的に無色の平板は着色した馬血液平板よりはるかに
容易にかつ迅速に読まれ評価される。

代理人　浅　　村　　　皓 外之名

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　硫酸アンモニウムを含むリン酸塩緩衝液中に
   タンパク質少なくとも５　ＩＩｇ／Ｍｌを含む酵素の濃
   厚溶液からなる安定化されたチミジンホスホリラーゼ調
   製物。
2. （２）硫酸アンモニウムの濃度が約１０１である特許請
   求の範囲第１項に記載の調製物。