JPS582671B2 - コレステリンエステラ−ゼの製法 - Google Patents

コレステリンエステラ−ゼの製法

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JPS582671B2
JPS582671B2 JP55113074A JP11307480A JPS582671B2 JP S582671 B2 JPS582671 B2 JP S582671B2 JP 55113074 A JP55113074 A JP 55113074A JP 11307480 A JP11307480 A JP 11307480A JP S582671 B2 JPS582671 B2 JP S582671B2
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ヘルヴイヒ・ブルンナー
ミヒヤエル・ネルベツク
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物からコレステリンエステラーゼを得る方
法に関する。
コレステリンエステラーゼは、コレステリンの酵素的測
定が開発されて以来、臨床的及び生化学的分析で重要な
役割をはたしている。
生物学的物質中でのコレステリンの大部分は、エステル
の形で存在するから、コレステリンエステラーゼ及びコ
レステリンを酸化する酵素例えばコレステリンオキシダ
ーゼ又はコレステリンデヒドロゲナーゼの共用によりコ
レステリンエステル類の全合成測定が可能である。
このことは、西ドイツ特許第２２６４８４７号公報から
公知である。
この場合コレステリンエステラーゼ測定の領域で、微生
物からの酵素が特に好適であることが立証された（西ド
イツ特許出願公開第２５０６７／２．３号公報）。
しかしながら、従来発見された後処理に引き合うコレス
テリンエステラーゼを含有する微生物の欠点は、この際
に得られる酵素活性の比較的低い収率にある。
ところで、以外にも、特定の微生物を使用する際に従来
可能であったよりも数倍高い活性を得ることができるこ
とが判明した。
シュードモナス属の菌からコレステリンエステラーゼを
得るための本発明の方法は、シュードモナスｓｐ．Ｄｓ
Ｍ１２８０（微工研菌寄第５６７３号）又はＤＳＭ１２
８１（微工研菌第５６７４号）は適当な栄養，培地中で
誘導物質の存在下に培養し、酵素を培養液及び／又は細
胞から回収することよりなる。
西ドイツ特許出願公開第２５２７０６８号公報から、既
にこの属の菌株シュードモナス・フルオレセンス（ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａ５ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）が公
知であるが、これは、同様に後処理に役立つコレステリ
ンエステラーゼ含分を有する。
しかしながら、この場合も得られる活性単位は低く、屡
々低い単位／ｌで存在するのみである。
これに反して、本発明で使用される微生物を用いれば、
１５０００以上の単位／ｌの活性が得られる。
本発明の範囲では、誘導物質を有する栄養培地中で培養
する。
ここで誘導物質とは、誘導物質を用いない場合よりも多
量に所望酵素を形成するように微生物を刺激する物質で
ある。
有利に、使用誘導物質を炭素源殊に単一の炭素源として
使用するのが有利である。
しかしながら特別な炭素源例えばトウモロコシ源水、ペ
ブトン、酵母エキス並びに好適性は低いが糖又はポリア
ルコール並びにグリセリンも使用できる。
誘導物質としては、パルミチンエステル殊にトリバルミ
チンが好適であることが立証された。
しかしながら誘導体としてのレシチンの使用下に、最良
の結果が得られる。
種々のレシチンのうちで、大豆レシチン又は他のレシチ
ン例えば卵レシチン又は脳レシチンも非常に良好な結果
を生じたことが立証された。
使用誘導物質量は、ある程度まで使用誘導物質の種類に
依る。
これは一般に、栄養培地の量に対して約０．１〜５重量
係である。
誘導物質及び唯一の炭素源としてのレシチンの使用の際
には、０．５〜２重量係の量で特に良好な結果が得られ
た。
栄養培地は、更に通例添加される塩及び僅少量成分を含
有し、適当な緩衝液の添加により約５〜９特に６〜８の
ｐＨ値に調節することができる。
緩衝液としては燐酸塩緩衝液が有利である。
更に、栄養培地は燐酸塩緩衝液のアルカリイオンを別と
して、有利になおアンモニウムイオン、塩素イオン、Ｆ
ｅイオン、Ｃｕイオン、Ｚｎイオン、Ｍｇイオン及びＣ
ａイオンを含有する。
この場合燐酸塩はＱ．４〜２重量係の濃度が有利である
が、これより高い又は低い濃度も使用できる。
動物脂肪及び意想外にコレステリンエステルは、本発明
方法の領域で誘導物質としての利点は低い。
本発明の範囲で有利な培地は、液体１ｌに対して大体次
の組成を有する： Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０ ５〜１０ｇ特に６〜８ｇＫ
Ｈ２ＰＯ４ １〜５ｇ特に２〜４９ＮＨ，Ｃ
Ｉ ０．２〜２ｇ特に０．８〜１．２ｇＮ
ａＣ ｌ ０．０ １〜０．１ ｇ特
に０．３ 〜０．７ｇ１％ＦｅＣｌ３溶液 ０．０１〜
１ｍｌ Ｏ，２％ＣｕＣ１２溶液 ０． ０ １〜１ ｍｌ１％
硫酸亜鉛溶液 ０．０１〜１ｍｌ １０％ＣａＣｌ２溶液 ０１〜１０ｍｌ １２％ＭｇＳ０４溶液 １〜２０１ｒＬｌ特に３〜１０
ｍＡ！大豆レシチン ０．１〜５重量係特に０．５
〜２重量係 培養は好気性条件下で実施する。
振盪培養も通気液中培養も好適である。
温度は約１５〜４５゜Ｃであってよく、２５〜３５℃が
有利である。
最大酵素収率は一般に１〜２日の培養時間の後に得られ
る。
本発明で使用される微生物は非常に類似しており次の特
徴を有する： ダラム陰性 純好気性 肉ペブトン寒天上で黄色コロニー ２５，３０及び３７°Ｃで生長 １０°Ｃで、かつ４１℃以上で生長せず 細胞の大きさ０．８〜１μ・２〜４μ 運動性有鞭毛叢 連鎖形成傾向 無胞子又は持続期 チトクロームオキシダーゼ１ １ カタラーセ叫 インドールー 亜硝酸塩一 フオーケスーブ口スカウエルー ゼ゛ラチンー 単一基質一分解： アドニット＋ クエン酸塩十 ガラクトース士 グルコース＋ イノシット＋ ラクトース＋ マンニット＋ マンノース＋ サリシン＋ ソノレビ′ソト＋ コレステリンエステラーゼは培地中にも細胞中にも現わ
れる。
界面活性剤殊に有利にアルキル基もしくはアルアルキル
基を有するポリエチレンエステル及びトリエチレンエス
テルの型に属する非イオン性活性剤の添加により、培養
液と細胞との間の分配モデルに、細胞内活性を犠性にし
て細胞外活性を高める意味で影響を及ぼすことができ、
イオン性界面活性剤では逆の方向の分配の変化が進行す
る。
培養終了後にコレステリンエステラーゼは細胞物質及び
／又は培養濾液から常法で単離でき、場合によっては精
製できる。
しかしながら、多くの目的にとって、未精製粗生成物（
これは、主として閉じられた細胞物質のみよりなる）が
好適である。
溶解めため（ど−このために公知の方法が好適である。
培養液からも閉じた細胞物質からも、不溶成分の分離の
後に酵素を慣用の沈殿剤例えば塩、例えば硫酸アンモニ
ウム又は有機溶剤例えばアセトン又はアルコールを用い
る沈殿により沈殿させ、次いで慣用の分別法例えばクロ
マトグラフイー及び沈殿法を用いて更に精製する。
次に実施例につき本発明を説明する。
例１ 低温アンプルから傾斜試験管上に施こしたシュードモナ
ス・ｓｐｅｃ．ＤＳＭ １ ２ ８ ０を主培地中で
３０゜Ｃ１好気性（振動フラスコ）で２日間予備培養し
、次いで、■ｌ当り次の組成を有する培地中に１０％移
植する： Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０ ７ｇＫＨ
２Ｐ０４３ ．９ ＮＨ，ＣＩ ＩｇＮａＣ
ｌ ０．０５ｇ？ｅＣ
ｌ３（１％） ０． １ ｒｎｌＣｕ
Ｃｌ２（ １％） ０． １ 耐Ｚｎ
Ｓ０４（ １％） ０．１ＴＬｌＣａ
Ｃｌ２（１０％） １． Ｏ ｒｎｌＭ
ｇＳ０４（ １ ２％） ５． ｏ ｒ
ｕｉ犬豆レシチン（ｐＨ７．０） １．５係
培養は３０℃、好気性で振動フラスコ中で行なう。
１〜３日後に約１５０００Ｕ／ｌの活性（上澄み及びバ
イオマス、基質、コレステリルーオレート）が得られる
。
同じ条件下でシュードモナスｓｐｅｃ． ＤＳＭ１２８
０の代りにシュードモナスｓｐｅｃ． ＤＳＭ１２８１
を用いる際に、ほぼ同じ収率が得られる１例２ 例１で得た培養培液から、不溶の細胞物質を遠心分離し
コレステリンエステル測定に使用した。
測定は次の反応条件により行なった： コレステリン エステラーゼ゛ 工）コレステリンエステル＋Ｈ２０ コレステリン士脂肪酸 コレステリン オキシダーピ・／カタラーゼ ２）コレステリン＋１／２０ コレステノン＋Ｈ２０ （２４０ｎｍでコレステノン形成を測定）測定のために
次の溶液を使用する： ■）緩衝液０．５ Ｍ， ｐＨ７． ５、０．４チテサ
イト（ Ｔｈｅｓｉｔ ） ２）コレステリンオレート、（テサイトジオキサン中（
ｖ／ｖ＝１／１ ）Ｃ＝４ ） ３）Ｈ２０２約０． ６ Ｍ （ベルヒドロール５ ｍ
ｌ！／１００ｙｄ） ４）カタラーゼ（プロテイン０． Ｏ Ｉ Ｔｎ９／ｍ
ｌ）５）コレステリンオキシダーゼ（最低５０Ｕ／ｍｌ
６）培養液（約５０００Ｕ／ｌ １：５ Ｈ２０で稀釈
、０．０ １ｍｌ−＋テスト） 測定のために溶液１） ２． ９ ５ｍｌを溶液３）０
．０２ｍｌと混合する。
５分後に溶液６） ０．０１ ｍｌ及び溶液５） ０．
０ ２ ｍｌを添加し、１分後に、溶液２） ０．１ｍ
ｌの添加により反応を開始させた。
計算は次のように実施する：

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ シュードモナス属の微生物からコレステリンエステ
    ラーゼを製造する場合に、シュードモナスｓｐ． ＤＳ
    Ｍ １ ２ ８ ０又はＤＳＭ１２３１を適当な栄養培
    地中で誘導物質の存在下に培養し、この培養液及び／又
    は細胞から酵素を取得することを特徴とするコレステリ
    ンエステラーゼの製法。 ２ 誘導物質としてのレシチンの存在で培養する、特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 大豆レシチンを添加する、特許請求の範囲第２項記
    載の方法。 ４ レシチン０．５〜２重量係の存在で培養する、特許
    請求の範囲第２項又は第３項記載の方法。 ５ 培地に燐酸塩０．４〜２重量係を添加する、特許請
    求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。
JP55113074A 1979-08-20 1980-08-19 コレステリンエステラ−ゼの製法 Expired JPS582671B2 (ja)

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JPS5642586A JPS5642586A (en) 1981-04-20
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DE (2) DE2933648A1 (ja)
DK (1) DK148361C (ja)
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IL (1) IL60449A (ja)
ZA (1) ZA805072B (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3200274A1 (de) * 1982-01-07 1983-07-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur stabilisierung waessriger loesungen von cholesterinesterase aus pseudomonaden
DE3340950A1 (de) * 1983-11-11 1985-05-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur gewinnung von cholesterinesterase
US5219733A (en) * 1985-03-06 1993-06-15 Yoshikawa Oil & Fat Co., Ltd. Process for preparing fatty acid esters
WO2003061679A1 (en) * 2002-01-22 2003-07-31 Harris Dennis H M D Composition for blood sugar regulation

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS527483A (en) * 1975-07-03 1977-01-20 Nagase Sangyo Kk Prparation of cholesterol esterase
JPS55113075A (en) * 1979-02-23 1980-09-01 Nec Corp Fixing device

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2315501C3 (de) * 1973-03-28 1980-02-21 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
JPS50157588A (ja) * 1974-06-17 1975-12-19
US4052263A (en) * 1975-12-11 1977-10-04 Eastman Kodak Company Production of cholesterol esterase using Nocardia cholesterolicum

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS527483A (en) * 1975-07-03 1977-01-20 Nagase Sangyo Kk Prparation of cholesterol esterase
JPS55113075A (en) * 1979-02-23 1980-09-01 Nec Corp Fixing device

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Publication number Publication date
DE2933648A1 (de) 1981-03-26
DE3062041D1 (en) 1983-03-24
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IL60449A (en) 1983-05-15
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DK319080A (da) 1981-02-21
US4360596A (en) 1982-11-23
DK148361C (da) 1985-11-04
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ATE2548T1 (de) 1983-03-15

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