HU183202B - Process for preparing cholesterol esterase - Google Patents

Description

Λ találmány tárgya eljásás koKsztennészteiá?. elcállí sására mikroorganizmusok segítségével.

A koleszletinészteráz fontos szerepet játszik a klinikai és biokémiai analitikában, mióta eljárásokat dolgoztak ki koleszterin enzimatikus meghatározására Mivel a koleszterin nagy része észterek formájában fordul eíő biológiai anyagokban, koleszterinészteráz e's koleszterint oxidáló enzimek, például koleszterinoxidáz vagy koleszterindehidrogenáz, együttes használata lehetővé teszi koleszterin-észterek teljesen enzimatikus meghatározását is. Ez a 2 264 847 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásból ismert. Különösen alkalmasnak bizonyult a koleszterinészteráz-meghatározás keretein belül a mikroorganizmusokból származó enzim (25 06 712.3 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat). Az eddig felfedezett, feldolgozásra érdemes koleszterinészteráz-tartalommal rendelkező mikroorganizmusok hátránya azonban, hogy a kapott enzimaktívitás — kitermelés viszonylag alacsony.

Meglepő módon azt észleltük, hogy bizonyos mikroorganizmusok alkalmazásakor sokszorosan nagyobb akti vitást érhetünk el, mint ami addig lehetséges volt. A koleszterinészteráznak a Pseudomonas nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok alkalmazásával való előállítására szolgáló találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy Pseudomonas sp. DSM 1280 vagy DSM 1281 -et alkalmas táptalajon valamilyen induktor jelenlétében tenyésztünk, és az enzimet a fermentléből vagy/és a sejtekből kinyerjük.

A 25 27 068 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratból ismeretesek már a Pseudomonas fluorescens nemzetség olyan törzsei, amelyek szintén feldolgozásra érdemes mennyiségű koleszterinészterázt tartalmaznak. Azonban ezekben az esetekben is kevés a kinyerhető aktivitásmennyiség, többnyire csak néhány egység,'liter. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmusokkal 15 000 és még több egység/liter aktivitást érünk el.

A találmány szerinti eljárás során olyan táptalajon tenyésztünk, amely valamilyen induktort tartalmaz. „lnduktor”-on itt olyan anyagot értünk, amely a mikroorganizmust arra serkenti, hogy a kívánt enzimet nagyobb mennyiségben termelje, mint induktor nélkül. A hozzáadott induktort előnyösen szénforrásként is, különösen egyedüli szénforrásként alkalmazzuk. Eljárhatunk azonban ügy is, hogy külön szénforrásokat, például kukorica áztatóvizet, peptonokat, élesztőkivonatot, valamint kevésbé alkalmasan cukrokat vagy polialkoholokat, például glicerint adunk a táptalajhoz. Induktorként a palmitin-észterek — fó'leg a tripalmitin — bizonyultak igen megfelelőnek. A legjobb eredményeket azonban a lecitin induktorként való alkalmazásával értük el. Az alkalmazott különböző lecitinek közül különösen alkalmasnak bizonyult a szőjalecitin, de más lecitínféleségek például a tojáslecitin vagy agyvelőlecitin - is nagyon jó eredményeket adtak.

A hozzáadott induktormennyiség bizonyos fokig az alkalmazott induktor fajtájától függ, ez általában köiülbelül 0,1 és 5 súly% között van a táptalaj térfogatára számítva. Lecitinnek induktorként és egyedüli szénforrásként való alkalmazása esetén 0,5-2 sűly%-nyi mennyiségnél kapunk különösen jó eredményeket.

A táptalaj ezen túlmenően rendszerint még hozzáadott sókat és nyomelemeket is tartalmaz, és pH-ját alkalmas puffer hozzáadásával körülbelül 5 és9,e!őnyö2 sen 6 és 8 közé keli állítani. Pufféiként a foszfátpuffer előnyös. A táptalaj ezenkívül célszerűen még ammónium-, klorid-, vas-, réz-, cink-, magnézium- és kalciumionokat is tartalmaz, eltekintve a foszfátpuffer alkáliion_q jóitól. Foszfát célszerűen 0,4 és 2 súly% közötti koncentrációban van jelen, de nagyobb vagy kisebb koncentrá- j dóban is adható hozzá. j

Állati zsírok, és meglepő módon koleszterin-észterek , is, a találmány szerinti eljárásnál induktorként kevésbé ; 10 bizonyultak előnyösnek. j

Egy, a találmány szerinti eljárás során előnyösen j rlkalmazott táptalaj összetétele körülbelül a következő, · ϊ liter folyadékra számítva:

5— 10 g, előnyösen 6—8 g Na₂ HP0₄ · 2 H₂ O;

1-5 g, előnyösen 2-4 gKH₂PO₄;

0,2-2 g, előnyösen 0,8-1,2 gNH₄ Cl; ;

0,01-0,1 g, előnyösen 0,3-0,7 gNaCÍ;

0,01 — 1 ml 1 %-os FeCl₃ oldat; j

0,01 1 ml 0 2 %-os CuCl₂ oldat;

0,01—1 ml 1 %-os cink-szulfát oldat;

0,1—10 ml 10 %-os CaCl₂ oldat;

1-20 ml, előnyösen 3-10 ml 12 %-os MgS0₄ oldat; ; 0,1—5 súly%, előnyösen 0,5-2 súly% szőjalecitin.

A tenyésztést aerob körülmények között végezzük.,

Mind rázatott tenyészet, mind levegőztetett merített tenyészet megfelelő. A hőmérséklet körülbelül 15 és j 45 °C között lehet, előnyösen 25—35 °C. Általában már; 1—2 napos tenyésztési időtartam után maximális enzimkitermelést kapunk.

QQ ^{r J} A találmány szerint használható mikroorganizmusok nagyon hasonlóak, és a következő jellemző tulajdonságokkal rendelkeznek: j

Gram-negatív, j obiigát aerob, sárgás telepek húspepton-agaron, növekedés 25,30 és 37 °C-on, ;

nincs növekedés 10 °C-nál és 41 °C felett, sejtnagyság 0,8-1 μ, 2-4 μ, ·

4Q niotil, lofotrich ostoros, nem hajlamosak láncképzésre, ‘ nincsenek spórák vagy nyugalmi alakok, citokróm — oxidáz + kataláz (+) indol nitrit Voges-Proskauer — zselatin Monoszubsztrát lebontás:

+ +

+ i + :

+ + +

+ +

+ '

A koleszterinészteráz mind a fermentlében, mind a sejtekben jelen van. Felületaktív szerek, különösen nem-ionogén szerek — amelyek előnyösen alkil- és aralkil-cso·portokkal rendelkező polioxietilén-ész.terek és -éterek típusához tartoznak - hozzáadásával a fermentlé és a sejadonit citrát galaktóz glükóz inozit laktóz mannit mamióz szalicin sznrhit

-2Egy 1. példa szerint kapott fermentiéből az oldatian sejttömeget iecentrifugáljuk, és koleszterinészteráz meghatározást végzünk. A meghatározás a következő reakcióegyenletek szerint történik:

, , , . , , „ koi.-észteráz

1. koleszterin-eszter + H₂O----->koleszΊ83 202 tek közötti megosz’ási arány az extracelluláris aktivitásnak az intracelluláris aktivitás terhére való növekedése irányában befolyásolható, ionogcn felületaktív szerek esetében a megoszlás változása fordított irányban megy végbe. ₅

A tenyésztés befejezése után a koleszterinészterázt a sejttömegből és/vagy a fermentlé szűrietéből szokásos módon elkülönítjük, és adott esetben tisztítjuk. Sok célra azonban már tisztításán nyerstermék is megfelel, amely lényegében csak feltárt sejttömegből áll. Feltárásra a szakemberek által már ismert módszerek alkalmasak, amelyek itt közelebbi magyarázatra nem szorulnak. Mind a fermentlé szűrietéből, mind a feltárt sejttömegből az oldatlan alkotórészek leválasztása után az enzimet szokásos lecsapószerekkei, például sókkal, így ammónium-szulfáttal vagy szerves oldószerekkel, például acetonnal vagy etanollal csapjuk le, és utána a szokásos frakcionálási műveletek, például kromatográfia vagy kicsapás alkalmazásával tisztítjuk tovább.

A következő példák a találmányt részletesebben 20 szemléltetik.

1. példa

A mélyhűtött ampullából, ferde táptalajról vett Pseudomonas spec. DSM 1280-at fó'táptalajon két napig 30 °C-on aerob körülmények között (rázólombik) előtenyésztünk, és utána 10 %-nyi mennyiségben átoltjuk olyan táptalajra, amely literenként a következő alkotóré- 39 székét tartalmazza:

7g Na₂FIPO₄-2 H₂O,

3gKH₂PO₄, lgNH₄CI,

0.05gNaCl, 35

0,1 ml 1 %-os FeCEoldaí,

0,1 ml 0,2 %-os CuCl₂ oldat,

0,1 ml 1 %-os ZnSO₄ oldat,

1,0 ml 10 %-os CaCl₂ oldat,

5,0 ml 12 %-os MgS0₄ oldat, 40

1,5 % szójalecitin, pH 7,0.

A tenyésztés 30 °C-on aerob körülmények között rázólombikban történik. 1-3 nap múlva körülbelül 15 000 egység/liter aktivitást (felülúszó és biomassza; szubsztrát.koleszteril-oleát) kapunk.

Körülbelül ugyanilyen kitermelést kapunk, ha azonos körülmények között Pseudomonas spec. DSM 1280 helyett Pseudomonas spec. DSM 1281 -et használunk. ,-n

2. példa terin + zsírsav

2. koleszterin + 1/2O₂ kol.oxidáz/ka taláz koiesztenon + fI₂O₂ (A kolesztenon-képződés mérése 240 nm-nél).

A méréshez a következő oldatokat használjuk:

1. 0,5 mólos, 7,5 pH-jú foszfátpuffer, 0,4 % Thesit (hidroxi-polietoxi-dodekán);

2. koleszterin-okát c=4, Thesit/dioxán (hidrcxi-polietoxi-dodekán/dioxán), 1:1 arányú elegy;

3. kb. 0,6 mólos H₂O₂ (5 ml Perhydrol/100 ml);

4. kataláz(0,01 mg protein/ml);

5. koleszterin-oxidáz (legalább 50 egység/ml);

6. fermentlé (körülbelül 5000 egység/liter esetén vízzel 1:5 arányban hígítva; vizsgálatra 0,01 ml).

A méréshez 2,95 ml 1. oldatot 0,02 ml 2. oldattal elegyítünk. 5 perc múlva 0,01 ml 6. oldatot és 0,02 ml

5. oldatot adunk hozzá, és 1 perc múlva a reakciót 0,1 ml 2. oldat hozzáadásával beindítjuk.

Claims (5)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás koleszterinészteráz előállítására a Pseudomonas nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok segítségével, azzal jellemezve, hogy Pseudomonas sp. DSM 1280-at vagy DSM 128I-et alkalmas táptalajon valamilyen induktor jelenlétében tenyésztünk, és az enzimet kinyerjük a tenyészfolyadékból vagy/és a sejtekből.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy lecitin induktor jelenlétében végezzük a tenyésztést.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szójalecitint adunk a táptalajhoz.
4. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 0,52 súly% lecitin jelenlétében végezzük.
5. 5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a táptalajhoz 0,4—2 súly% foszfátot adunk.