JPS5917982A - 第一および第二アルコ−ルデヒドロゲナ−ゼ酵素およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、主要な炭素およびエネルギー源として少なく
ともａ個の炭ｌｇ涼子を有する含炭紫化合物、好’ＥＬ
＜ｉｆ，例えばＣ２−　Ｃ．、。アルカン箇たはアルコ
ールのよりなＣ，　−　Ｃ，。アルキル化合物の存在下
に於て好気的に増殖さｒ１７ｌＣ９Ｊ住物から誘導され
るニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”）
ｉ会、第二アルコール％異性デヒドロダナーゼ酊鉋であ
る、新規ｌこ発見され、分離さわた熱安定性酵素に関寸
る。

本発明の酵素の精製形は、ＮＡＤ＋唸たにＮＡＤＰ十の
存在下に於て、第二およぴか一アルコールからのそれぞ
れメチルケトンおよびアルデヒドの製造、ならびにジオ
ールおよひアルデヒドの酸化、ならびに他の工業的合成
およひ分析用途に使用することができる。不発ＨＡ　Ｉ
ｆＪ　、第一アルコールに対して優先的なφＩ規発見Ｎ
ＡＤ＋結付、アルコールデヒドログナーゼ酵素にも関す
る。

肝臓およびパン酵母からのＮＡＤ＋依存性第一アルコー
ルデヒドログナーゼは、恍先的に第一アルコール′ｆ酸
化し、より低い速Ｎ（エタノール活性の約ｌθ％）で第
二アルコールを酸化する。一般的に、Ｃ−１．プレンデ
ン（　Ｃ　−　１．　　８ｒａｎｄｅｎ　）他、ザ●エ
ンザイム（　Ｔｈ＠Ｅｎｚｙｍｅ　）　　ｇイヤー、Ｐ
．Ｄ．　（　Ｂｏｙａｒ　Ｐ．Ｄ．　）編、ＶＯＷ．／
／（アカデミックｅプレス社、ニューヨーク（　Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ：　Ｎ＠ｗｙｏｒｋ　）　、／
　ｑ’７　！；　）　／　０　３　−　／　０　９頁會
参照されたい。Ｆ．Ｍ．　　デイツキンソン（Ｆ．Ｍ．
Ｄｌｃ−ｋＩｎｓｏｎ　）　　他、ｅｌｏｃｈｅｍＪ．
、　／　Ｏ　Ｑ　、’乙！（／ｑ乙７）およひＦ．Ｍ．
　　デイツキンソン（　Ｆ．Ｍ。

Ｄｌｃｋｌｎｓｏｎ　）他、Ｎａｔｕｒｅ　（　Ｌｏｎ
ｄ　）　、’　　、２　／　ＩＩ　。

、：／　ｔ　（　／　９　６７　）も参照さｆＬｆｃい
。ＮＡＤ（Ｐ）依存性第一アルコールデヒト゛ログナー
ゼ酬．素は、グセｆ＞｝’モナ：ｘ．　（　Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　）　、太ｈｍｉ（　Ｅｓｈｅｒｌｃｈｌ
ａｃｏｌｌ）　、ロイコノストック−メセンテロイデス
（　Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｌｄｅ
ｓ　）　　、リゾグ．ｘージャパニクス（　Ｒｈｌｚｏ
ｐｕｓ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）からも分離さ１ｌている
。

米国轡計弟ダ，λダ／，／ざ９号およひ＃ｌ　、２！；
０　、２．ｔｑ号にね、メチロトロフ做生物から誘導さ
れるｉ規ＮＡＤ＋依存性、第二アルコール製異性アルコ
ールデヒドロゲナーゼが記載されている。かかる酵素は
、メチルケトンの製造に於て重畳である。

本発明は、微生物細胞増殖のための炭素およびエネルギ
ー源を与えかつ橡生物ま＊、　１−１その遺伝手術誘導
体す力わち遺伝子工学誘導体（ｇｓｎｅｔｌｃａ−１１
ｙ　ｅｎｇｌｎｅｅｒｅｄ　ｄｅｒｌｖａｔｌｖｅ　）
　ｊたはその自然突然変異株中にアルコールデヒドロｒ
ナーゼ酵素活性を誘発する、少なくとも２個の炭素原子
を肩する含炭素化合物を含む培養基すなわち普通培地（
ｎｕｔｒ　１ｅｎｔ　ｍｅｄｌｕｍ　）中に於て好気条
−件下で予め増殖させである微生物またはその楓伝手術
誘導体またはその自然突然変異株の細胞から誘導される
ことｆ％徴とする第一またｔｊ＠ニアルコールデヒドロ
グナーゼ酵素に関する。上記酵素の中のｌっは、ＮＡＤ
”またはＮＡＤＰ＋の存在下に於て好気条件下で優先的
に第一アルコールを対応する酸化生成物へ酸化し、挑−
アルコールデヒドログナーゼの性質ケ有する。上記酸素
の中のもうｌっは、ＮＡＤ　　またはＮＡＤＰ　　の存
在下に於て短鎖第一および駆ニアルコール１１．ジオー
ル、アルデヒドを対応する酸化生成物へ転化させること
を特徴とする、熱安定性、第ニアルコールデヒドロｒナ
ーセテする。ｌＩ６回鞘表するとき、この第ニアルコー
ルデヒドログナーゼは、ポリアクリルアミドゲルカラム
クロマトグラフィーで一用定Ｌ７て約／ｌｊ　、０００
±３．θｏｏダルトンの分子ｆｉｔ？廟りかつ少々くと
もｓｏ”ｃ、好ましくａ６ｏ−８５℃のａｍで、１時間
以上安燈であることがわかった。

本発明によれけ、アルコール、ジオール、アルデヒド（
好ましくはＣ，−Ｃ５にシーアルコール、ｃ、−ｃ、１
４ニア　ルコ−Ａ、、ｃ、　−ｃ５ジオール、Ｃ１−Ｃ
，アルデヒド）が、かがるアルコール贅たはジオールま
たはアルデヒドを、反応媒實中に於て〜微生物あるいけ
その遺伝手術誘導体または自然突然変異株から誘導され
る微生物細胞、あるいは該細胞から製造される酵素製剤
と、酸化生成物が少なくとも分離可能な隼で生成するま
で報触させる工程であって、該微生物細胞またｉｊ誘導
体または酵素製剤が予め約ｑθ℃までの温度に加熱され
ておりかつ該微生物が、微生物細胞増殖のための炭素お
よびエネルギー源を与えかつ微生物または誘導体または
突然変異株または製剤中にアルコールデヒドロゲナーゼ
？？′素活性？読発する、少すくとも２個の炭素原子を
有する含炭素化合物を含む普通培地中に於て好気条ｆｔ
’下で増殖窟せたものである接触工程と、分離可能な招
で生成物を生成させる工程とを含む方？’ＡＫよって、
それぞれの対応する酸化生成物へ微生物学的に転化させ
る。

上記熱安定性酵素は、メチルケトン、好ましくはアセト
ンを対応するアルコールへ還元することもできるが、速
度は低い。

本明細書中に於て、”微生物”とは、その最も広い意味
で用いられており、＃Ｉ菌はかりでなく、酢旬、糸状真
菌、放ｌＩＩ！菌、原生贈物をも含む。好１しくに、微
生物は細ｌ！ｌを含む。本発明の微生物は、主要なまた
は唯一の炭素およびエネルギー源として０２　　以上の
アルキル化付物ヲ第１」用するａｉ力のあるものとして
定義される。

本明細書中で、′ｍ勢生物の煩−伝′＋術肪導体すたｔ
ｒｉ瀦か子工学銹導体”という′ｆｔ、珍は、当前・者
が酩識している意味で変えらｊた声伝装慣（ａｌｔｅｒ
ｅｄｈｓｒｅｄｌｔａｒｙ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　）　
　ｆ有する生細胞を意味するために用いられており、人
為突然変！【−株およびＩｆｌ換型ＤＮＡ生ｉｓ生物（
ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ−ｐｒｏｄｕｃｅ
ｄ　ｍ　ｌｃｒｏｏｒｇａｎｌｓｍｓ　）　　を含む。

＠耐′素＆・剤”という用語は、所望のデヒドロゲナー
ゼｌｙ繁活性を示す物＊　ｉｌ＋放物を薄味するために
用いられる。この用語は、世１えは、生金ａ胞、乾燥細
胞、無紐１胞粒状および可溶性分画、細胞抽出物、およ
び細胞から誘導される釉ｉＪＪ、濃紺製剤、％ＫｆＩｆ
製アルコールデヒドログナーゼヲ篤味するために用いら
れる。酵弊製剤は、乾燥彰であっても液状形であっても
よい。この用語は、また、酵りの１四定形、例えば、微
生物の・全細胞、あるいは基質および生成物分子を自由
に通過させるように十分大きいが酌素ケ保持するように
十分小さい細孔を冶するグル格子内への酵素の捕嫂、お
よび酵素の共有化学結付、吸収によって不溶性マ）　Ｉ
Ｊラックスへ定または結合される酵素抽出物を本含む。

＠酸素製剤”という用語は、例えば、ロニーｎｇｌｎｅ
ｅｒｌｎｇ　）　　（／　９りｌ）中に配船、されてい
るような中空繊維膜内に保持されたＰ素をも含む。

１第ニアルコールデヒドロダナーゼ酵素”という用語は
、以下、優先的に第二アルコールの酸化を触媒するが、
一般九より低い程度に、アルコール、ジオール、アルデ
ヒド″ｆＭ化する口１コカおよびケトンをアルコールへ
還元する能カケも有する熱安定性酵素ヲ誦味するために
用いられる。かくして、本酵素は、緻密に第二アルコー
ル植異性ではｆｘ＜、”ｋＬニアルコールデヒドログナ
ーゼという用語は、該用語を用いる場合は癌に、かつ本
酵素ヲ他のアルコールデヒドロゲナーゼｖ＃紫と区別す
る目的で便宜上用いらｊる。

＠ｍ−フルコールデヒドロゲナーゼ酵素２という用語は
、以下、第一アルコールに対して優先的な触媒ｆ慈味す
るため、かくして優先的に第二アルコールを酸化する熱
安定性アルコールデヒドロダナーゼ静翼と区別するため
に用いられる。

１可溶性分画”という用語は、破Ｓ細胞を１０、０００
−．２０　、０００　Ｘ　＆−で／！；−３０分以上遠
心分トした後の可溶性抽出物（上澄液）中の酵素活性ｆ
意味する。

好ましくは増殖基質として用いられるもの？記載するた
めに用いられる＠ｃ２−　ｃ、。アルキル化付物”とい
う用語は、例えばエタン、グロパン、ブタン、イソブタ
ン、ペンクン、コーメチルブタン、ヘキサン、メクタン
、デカンなどのようなＣ２−Ｃ，。

アルカン、あるいは例えばエチル、グロビル、ブチル、
ヘキシル、デシルなどの基を供与する化付物であるエタ
ノール、グロノ千ノール、ブタノール、ヘキサノール、
オクタツール、デカノール、エチルアミン、グロビルア
ミン、ｔｓ酸ブチル、炭酸エチルなどのような’２−　
ｃ、。アルキル基供与性化付物を意味する。かかるアル
キル基供与性化付物は、０２　　以上をオリ用する微生
物にデヒドロゲナーゼ酵素浩碓を誘発する能力がある増
飴自基質としても特徴づけられる。好ましくは、本発明
のＣ３−Ｃアルキル化合物ｒｉｃ２−Ｃ４アルキル化合
物で０ あり、より好ｉ［７〈はＣ２−Ｃ４ｎ−アＡ−カン、ｃ
　　−ｃ　　第一アルコール、Ｃ２−０４丁ルキルアミ
４ ンである。

＠Ｎ釦フルコール、ジオール、アルデヒド”という川船
は、第ニアルコールデヒドログナーゼのための好ましい
基質、すなわち、Ｃ４−Ｃ５枦、−アルコール、ｃ　　
−ｃ　　紀ニアルコール、ｃ、　−ｃ５シフ オー　ル、Ｃ，−Ｃ４アルデヒドヲ漸吐する。

本発明の１つの実施の態様として、微生物細胞の増殖の
ための炭素およびエネルギー源を寿え力・つ細り中にア
ルコールデヒドロゲナーゼ１１古性を誘発する、少なく
ともλ個ｆ）炭素原子？−肩する含炭素化付物存在下に
於て好気的に増殖させである微生物の細胞から誘導され
るＮＡＤ（Ｐ）＋納会アルコールデヒドログナーゼレ紫
が提供される。

本発明のもう１つの実施の態様は、所望の基質會、約９
０′Ｃまでの温度、好ましくＩｒ１３０−ｇ５℃に予め
加熱しである微生物細胞またにそれから装造される酸素
製剤と初触略せることによる、騙−および第二アルコー
ル、ジオール、アルデヒド、好１し、〈はｃ、　−ｃ５
第ニアルコール、ＣＭ−０７糖ニアルコール、ｃｓ−ｃ
５ジオール、ｃ、−ｃ４アルデヒドを対応する酸化生成
物へ転化させる方法を含む。加齢のために豹容される時
間は、温度によって劇的に！′１々るが、好１しくはユ
時間捷でである。

微生物自体に、少なくとも２個の炭雰原子！７肩する含
炭素化合物、好着しくはＣ２−Ｃ，。アルカ：ｉ’ｔ、
１ｉｓｔエタノール、プロア９ノール、ブタノール、グ
ロビルアミン、峙酸グロビル、蟻酸ブチル、炭酸エチル
、炭酸グロビルの工うなＣ２−ＣＴｏ　　アルキル産供
与性仕４！ｒ物の存仔下に於て好気条件下で予め増殖さ
！する。

このｈ的のための最も好ましい紀−アルコール基＊　Ｖ
Ｊ、　、メタノール、エタノール、ｌ−グロノ！ノール
、ｌ−ブタノール、ｌ−ペンタノールである。

本発明の最も好ましい第二アルコール基質は、コ−グロ
パノール、ノーブタノール、ノーにンクノール、３−　
ペンタノール、−（ソブタノール、シクロヘキサノール
、ベンジルアルコールである。本発明の）伎も好寸しい
ジメールｋＡ、／、２−ブタンジオール、／、３−ブタ
ンジオール、２．３−ブタンジオール、１．コープロバ
ンジオールであり、Ｍ　も＆）ましいアルデヒドは、ホ
ルムアルデヒド、グロパナールおよびブタナールである
。

本発明は下記の％ダ會含む。

本発明のアルコールプ′ヒドロダナーゼ酊潔くは、Ｃ３
以上のアルキル化合物で」１１・＋　’Ａ（１官ＪＬだ
微生物から誘導され、好熱性であることもわかっている
。

アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、０２　　以上増力
ｉ林の破壊卸１胞の無卸ｊ胞可溶性抽出物中にｌｉ：ｔ
ｇ察される。無細胞糸１ｄ　、その活性のために、コフ
ァクター、特ＶこＮＡＤ＋を＄１智とする。

１つの株グセウド０モナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）　Ｎ　
ＲＲＬ　Ｂ　−／、１りをさらに精製するとき、ａつの
型の酊素が検出される。、第一アルノールデヒドロゲナ
ーゼ活性は、εｆ１．−アルコールノー臀先的に「ｊ？
゛化し、公知のＭ’ｓ−フルコールデヒドロゲナーゼ、
＋（゛＜メ（、例えば・千ン醪°母７〕・らのアルコー
ル二Ｎへ〇　＋ｊｉｊ７化奔元酵素および一ヒ記プレン
デン（Ｂｒ１ｎｄｅｎ　）他、６ザ・エンザイ７．　（
Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｒｎｅ　）″　ｏｐ、１０′ｌ−イｆ
　に記載さノしているようなアルコールデヒドロゲナー
ゼに似た１翼を示す。

Ｕ＞ニアルノールデヒドログナーゼ耐素ｒ、ｉ、”＋／
。

回４Ｕ′貌すると、ＮＡＤ（Ｐ）十の存在−トに於て、
肝）ニアルゴールケメチルケトンへ、かつ８ｊＬ　　７
　Ａ／コールをアルデヒドへ、かつ・ジオールおよびア
ルデヒド？−ｆ：れぞれの対応する酸化化成物へ化学量
論的に酸化し５、最良の酸化はガ１．ニアルコールで起
こり、ジオール、第一アルコール、アルデヒドｉ）’％
これシζ゛続く。ｄ−７０ロノやノール、ノーブタノー
ル、７．３−ブタンジオールに対して泊１６の活性が児
らｔｌる。このＱ′？′素は、弄学活性軌性体のｒヒに
゛化１１ｋにｅま何らσノ陪先性も示さない。この精製
６？素はまた、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ２の存在１に方シ・てア
セトンをグロ／やノールへ領元する。

オｆＩ製給ニアルノールデヒドログナーセ″酊弊乏は、
ｄ？リアクリルアミドグルカラムクロマトグラフィーで
沖ｊ定して約／７７！；、０００±、ｔ　、ｏｏｏり゛
ルトンの分子整を不する。

趙製顔ニアルノールデヒドログナーゼ１°素は、ρ１１
７−９および湛度乙θ−７０℃に於て最適活性を廂する
。この酔累の活性化エネルギーはざ、２ｋｅ８１　　で
ある。

矛＾ＩＵ第ニアルノールデヒドログナーゼ醪１は、ｇｓ
”ｃｉで、１時間以上加熱されても安定であるが、９．
２℃に於て失活し１、沸ル１丞するとｉ　ｔｆｇする。

希ＱＵ　第ニアルノールデヒドログナーゼ耐ス・は、ナ
１；力なチオ試薬で抑制されるか、はとんどの会商キレ
ート剤では抑制されずかつ酸化混＠′物中のダＱＱｍＭ
までのノーブタノールでは抑制されない。

本発明に使用できる低生物は、少なくとも２個の炭素原
子を南イる含炭素化付物１自む晋ｉｔ＋ｊ馬地中で好気
増殖する能カケ有する微生物と厘蟻することができる。

本発明の目的のためにＪ向当な微生物の例を下に示−１
０ 為発り１１に有１−ｔｌな、ｇｒたに’ｒ＋’＋　ＪＦ
、さノ１、分１１ｊｌｉされプＣ徽生物ｒｒ、ｒ　、ロ
パートＳ、ブリード（Ｒｏｈｅｒｔ　Ｓ。

ｌｏ［２ｙ　）　　ＩＥｇ　）：Ｆ９．　［パルトチモ
ア（日ａｌｔ１ｍｏｒｅ　）　：つ・イリアムズ・アン
ド・ウイルキンズＫｌ：　（ＷＩ　Ｉ　ｌ　ｌ　ａ　−
ｍｓ　ａｎｄ　Ｗｌｌｋｌｎｓ　Ｃｏ、）、／　９　’
７　’Ｉ　）　Ｖｔ’　ｉｉｊ’、載きれている分類方
テいｒ−何って同定さｔ］たものであり、下記の名称で
−４１＋る。

’＜’１　　　偽　　等　　　旬　　　喝　　　σ　　
　−γ　　　つ　　　Ｎ＼　　　　＼　　　＼　　　　
＼　　　＼　　　＼　　　＼　　　＼　　　　＼１　　
　　　　　　　　　　　　１１１１１ｃｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　ｃｏａＱｃａｃｏｃ。

ＪＪＪＪＪ　　　−−ＪＪ Ｃｌ：！ｃｔ　　　匡　　ｃｔ　　　匡　　α　　　ご
　　　匡α　　　１ｌｔ（１：Ｉ！　　　α　　ご　　
匡　　　ぽ　　　匡ｚｚｚｚｚｚｚｚｚ −乙　　龜　　　九　　龜　　乙　　　龜　　　龜　　
ωＪ　　　　−Ｊ　　　Ｊ　　　Ｊ　　　Ｊ　　　　Ｊ
　　　Ｊ　　　　Ｊα　　Ｃｔ　　　匡　　ｃｔ　　　
匡　　α　　　匡　　　匡　　　匡ロ　　ロ　　Ｑ　　
ロ　　ロ　　０　　ロ　　ロ　　ロへ呵ず＠槌トに−Ｑ ＼＼ζ−＼＼＼曳１ 上記株のおのおのは、米ｌｉ　ｆｆ４務省、アグリカル
チャー・リサーチ・サービス、ノーザン・リジョナル・
リサーチ・ラブ・ラトリー〔（＾ｇｒｌｃｕｌｔ−ｕｒ
ｅ　Ｒｔｓｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、　Ｎ６ｒｔｈ
ｅｒｎ　Ｒｅｇｌｏｎａｌ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　）　（Ｎ　ＲＲＬ　）　（ｐｅｏｒ
ｌａ。

１１１１ｎｏｌｓ　　ｉｓ　／　ｌ、　０４’　）　）
に寄託されており、ＮＲＲＬと本特許出願人、エクソン
拳リサーチ・アンド・エンジニアリング社（Ｅｘｘｏｎ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈａｎｄ　Ｅｎｇｌｎ＠ｅｒｌｎｇ　
Ｃｏｍｐａｎｙ　）　（Ｅ　ＲＬ　Ｅ　）とσ）間の契
約に従って上記の個々のＮＲＲＬ名称をＮＲＲＬから受
り六ものである。ＮＲＲＬとσ）この契約は、該寄託株
を記載および同定する米国特許の発行時あるいは本出願
に相当する米国または米国以外の−１の特許出願または
特許の出願公告または出願公開時のいずれがか鮫初に起
こる時期にｉたは所望の時期に、公衆にこれらの株σ）
後代の永久的入手可能性を与え、かつ米国特許商標周長
官が３３ＵＳＣ／２コおよびそれに関する長官規則Ｃ３
７ＣＦＲ／、／弘を含み、特にｇｇｂＯＧＡＪｇＫ関す
る）に従って、かつ西独特許局およびドイツ連邦共和国
裁判所（ｔｈｅ　Ｃｏｕｒｔ＠　ｏｆｔｈｅ　Ｆｅｄｅ
ｒａｌ　Ｒａｐｕｂｌｌｃ　ｏｆ　Ｇｓｒｍａｎｙ　）
に、西独の法ｆ４４に従って、かつ日本国の法律に従っ
て資格があると決定した者にこれらの株の後代の入手可
能性を４える。本出願人は、寄託されたこれらの株のい
ずれかが死滅するか、あるいは適当な条件下で培すした
とき抽失または破壊されるような場合には、通告して四
じ株の生存能力のある培養菌と１白ちに堆り換えるとい
うことに同意している。しかし、寄＃ｔＭの入手可能性
は、政府の指令によって付与された特許権の減損に於て
、本発明全５Ａ施するライセンスを構成するものでない
ことを理解すべきである。

とｎらの新たに分離された株の分類孝的および形態学的
特性を下に示す。

做生物株の形態学的および ７ ＣＲＬｌ、’７株Ｐ／／（ＮＲＲＬ　　Ｂ−／／、、？
／３）：細胞は、対数増殖期に於て非′帛に短くかつふ
つ〈らとしており、定常期には球菌形に近い。細胞は、
主として対をなし、短鎖である。非胞子形成性、非運動
性細胞。Ｃ２−Ｃ，。アルカン、Ｃ２−Ｃ，。第一アル
コール、クロビルアミン、および普通寒天（ｎｕｔｒｌ
ｅｎｔ　ｓｇａｒ　）で好気的に増殖する。メタンでは
増殖し力い。

コ　アクチノミセス（Ａｃｔｌｎｏｍｙｃｅｓ　）ｓｐ
、　　ＣＲＬ６６株Ｐ７（ＮＲＲＬ　　ｔｔ、３／ＩＩ
）：この菌は、ダラム陽性菌であり、不規則染色性細胞
。

で、非耐酸性す々わち非耐Ｐ？色性（ｎｏｎ　ａｃｌｄ
−ｆａｓｔ　）　、非胞子形成性、非運動性である。

多くの線状細胞で、枝分かれかある。平板上に粗いコロ
ニ＝會つくり、ピンクの着色ケ生じる。

ｃ、　−ｃ、。アルカン、Ｃ２−Ｃ１゜纂−アルコール
、クロビルアミンおよび晋拙泉天で好気的に増殖する。

メタンでｔｉ増殖しない。

３、　アルスロパクテル（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　
）ｉｐ、　ＣＲＬ６０株Ｐ／（ＮＲＲＬ　　Ｆ３−／／
、Ｊｊ／ｊ！；）：培養菌は、球状細胞からなる。古い
培養菌中では、細胞は、球形乃至卵形または僅かに細長
い形である。菌は、ダラム陽性、非制御、厳密に好気性
である。ゼラチンを加水分解し、硝酸塩ｆ還元する。Ｃ
２−Ｃ，。アルカン、Ｃ，−Ｃ，。

第一アルコール、クロビルアミン、コハク酸塩および普
通寒天を消費して好気的に増殖する。

メタンでは増殖１ない。

ｌｚｇａＥｔＣＮＲＲＬ　Ｂ−ｔｔ、３ｔｌｚ）：ｊ＠
養菌は、球状細胞からなる。古い培養菌中でけ、細ＩＰ
ｐＨｄ球形乃至卵形″ｆ！たは伽かに細長い形である。

珈は、ダラム陽性で、非耐酸性、厳密に好気性であり、
ゼラチンを加水分解し、硝酸塩を還元する。Ｃ２−Ｃ，
。アルカン、Ｃ，−Ｃ，。

挑−アルコール、エチルアミン、クロビルアミンおよび
普通寒天で好気的に増殖する。メタンでは増殖しない。

７０株Ｂ／（ＮＲＲＬ　　８−／／、、？／？）：培養
菌は、球状細胞からなる。古い培養−中では、細＆１１
１Ｌ、球形乃至卵形または僅かに細長い形である。この
菌は、ダラム陽性で、非１Ｉｔｔｆｔ１′性、厳密に好
気性である。ゼラチン會加水分解し１、硝酸塩ｔ−ａ元
する。”２−　Ｃ１゜アルカン、Ｃ２−Ｃ４゜婢−アル
コール、ブチルアミン、および普通寒天で増殖する。メ
タンでは増殖しガい。

ＣＲＬ、ｔ２Ｐ、７Ｐ（ＮＲＲＬ　　Ｆ３−／／、３／
ｇ）”。

Ｃ，−Ｃ，。アルカンおよび第一アルコールの存在下に
於て、無機塩寒天平板上に、勤いた、盛り上がった黄色
コロニーヲ生じる。普通培地でも増殖する。好気性桿状
菌。

ＣＲＬ５４　Ｐ　Ａ　Ｙ　（ＮＲＲＬ　　Ｂ−／／、、
？／？　）　：Ｃ３−Ｃ，。アルカンおよび第一アルコ
ールの存在下に於て、無機塩寒天平板上で、輝いた、Ｌ
Ｋり上がった黄色コロニーを生じる。背通培地上でも増
殖する。好気性桿状乃至梨状劇。

と　ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｌｂａｃｔｅｒｌｕ
ｍ　）ｓｐ。

ＣＲＬＩ／株Ｐ２（ＮＲＲＬ　　Ｂ−ｔｔ、３２０）：
細胞は、コリネ形の彫態を有し、１スナツピング（Ｓｐ
ａｐｌｎｇ　）”方式の細胞分割ケ有する。この菌は、
好気性であり、平板上に帯黄色乃至橙色の色素を生じる
。Ｃ２−Ｃ，。アルカン、Ｃ２−Ｃ４゜躯−アルコール
、クロビルアミン、コハク酸塩、および鞘通癩天で、好
°気的に増殖する。

メタンでは増殖（１，ない。

９　コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌ
ｕｍ　）ｓｐ。

ＣＲＬｌ、？株Ｐダ（Ｎ　ＲＲＬ　Ｂ−／／、３コｌ）
：細胞は、′Ａ肯ぐ力せた祉曲がった桿状で、しはしは
一端または両端がふくらんでいる。ダラム陽性で、通常
不均一に染まり、【７ばしは、メチレンブルーで帯背紫
色に染まるメタクロマチック（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔ
ｌｃ　）顆粒管含む。この菌は、ゼラチン？液化１、ｃ
、　−ｃ、。アルカン、Ｃ２−Ｃｌｏ組−アルコール、
クロビルアミン、コハク酸塩および・ｈ通球天で糟畑す
る。メタンでは増幼しない。

ｌＯミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕｍ　
）ｓｐ。

ＣＲＬ！；／　　ｐ２ｙ　　（ＮＲＲＬ　　Ｂ−ｔｔ、
３２２）：Ｃ２−Ｃ，。アルカンおよび第一アルコール
の存右下に於て、無機寒天上に小さい白色コロニーを生
じる。普通培地上でも楯゛殉する。この菌は、非運動性
、ダラム陰性、好気性桿菌である。

ｌ／、ミコパクテリウＡ　（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕ
ｍ　）ｓｐ。

ＣＲ１４２株ｐ　ｃ　（ＮＲＲＬ　８−ｔｌ、３２３　
）　：細胞は、短い、僅かに曲がった、ふっくらとした
桿で、両端が丸くなり、時に浮くなっている。

耐酌性菌。滑らかな、湿った、■いたコロ；−を生じ、
濃黄色の着色がある。Ｃ２−Ｃ１ｏ　　アルカン、Ｃ７
−Ｃ，。第一アルコール、クロビルアミン、および普通
寒天で好気的に増殖する。メタンでは増殖しない。硝酸
塩を還元し、カタラーゼ試験陽性である。

１２　　ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕ
ｍ　）ｓｐ。

ＣＲＬＡ？株Ｅ　２　（ＮＲＲＬ　Ｂ−／　ｔ　、３２
（１）　：細胞は短く、僅かに曲かった、ふっくらとし
た桿で、両端が丸くなり、または時に厚くなっている。

耐酸性菌。滑らかな、湿った、輝いたコロニー？生じ、
濃黄色の着色がある。Ｃ２−Ｃ，。

アルカン、Ｃ２−０１゜第一アルコール、エチルアミン
、ゾロビルアミンおよび有通寒天でりｒ気菌［１殖する
。メタンでは増列１１＋　１．ない。

／、？　　ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｌａ　）ｓｐ、　
ＣＲＬ　、Ｓ　！；ＰＡＹ（ＮＲＲＬ　　／１．３２！
；）：Ｃ２−ｃ、。アルカンおよび第一アルコールの存
在下に於て、無機塩寒天平板上に、増殖の遅い、輝いた
黄色コロニーを生じる。普通培地でも増殖する。グラム
陽性、桿状好気性菌。

７％　　ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｌａ　）ｓｐ、　Ｃ
ＲＬ　！；　７Ｐ’７Ｙ（ＮＲＲＬ　　／／、３２乙）
：Ｃ２−ｃ、。アルカンおまひａＬ−アルコールの存在
下に於て、無機塩寒天平板上に、輝いた、盛り上がった
クリーム色乃至黄色のコロニーを生じる。普通培地でも
増殖する。グラム陽性、桿状第。

／、ｊ　ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｌａ　）ｓｐ、　Ｃ
ＲＬ　ｂ　４’抹　ｐ！；（ＮＲＲＬ　／／、３２７）
：コロニーは乾いていて、フレーク状である。細胞は、
枝分かれのある一系を生じ、不規則な杆状卸ｊ胞と球状
細胞とに分裂する。平板上に帯黄色コロニーを牛しる。

Ｃ２−０１゜アルカン、Ｃ２−Ｃ，。第一アルコール１
、クロビルアミン、コハク酸塩および普通寒天で好気的
に増殖する。メタンでは増Ｍ１表い。

／４　　グセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）
ｓｐ、　　ＣＲＬ１２　　Ｐ３Ｙ　　（ＮＲＲＬ　　Ｂ
−／／　、３２９）：Ｃ２−Ｃ，。アルカンおよび第一
アルコールの存在下に於て、無機塩寒天平板上に、小さ
い黄色コロニー管生じる。普通培地上でも増殖する。

ダラム陰性、好気性、運動性、稈状酌。

／７　グセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）ｓ
ｐ、　　ＣＲＬ！；１１　　ＰＩＩＹ　　（ＮＲＲＬ　
　Ｂ−／／、３３０）：Ｃ２−０１０アルカンおよび第
一アルコールの存在下に於て、無機塩寒天平板上に、輝
いた黄色コロニーヲ生じる。晋Ａ培地上でも増殖する。

ダラム陰性、運動性、好気性桿菌。

１ｇ　　グセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）
ｓｐ、　　ＣＲＬＳｇ　　ＰｑＹ　　（ＮＲＲＬ　　Ｂ
−／／、３３／）Ｃ２−Ｃ４゜　　アルカンおよび第一
アルコールの存在下に於て、無機塩寒天平板上に、黄色
コロニーを生じる。普通培地上でも拍動する。ダラム陰
性、運動性、好気性桿−０ １９グセウドモナス（Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ　）ｓｐ
、　　ＣＲＬ乙５株ｐ６（ＮＲＲＬ　Ｂ−／／ｒ３３２
）：この菌は、ダラム陰性、好気性担菌である。極性、
単毛性鞭毛で運動する。螢光色糸全生成【２ない。

硝酸塩は、とわらの菌で脱窒素される。Ｃ２−０１０ア
ルカン、ｃ、　−ｃ、。第一アルコール、クロビルアミ
ンおよび普通寒天で好気的に増殖する。メタンでは増殖
しない。

コθ　グセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）ｓ
ｐ、　　ＣＲＬ７／ａＢ、２（ＮＲＲＬ　　Ｂ−／／、
、３３３）：この菌は、ダラム陰性、好気性桿菌である
。極性、単毛性軟毛で運動する。螢光色素を住成し々い
。こｔｌらの菌は、硝酸塩を脱窒する。Ｃ２−Ｃ５゜ア
ルカン、Ｃ２−ｃｌｏ　　第一アルコール、ブチルアミ
ンおよび普通寒天で好気的に＃ｌ１ｆｌする。

メタンでｉｊ増殖しない。

上記の、新たに発見きれ、分離された株は、米国１ニュ
ーシャーシー州リンデン市のペイウェイ・リファイナリ
ー（Ｂａｙｗａｙ　Ｒｅｆｌｎｅｒｙ　）の土壌試料お
よびニューシャーシー州すンデン市ワリナンコ／４’−
り（Ｗａｒｌｎａｎｃｏ　Ｐａｒｋ　）　　の湖水試料
から得たものである。これらの試料を、酸素およびプロ
パンの下で増殖させることによって、微生物のスクリー
ニングを行った。次に、下記の方法で、做生物ケ分離し
、精製しかつ保持した。

これらの新たに発見され、分離された株の培養菌の保持
は、注意深く管理されねばならない。培養菌−″）好ま
しい分離および保持手段は、下記の通りである。ｌｒの
土堀または湖水試料を、下記第２表中に記載した無機塩
培地ＩＱｍｌ中に懸濁し、室温で１時間、沈降させた。

上澄液ケ、無機塩培地ｋ　Ｏｍｌが入っている３　００
　ｒｕｇフラスコ中圧接種する。この増菌フラスコを、
気状のエタンまたはグロ・母ンまたはブタンと空気（／
：／Ｖ／Ｖ）との雰囲気中で、振ＩＩ機上で、３０℃で
培養した。

９６時間以内に、培地Ｆｉ濁った。この坤′＃４培宜菌
の系列希釈をつくす、無機塩寒天平板上に塗床する。こ
れらの平板は、気密シールをもつ盤と備え付けのホース
連結をもつ外部スリーブと紮有するガラス製デシケータ
−中で培養されねばならない。

テシ’ｙ−−１−ＦＪ、％ＢＧ♂、気さ１１、エタンま
たｒ」プロパンまたけブタンと９気との混合ガス（／　
：　／　Ｖ／Ｖ）’ｆ−満たす。培養は、３０”Ｃで行
わねばならない。培養菌は、これらのデシケータ−中で
、９℃に於て、３力月ｌｌ１１生存する。しかし、しば
しば培養菌ゲ移すことが好１［い。

上に挙けた新株に加えて、本発明に有用な他の做生物株
を下に列誉する。これらは、すべて既知の株であり、ロ
パートＳ、ブリード（Ｒｏｂ＠ｒｔ　Ｓ。

１ｏｇｙ）ａｔｔｆｆ版〔パルチモア（Ｂａｌｔｌｍｏ
ｒｅ　）　：ウィリアムズ争アンド―ウィルキンズｊｄ
　（Ｗｌｌｌｌａ　−ｍｓ　＆　Ｗｌｌｋｌｎｓ　Ｃｏ
、）、／９’７り中に−Ｎｂ　ｔｆｉ、　サｔ’Ｌ　テ
いる分類方式ＩＣ（ｉＥって分類されている。各様の継
代培養ハ、米国メリーランド州ロックビル市（Ｒｏｃｋ
ｖｌｌｌｅ＋　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０　ｇ　ｋ　２　
）のアメリカン・タイグ曹カルチャー・コレクション（
＾ｍ５ｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｌｏｎ　　）（ＡＴＣＣ）の寄託所あるいは米
国イリノイス州４オリア■」（Ｐｅｏｒｌａ　ｌ１ｌｌ
ｎｏｌｓ　ｌｒ　／　６０　’／−）の米国ａ＋ｉ省ノ
ーザン・リジョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒ
ｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｌｏｎａｌ　Ｒ＠５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　）（ＮＲＲＬ）の寄託所に寄託さ
れている。各継代培養菌は、寄託ＰＪｒから、下記のよ
うな何個のＡＴＣＣまたはＮＲＲＬ株名称を与えられて
いる。微生物の中には、ＡＴＣＣ，ＩＪタログ・オプ・
ストレインズ　ｌ　（ＡＴＣＣＣａｔａｌｏｇ　ｏｆ　
５ｔｒａｌｎｓ　Ｉ　）第１Ｓ版％　　７９ｇ、Ｚに記
載されているように、２つの名称ゲもつものがあること
が紹めらｔしるであろう。

＼　　　　ｅ＋４　　　　〜　￥　匂　　　　く　も　
−艶　θ＜　　　　　　（＜　　　　　　＜　　　　　
　＜　　　　　　２２＜　　　　　　＜＜上記株の形態
学的および分類学的特性、ならびにこれらのａ′？記載
している参考文献またＦｉ特許を下に示す： ロドコックス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
Ｏ９蝕頭仔リー）〔アルスロパクテルすへｒｔｈｒｏｂ
ａｃ−ｔｅｒ　）ｉｐ、）＾Ｔｃｃ／ｑ／ｌｌＯＣＭ、
ゴールドパーグ（Ｍ、　Ｇｏｌｃｌｂｅｒｇ）　　他、
Ｃａｎ、Ｊ、ＭＩｃｒｏｂｌｏｌ、＋３＋３２９（／９
！ｆ７）〕この菌は、ダラム陰性桿菌であり、通常、対
数期に於て非常に蝮くかつふっくらとしており、定常期
には球菌影に近づき、主と１．て対伊なし１、短釦、非
運動性で、カタラーゼ陽性である。普通ブロスすなわち
栄養ブロス、コハク酸塩、葡萄糖、脂肪族炭化水素、ｎ
−パラフィンで好気的に増殖する。メタンでに増殖しな
い。

グセウドモナス嘗アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓａｅｒｕｇｌｎｏｓａ　）　　（アルカリゲネス（
Ａｌｃａｌｌｇｅｎａｓ）ｓｐ、）ＡＴｃｃ／ｊｊ２ｊ
（エツソ譬リサーチ・アンド・エンジニアリング社（Ｅ
ｓ５ｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈａｎｄ　Ｅｎｇｌｎ＠ｅｒｌ
ｎｇ　Ｃｏ、）　　の米国特許第３．３０ｇ　、３０３
号、”　　２４　ｍ！；０２号および米国特許第３．３
０／、７１，１．号〕この菌は、ダラム陰性小桿菌で、
非運動性である。葡萄糖を発酵させる。Ｃ，−Ｃ２゜ｔ
＋ｈ肪族炭化水素、例えばＣ２−Ｃ１１０’−”ラフ−
インおよびＣ６−ｃ、。オレフィンで好気的に増殖する
。

アルスロパクテル・ペトロレオファグス（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔ＠ｒ　Ｐｅｔｒｏｌｅｏｐｈａｇｕｓ　）　（
株Ｎｏ、、２−／！；）　（日本油脂株式会社の米Ｌｌ
ｉ１７Ｆ、ｆ許第３．７乙コ、９９７号）この菌は、ダ
ラム陽性または陰性、非運動性桿ｋ　ａ　Ｃ２−Ｃ６お
よびＣ１，−Ｑ、、　（１−７ぐラフイン、葡萄糖、ク
エン酸塩、グリセリンで好気的に増殖する。メタンでは
増殖しない。

アルスロパクテル令シングレツクス（Ａｒｔｈｒｏｂ−
ａｃｔｅｒ　ｓｌｍｐｌｅｘ　）＾ＴＣＣ２／θ３２Ｃ
Ｂ−／２９株）〔ブライドケミカル社（Ａ１１ｌｓｄ　
Ｃｈｅ　−ｍｌｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）　　の米国特許第
３　、１．．２２　、Ｑｂ！ｒ号〕この餉は、桿菌形お
よび琢菌影の両方のダラム陰性細胞であり、運動性、非
胞子形成性である。

ＣＭ　−０１６ｎ　−ｚ？ラフインでｊＪＩＩ殖する。

メタンでは増ｒＡシし、ない。

グセウドモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ　
−ｌｕｍ））ＡＴＣＣ／、ｆｆｊ２ｇ（エッソ争リサー
チ・アンド−エンジニアリング社（Ｅｓ５ｏ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈａｎｄ　Ｅｎｇｌｎｅｅｒｌｎｇ　Ｃｏ、　）
の米１ｍ１％許第３　、３０ｇ　、０３５号お工ひＲｅ
、第２４．！；０２号〕この菌は、ダラム陣性の小桿状
体で、非運動性である。＊＠糖？発酵させる。Ｃ２−Ｃ
ＢｏｌｊＴ肪か炭化水素、例えばＣ２−Ｃ５ｏ　　ｎ−
・母ラフインお工びＣ６−Ｃ，。オレフィンで好気的に
増殖する。

ブレビバクテリウム（ｅｒｅｖ＋ｂａｃｔｓｒ＋ｕｍ）
ｓｐ。

ＡＴＣＣ／４ＡＩＩ？［メルク・アンド・カン／ぐニー
社（Ｍｅｒｋ　＆　Ｃｏ、　ｌｎｅ、）　　の米国特許
第３．２．３９．３９’７号〕このＷ４Ｖｉ、ダラム陽
性の短い桿状体。Ｃ２＝−Ｃ，。アルカンおよびアルコ
ールならひに普通寒天で増殖する。メタンでは増殖しな
い。

ブレビバクテリウム・フスクム（Ｂｒｅｖｌｂａｃｔｅ
ｒ　−１ｕｍずｕｓｃｕｍ　）　　＾ＴＣＣ／Ａ；９９
３〔Ｎ、サ−ｆ　トウ（Ｎ、　５ａｌｔｏ　）　　他、
Ａｇｒ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋　２　ｇ　ｓｑざ
（／ｑ６ダ）およびＮ、サイヘトウ（Ｎ、Ｓａｌｔｏ）
Ｂｌｏｃｈｅｍ、Ｊ、＋　！；　７　、７　（／　９４
　！　）　］この１ｌｉｔ、ダラム陰性で、短い、枝分
かれのない桿状体で、草純な細胞分割で繁殖し、プレビ
バクテリアセアエ（日ｒｓｖｌｂａｃｔｅｒｌａｃｅａ
ｓ　）　ＭＬＬ＠かれ、運動性である。帯褐色または帯
黄色または橙色色素ケ生産する。普通プロス、葡萄糖、
コハクＰ地、脂肪族炭化水素およびパラフィンで好気的
に増殖する。

メタンでＦｉ増殖し、ない。

アルカリゲネス・エウトロフス（＾ｌｃａｌ１ｇｅｎｅ
ｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　）　（ヒドログノモナスーエウ
トロファ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ　ｅｕｔｒｏ
ｐｈａ　）　）　ＡＴ　ＣＣ／　７　ｂ　９　？　（Ｉ
ｎｔｅｒｎ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ
、。

／９．３ｇ！；（／９６デ）（粘り株）、Ｂ、Ｆ、　　
ジョンソン（日、Ｆ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　）　　他、Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、。

ｉｏｑ、ｌＩｂざ（／９り／）、Ｄ、Ｈ，デービス（Ｄ
、Ｈ，Ｄａｖｌｓ　）　　他、＾ｒｃｈ、　Ｍｌｃｒｏ
ｂｌｏｌ、、　７　Ｑ。

、２（／９７０））この＃ｉは、グラム隙性単細胞桿状
体で、連動性であり、周毛性鞭毛？肩する。非胞子形成
性。コロニーは、不透明または白色着たねクリーム色で
ある。普通プロス、葡萄糖、コノ・り給烙、脂肪族炭化
水素、・（ラフインで好気的に増殖する。メタンでは増
殖し、ない。

ミコバクテリウム・アルプム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌ
ｕｍａｌｂｕｍ　）＾７ｃｃｕｑＡりＡ　（：Ｊ、Ｐｌ
、ベリー（Ｊ、Ｊ、Ｐｅ＋ｒｒｙ）他、　　Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｌｏｌ、、　　／ヨ／　　、４−１　　Ａ；／３
Ｃ／９７２）　　、Ｊ、Ｇｅｍ、Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ。

ｇ２、ｉｔ３＜１ｑｔｑ＞〕この菌は、グラム法では容
易に染色されないが、通常、ダラム陽性と考えられてい
る。非運動性で、僅かに曲がった、または真直ぐな桿状
体で、時々枝分かれがあり、線状または菌糸状増殖が起
こり得る・Ｉヤラフインおよび脂肪族炭化水素で好気的
に増殖する。メタンでは増殖しない。

ミコバクテリウム・パラフイニウム （Ｍｙｃｏｂａｃｔａｒｌｕｍ　ｐｓｒａｆｆｌｎｌｃ
ｕｍ　）ＡＴＣＣ／２４りＯ（Ｊ、Ｂ、デービス（Ｊ、
Ｂ、　Ｄｅｖｌｓ　）他、Ａｐｐ。

Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、、　’Ｉｓ　Ｊ　／　０　（／　
９　！ｒ　Ａ　）、マグノリアペトロリアム社（Ｍａｇ
ｎｏｌｉａ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　Ｃｏ、）　）この菌
は、ダラム陽性の細長い桿状体で、非運動性であり、あ
る増殖段階に於て耐酸−アルコール性である。細胞およ
び細胞壁中にアイリツシュリピド（Ｉｒ１ｓｈ　１ｉｐ
ｉｄ　）を含む。コロニーは、通常力四チノイド顔料の
ために、規則的にまたは可変的に黄色または橙色である
。Ｃ２−Ｃ，、ｎ−アルカンのようなパラフィン炭化水
素、脂肪族炭化水素、エタノール、酢酸塩で好気的に増
殖する。メタンでは増殖しない。

ロドクロウス９０ドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　）　（ミコバクテリウム・ロ
ドクロウス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｒｈｏｄｏ
ｃｈｒｏｕｓ　）　ＡＴＣＣ２９６７０［Ｊ、Ｊ、ベリ
ー（Ｊ、Ｊ、　Ｐｅｒｒｙ　）他、Ｊ１日ａｃｔｅｒｌ
ｏ１．。

／／コ、！；／ＪＣ／　　？７ｕ）］この菌は、グラム
法で容易に染色されないが、通常、ダラム陽性と考えら
れている。非運動性の、短い、ふっくらとした桿状体で
、催かに曲がっており、丸いか時に厚くなった両端を有
し、枝分かれがあり、まれではあるが時にＹ形細胞が見
られる。耐酸−アルコール性。黄色乃至橙色色素。パラ
フィンおよび脂肪族炭化水素で好気的に増殖する。メタ
ンでは増殖しない。

、２　？　Ａ　７２　（Ｊ、Ｊ、ベリー（Ｊ、Ｊ、　Ｐ
ｅｒｒｙ　）他、Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ＊、　　
９　’Ｉ、／９／９Ｃ／９４７）、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｌｏ１ｍ＊　　９　Ａ、３／ｇ（／９乙ｇ）、Ａｒｃｈ
、　ＭｌｋｒＯ−＊　９７％ｇ　７　（／　９７３　）
、Ｊ、　Ｇｓｎ、　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、、　ｇ　２、
／１，３（／９’／’Ａ）％Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ
、、　　／／ｇｓ　　３９４ｔＣ／　９７４’））ＡＴ
ＣＣ２９６りＯと同じ特性。

／ｇｌＬｔＣＲ１Ｓ、ブリード（Ｒ，Ｓ、　Ｂｒｅｅ＜
１　）、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、、　’７　Ｊ、／
　５　（／　９　！；　７　）　）ＡＴＣＣコ９６りＯ
と同じ特性。

ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃ■μシ）ｓｐ、［ノカルジ
ア・ネオオノや力（辺憇σＤゴ実関２−ａｃａ、））Ａ
ＴＣＣコ／４１９９　（株２−３３＞（日本油脂株式会
社の米国特許−第３．７１，２，９９７号）この菌は、
ダラム陽性桿状体または線条であり、非運動性である。

Ｃ２−Ｃ４およびＣ１１−Ｃ１８ｎ　−ハラフィン、葡
萄糖、グルコン酸塩、クエン酸塩、ゴハク酸塩で好気的
に増殖する。メタンでは増殖しない。

ロドクロウス・ロドクロウス（肋列−叩ｏｃｃｕｓｒｈ
ｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　）　（ノカルジア・）やラフイニ
カ（Ｎｏｃａｒｄｌａ　　ｐａｒａイｆｌｎｌｃａ　　
）　　八ＴＣＣ２／／９ｇ〔協和発酵工業株式会社の米
国特許第３．’Ｂ；／　、３３７号〕この菌は、ダラム
陽性桿状体または細胞で、非運動性である。砂糖を発酵
させる。Ｃ，−Ｃ４およびＣ，２−Ｃ＋　７　ｎ−アル
カンで好気的に増殖するＯメタンでは増殖しない。

プセウドモナスψクルクラエ（Ｐｓｓｕｄｏｍｏｎａｓ
ｃｒｕｃｕｒａｅ　）　ＮＲＲＬ　　Ｂ−１０２／　（
上記／４−ギーズ・マニュアル・オプ・デイターミネテ
イプ・）９クテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎ
ｕａｌ　ｏｆ　ＤｅｔｅｒｒｎｌｎａｔｌｖｅＢａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ　）、第３版、／９７’ｌ〕この菌は
、ダラム陰性好気性桿状体である。極性単毛性鞭毛によ
って運動性。螢光色素を生産しない。Ｃ２−Ｃ１゜アル
カン、Ｃ２−Ｃ，。第一アルコール、フチルアミンおよ
び普通寒天で好気的に増殖するＯメタンでは増殖しない
。

グセウドモナス・フルオレッセンス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　
）　Ｎ　ＲＲＬ　　Ｂ　−／！＃４（上記パーギーズ・
マニュアル・オブ・デイターミネテイプ・／々クテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｓｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
ｔｅｒｍｌｎａｔｌｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｌｏ　−１ｏｇ
ｙ　）、第３版、／９７１１”Ｊこの菌は、ダラム陰性
、好気性桿状体で、運動性である。螢光色素を生産する
。ゼラチンを加水分解する。非胞子形成性。Ｃ２−Ｃ５
゜アルカンおよび第一アルコールの存在下に於て、無機
塩平板上に小黄色コロニーを生じる。普通培地上でも増
殖する。メタンでは増殖しない。

グセウドモナス・モノ４シア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｃｅｐａｃｌａ、　）　Ｃプセウドモナス轡ムルチがラ
ンスＣＲ，Ｙ、スタニアー（Ｒ，Ｙ、　５ｔａｎｌｅｒ
　）他、Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、、　　’Ａ３＝　／　！；　９　
（／　９　ｌ、ｊｐ　）およびＲ，Ｗ、バラード（Ｒ，
Ｗ、　Ｂａ１ｌａｒｄ　）他、Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、、　　Ａ　Ｏｂ　／　９９　（／
　９りθ）〕この菌は、ダラム陰性、単細胞桿状体で、
極性、多毛性鞭毛で運動性である。ゼラチンを加水分解
する。

フェナジン顔料を生産する。非胞子形成性。コハク酸塩
、葡萄糖、普通ブロス、ツクラフイン、脂肪族炭化水素
ｂ　ｃ　　　ｃ　　アルコール、ブチルアミン４ で好気的に増殖する。メタンでは増殖しかい。

ゾセウドモナス會プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕ
ｔｌｄａ　）　　タイプＡ　　ＡＴＣＣ／り４ｔ！ｒ３
（”Ｒ，Ｙ。

スタニア−（Ｒ，Ｙ、　５ｔａｎｌｅｒ　）他、Ｊ、　
Ｇｅｎ。

Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、、　＜ｚ　３、／！；９Ｃ／９乙
乙）〕この菌は、ダラム陰性、単細胞桿状体で、極性、
多毛性鞭毛で運動性である。ゼラチンを加水分解せず、
また脱窒素しない＠拡散性螢光色素を生産する。

非胞子形成性。コハク酸塩、普通ブロス、葡萄糖、ツク
ラフイン、脂肪族炭化水素％Ｃ２−Ｃ４アルコール、ブ
チルアミンで好気的に増殖する。メタンでは増殖し々い
。

プセウドモナス・アエルギノーザ ／！；３２２Ｃエッソ・リサーチ・アンド・エンジニア
リング社（Ｅｓ５ｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｅｒ
＋ｇｌｎｅｅｒｌｎｇＣｏ、　）の米国特許第３．３０
ｇ　、０３３号、Ｒｅ第２１．、ｊ！；０１．号オヨび
米国特許第３．．３０／、７１，１゜号〕この菌は、ダ
ラム陰性、小桿状体で、運動性である。殿粉および葡萄
糖を発酵させる。螢光およびフェナジン色素を生産する
。非胞子形成性。

Ｃ２’！。脂肪族炭化水軍、例えばＣ２−０３゜ｎ−ノ
やラフインおよヒｃ２−ｃ３ｏ　　オレフィンで好気的
に増殖する。

遺伝手術誘導体も、微生物細胞の生産およびこれらの細
胞から誘導される酵素製剤の製造に使用され得ることは
言うまでもないであろう。

第２表 すべての菌は、好ましくは、μ週間毎に、下記組成を有
する培地を含む無機塩寒天平板上で継代培養される。

Ｎｔ３２ＨＰＯａ　　　　　　　　　　　Ｏ−２／　１
１ＮａＨｐｏ　　　　　　　　　　　　０．０９１４ ＮａＮｏｓ　　　　　　　　　　　　Ｃ２，Ｃ７１！Ｍ
ｇＳＯ４・’７Ｈ２００，２１！ にＣ＋　　　　　　　　　　　　　　Ｏ０ＯダＩＣａ　
ＣＩ　２　　　　　　　　　　　　θ、ｏｉｓｉＦｓＳ
Ｏ４”りＨ２Ｏ／　　　　　Ｑ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２ｏ　　　　　　　　　　θ、０／　
ＱＨ５ＢＯ４０，０２ｍｙ ＭｎＳＯ４−、！；Ｈ２００，／４ｔ　ＩＺ　ｎ　Ｓ　
Ｏ４０−０＝２　”ＥＩ ＭｏＯｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　（７ｅ　Ｏ−１”９寒天　　　　
　１５　１ｉ１ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　／　　　
を微生物の商業的繁殖方法では、一般に、段階で繁殖を
進行させることが必要である。これらの段階は、方法の
性＊および微生物の特性によって、少ないことも、多い
場合もあり得る。通常、繁殖は、通常フラスコ内に人っ
ている予め滅菌した普通培地へ培養斜面から細胞を接種
することによって開始される。フラスコ内で、微生物の
増１１＝は、種々の手段、例えば完全な曝気のための振
盪、および適当な温度の保持によって促進される。この
工程または段階を、同じ豊たはより大きい容量の、普通
培地が入っているフラスコまたは容器内で、７回以上繰
返す。これらの段階は、便宜上、培養発育段階（ｃｕｌ
ｔＬＩｒａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ
　）　　と呼ばれる・最終発育段階からの、培地を伴っ
た、または伴わない微生物を大規模発＃槽中へ導入また
は接種し、商業的な量の微生物あるいは微生物からの酵
素を生産させる。

段階的に微生物を増殖させる理由は種々あるが、主とし
て微生物の増殖および（またＦｉ）微生物からの酵ぎの
生産のために必要な条件に依存する。

これらの条件には、微生物の安定性、適当な栄養源％Ｉ
）Ｈ％浸透圧関係、曝気度、温度、発酵中の純粋培養条
件の保持が含まれる。例えば、蓼生物細胞の最高収量を
得るためには、最終段階の発酵条件を、培養発育段階で
微生物の増殖を得るために実施した条件と幾らか変えね
ばならないことがあり得る。培地の純粋性の保持も、考
慮すべき極めて重要なことであり、本発明の微生物の場
合のように好気条件下で発酵を行う場合には、特に重要
である。もし、発酵を最初から大発酵槽中で開始したと
すると、かなりの収量の微生物および（または）微生物
からのデヒドロゲーゼ酵素を得るために比較的長時間を
要する。このことは、勿論、培地の汚染および微生物の
突然変異の可能性を増大する。

微生物の増殖に用いかつデヒドロケッナーゼ酵素系を含
む培地は、燐酸塩、硫酸塩、硝酸塩の無機塩ならびに酸
素および０２　以上の化合物源を含む。発酵は、一般に
、！ｒ０〜約０〜℃の範囲の温度、好ましくは約、２５
０〜約！ｒＯ℃の範囲の温度で行われる。培地のｐＨは
、約ｑ〜９、好ましくは約５．３−ｆ　、　、ｔ、より
好ましくはす、ｏ〜７．５の範囲のｐＨに調節されねば
ならない。発酵は、常圧で行うことができるが、約３気
圧以ｆまでの高圧も使用することができる。

典型的には、微生物を増殖させかつアルコールデヒＰロ
ナツナーゼ酵素活性を誘発させるために、微生物を培地
中に接種し、この培地を％０２　　以上のアルキル化合
物と酸素とを含む混合ガスと接触させる。連続流動培養
のためには、適当に装備された発酵容器、例えば、内部
冷却あるいは外部再循環冷却ループのいずれかを備えた
、攪拌機、バッフル付き発酵槽またはスフ４−ジ塔発酵
槽中で、微生物を増殖させる。新鮮な培地を、毎時０．
０１〜／培養物容竜に等しい連間で、連続的に培養物中
へ送りこみ、かつ培養物の容積が一定に保たれるような
速度で、培養物を取抄除くことができる・Ｃ７以上のア
ルキル化合物と、酸素と、恐らくは二酸化炭素または他
のガスとを含む混合ガスを、好ましくは、容器の基底で
、スノぐ−ジャーを通して連続的にバブリングすること
によって培地と接触させる。培養のため酸素源は、空気
または酸素または酸素に富む空気であることができる。

使用済みガスは、容器のヘッドから除去することができ
る。使用済みガスは、外部ループを通して、あるいはガ
スインデューサーインペラーによって内部的に、再循環
させることができる。ガスの流速および再循環は、微生
物の最高増殖および０２　　以上のアルキル化合物の最
大利用を与えるように設定されねば力らない。

第一および第ニアルノールデヒドロダナーゼ酵素分画を
得たい場合には、まず、細胞を、例えばソニケーション
（５ｏｎｌｃａｔｌｏｎχフレンチプレツシヤーセルな
とで破壊した後、例えば、１０〜２０．０００ｙ、ｇ　
　で約／ｊｔ−３０分間遠心分離して、細胞破片を除去
する。この増殖培地からの微生物細胞の採取は、通常用
いられる標準的方法、例えば凝集および（または）沈降
および（または）沈殿と、それに続く遠心分離および（
ｔたは）濾過によって行うことができる。このバイオマ
スは、例えば凍結または噴霧乾燥によって乾燥すること
もでき、アルコールデヒドロゲナーゼ転化工程で使用す
るためＫこの形で用いることができる。第一および第ニ
アルノールデヒドログナーゼ酵素系の場合には、可溶性
抽出物（これは、随意に１不活性担体上に固定化させる
ことができる）の形で、酵素を都合よく使用することが
できる。

本発明を実施するために、例えば、誘発性増殖基質また
はそれから誘導される酵素製剤を含む普通培地中で好気
的に増殖させである０３以上アルキル化合物利用性微生
物から微生物細胞が誘導される、上記の方法のようにし
て、第一および第ニアルノールデヒドロｒナーゼ酵素を
得る。微生物がその中で誘発されかつ増殖する普通培地
は、フォスターおよびデービス（Ｆｏｓｔｅｒ　ｅｎｄ
　ＤａｖｌｓχＪ、　　Ｂａｃｔｅｒ　量ｏ１．−ｊ：
ｉ−１，−１−：１　％　　／　　９　−１’ｌ　　（
／　　９　　ｂ　　Ｏ）　　中　しこ記載されている培
地であることができる。一度、微生物が誘発されかつ増
殖すると、好ましくは微生物細胞を採取し、かつ得られ
た休止微生物細胞または例えば遠心分離によって得られ
る酵素製剤を、そのま＼、久に、緩衝液中で、アルコー
ル、ジオール、アルデヒドを対応する酸化生成物へ転化
させるため（あるいはメチルケトンをアルコールへ転化
させるため）に用いることができる。緩衝液中の基質と
誘発微生物細胞または酵素製剤との混合物を、所望の転
化度が得られるまで定温放置する。その後で、生成物を
、通常の方法、例えば蒸留などによって回収する。基質
の対応する生成物への転化は、一般に約！ｒ〜９０℃の
範囲の温度および約ｑ〜９の反応媒質ｐＨＫ於て、好ま
しくはｇｏ−ｇθ℃の温度および約Ｓ、Ｓ〜ｇ、ｓの反
応媒質ｐＨで行われる・ 本発明の方法は、パッチ式、半連続式、連続式、共流式
または向流式で行うことができる。随意に５酵素製剤ま
たは微生物細胞と緩衝液とを含む懸濁液を、管反応器中
を上昇する空気流に対して自流的に１激しく攪拌しなが
ら下方へ流す０この下流流懸濁液から頂部層を除去する
が、培養物と残りの緩衝液とは、より多量の酸化可能な
基質とともに、かつ所要に応じて新しい酵素製剤または
誘発環される。

微生物の増殖と酸化工程とけ、同時に、但し別々に行い
かつ酸化工程でずっと高い曝気（例えば。

増殖に所要な曝気の少なくとも一倍、好ましくは少々〈
と４，１−倍の空気過剰）を用いることによって都合よ
くカップリングさせることができる。増殖工程および脱
水累工程の両方を、同一反応器中で、順次操作または同
時操作で、正規の曝気および強力表曝気を交互に用いる
ことによって行うことができる。

以下、本発明を、実施例によってさらに説明する。しか
し、これらの実施例は、決して本発明を限定するものと
考えるべきではない。特に断らない限り、部および優は
、重量による。

実施例／ 粗製抽出物を用いる酸化： 下記組成（水ｉｓ当たシ）を有する上記フォスターおよ
びデービ、Ｘ（Ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｄａｖｌｇ　）
％Ｊ、　Ｂｓｃｔｅｒｌｏｌ、、　　？　／％　／　９
．２４１　（／　９　ＡＡ　）記載の普通培地を調製し
た＠ Ｎａ　ＨＰＯＯ，２／　１ ４ Ｎ　ａＨ２ＰＯａ　　　　　　　　　　　Ｏ−０９１Ｎ
ａＮＯ，コ、０１！ ＭｇＳＯ４・りＨ２Ｏ０，２１ にＣＩ　　　　　　　　　　　　　Ｑ、ＱグｇＣｅ　Ｃ
ｌ　２　　　　　　　　　　　０　＊θ／３１ＦｅＳ０
４・りＨ２Ｏｌ　　　　ｌ１ｇＣｕ５Ｏ４−ｊＨ２００
，０ノ露ｇ Ｈｓ　ｅｏ　ａ　　　　　　　　　　　　　Ｏ＃　０２
　ｌｌｙＭｎＳＯ４−５Ｈ２００，０２Ｑ Ｚ　ｎＳＯ４０ｅ　’Ｑ　”９ Ｍ０Ｏ，Ｏｅ０２ｍｙ この普通培地のｐＨを、酸または塩基の添加によって７
．０にＭ６節し、この培地り００ｖｔｔずつの試料を、
複数の２．Ｓｔ容振盪フラスコ中へ入れた。

この振盪フラスコを、陣大平板上の均一な微生物コロニ
ーを含む接種用細胞ループ（隔離物の純粋性は、顕微鏡
検査で確認した）で接種した。この隔離物は、ガス比／
：／Ｖ／Ｖのプロパンと空気との雰囲気下に於て寒天平
板上で保持され、ａ週間毎に移しかえたものである。／
−グローノールおよびコープロバノールで増殖されるた
めには、培地に、０．３９６のこの液体増殖基質を補給
し、た・気状アルカンで増殖させるためＫは、接種され
たフラスコの気相を、Ｖ／Ｖ基準で／：／の比率のプロ
／９ノまたはメタン（対照）と空気とからなる混合ガス
で置換した。この接種フラスコを、気密に密閉し、回転
振盪機上で％　ａ２　ｇ　Ｏｒｐｍ　ｓ　ｊ　０℃に於
て、−日間、媒質中に濁りが生じるまで、定温放置した
。

かくして増殖した細胞を％　ｐＨ７、（７のコ５ｍＭ燐
酸カリウム乾衝液で２回洗い％　！；　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ
ｔ、およびデオキシリがヌクレアーゼ（０、Ｏ，！−１
１９／Ｍ）を含む同じ乾衝液中に懸濁させた。フレンチ
プレッシャーセＡ／　（Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓｕｒ
ｅ　ｃｅｌｌ　）　　を６０ｍＰａで７回通すζ２とに
よって、９℃に於て細胞懸濁液を破壊した。この破壊細
胞懸濁液を、ｉｓ　、ｏｏｏｘｔｚで／、！−分間遠心
分離して未破壊細胞を除去した０無細胞粗製抽出物（酵
素製剤）を、さらに、酸化研究に用い念。

試験した第一および第二アルコールの脱水素速度は、還
元ＮＡＤ　　の生成（３ダＯｎｍに於て励起。

’Ｉ　Ａ　Ｏｎｍに於て放出）を追跡することによって
螢光分光光度計で測定された。試験系（３ｃｃ）　ｔｒ
ｉ、７３０８モルのｐｌ！７．Ｏの燐酸ナトリウム緩衝
剤と７．０μモルのＮＡＤ＋と所定歓の酵素製剤と２０
μモルのアルコール基質とを含んでいた◎反応は、基質
アルコールの添加によって開始され念。

生成物のアルデヒドまたけケトンは、水素炎イオン化ガ
スクロマトグラフィー（ステンレス鋼製カラムを１１０
℃の恒温に保った）を用い、真の標準との保持時間の比
較および同時クロマトグラフィー（ｃｏｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ　）　　によって同定きれた。

蛋白質／　ｍｙ当たり毎分生成される生成物のｎモルと
して比較化速度を示した。得られた結果を第３表に示す
。

実施例コ 酵素の精製： ｌ工程で精製を行った。各工程はダ℃に於て行った。特
に断らない限り、緩衝液は１．ｉｍＭのジチオスレイト
ールを含む、ｐＨ７，０の０．０！；Ｍ燐酸ナトリウム
緩衝液であった。特に断らない限り、遠心分離は、ｉｏ
　、ｏｏｏｘｙで２０分間行・つた。

工程／（粗製抽出物）： 微生物フセウドモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ→ＮＲＲＬ　　
Ｂ−／２’ｌｌｌの凍結細胞（湿潤重量４００＆”）を
融解させ、／ｌの緩衝液中に懸濁させた。この細胞懸濁
液を、６θｍＰａに於て、フレンチプレッシャーセルラ
２回通すことＫよって破壊した。この破壊細胞懸濁液を
、遠心分離して細胞破片を除去した。得られた粗製抽出
物に、グリセリンを、最終濃度Ｓ％まで添加した。

工ａ　２　（硫酸アンモニウムによる分別）：工程／で
得た粗製抽出物に、硫酸アンモニウムを、３０％飽和ま
で添加した。生成した沈殿を、遠心分離しかつ捨てた。

上澄液に、さらに硫酸アンモニウムを、４０％飽和まで
添加した。溶液のｐＨは、水酸化アンモニウム溶液で、
絶えず７．０に調節した。生成した沈殿を遠心分離によ
って除去し、少量の緩衝液に溶解させた。第一および第
二アルコールの両アルコールデヒドロゲナーゼ活性を含
むこの分画を、５ｍＭジチオスレイトールとＳチグリセ
リンとを含む、ｐＨ７，０のｏ　、　ｏｏｓＭ燐酸ナト
リウム緩衝液に対して／晩中透析した。

工程３（ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィ
ー）： 工程コで得られた透析済み分画を、５ｍＭジチオスレイ
トールと５ｅＩｂグリセリンとを含むｐＨ’７．０の０
．００３Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液で平衡化されているＤ
ＥＡＥ−セルロースカラムへ適用した〇カラムを、、５
ｍＭジチオスレイトールと５チグリセリンとを含む、ｐ
Ｈ？、　、　０の０．０！；Ｍ燐酸塩緩衝液ＡＯＯｍｔ
で洗った後、同一緩衝液中０−０．３Ｍ　ＮａＣｔ　の
直線勾酸で溶出した。

アルコールデヒドロゲナーゼ活性はコ分画に分離され、
約０　、２！ｒＭ　　ＮａＣ１濃度で溶出された分画Ｆ
ｉ第一アルコールに対して活性優先性を有しく第一アル
コールデヒドロゲナーゼ）、０．５ＭＮａＣ１濃度で溶
出された分画は第二アルコールに対して活性優先性を有
していた（第ニアルノールデヒドログナーゼ）。両方の
アルノールデヒドロｒナーゼ活性分画を、別個に合わせ
た。硫酸アンモニウムを、ｌ、０４飽和を与えるように
添加して。

蛋白質を沈殿させ、沈殿を、少量の緩衝液に溶解し、緩
衝液に対して透析した。

第一アルコールデヒドロゲナーゼの性質は、Ｃ，ブレン
デン（Ｃ，Ｂｒａｎｄｅｎ　）他藩′ザ壷エンザイムズ
（Ｔｈｅ　Ｅｒｒｚｙｍｅｓ　）　　、ｇイヤー、Ｐ、
Ｄ。

（Ｂｏｙｅｒ、　Ｐ、Ｄ、）編、第１／巻〔アカテミッ
ク・プレス社（Ａｃａｄｅｍｌｃ　Ｐｒｅｓｓ　）　：
　二：ｘ−−＝ｉ−り、／９り！ｒ）〕／θ３−／θｑ
（上掲）に記載されている公知のアルコールデヒドロゲ
ナーゼの性質と似ていた◎ 工程グ（ポリアクリルアミドゲルカラムクロマトグラフ
ィー）： 、工程３からの第ニアルノールデヒドログナーゼ分画を
、さらに精製処理した。工程３がらの透析済み活性分画
の試料、２１を、緩衝液で平衡化されているポリアクリ
ルアミドグル〔ビオーラド社（日１ｏ　−Ｒａｄ　Ｃｏ
ｒｐ、　）のビオ−グル（Ｂｌｏ−Ｇｅｌ）Ａ　−／　
、ｊｍ〕カラＡ（ｉｌｉ径コ３ｖｔｍ、×長さ１００ｃ
ｒｎ）に適用した。各２ｍ１分画を捕集した。第ニアル
ノールデヒドロダナーゼ活性は、管Ａ１３ｋから＆／Ｓ
θまで溶出され、管Ａ／ｌコがピークであった。紀ニア
ルノールデヒドログナーゼ活性分画を合わせた。グリセ
リンを、最終濃度Ｓ％になるように添加した。次に、こ
の溶液を、メンプランを備えた限外濾過装置で濃縮した
。

工程Ｓ（アガロース親和クロマトグラフィー）：工程ｑ
で得た濃縮液を、親和クロマトグラフィーのために５ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む緩衝液で平衡化されている
アガロース〔アフィ・グルブルー（Ａｆｆｌ　−Ｇｅｌ
　Ｂｌｕｅ　）　）親和カラム（θ１ｇ×ｉｇ　ｃｍ　
）に適用した。カラムを、同じ緩衝液／ＳθＶで洗った
後、ｊｍＭ　　ＮＡＤ＋を含む同じ緩衝液で溶出させた
。ｌｌずつの分画を集めた。第ニアルノールデヒドロｒ
ナーゼ活性は、管ｓｉｏ〜屋ｌＳに得られた。

精製工程の要約および各工程から得られた分画の性質を
第ダ表に示す。各分画中のＮＡＤ”−結合第二アルコー
ルデヒドロゲナーゼの活性は、螢光分光光度計を用い、
還元ＮＡＤ＋の生成（Ｊ４’Ｏｎｍに於ける励起％１Ｉ
６０ｎｒｎＫ於ける放出）を監視することによって測定
された。試験系＜、：ｙｙｔｔ）は、ＩＳＯμモルのｐ
Ｈ７，Ｏの燐酸ナトリウム緩衝液と、／、ＯｓそルのＮ
ＡＤ＋と、所定量の酵素分画と、２０μモルのノーグロ
／４′ノール基質とを含んでい穴、酵素活性／単位は、
毎分／ｎモルのＮＡＤ＋の還元を示す＠各分画中の蛋白
質濃度は、ｏ、＋、　ｏ−リー（０”＊Ｈ，Ｌｏｗｒｙ
　）他、Ｊｅ　Ｂｌｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　／　９３．２！ｒ！！　（／　９！ｒ／
　）の方法で測定したものである°。

実施例３ 性質 純度および分子量： 実施例コの工程Ｓで得られた精製酵素分画は、７．５−
ゲル中で、Ｓ、レイモンド（Ｓ、　Ｒａｙｍｏｎｄ）、
ＣＩ　Ｉ　ｎ　、Ｃｈ　ａｍ　−ｒ　ｇ　ｅ　’Ｉ！ｒ
！ｒ（／？Ａ−２）　　記載のクマシーブリリアントグ
ルーによる染色と、Ｇ、Ｊ、　　プリュワー（Ｇ、Ｊ、
　Ｂｒｅｗｅｒ）、　　アン・イントロダクション・ツ
ー・アイソザイム・テクニックス（＾ｎ　Ｉｎｔｒｏｄ
ｕｃ−レス（＾ｃａｄｅｍｌｃ　Ｐｒｅｓｓ）社；　ニ
ューヨーク、１ｑ７０〕／／７−１７９頁記載のニトロ
・ブルーテトラゾリウム活性染色との両方の染色を用い
て行ったポリアクリルアミドダル電気泳動で、単一の蛋
白質帯を示した。較正？リアクリルアミドダルカラムク
ロマトグラフィー分析で測定された第＝アルノールデヒ
ドａｌｌナーゼの分子量は、／ＩＩ！、０００　　ダル
トンであった。ドデシル硫酸ナトリウム（Ｏ，／％）の
存在下に於けるＩリアクリルアミドグル中での電気泳動
は、ダｏ　、ｏｏｏダルトンの分子量をもつ単一蛋白質
成分を与え、第ニアルノールデヒドロｒナーゼが、同一
分子量のり個の亜単位（亜単位蛋白質／分子当たシｔＩ
ｏ　、ｏｏθグルトン）からなることを示した。

基質特異性： 実施例コの工程５で得た精製酵素を、実施例１の方法で
、第一および第二アルコール、ジオール、アルデヒドの
酸化に用いた。これらの基質に対するデヒドロｒナーゼ
の特異性を、蛋白質ｇ、５′μ？当たりの毎分生成され
る生成物のｎモル数として、かつツー７’　ａ　ｔ＃ノ
ールの酸化速度（酸化速度１００チとして）に対する百
分率として第５表中に示した。

＼　　　　　　　　　　　　　　）））さ これらの結果は、第ニアルノールデヒドロｒナーゼ酵素
が広い基質特異性を有しており、短鎖λ−フルコール、
アルデヒド、／−アルコールオヨびある種のジオールに
対して活性であり、ａ−ブタノールに対して最高の酸化
速度を有することを示シている。分枝鎖アルコール、環
式アルコール、芳香族アルコールも、より低い速度で酸
化された。

この酵素は、ノープタノールの（ト）−および（→−異
性体の酸化速度が等しいことによって示されるように、
基質の立体特異性に対しては何らの選択性も示さなかっ
た。

ＮＡＤＰ　　を第ニアルノールデヒドロダナーゼのコフ
ァクターとして用いたとき、酸化速度はＮＡＤ　　の場
合の約ＳＯ係であった。ＮＡＤＨ２の存在下に於て、こ
の酵素によるアセトンのプロパツールへの還元（逆反応
）が起こったが、酸化速度は、酸化（前進反応）に対し
て観察された速度の約−〇係であった。

ｐＨの影響： 第二アルコールデヒドロダナーゼ酵素活性に及はすｐＨ
の影響を、０．Ｏ左Ｍ緩衝液（ｐＨ！ｒ　−ｇに対して
は燐酸ナトリウム緩衝液、９７１ｇ−１０に対してけト
リス・ＨＣｔ緩衝液）を用いて、ｓ−ｉ。

のｐｇ範囲で研究した。酵素活性は、実施例二記載の方
法に従ってＳｂ２の酵素を用いて、２．Ｓ−”Ｃに於て
測定した。酵素活性〜ｐＨのプロットを第１図に示す。

図かられかるように、酵素活性の最適ｐＨｌ−ｉ約７〜
９に見られ、活性は、はぼ／１ＩＯｎモル還元ＮＡＤ／
分に達した。

温度の影＃： 第ニアルノールデヒドログナーゼ酵素活性に及ばず温度
の影響を、ｐＨ７，０の燐酸塩緩衝液中で測定した。何
故ならば、この緩衝液のｐＨＶｉ％温度の変化によって
ひどく変わらないからである。反応混合物を、酵素（／
、Ｓｂ２）の存在下に於て、１０〜ｑＯ℃でＳ分間、予
め定温放置した後、同温度で、コープロバノールを添加
することによって反応を開始させた。酵素活性〜温度の
プロットを第２図に示す＠これらの結果は、デヒドロゲ
ナーゼ触媒反応の最適温度が４０−７ｇ℃であり、この
場合、活性は約３’ｌ−，３ｇ　ｎモル還元ＮＡＤ−７
分であるが、温度９０℃でも活性（約ココー２３ｎモル
還元Ｎ　Ａ　Ｄ　”７分）は依然として高いことを示し
ている。速度〜絶対温度の逆数のアーレニウスプロット
から算出した第ニアルノールデヒドログナーゼの活性化
エネルギーけｇ　、　２　Ｋｃａｌである。

酵素の熱安定性： ＮＡＤ結合第ニアルコーノーヒドログナーゼ酵素の熱安
定性をも、空気の存在下に於て、チオール保臘剤を添加
せずに、希薄酵素溶液（，３００μ９　／　ｍｙ　）を
用いて研究した０３種の異なる温度に於ける熱安定性（
酵素活性）〜時間のプロットを第３図に示す。図から、
４＆″ｃＫ於て７３分間加熱することによって酵素活性
が影響を受けないことがわかる。酵素は、ｇｓ−”ｃで
７Ｓ分間の加熱に対しても良好な安定性を示したが、９
２℃では顕著に失活し、沸騰によって変性された。酵素
の安定性および活性は、酵素の凍結および融解では変化
しなかった。

ミバエリス（Ｍｌｃｈａｅｌｌｓ　）定数：ＮＡＤ＋お
よびコープ口／ぞノール濃度の酵素活性に及ばず影響を
、２５℃に於て、ｐＨ７，０の０．０！；Ｍ燐酸ナトリ
ウム緩衝液で研究した。

ＮＡＤ＋に対するにｍ値の測定では、λ−ゾロノ９ノー
ルを飽和レベル（乙、４ｍＭ）に保ち、コープロバノー
ルに対するにｍ値の測定ではＮＡＤ　　を飽和レベル（
／ｍＭ）に保った。ラインウイーノ々−・パークプロッ
トから計算したＫｍ値は、ＮＡＤ＋　に対してはｇ、コ
Ｘ　／　０−’　Ｍであり、コープロバノールに対して
はｇ、！；×１０−”ｖであつ之。にｍ値が低ければ低
いほど、それだけ酵素がより活性であることが認められ
ている。

潜在的抑制剤の影＃： 第６表に記載した金属キレート剤およびチオ試薬の７種
の／　ｍ　Ｍ濃度の存在下に於て、第ニアルノールデヒ
ドログナーゼ酵素の精製抽出物によるコープロバノール
の酸化を行った０ 第　　　６　　　表 チオセミカルパジｒ　　　　　　　　　　　　＋＜ｚヨ
ード酢酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
θアセトアミド　　　　　　　　　　　　　　　θイミ
ダゾール　　　　　　　　　　　　　　ＯＮ−エチルマ
レイミド　　　　　　　　　　３３Ｓ、ダー・ジチオビ
ス−（ニーニトロ ベンゾエート）　　　　　　　　　　　　　１００ｐ−
ヒドワキシノルキュリベンゾエート１００エチレンジア
ミン四酢Ｍ　（Ｅ　Ｄ　ｖ＾）　　　　０シアン化カリ
ウム　　　　　　　　　　　　　θ／　ｒ　／　０−フ
ェナントロリン　　　　　　ｌＯθα、αｌ−ジピリジ
ル　　　　　　　　　　　９０チオ尿素　　　　　　　
　　　　　　　　　　θｓ−ニトローｇ−ヒドロキシキ
ノリン　　１０θＣｕ”　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　／　０８ｇ２＋　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　／　
０　（’第６表から、酵素の活性は、ｐ−ヒドロキシメ
ルキュリペンゾエート、＆、、！−’−ジチオビスー（
２−＝　ト０安Ｊｕｌ￥ｉ１．ｔ−二トローざ−ヒドロ
キシキノリンのような強力なチ゛オ試梨で抑制されるこ
とがわかる。／、ＩＱ−フェナントロリンおよび第二水
銀イオン以外の金属キレート剤に、配素活性全抑制しな
かった。

２−ブタノールの影ψ： 第ニアルノールデヒドログナーゼの活性は、酸化反応混
合物中のダθＱｍＭまでのノープタノールの存在によっ
て抑制これなかった。酬ネは、０．９Ｍのコープタノー
ル溶沿中で、なお元の活性のり０９６を示し、／、／Ｍ
のノープタノール溶液中で、元の活性の３０光を示した
。

要約すると、本発明は、第二アルコールに対して優先的
であるが、挑−アルコール、ジオ−ｋ、アルデヒドおよ
びメチルケトンをもそれぞれの対応する転化生成物へ転
化させる広い７２＋＝賀％異性を有する熱安定性アルコ
ールデヒドロゲナーゼ酵素と、挑−アルコールに対して
優先的な熱安定性アルコールデヒドロゲナーゼ酵素とを
提供することがわかる。

ダ図面の簡単々詐１中Ｊ 第１図は、ニーグロノ９ノールの酸化に用いられた、グ
セウドモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕ−ｄｏｍｏ
ｎａｓイ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）　ＮＲＲＬ　　Ｂ−
／、）、ｔｌｌｌ　　からの精製鯖ニアルノールデヒド
ログナーゼ酪素の幣駆ン占性〜ｐＨのプロットケ示し、 第２図は、ニーグロノ９ノールの酸化に用いらね穴、グ
セウドモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕ−ｄｏｍｏ
ｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｓ　）　ＮＲＲＬ　　Ｂ
−／２１１１１　　から（７’）　ａ　ｍａ　１．ニア
ルノールデヒドログナーゼＶ＞の酵素活性〜１０−９０
℃の温度のプロットを示し、駆３図は、コープロノ母ノ
ールを基質とし、て用い、Ａ、？″ｃ、ｇｓ°Ｃ，９ユ
℃に於て、希薄浴液として加熱さｊたときの、グセウド
モナス・フルオレッセンス（ＰｓｅｕｄＯｍｏｎ！！Ｌ
ｌｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）　Ｎ　ＲＲＬＢ　−／　２
’ｌ’ｌからの１丁（製第ニアルノールデヒドログナー
ゼレ素の酵素活性（最大値の％）〜時間σ）グロット？
示す。

女 ま 争 Ｈ ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ＦｊＧ、３ 第１頁の続き ＠Ｒ明　者　アレン・アイ・ラスキン アメリカ合衆国ニューシャーシ ー州サマーセット・アールディ ３ボツクス３９２デイ ４４８−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１徽生物細胞の増殖のための炭素およびエネルギー
   源を与えかつ微生物またはその遺伝手術誘導体またにそ
   の自然突然ＩＩ中にアルコールデヒドロゲナーゼ酵素活
   性を肋発する、少々くとも２個の炭素原子ヲ看する含炭
   紫化合物を含む普通培地中に於て好気条件下で予め増殖
   させである微生物またはその遺伝手術誘導体またはその
   自然突然変異株の細胞から′＠導されることｆ特徴とす
   る第一または第ニアルコールデヒドログナーゼ酵素。 Ｔ２１ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下に於て好気条
   件下で第一アルコールを対応する酸化生成物へ転化させ
   ることｆ躯徴とする特許請求の範ｖ１１第（１１項記載
   の第一アルコールデヒト”ロダナーゼ酵素。 ＋３１　　Ｎ　Ａ　［）　＋ｔたはＮＡＤＰ＋の看在下
   に於て知釦第−および帖ニアルコール、ジオール、アル
   デヒドを対応する酸化生成物へ転化させることｆ特徴と
   する特許請求の範囲第（１）項記載、の第ニアルコール
   デヒドロダナーゼ静翼。 包）　ポリアクリルアミドダルカラムクロマトグラフィ
   ーで測定して約ｌダＳ、Ｖθ０十ｓ、ｏｏ。 ダルトンの分子１（ライｊすることと、少なくとも５０
   ℃の温度に於て１時間以上安定であることとに％徴とす
   る第；アルコールデヒドロゲナーゼ酬紫。 （５１１−０−ｇ　！；　’Ｃに於て１時間り上安定で
   あることを特徴とする１時計・請求の範囲第（４１］Ｊ
   Ｉ記戦のデヒドロク゛９ナーゼｔ１ψ累。 （６１反応油付物中に於てアルコールまたはジオールま
   たはアルデヒドまたはケトンを、微生物あるいはその）
   ｙ４伝手術ｉ＃ｉ導体″または自然突然変異株からｉ４
   導される微生物細胞、あるいＦＪ、該細胞から製造され
   る酵素製剤と接触させる工程であって、細胞が予め１約
   ９０℃までの温度ｐｃ加熱されておｐかつツ生物が、微
   生物の細胞の増殖のための炭１およびエネルギー源を与
   えかつ微生物あるいはその遺伝子ｌｒｔ卿鳩体または自
   然突然変異株、あるいＦｉ酵酵素剤剤中アルコールデヒ
   ドロデナーゼ酵素活性ｆ誘発する、少なくともａ個の炭
   素原子を有する含炭算化合物を含む普泊培地中に於て好
   気条件下で予め増殖させである接触工程と、単離可能な
   館で生成物全生成させる工程とを特徴とする、アルコー
   ル、ジオール、アルデヒドの対応する酸化生成物への、
   あるいはメチルケトンσ）アルコールへの微生物学的転
   化方法。 ＩｆＪ　　アルコールカｃ、−ｃ６框−アルコールまた
   はｃＢ−ｃ、　Ｍニアルコールであり、ジオールがｃ、
   　−ｃ、ジオールであり、アルデヒドがｃ、−ｃ。 アルデヒドであり、メチルケトンかアセトンであること
   を特徴とする特許紬求の範囲第（６１項記載の方法。 （引　微生物が、Ｃ２−Ｃ，。アルキル化付物の存在下
   に於て好気条件下で増殖さゼた細菌または具―また＃′
   ｉ酵母であることを特徴とする請求の範囲第（６１項ま
   たは第《７１増記載の方法。 （０１　　酵素製剤が無細胞でありかつ反応媒質がニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチドケも含むことを特徴
   とする％許結求の範囲第《６１功−第（８１項のいずれ
   かｌ項記載の方法。 顛　酵素製剤が実質的Ｋｌｌ−された絨ニアルコールデ
   ヒドログナーゼであること？：％徴と寸る特訂梢累の範
   囲第（６）項一第《９１項のいずれかｌ項記載の方法。