JP2898022B2 - コラーゲン分解酵素の製造方法 - Google Patents
コラーゲン分解酵素の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は新規の生産菌を用いてコラーゲン分解酵素標
品を生産する方法に関するものである。
品を生産する方法に関するものである。
[従来の技術] 不溶性コラーゲン分解活性を有するコラゲナーゼは細
胞分散をはじめ、その他種々の生化学的試薬として幅広
く使用されている。一方、火傷や床ずれ、椎間板コラー
ゲン分解によるヘルニア、腰痛等の病気の治療用として
も利用される。これまでコラゲナーゼの生産にはクロス
トリジウム・ヒストリテクムが最もよく使われて来た
が、嫌気性菌であるために培養が難かしく、しかも病原
菌であるために危険性があった。これらの点を解決する
ための好気的培養による生産法はストレプトマイセスに
よるものが知られている。
胞分散をはじめ、その他種々の生化学的試薬として幅広
く使用されている。一方、火傷や床ずれ、椎間板コラー
ゲン分解によるヘルニア、腰痛等の病気の治療用として
も利用される。これまでコラゲナーゼの生産にはクロス
トリジウム・ヒストリテクムが最もよく使われて来た
が、嫌気性菌であるために培養が難かしく、しかも病原
菌であるために危険性があった。これらの点を解決する
ための好気的培養による生産法はストレプトマイセスに
よるものが知られている。
[発明が解決しようとする問題点] 本発明者は好気性条件下で培養して、新規なコラゲナ
ーゼを産生しうる菌株を取得するために、多数の微生物
を分離し、それらについて生産されるコラゲナーゼ活性
を検討した。その結果、従来、その生産物が充分検討さ
れていないチトファーガに属する菌株が高い活性を示す
ことを見出し、新規のコラーゲン分解酵素の生産が期待
された。本発明は新規生産菌チトファーガによるコラー
ゲン分解酵素部分精製標品の製造法に関するものであ
る。
ーゼを産生しうる菌株を取得するために、多数の微生物
を分離し、それらについて生産されるコラゲナーゼ活性
を検討した。その結果、従来、その生産物が充分検討さ
れていないチトファーガに属する菌株が高い活性を示す
ことを見出し、新規のコラーゲン分解酵素の生産が期待
された。本発明は新規生産菌チトファーガによるコラー
ゲン分解酵素部分精製標品の製造法に関するものであ
る。
[問題点を解決するための手段] 本発明はチトファーガに属する生産菌を培養して、培
養液からコラーゲン分解酵素部分精製標品を採取するこ
とによるコラーゲン分解酵素標品の製造方法である。
養液からコラーゲン分解酵素部分精製標品を採取するこ
とによるコラーゲン分解酵素標品の製造方法である。
本発明に用いられる微生物はチトファーガに属するコ
ラーゲン分解酵素生産菌であり、本発明に特に有効であ
った菌株はたとえばチトファーガL43-1株である。本菌
株は平成元年8月22日、通産省工業技術院微生物工業技
術研究所へ委託番号微工研菌寄第10972号として寄託し
た。本菌株は千葉県の土壌から分離されたもので、その
菌学的特徴は次の通りである。
ラーゲン分解酵素生産菌であり、本発明に特に有効であ
った菌株はたとえばチトファーガL43-1株である。本菌
株は平成元年8月22日、通産省工業技術院微生物工業技
術研究所へ委託番号微工研菌寄第10972号として寄託し
た。本菌株は千葉県の土壌から分離されたもので、その
菌学的特徴は次の通りである。
1)形態 長さ2〜3μm、幅約0.5μmのかん菌である。鞭毛
及び芽胞をもたない。
及び芽胞をもたない。
2)生育状態 普通寒天培地上で増殖し、コロニーは直径1〜2mm、
半透明で光沢があり凸状で非水溶性黄色色素を産生す
る。好気性菌で嫌気的に増殖しない。至適生育温度は25
℃〜30℃であり、37℃で生育しない。増殖にはペプト
ン、アミノ酸を要求する。
半透明で光沢があり凸状で非水溶性黄色色素を産生す
る。好気性菌で嫌気的に増殖しない。至適生育温度は25
℃〜30℃であり、37℃で生育しない。増殖にはペプト
ン、アミノ酸を要求する。
3)グラム染色(−) 4)生理学的性質 グルコースから酸化的に酸を産生する。ウレアーゼ
(−)、インドール産生(−)、硝酸塩の還元(−)、
ゼラチン液化(+)、オキシダーゼ(+)、カタラーゼ
(+) 5)キノンの分析 ユビキノン:Q−6〜Q-10までのユビキノンがない。
(−)、インドール産生(−)、硝酸塩の還元(−)、
ゼラチン液化(+)、オキシダーゼ(+)、カタラーゼ
(+) 5)キノンの分析 ユビキノン:Q−6〜Q-10までのユビキノンがない。
メナキノン:MK-6を主成分としMK-7を副成分とする。
6)DNAのG+C含有 33.07% 7)菌体脂肪酸 分岐脂肪酸が多い。
以上の性質から本菌はチトファーガに属することが認
められた。
められた。
上記以外の菌株であってもコラーゲン分解酵素生産能
を示すチトファーガに属する菌あるいはそれらの変異株
であっても使用することができる。
を示すチトファーガに属する菌あるいはそれらの変異株
であっても使用することができる。
コラーゲン分解酵素は上記の生産菌株を適切な好気的
培養条件下、たとえば振盪培養法や通気撹拌培養法で生
育させることにより生産される。培養地としては生産菌
株が摂取しうる窒素源および無機塩などを含有させる。
生産菌は通常25℃〜30℃で培養するのが望ましい。本酵
素を生産するためには細菌の発育のために使われる窒素
源はすべて利用できる。たとえばペプトン、肉エキス、
酵母、酵母エキス、豆類粉末、コーン・スチープ・リカ
ー、米ぬか、麩、ゼラチン、魚粉、ミートミール及び無
機窒素等を用いることができる。尚、コラーゲン分解酵
素の生産には0.1〜0.4%のゼラチンを含ませた培地が好
適である。
培養条件下、たとえば振盪培養法や通気撹拌培養法で生
育させることにより生産される。培養地としては生産菌
株が摂取しうる窒素源および無機塩などを含有させる。
生産菌は通常25℃〜30℃で培養するのが望ましい。本酵
素を生産するためには細菌の発育のために使われる窒素
源はすべて利用できる。たとえばペプトン、肉エキス、
酵母、酵母エキス、豆類粉末、コーン・スチープ・リカ
ー、米ぬか、麩、ゼラチン、魚粉、ミートミール及び無
機窒素等を用いることができる。尚、コラーゲン分解酵
素の生産には0.1〜0.4%のゼラチンを含ませた培地が好
適である。
培養は本コラーゲン分解酵素の生産量が多くなる適切
な培地に接種して培養するが、培地は中性付近がよい。
な培地に接種して培養するが、培地は中性付近がよい。
コラーゲン分解酵素の部分精製標品の抽出分離には微
生物の生産物を抽出分離するのに通常用いられる手段を
適当に組み合わせることによって行うことができる。た
とえば硫安等による塩析法、アセトン、メタノール、イ
ソプロパノール等の有機溶媒による沈澱法、各種吸着体
による吸着、溶離法、イオン交換体による吸着、溶離、
クロマトグラフィー、種々の担体によるゲル過法、種
々の電気泳動法、限界過法、凍結乾燥法、透析法、ク
ロマトフォーカシング、疎水性クロマトグラフィー等で
ある。
生物の生産物を抽出分離するのに通常用いられる手段を
適当に組み合わせることによって行うことができる。た
とえば硫安等による塩析法、アセトン、メタノール、イ
ソプロパノール等の有機溶媒による沈澱法、各種吸着体
による吸着、溶離法、イオン交換体による吸着、溶離、
クロマトグラフィー、種々の担体によるゲル過法、種
々の電気泳動法、限界過法、凍結乾燥法、透析法、ク
ロマトフォーカシング、疎水性クロマトグラフィー等で
ある。
本発明で得た部分精製標品はさらに上記の精製手段を
組み合わせて精製を行うことができるが、本酵素の部分
精製標品はコラーゲンの分解に実用的に使用することが
できる。
組み合わせて精製を行うことができるが、本酵素の部分
精製標品はコラーゲンの分解に実用的に使用することが
できる。
尚、コラーゲン分解酵素の活性は次の方法で測定す
る。即ち、50mMトリス・HClバッファー(pH7.5,4mMのCa
Cl2含有)0.9ml、酵素溶液0.1mlと牛アキレス腱コラー
ゲン10mgを30℃、60分反応させる。反応後1.0mlの0.1mM
醋酸を加えて、遠心分離して上清をとる。その0.1mlを
ニンヒドリン発色し、波長570nmで測定する。活性は1
分間に1μMのロイシン当量の発色を与える酵素量を1
単位として示す。
る。即ち、50mMトリス・HClバッファー(pH7.5,4mMのCa
Cl2含有)0.9ml、酵素溶液0.1mlと牛アキレス腱コラー
ゲン10mgを30℃、60分反応させる。反応後1.0mlの0.1mM
醋酸を加えて、遠心分離して上清をとる。その0.1mlを
ニンヒドリン発色し、波長570nmで測定する。活性は1
分間に1μMのロイシン当量の発色を与える酵素量を1
単位として示す。
又、50mMトリス・HClバッファー(pH7.5,4mMのCaCl2
含有)に牛アキレス腱コラーゲン1%として、酵素液を
加え25℃で静置後、コラーゲンの消化の程度を観察し
た。
含有)に牛アキレス腱コラーゲン1%として、酵素液を
加え25℃で静置後、コラーゲンの消化の程度を観察し
た。
次に実施例によって本発明のコラーゲン分解酵素の部
分精製標品の生産方法を更に詳細に説明する。
分精製標品の生産方法を更に詳細に説明する。
[実施例] 次に示す成分から成る培地(第1表)でチトファーガ
に属する生産菌株を25℃、18時間振盪培養した(110rp
m)。培養後菌体を除き、液12lを限外過して分子量
約1万以下のものを除きつつ濃縮して750mlとし、これ
に硫安を加えて30〜70%飽和で沈澱となる画分を集め酵
素の部分精製標品を得た。その全蛋白量、全活性、比活
性、回収率を次の第2表に示した。比活性は約3.7倍上
昇し、回収率86.3%であった。尚、この画分はDEAEセフ
ァロースのカラムにかけると非吸着区分、吸着分として
数画分が得られた。
に属する生産菌株を25℃、18時間振盪培養した(110rp
m)。培養後菌体を除き、液12lを限外過して分子量
約1万以下のものを除きつつ濃縮して750mlとし、これ
に硫安を加えて30〜70%飽和で沈澱となる画分を集め酵
素の部分精製標品を得た。その全蛋白量、全活性、比活
性、回収率を次の第2表に示した。比活性は約3.7倍上
昇し、回収率86.3%であった。尚、この画分はDEAEセフ
ァロースのカラムにかけると非吸着区分、吸着分として
数画分が得られた。
第 1 表 成 分 配 合 量 ポリペプトン 5g 酵母エキス 1g ゼラチン 2g リン酸1カリウム 0.5g リン酸2カリウム 0.5g 硫酸マグネシウム 0.2g 硫酸第1鉄 0.01g 硫酸マンガン 0.01g 塩化ナトリウム 0.01g 塩化カルシウム 0.6 g 水 1 (殺菌前のpHは7.0)
Claims (1)
- 【請求項1】チトファーガに属するコラーゲン分解酵素
生産細菌を培養し、培養液からコラーゲン分解酵素部分
精製標品を採取することを特徴とするコラーゲン分解酵
素標品の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22982589A JP2898022B2 (ja) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | コラーゲン分解酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22982589A JP2898022B2 (ja) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | コラーゲン分解酵素の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0391478A JPH0391478A (ja) | 1991-04-17 |
JP2898022B2 true JP2898022B2 (ja) | 1999-05-31 |
Family
ID=16898263
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP22982589A Expired - Lifetime JP2898022B2 (ja) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | コラーゲン分解酵素の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2898022B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7811560B2 (en) * | 2006-01-30 | 2010-10-12 | Auxilium Us Holdings, Llc | Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases |
ES2968836T3 (es) | 2012-01-12 | 2024-05-14 | Endo Global Ventures | Enzima del clostridium histolyticum |
-
1989
- 1989-09-05 JP JP22982589A patent/JP2898022B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0391478A (ja) | 1991-04-17 |
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