JPS60221084A - スフインゴミエリナ−ゼの製造法 - Google Patents
スフインゴミエリナ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS60221084A JPS60221084A JP59076585A JP7658584A JPS60221084A JP S60221084 A JPS60221084 A JP S60221084A JP 59076585 A JP59076585 A JP 59076585A JP 7658584 A JP7658584 A JP 7658584A JP S60221084 A JPS60221084 A JP S60221084A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pseudomonas
- sphingomyelinase
- bacillus cereus
- producing
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はスフインゴミエリナーゼの製造法に関シ、詳し
くはバチルス・セレウスと共に特定のシュードモナス属
細菌を加えて混合培養することにより高収率でスフイン
ゴミエリナーゼを製造する方法に関する。
くはバチルス・セレウスと共に特定のシュードモナス属
細菌を加えて混合培養することにより高収率でスフイン
ゴミエリナーゼを製造する方法に関する。
スフインゴミエリナーゼは、生体内に存在するリン脂質
であるスフィンゴミエリンを分解する能力を有すること
から、スフィンゴミエリンの定量のため臨床検査などに
使用することが期待されている。
であるスフィンゴミエリンを分解する能力を有すること
から、スフィンゴミエリンの定量のため臨床検査などに
使用することが期待されている。
スフインゴミエリナーゼは動物組織から得らを採取する
方法が知られている。
方法が知られている。
しかしながら、バチルス・セレウスを用いる方法はスフ
インゴミエリナーゼの生産量が低いため、商業生産には
適さないものであシ、より効率的なスフインゴミエリナ
ーゼの製造法の開発が望まれている。
インゴミエリナーゼの生産量が低いため、商業生産には
適さないものであシ、より効率的なスフインゴミエリナ
ーゼの製造法の開発が望まれている。
このような事情に鑑み、本発明者らはバチルス・セレウ
スヲ培養してスフィンゴミエリナーゼを製造するにあた
り、該酵素の単位容量当りの生産量を上げることについ
て検討を重ねた。
スヲ培養してスフィンゴミエリナーゼを製造するにあた
り、該酵素の単位容量当りの生産量を上げることについ
て検討を重ねた。
その結果、バチルス・セレウスとシュードモナス属細菌
とを混合培養する方法が有効であることを見出し、この
知見に基いて本発明を完成したのである。
とを混合培養する方法が有効であることを見出し、この
知見に基いて本発明を完成したのである。
本発明はバチルス・セレウスを培養し、培養物からスフ
インゴミエリナーゼを採取することよりなるスフインゴ
ミエリナーゼの製造法において、バチルス拳セレウスと
共にシュードモナス属に属する細菌を加えて培養するこ
とを特徴とするスフィンゴミエリナーゼの製造法である
。
インゴミエリナーゼを採取することよりなるスフインゴ
ミエリナーゼの製造法において、バチルス拳セレウスと
共にシュードモナス属に属する細菌を加えて培養するこ
とを特徴とするスフィンゴミエリナーゼの製造法である
。
バチルス・セレウスとしてはスフィンゴミエリンーゼ生
産能を有するものであれば任意に使用できる。たとえば
バチルス・セレウスエＡＭ１０２９、同工ＡＭ１０７２
、同工ＡＭ１１１０．同工ＡＭ１７２９などを挙げるこ
とができる。
産能を有するものであれば任意に使用できる。たとえば
バチルス・セレウスエＡＭ１０２９、同工ＡＭ１０７２
、同工ＡＭ１１１０．同工ＡＭ１７２９などを挙げるこ
とができる。
一方、シュードモナス属に属するスフインゴミエリナー
ゼ生産菌としては種々のものがあり、たとえばシュード
モナス・エルギノーザ（Ｐａａｕｄｏｍｏｎａｓ 翌聾
銘些眩）工ＡＭ１００７．シ１−ドゝナスφフルオレセ
ンス（Ｐｓ、 ｆｌｕｏｒｅｓｏｅｖｓ）工ＡＭ１２０
０１、シュードモナス争シュイルキリエンシス（Ｂｅ、
５ｃｈｕｌｋ１１１１ｅｎｓｉｅ）工ＡＭ１０５１、
シュードモナスｅストウツエリ（Ｐｓ、５ｔｕｔｚｅｒ
ｉ）工ＡＭ１２０９７、シュードモナス・プチダ（Ｐｓ
、 ｐｕｔｉｄａ） Ｉ ＡＭ １００２、シュードモ
ナス・エスピー（Ｂ、 修Ｔ −１（ＦＩＲＭ Ｐ−４
８４７）などがある。
ゼ生産菌としては種々のものがあり、たとえばシュード
モナス・エルギノーザ（Ｐａａｕｄｏｍｏｎａｓ 翌聾
銘些眩）工ＡＭ１００７．シ１−ドゝナスφフルオレセ
ンス（Ｐｓ、 ｆｌｕｏｒｅｓｏｅｖｓ）工ＡＭ１２０
０１、シュードモナス争シュイルキリエンシス（Ｂｅ、
５ｃｈｕｌｋ１１１１ｅｎｓｉｅ）工ＡＭ１０５１、
シュードモナスｅストウツエリ（Ｐｓ、５ｔｕｔｚｅｒ
ｉ）工ＡＭ１２０９７、シュードモナス・プチダ（Ｐｓ
、 ｐｕｔｉｄａ） Ｉ ＡＭ １００２、シュードモ
ナス・エスピー（Ｂ、 修Ｔ −１（ＦＩＲＭ Ｐ−４
８４７）などがある。
上記微生物の混合培養は通常の条件を適用して行なえば
よく、両者が十分に生育し、所定量のスフィンゴミエリ
ナーゼを生産することが出来る培地を使用して培養すれ
ばよい。たとえば、炭素源としてはグリセリン、ブドウ
糖などを使用でき、窒素源としてはポリペプトン、トリ
プトン、コーン・ステープ・リカーなどを用いることが
できる。その他無機塩類等の生育に必要な成分を適宜添
加する。なお、培地に植物油（たとえば大豆油、米ぬか
油など）を１〜２％程度添加することによりスフインゴ
ミエリナーゼの生産量を増すことが出来る。
よく、両者が十分に生育し、所定量のスフィンゴミエリ
ナーゼを生産することが出来る培地を使用して培養すれ
ばよい。たとえば、炭素源としてはグリセリン、ブドウ
糖などを使用でき、窒素源としてはポリペプトン、トリ
プトン、コーン・ステープ・リカーなどを用いることが
できる。その他無機塩類等の生育に必要な成分を適宜添
加する。なお、培地に植物油（たとえば大豆油、米ぬか
油など）を１〜２％程度添加することによりスフインゴ
ミエリナーゼの生産量を増すことが出来る。
培養は１０〜４０°Ｃ１好ましくは２５〜３５°Ｃの温
度で５〜２０時間、好ましくは７〜８時間行なう。培養
中、培養液のｐＨを７．０〜８．０に保つことが望まし
いので、必要に応じて適当な酸またはアルカリを加えて
ｐＥ調節を行なう。
度で５〜２０時間、好ましくは７〜８時間行なう。培養
中、培養液のｐＨを７．０〜８．０に保つことが望まし
いので、必要に応じて適当な酸またはアルカリを加えて
ｐＥ調節を行なう。
バチルス・セレウスを単独で培養した場合、スフインゴ
ミエリナーゼの生産量は供試菌株ニもよるが１大体７０
０〜１０００単位／ｌであるが、シュードモナス属細菌
と混合培養することによりその生産量は増加する。増加
量は混合するシュードモナス属細菌の種類やバチルス・
セレウスとの組合せにより差はあるが、菌の選択あるい
は組合せによっては約１０倍となるものもある。
ミエリナーゼの生産量は供試菌株ニもよるが１大体７０
０〜１０００単位／ｌであるが、シュードモナス属細菌
と混合培養することによりその生産量は増加する。増加
量は混合するシュードモナス属細菌の種類やバチルス・
セレウスとの組合せにより差はあるが、菌の選択あるい
は組合せによっては約１０倍となるものもある。
スフインゴミエリナーゼの確認は、スフインゴミエリナ
ーゼによりスフィンゴミエリンを分解して生成する７オ
スホリルコリンをさらにフォスファターゼで分解し、そ
の際生成するリンあるいはコリンを定量することにより
行なう。
ーゼによりスフィンゴミエリンを分解して生成する７オ
スホリルコリンをさらにフォスファターゼで分解し、そ
の際生成するリンあるいはコリンを定量することにより
行なう。
また、スフィンゴミエリナーゼによる分解後、クロロホ
ルム等の溶媒によってスフィンゴミエリンと生成物であ
る７オスホリルコリンとを分離して無機リンを定量する
ことによって行なってもよい。
ルム等の溶媒によってスフィンゴミエリンと生成物であ
る７オスホリルコリンとを分離して無機リンを定量する
ことによって行なってもよい。
スフインゴミエリナーゼの分離、精製には種々の方法を
適用することができ、以下に効率的な方法を例示する。
適用することができ、以下に効率的な方法を例示する。
まず、培養物を遠心分離することによって上澄の培養液
を得、次いで培養液に硫酸アンモニウムを６０％飽和に
なるまで加えて塩析を行なう。しかる後、再び遠心分離
を行なって沈殿物を分取したのち、ｌ１ｌＨ８の２Ｑｆ
ｆ！Ｍ）リス・バッファーに溶解せしめる。さらに、硫
酸アンモニウムを３０％飽和になるまで加え塩析を行な
う。
を得、次いで培養液に硫酸アンモニウムを６０％飽和に
なるまで加えて塩析を行なう。しかる後、再び遠心分離
を行なって沈殿物を分取したのち、ｌ１ｌＨ８の２Ｑｆ
ｆ！Ｍ）リス・バッファーに溶解せしめる。さらに、硫
酸アンモニウムを３０％飽和になるまで加え塩析を行な
う。
次に１遠心分離により沈殿物を分離し、これをｐＨ８の
２０ｆｆ！Ｍ ト！Ｊス・バッファーに再度溶解する。
２０ｆｆ！Ｍ ト！Ｊス・バッファーに再度溶解する。
しかる後、遠心分離を行なって不純物を除去し、次いで
ｐＨ８の２０ｆｆ１Ｍ ）リス・バッファーを用いて透
析を行なう。この後１セフアデツクス０７５などを用い
るゲル濾過による精製やＤＩＩｉＡＥセルロース、ＣＭ
セルロースナトヲ用いるイオン交換による精製を行なう
。
ｐＨ８の２０ｆｆ１Ｍ ）リス・バッファーを用いて透
析を行なう。この後１セフアデツクス０７５などを用い
るゲル濾過による精製やＤＩＩｉＡＥセルロース、ＣＭ
セルロースナトヲ用いるイオン交換による精製を行なう
。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
下記組成の培地を用いシュードモナス・エスピーＴ −
１（ＦＥＢＭ Ｐ−４８４７） とバチルス・セレウス
エＡＭ１７２９のそれぞれについて前培養を行なった。
１（ＦＥＢＭ Ｐ−４８４７） とバチルス・セレウス
エＡＭ１７２９のそれぞれについて前培養を行なった。
ペプトン ２％
イーストエキス １％
グリセリン ２％
Ｎａ０２１％
ＭｇＳへ ０．５％
蒸留水 １５０ｄ
ｐＨ７，５
すなわち、５００ｄ容坂ロフラスコに上記培地を入れ、
上記微生物を接種し、６０°Ｃで１６時間振とり培養を
行なった。次に、シュードモナス・エスピーＴ−１（Ｆ
ＥＢＭ Ｐ−４８４７）の前項ＩＩ ｍ ５００ Ｉｌ
ｌ 、！： バチルス・セレウスエＡＭ１７２９の前培
養液３ｏｍを、上記組成の培地に２％大豆油を加えたも
の６ｔを仕込んだ５を容ジャーファーメンタ−に接種し
、温度３０°Ｃ１通気鍬Ｉ Ｖ／’Ｖ・ｗｉｎｓ 攪拌
速度５００ ｒｐｍ、 ｐ）１７．５の条件で培養した
。８時間後、溶存酸素が上がりはじめたところを培養の
終点とした。その結果、培養液１を当り１３９００Ｕの
スフィンゴミエリナーゼが得られた。
上記微生物を接種し、６０°Ｃで１６時間振とり培養を
行なった。次に、シュードモナス・エスピーＴ−１（Ｆ
ＥＢＭ Ｐ−４８４７）の前項ＩＩ ｍ ５００ Ｉｌ
ｌ 、！： バチルス・セレウスエＡＭ１７２９の前培
養液３ｏｍを、上記組成の培地に２％大豆油を加えたも
の６ｔを仕込んだ５を容ジャーファーメンタ−に接種し
、温度３０°Ｃ１通気鍬Ｉ Ｖ／’Ｖ・ｗｉｎｓ 攪拌
速度５００ ｒｐｍ、 ｐ）１７．５の条件で培養した
。８時間後、溶存酸素が上がりはじめたところを培養の
終点とした。その結果、培養液１を当り１３９００Ｕの
スフィンゴミエリナーゼが得られた。
次に、培養液を常法通シ遠心分離した後、７０％飽和に
なるまで硫酸アンモニウム（固型）を加え、１夜静置し
た。次に、遠心分離を行なって沈殿物を分取し、これを
ｐＨ８の２０ ｍ Ｍ トリス・バッファーに溶解し、
セファデックスＧ５０を用いゲル濾過を行なって濃縮し
た。さらに、ＤＩＡＩセルローズでイオン交換したのち
濃縮し、次にＰＢＥ９４ゲルを用いてクロマトン１−カ
シングを行ない、引続きＴＯＹＯＰＩＣＡＲＬＨＷ５５
ｆを用いてゲル濾過を行なった。精製過程における精製
度合を第１表に示す。
なるまで硫酸アンモニウム（固型）を加え、１夜静置し
た。次に、遠心分離を行なって沈殿物を分取し、これを
ｐＨ８の２０ ｍ Ｍ トリス・バッファーに溶解し、
セファデックスＧ５０を用いゲル濾過を行なって濃縮し
た。さらに、ＤＩＡＩセルローズでイオン交換したのち
濃縮し、次にＰＢＥ９４ゲルを用いてクロマトン１−カ
シングを行ない、引続きＴＯＹＯＰＩＣＡＲＬＨＷ５５
ｆを用いてゲル濾過を行なった。精製過程における精製
度合を第１表に示す。
」Ｌ−ユー二聚
培養上清 ３０００１５．９５８７００ １硫安沈ン殿
１５０１５０ ２２５００ ．９ゲル濾過 ５００４
０ ２００００ １０イオン交換 ２００ ８０ １６
０００ ５０クロマトフオーカシング ５０ ５００
１５０００ ５００ゲル濾過 ７０１５０ １０５００
１５００なお、酵素の生産量の測定および確認は下記の
試薬を用いた光学的検定法により行なった。
１５０１５０ ２２５００ ．９ゲル濾過 ５００４
０ ２００００ １０イオン交換 ２００ ８０ １６
０００ ５０クロマトフオーカシング ５０ ５００
１５０００ ５００ゲル濾過 ７０１５０ １０５００
１５００なお、酵素の生産量の測定および確認は下記の
試薬を用いた光学的検定法により行なった。
スフィンゴミエリン ０．１％ ０．１ｄ上記試薬（合
計３ゴ）を混合後５７°Ｃに保持し、これに酵素液０．
１１を加え、光学計によシ波長５０叶猟における吸光量
の増加（△Ａ）を測定した。また、酵素生産量は次式に
より算出した。
計３ゴ）を混合後５７°Ｃに保持し、これに酵素液０．
１１を加え、光学計によシ波長５０叶猟における吸光量
の増加（△Ａ）を測定した。また、酵素生産量は次式に
より算出した。
実施例２
実施例１においてバチルス・セレウスとシュードモナス
属に属する細菌の組合せを代えたこと以外は同様に行な
った。培養液１を当りの酵素量（Ｕ）を第２表に示す。
属に属する細菌の組合せを代えたこと以外は同様に行な
った。培養液１を当りの酵素量（Ｕ）を第２表に示す。
第 ２ 表
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）バチルス・セレウスを培養し、培養物からスフイン
ゴミエリナーゼを採取することよりなるスフインゴミエ
リナーゼの製造法において、バチルス・セレウスと共に
シュードモナス属ニ属する細菌を加えて混合培養するこ
とを特徴とするスフインゴミエリナーゼの製造法。 ２）シュードモナス属に属する細菌が、シュードモナス
・エルギノーザ（ＦＪ螺■空籠利瓦論韮）工ＡＭ１００
７、シュードモナス−フルオレセンス（理、ル匡（支）
０皿）■ＡＭ１２００１、シュードモナスロシュイルキ
リエンシス（Ｐ ｓ、 ｓｃｈ ｌｋｉｌｌｉｅｎｓｉ
ｓＩＡＭ１０５１ 、シュードモナス９ストウツエリ（
Ｐｓ、 ｓ４ｅ？ｉ）工ＡＭ１２０９７、シュードモナ
ス・プチダ（Ｐｓ、 座集）工ＡＭ１００２およびシュ
ードモナス・エスピー（Ｐｐ、 ｓｐ、） Ｔ−１（Ｔ
ＥＲＭ Ｐ−４８４７）のいずれかである特許請求の範
囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59076585A JPS60221084A (ja) | 1984-04-18 | 1984-04-18 | スフインゴミエリナ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59076585A JPS60221084A (ja) | 1984-04-18 | 1984-04-18 | スフインゴミエリナ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60221084A true JPS60221084A (ja) | 1985-11-05 |
| JPS6247515B2 JPS6247515B2 (ja) | 1987-10-08 |
Family
ID=13609360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59076585A Granted JPS60221084A (ja) | 1984-04-18 | 1984-04-18 | スフインゴミエリナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60221084A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003501399A (ja) * | 1999-06-09 | 2003-01-14 | ブイエスエル・ファーマ・リミテッド | 食養生製品、食品添加物または医薬用アルカリ性スフィンゴミエリナーゼ含有組成物 |
-
1984
- 1984-04-18 JP JP59076585A patent/JPS60221084A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003501399A (ja) * | 1999-06-09 | 2003-01-14 | ブイエスエル・ファーマ・リミテッド | 食養生製品、食品添加物または医薬用アルカリ性スフィンゴミエリナーゼ含有組成物 |
| JP2012040015A (ja) * | 1999-06-09 | 2012-03-01 | Actial Farmaceutica Soc Por Quotas De Responsabilidade Ltda | 食養生製品、食品添加物または医薬用アルカリ性スフィンゴミエリナーゼ含有組成物 |
| JP4897167B2 (ja) * | 1999-06-09 | 2012-03-14 | アクティアル・ファルマセウティカ・ソシエダデ・ポル・クオタス・デ・レスポンサビリダデ・リミターダ | 食養生製品、食品添加物または医薬用アルカリ性スフィンゴミエリナーゼ含有組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6247515B2 (ja) | 1987-10-08 |
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