JPH03172190A - 有機代謝産物の採取方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細胞外に有機物を排出する藻類を利用して有機
代謝産物を採取する方法に関する。

（従来の技術） 現在、遺伝子工学の技術の発達とともに、多くの微生物
遺伝子を操作し、有用な物質を得ることが可能になって
きた。この場合、微生物細胞内に生産された目的とする
物質が細胞外に排出されることが、工業生産上極めて重
要である。現在、このようにして得られた酵素や抗生物
質等の代謝産物が医薬品をはじめ日用品、食品にいたる
まで、多くの面において利用されているのは周知の事実
であり、また動物細胞からもインターフェロン等有用物
質が得られるようになりつつある。

一方、植物細胞においては、細胞が厚い細胞壁に覆われ
てあり、また一般的には光合成により、独立栄養で生活
しているので、無機塩類とＣＯ２を栄養源として吸収す
るものの、分子量が大きい高分子有機代謝産物の細胞壁
の通過ならびに放出、排出は行われていないとされてい
る。

したがって、植物細胞を培養してその有機代謝物を細胞
外に排出させて採取する試みはほとんど行われていない
。

例外的に、クロレラ・ブルガリスの或る株が細胞内にデ
ンプン粒を生産しかつ細胞外に排出することは知られて
いる（特公昭５６−１１３１７号）が、デンプン以外の
高分子有機代謝産物の挙動については全く知られていな
い。

（発明の解決しようとする課題） 本発明者らは植物細胞を培養して有機代謝産物を細胞外
に排出させ、採取する方法について研究を重ねて本発明
に到達した。

（課題を解決するための手段） 本発明は、従属栄養条件下で培養できる微細藻類の株を
、同化しうる炭素源、利用しうる窒素源、リン供給源お
よびミネラルを含有する液体培地中で、好気条件下に、
少くとも対数増殖期に達するまで培養し、培養物から不
溶物を除いた画分を採取することを特徴とする有機代謝
産物の製造法である。

従属栄養条件下で培養できる微細藻類としては、たとえ
ば、クロレラ属、セネデスムス属に属する緑藻が挙げら
れる。

これらの属に属する株の好ましい例としては、クロレラ
属については、たとえばクロレラ●ブルガリスＡｌ−１
ｙ　株から単細胞分離によって得られたＡｌ−１ｙ−５
（１１）　、その変異株または遺伝子工学的に修飾され
た株などが挙げられる。

クロレラ●ブルガリスＡ７？−１ｙ−３（１１）の形態
学的および生理的特徴は次の通りである。

細胞は球形で、大きさは３．３〜６０Ｘ３．３〜５．２
μ、１個の葉緑体を有し、単一細胞で生活する。２個、
４個又は６個（通常４個）の嬢細胞（ａｕｔｏｓｐｏｒ
ｅ）を形成する。細胞壁は平滑であるが、細胞が老化す
ると、自然に破れ易いという特性を有する。生育可能な
ｐ　Ｈは５〜９、生育可能な温度は２５〜４２゜Ｃであ
るが、最適ｐ　Ｈは７〜８、最適温度は３１゜Ｃである
。コロニーの色は初め緑色で、生育するに従って緑色が
うすくなって帯黄色になる。

この株は明暗培養ともに藻体の乾物量の７０〜８０優の
デンプンを蓄積する。さらに本株は生成デンプンの最高
２／３を体外に排出する特性をもっている。

また、セネデスムス属についてはセネテ゛スムス●オブ
リキュウス５３が挙げられる。

これらの株は種類により、たとえば遺伝子工学の操作に
より、有機代謝産物が質または量的に変化しても、水溶
性有機代謝産物を排出しうる限り使用可能である。

本発明においては、上記の株を液体培地中で、振とう培
養や深部通気培養のような好気条件下に培養する。

培養は光線照射下に明培養の形で行ってもよく、光線遮
断下に暗培養の形で行ってもよい。

培地としては、同化しうる炭素源、利用しうる窒素源お
よび必要なミネラルを含むものが用いられる。

炭素源は、明培養の場合炭酸ガスでよいが、暗培養にお
いては、グルコース、マンノース、酢酸などを用いるの
が好ましい。

窒素源としては、尿素、ポリペプトン、酢酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸カリウ
ムなどを用いうる。

リン供給源としては、リン酸一水素カリウムもしくはナ
トリウム、リン酸二水素ナトリウムのようなリン酸塩類
が用いられる。

ミネラルとしては、硫酸もしくは塩化マグネシウムのよ
うなマグネシウム塩類、塩化カルシウムのようなカルシ
ウム塩類、硫酸第一もしくは第二鉄のような鉄塩類が少
量用いられる。

培地の初発ｐＨは５，５ないし１５、好ましくは約７に
調整される。

培地温度は２５ないし３５゜Ｃ１好ましくは約３０゜Ｃ
に調整するのがよい。

培養の進行により藻の細胞は増殖し、対数増殖期を経て
定常期に入るが、本発明においては少くとも対数増殖期
に達するまで培養する。所望により定常期に入るまで培
養を継続してもよい。

上記の培養により、細胞内に生産される有機代謝産物は
細胞外に排出される。

かくして得られた培養物から細胞やデンプンなどの不溶
物を除去して水溶性有機代謝産物を含む画分を得ること
ができる。

不溶物の除去は、培養物から固形物を枦過または沈降に
よって除くことにより容易に行うことができる。

不溶物を除去した画分中に発現する有機代謝産物として
は、たとえば、クロレラ生長因子（ＯＧＦ）、クロロフ
ィル、ペプチド、核酸系物質などが挙げられる。これら
は培養した細胞の株の種類により異りうる。

かくして、藻類の液体培養物から細胞を破砕することな
く有用な有機代謝産物を採取することができる。所望に
より培養物中の細胞を破砕してもよいが、破砕を避ける
ことにより細胞内容物の混入による所望の有機代謝産物
の汚染を防ぐことができる。

また、有用な外来遺伝子を導入したり、または細胞融合
等の遺伝子操作的手法により改変した株を利用して有用
な有機代謝産物をタンク培養により工業的規模で生産す
ることもできる。なおクロレラ●ブルガリスＡｄ−１ｙ
ｉ（１１）株は鹿児島大学農学部に保存されている。

実施例１ 培地組成： ＮａＮＯｓ　　　　　２．Ｏ　　ｆ　　ＭｇＳＯ＊●７
ＨｔＯ　　Ｏ．２　？ＣａＣｌｚ●２ＨｔＯ　　Ｏ．０
５　　　ＦｅＳＯ４●７Ｈ２０　　Ｇ．００２５Ｋ２Ｈ
ＰＯ４０．８　　　ＫＨ２ＰＯ４０．２酵母エキス　　
１．０　　　グルコース　　２０．０上記を水１ｌに溶
解し、ｐ　Ｈ　７．　２に調整上記培養液を５００ｍｌ
容量の坂口フラスコに１００ｍｌずつ分注し１２Ｇ’Ｃ
で１５分間滅菌した。これにクロレラ●ブルガリスＡＪ
−ｍｙ−３（１１）株の作存用斜面培養から採ったクロ
レラ１白金耳を接種し、５０゜Ｃで５日間振盪培養）（
１３０往復／分）後、遠心分離によってクロレラ藻体と
デンプン粒を分離した。

遠心管の最下層に緑色のクロレラ藻体、その上層に純白
のデンプン粒が沈澱した。デンプン粒はヨード澱粉反応
により着色し、顕微鏡で確認した。

また培養液の遠心上清は緑色をしており、これを減圧濃
縮後、分液ロートでエチルエーテル層に転溶し、自記分
光光度計により、紫外、可視の吸収曲線を描かせたとこ
ろ、クロロフィルの吸光度曲線とほとんど同一であった
。

また培養液遠心上清を自記分光光度計により吸収曲線を
描かせたところ２　６　０　ｎｍに吸収ピークが見られ
た。これを脱塩処理後、乳酸閑によるＣＯＦ定量により
、クロレラの熱水抽出液と同様のＣＧＦが確認された。

これらのことから核酸系の物實が藻体外に排出されてい
ることが明かである。

＊ＣＧＦの定量法 ＣＧＦの含有量はラクトパチルス●アシドフイルス．（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕ
ｓ）Ｉ　ＦＯ３２０５を用いて生物学的に定量した。本
菌の保存はニツスイ一般乳酸菌接種用培地に沈降性炭酸
カルシウムを入れたものを使用した。試験に使う前に植
えつぎ、２４時間培養した後、前培養培地（酵１エキス
１１１グルコース１２、ペプトン０．５２、酢酸ソーダ
０．５２、水１　０　０ｍｌ，　ｐＨ６．８　）に植え
つぎ、２４時間培養した。これを遠沈（３０００ｒｐｍ
５分間）した後、上澄を捨て、生理食塩水５ｍｌを加え
て撹拌し、遠沈した。この遠沈を２〜３回繰返して洗浄
を行なった後、５０倍に希釈して使用した。

ＭＩＩした試験管に基礎培地（スキムミルク８Ｆ，グル
コース３２、水１００ｍｌ　）を３．５ｍｌ入れ、これ
にＬ記の培養液遠心上清または５０倍に希釈したクロレ
ラエキスを３．５ｍｌを加え全量を７ｍｇトシ、１００
゜Ｃで５０分間滅菌した。これに上記の乳酸菌（５０倍
希釈液）１〜２滴を接種し、３ｏ゜Ｃで４日間培養した
後、生成した乳酸を１／１ｏＮＮａＯＨで滴定した。指
示薬はＢＴＢ及びＮＲの混合指示薬を使用した。

なお、クロレラエキスは次の操作により作製した。即ち
乾燥クロレラ・ブルガリスＳ−２２５株６〜１（ｌを１
００ｍｌの水に懸濁し、１００゜Ｃで１時間煮沸した後
遠沈（４０００ｒｐｍＩＯ分間）し、上澄を水で１０〜
２０倍に希釈して調製し　ｔこ。

実施列２ 培地組成： ＮａＮＯｓ　　　　　２．Ｏ　ｆ　　ＭｇＳ０４●７｝
Ｉｚ０　　０．２　ｆＣａＣｈ●２Ｈ２０　　０．０５
　　Ｆｅ８０＜●７Ｈ２０　　０．００２６Ｋ２ＨＰＯ
＋　　　　０．８　　　Ｍ｛２ＰＯ４　　　　０．２酵
母エキス　　１．０　　　グルコース　２０．０上記を
水１ｌに溶解し、ｐＨ７、２に調整上記培養液を５００
ｍｌ容量の坂口フラスコに１００ｍｌずつ分注し、１．
２気圧、１２３℃で１５分間蒸気滅菌した。これにクロ
レラ●ブルガリスＧ−５１２株の保存用斜面培養から採
ったクロレラ１白金耳を接種し、暗黒下に３０゜Ｃで５
日間振盪培養（１３０往復／分）後、遠心分離後その上
清をＰ紙で胛過し、自記分光光度計により吸収曲線を描
かせたところ２　６　０　ｎｍに吸収ピークが見られた
　（第１図）これを脱塩処理後、乳酸菌によるＣＧＦ定
量法により、クロレラの熱水抽出液と同様のＣＧＦが確
認された。

？の培養液遠心上清枦過液に活性炭を加え、よく撹拌後
、活性炭を炉別した。この枦別した活性炭にエタノール
を加えて溶出させたエタノール溶出液を自記分光光度計
により吸収曲線を描かせたところ、２　６　０　ｎｍに
著しい吸収ピークが見られた　（第２図ｔこのエタノー
ル溶出液を４０℃以下でロータリーエバポレーターで乾
固させたのち、システィン−７０％■硫酸法およびシス
ティンー濃硫酸法によって、クロレラＣＧＦと称される
ものと同様の核酸系物質であることを確認した。

クロレラ−ブルガリスに代えてセネデスムス●オブリキ
ュウス５３を用いるほかは上記と同様に行ったところ同
様の結果が得られた。

（発明の効果） 本発明によれば、微細藻類が細胞外に排出する種々の有
機代謝産物を工業的規模において採取することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２においてクロレラ・ブルガリスを培養
後、培養物上清液の示す紫外部吸収スペクトル曲線、第
２図は上記培養上清液の成分を活性炭に吸着させたのち
エタノールで溶出した溶出液の紫外部吸収スペクトル曲
線である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）従属栄養条件下で培養できる微細藻類の株を同化
   しうる炭素源、利用しうる窒素源、リン供給源およびミ
   ネラルを含有する液体培地中で、好気的条件下に、少く
   とも対数増殖期まで培養し、培養物から不溶物を除いた
   画分を採取することを特徴とする有機代謝産物の採取方
   法。
2. （２）微細藻類が緑藻である請求項１記載の方法。
3. （３）微細藻類がクロレラ属またはセネデスムス属に属
   する請求項１記載の方法。
4. （４）株がクロレラ・ブルガリスに属する請求項１記載
   の方法。
5. （５）培養を暗黒下で行う請求項１、２、３または４記
   載の方法。
6. （６）有機代謝産物がクロレラ生長因子、クロロフィル
   、ペプチド、または核酸系物質である請求項１、２、３
   、４、５または５記載の方法。