DE2659878A1

DE2659878A1 - Verfahren zur herstellung von kreatinamidinohydrolase

Info

Publication number: DE2659878A1
Application number: DE19762659878
Authority: DE
Inventors: Narimasa Saito; Masaru Suzuki
Original assignee: Noda Institute for Scientific Research
Current assignee: Noda Institute for Scientific Research
Priority date: 1975-04-05
Filing date: 1976-04-01
Publication date: 1977-11-10
Also published as: JPS51118884A; JPS528395B2; DE2659878B2; DE2659878C3

Description

Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase hoher Wirksamkeit unter Verwendung eines Stammes, der zu der Gattung Flavobacterium oder Gattung Corynebacterium gehörig ist und die Fähigkeit aufweist, Kreatinamidinohydrolase zu erzeugen.
Kreatinamidinohydrolasastellt ein Enzym dar, welches Kreatin zu Harnstoff und Sarkosin hydrolysiert. Diese Reaktion ist durch die nachfolgende Gleichung-- dargestellt: Kreatin + H20 Kreatinamidinohvdrolase Harnstoff + Sarkosin Derzeit wird in der klinischen Medizin die Diagnose von Muskel- und Nierenerkrankungen durch Bestimmung des Kreatins vorgenommen, welches im Serum und Urin vorliegt.
Derzeit wird die Kreatinbestimmung überlicherweise durch Analyse von Kreatinin mit Hilfe der nicht enzymatischen Jaffe-Reaktion auf Grundlage der charakteristischen Eigenschaft von Kreatin vorgenommen, dass Kreatin bei Erhitzung in saurem Medium eine Dehydratisierung zu Kreatinin erfährt.
Die vorstehend erwähnte Methodik der Bestimmung von Kreatin ist dadurch nachteilig, dass die Jaffe-Reaktion nicht spezifisch ist, und dass das Serum und der Urin eine erhebliche Menge anderer Substanzen enthält, die das Versuchsergebnis fehlerhaft gestalten können und hierdurch die Zuverlässigkeit des Messergebnisses beeinträchtigen. Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren der enzymatischen Bestimmung von Kreatin unter Verwendung eines Enzyms zu entwickeln, welches Kreatin spezifisch zersetzen kann.
Es ist bekannt, dass Enzyme mit der Fähigkeit der Zersetzung von Kreatin in Mikroorganismen vorliegen, die zu der Gattung Pseudomonas (Journal of General Microbiology, Band 14, S. 351 (1957)), Gattung Arthrobacter (Molecular und Cellular Biochemisty, Band -3, S. 9, 1974) und Gattung Alcaligenes (US-Patentschriften 3 806 416 und 3 806 420) zugehörig sind.
Jcdoch ist die Verwendung von Kreatin-zersetzenden Enzymen, die aus den vorstehend erwähnten Mikroorganismen gewonnen werden, nachteilig, da diese im allgemeinen gegenüber Umwelteinflüssen, wie Temperatur, pH-Wert, Sauerstoff und dergleichen, labil sind und weiter, weil sie alle in Mikroorganismen aufgefunden werden, so dass ihre Gewinnung ein Zweistufenverfahren erfordert. Dieses Zweistufenverfahren umfasst einerseits eine Stufe des Anwachsens und der Kultivierung von Mikroorganismen und andererseits eine Stufe der Gewinnung der kultivierten Bakterien und der Extraktion der Enzyme aus den Zellen durch Vermahlung, chemische oder enzymatische Aufarbeitung, wodurch das Reinigungsverfahren ziemlich kompliziert gestaltet und die Produktausbeute verringert wird.
Angesichts dieses Sachverhaltes wurde eine umfangreiche Suche nach Stämmen durchgeführt, die zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolase in hoher Ausbeute befähigt sind. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Kultivierung von Mikroorganismen, die induktive Produktion von Enzym und die Anreicherung des Enzyms in der Kulturlösung gleichzeitig erreicht werden kann, und deshalb Kreatinamidinohydrolase in hohen Ausbeuten in nur einer Stufe ohne Extraktion der Enzyme aus den kultivierten Zellen dadurch gewonnen werden können, dass man einen Stamm, der zu der Gattung Flavobacterium oder Gattung Corynebacterium gehörig ist, in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon kultiviert. Die Erfindung baut auf dieser Erkenntnis auf.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Kreatinamidinohydrolase und ein neues Verfahren zu deren Herstellung zu schaffen.
Die Aufgabe der Erfindung kann durch Kultivierung eines Stammes der Gattung Flavobacterium oder Corynebacterium de die Fähigkeit zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolase in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon aufweist, und Sammlung der Kreatininamidohydrolase und von Kreatinamidinohydrolase aus der Kulturflüssigkeit gelöst werden.
Das Enzym kann isoliert werden, indem man es auf eine Diäthylaminoäthylcellulosesäule, die zuvor mit einer o,o5 m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,o) equilibriert worden ist, aufbringt, wobei Kreatinamidinoiwydrolase hindurchtritt und aus dem unadsorbierten Teil gewonnen wird.
Das Enzym wird ~+ auf einer Diäthylaminoäthylsäule adsorbiert avEden, die mit dem vorstehend angeführten Puffer equilibriert worden ist und :t::Kreätinamidinohydrolase wird unter Ausnutzung eines linearen Gradienten an NaCl eluiert.
Die in der Erfindung verwendeten Stämme können beliebige Stämme darstellen, solange sie zu der Gattung Flavobacterium oder Gattung Corynebacterium gehörig sind und eine Fähigkeit zur Erzeugung von X Wratinamidinohydrolase aufweisen. Arten oder Mutanten der vorstehend erwähnten Stämme können ebenfalls verwendet werden.
Konkrete Beispiele von Stämmen, die zu der Gattung Flavobacterium gehörig sind, sind Flavobacterium U-188 (ATCC 31200, FERM-P No. 2922) und dergleichen.
Konkrete Beispiele von Stämmen, die der Gattung Corynebacterium zugehörig sind, umfassen Corynebacterium U-41 (ATCC 31201, FERM-P Nr. 2923) und dergleichen.
Flavobacterium U-188, auf das vorstehend Bezug genommen worden ist (nachstehend Stamm U-188 genannt) stelle einen Stamm dar, der in Humuserde neu gefunden wrude. Seine bakteriologischen Eigenschaften sind nachstehend aufgeführt. Die Beschreibung der bakteriologischen Eigenschaften wird gemäss der Weise des "Manual of Microbiological Methods" (1957 durch McGraw-Hill Book Company, Inc. veröffentlicht) vorgenommen. Das gleiche gilt für die anderen Stämme.
a Morphologie Mikroskopische Beobachtungen (kultivier in einem ° Bouillon-Agar-Medium bei 30 C während 48 Stunden) (1) Form und Grösse der Zellen: Stäbchen einer Grösse von o,5 bis 0,7 X 1,5 bis 1,7/u (Micron).
(2) Polymorphismus der Zelle: Während des Lebenszyklus kann kein Polymorphismus beobachtet werden, und die Zellen treten allein oder zu zweit auf.
(3) Motilität: Motil, mit Hilfe von 3 bis 7 Peritrichous Flagella.
(4) Sporen: Es bildet keine Sporen aus.
(5) Gram-Färbung: Negativ (6) Säurefestigkeit: Negativ b Wachstumszustand in verschiedenen Nährlösungen: (1) Boullion-Agar-Plattenkultur (2 Tage bei 3o0C) Die kreisförmigen Kolonien sind uneben, konvex,mit gewelltem Rand, schwachocker; Durchmesser von 2 bis 3 mm.
(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur (2 Tage bei 3o0C) Gutes Wachstum, Ausbreitung, matter Glanz, Erzeugung eines wasserunlöslichen gelbbraunen Pigmentes.
(3) Eingetauchte Bouillon-Kultur (1 Tag bei 3o0C) Membranige Pellikeln mit schwerem Sediment.
(4) Bouillon-Gelatine-Stabkultur (1 bis 40 Tage bei 2o0C) Gutes Wachstum auf der Oberfläche und in der oberen Schicht, keine Verflüssigung.
(5) Laimusmilch (1 bis 14 Tage bei 3o0C) Unverändert (pH- 6,8). Keine Reduktion des Lackmus, keine Koagulation, keine Peptonisierung.
(6) Kartoffel-Kultur (2 Tage bei 3o0C) Kin sichtbares Wachstum c Physiologische Eigenschaften (1) Reduktion von Nitraten: Stark festgestellt.
(2) Stickstoffentzugsreaktion: Nicht festgestellt.
(3) Versuch: Negativ (4) VP-Versuch: Negativ.
(5) Indolbildung: Nicht festgestellt.
(6) Bildung von Schwefelwasserstoff:- festgestellt.
(7) Stärkehydrolyse: Nicht festgestellt.
(8) Verwendung von Citronensäure: Nicht festgestellt.
(Koser- und Christensen-Medium werden in Kombination verwendet).
(9) Anorganische Stickstoffquelle: Nicht verwendet. -(Ammoniumsalze, Nitrate).
(lo) Pigmentbildung: Es wird ein wasserunlösliches, ockexgefärbtes Pigment gebildet.
(11) Urease: Nicht gebildet.
(12) Oxidase: Gebildet.
(13) Katalase: Gebildet.
(14) Bedingungen des Wachstumsbereiches Optimale Wachstumsbedingungen: 25 bis 350C, pH 7 bis 9, aerob.
Bedingungen, die das Wachstum erlauben Es kann unter aeroben bis geringfügig fakultativer anaerober Bedingung bei Temperaturen zwischen 5 und 40°C wachsen, wenngleich es bei 5o0C (Boullon-SchEttelkultur) kaum wächst. Der pH-Bereich, der ein Wachstum erlaubt, liegt zwischen 6 und 11. Bei Erhitzung auf 80°C während 30 Minuten wird dieses ausgelöscht.
(15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: Aerob.
(16) O-F-Versuch (nach der Hugh Leifson-Methodik): Negativ (17) Koagulation der Milch: Keine Milchkoagulation.
(18) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen: Weder Säure-noch Gas wird aus Kohlenstoffquellen, wie L-Arabinose, D-Glukose, D-Mannose, D-Frukoose, D-Galaktose, Maltose, Sukrose (Saccharose),Laktose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin, Stärke, Raffinose, Dextrin; Inulin, Glykogen Cellulose und dergleichen gebildet.
d. Physiologische Eharaktertstika Stamm U-188 besitzt eine hohe Aktivität zur Erzeugung von - --- Kreatinamidinohydrolyse in - in Gegenwart von Kreatinin und/oder Kreatin.
Im Verlauf der Kultivierungszeit wird Harnstoff gebildet und 'in der Kulturlösung angesammelt. Das Medium wird unter Ammoniakerzeugung alkalisch. Die Erzeugung der Enzyme und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak werden in üblichem Nährmedium, das weder Kreatinin noch Kreatin enthält, nicht festgestellt.
Durch Vergleich der vorstehend angeführten charakteristischen Eigenschaften des Stammes U-188 mit der Klassifikation, die in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 Aufl. (1974)", erwähnt ist, kann festgestellt werden, dass Stamm U-188 zu der Gattung Flavobacterium zugehörig ist. Hinsichtlich der Spezies wird jedoch festgestellt, dass Stamm U-188 keinem der bisher bekannten bakteriellen Spezies entspricht. Daher kann Stamm U-188 aus den folgenden Gründen als neue Bakterienspezies angesehen werden: Stamm U-188 ist ein gram-negatives, aerobes; nicht sporenbildendes, stäbchenförmiges Bakterium, das ein ockergefärbtes Pigment (wasserunlöslich) in üblichem Nährmedium ausbildet.
Es ist mit Hilfe von Peritrichous Flagella motil. Darüber hinaus erzeugt es weder Säure noch Gas aus Xohitstoffquellen und verändert Lackmusmilch nicht. Es gehört daher zur Gattung Flavobacterium. Es wird-als analog zu Flavobacterium rigense angesehen, da es nicht aus Seewasser, sondern aus Erde gewonnen wird, da es motil ist und bei 370C gut wächst, weil es kein NaCl erfordert und weil es Nitrate zu Nitriten reduziert.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, gehört es jedoch zu einem unterschiedlichen Spezies von Flavobacterium rigense, weil das durch Stamm U-188 erzeugte Pigment eine Ocker-Farbe, unabhängig von.den Kulturbedingungen aufweist und wasserunlöslich ist, weil es Gelatine nicht verflüssigt, weil es weder Säure noch Gas aus Glukose und anderen Kohlenstoffquellen erzeugt, und weil es auf Kartoffel nicht wächst.
Tabelle 1 Art des Stammes Flavobacterium Flavobacterium U-188 : rigense 1. Pigmentbildung Ocker (wasserunlöslich) anfänglich gelb, was später zu orange umgewandelt wird (löslich) 2. Wachstum bei 37 ob gut gut 3. Verflüssigung trichterförmige Verauf Gelatine nicht festgestellt flüssigung 4. Peptonisierung von Casein nicht festgestellt nicht festgestellt 5. Ausnutzung von Zucker (Bildung von Säure) Glukose nicht festgestellt festgestellt Sukrose nicht festgestellt unbekannt Maltose nicht festgestellt unbekannt 6. Bildung von Schwefelwasserstoff festgestellt nicht festgestellt 7. Reduktion von Nitraten festgestellt festgestellt 8. Wachstum auf Kartoffel nicht festgestellt gut Flavobacterium U-188 ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, als FERM-PNr. 2922 und in American Type Culture Collection (USA) als ATCC 31200 hinterlegt.
Corynebacterium U-41 (nachstehend als Stamm U-41 bezeichnet) stellt einen Stamm dar, welcher in Humus werde durch die Erfinder neu aufgefunden worden ist. Seine bakteriologischen Eigenschaften sind nachstehen aufgeführt: a Morphology Mikroskopische Beobachtung (kultiviert in einem Bouillon-Agar-Medium bei 30°C während 6 Stunden) (1) Form und Grösse der Zelle: Kurze Stäbchen einer Grösse von 0,3 bis 0,5 x 1,0 bis 1,3 µ (micron).
(2) Polymorphismus der Zelle: Es wird ein Polymorphismus in Abhängigkeit von dem Lebenszyklus festgestellt.
(3). Motilität: Nicht motil.
(4) Sporen: Keine.
(5) Gram-Färbung:- Positiv.
(6) Säurebeständigkeit: Negativ.
b Wachstumszustand in verschiedenen Medien (1) Bouillon-Agar-Plattenkultur (2 Tage bei 3o0C). Die kreisförmigen Kolonien sind ganz, glatt, weisen eine gelbe Farbe auf, 2 mm Durchmesser1matt (2! Bouillon-Agar-Schräakultur (2 Tage bei 3o?C).
Gutes Wachstum, Fadenformr Erzeugung eines wasserunlöslichen, mattgelben Pigmentes g39 Untergetauchte Bouillon-Kultur (2 Tage bei 3o0C).
Geisselförmige (flagile) Häutchen mit Rand.
(4) Bouillon-Gelatine-Stäbchenkultur (1 bis 40 Tage bei 2 oOC) Trichterförmige Verflüssigung.
(5) Lackmusmilch (1 bis 14 Tage bei 3o0C) Reduktion von Lackmus zu rot (pH 7,9). Keine Koagulierung, jedoch Peptonisierung.
c Physiologische Eigenschaften (1' Reduktion von Nitraten: Festgestellt.
(2) Stickstoffentzug: Nicht festgestellt.
(3) MR-Versuch: Negativ (4) VP-Versuch: Negativ (5) Indolbildung: Nicht festgestellt.
(6) Schwefelwasserstoffbildung: Festgestellt.
(7) Stärkehydrolyse: Festgestellt.
(8) Ausnutzung von Citronensäure: Festgestellt.
(Koser- und Christensen-Medium werden in Kombination verwendet).
(9) Anorganische Stickstoffquelle: Nicht verwendet (Ammoniumsalze, Nitrate).
(lo) Pigmentbildung: Ein wasserunlösliches, schwach gelb gefärbtes Pigment wird gebildet.
(11) Urease Nicht gebildet.
(12) Oxidase: Gebildet.
(13) Katalase: Gebildet.
(14) Bedingungen des Wachstumsbereiches: Optimale Wachstumsbedingungen: 25 bis 35ob, pH 6 bis 9, aerob.
Bedingungen, die das Wachstum erlauben: Es kann unter aeroben bis schwack-fakultativ anaeroben Bedingungen bei Temperaturen zwischen 5 und 40°C wachsen, es wächst jedoch kaum bei 450C (Bouillon-Schüttelkultur). Der pH-Bereich, der ein Wachstum gestattet, liegt bei 6 bis i1. Bei Erhitzung auf 80°C während 30 Minuten wird dieses ausgelöscht.
(15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: Aerob.
(16) O-F-Versuch (Hugh Leifson-Methodik): Negativ (17) Milchkoagulierung: Nicht festgestellt.
(18) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen: Weder Säure noch Gas werden aus Kohlenstoffquellen, wie L-Arabinose, Glukose' D-Mannose, D-Fruktose, D-Galaktose, Maltose, Sukrose, Laktose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Clycerin, Stärke Raffinose, Dextrin, Inolin, Glykogen, Cellulose und dergleichen gebildet.
d Physiologische Charakteristika Stamm U-41 besitzt eine hohe Aktivität zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolase in Gegenwart von Kreatinin und/oder Kreatin. Im Verlauf der Kultivierungszeit wird Harnstoff gebildet und in der Kulturlösung. angesammelt. Das Medium wird unter Ammoniak erzeugung alkalisch. Die Erzeugung der Enzyme und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak werden in üblichem Nährmedium nicht festgestellt, das weder Kreatinin noch Kreatin enthält.
Durch Vergleich der vorstehend erwähnten charakteristischen Eigenschaften des Stammes U-41 mit der Klassifikation, die "Bergey's Manual of Determinative and Bacteriology, 7. Aufl. (1957) und 8. Auflage (1974)" erwähnt ist, kann die Entscheidung getroffen werden, dass Stamm U-41 zu der Gattung Corynebacterium gehörig ist. Hinsichtlich der Spezies wird jedoch festgestellt, dass Stamm U-41 zu keinem der bekannten bakteriellen Spezies zugehörig ist. Daher kann Stamm U-41 als neue Bakterienspezies aus den folgenden Gründen angesehen werden: Stamm U-41 wird als zu der Gattung Corynebacterium zugehörig angesehen, weil es Polymorphismus in Abhängigkeit von dem Lebenszyklus zeigt, die Gram-Färbung immer positiv und auf keine Weise negativ ist, es ein nicht Sporen ausbildendes, stäbchenförmiges Bakterium darstellt und im üblichen Nährmedium wächst, weil es bei einer Temperatur oberhalb So0C nicht wächst und daher keine Hitzebeständigkeit aufweist, und weil es keine Fähigkeit zur Zersetzung von Cellulose besitzt.
Es wird als analog zu Corynebacterium rathayiangesehen, weil es nicht aus tierischem Ursprung isoliert wird, weil es Nitrate zu Nitriten reduziert, und weil es Gelatine verflüssigt. Stamm U-41 wird aus Erde gewonnen, stellt kein pathogenes Bakterium für Gemüse dar und verflüssigt darüber hinaus in intensiver Weise Gelatine und nutzt Kohlenstoffquellen, wie in Tabelle 2 gezeigt ist, nicht aus. Es unterscheidet sich daher erheblich von Corynebacterium rathayi, so dass es als neue Spezies angesehen werden muss.
Corynebacterium U-41 ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, als FERW No. 29 23 und in der American Type Culture Collection als ATCC 312o1 hinterleat.
Tabelle 2 Art des Stammes Corynebacterium Corynebacterium U-41 : rathayi 1. Fähigkeit zur Verflüssigung Stark mild und langsam von Gelatine 2. Wachstum in Nährmedium gut gut 3. Ausnutzung von Zucker 5Säurebildung) Glukose -Laktose - + Sukrose - + 4. Ausnutzung von Citronensäure festgestellt nicht festgestellt Zur: Herstellung von ;:--Kratinamidinohydrolase unter Verwendung der vorstehend erwähnten Stämme können herkömmliche feste Kulturen herangezogen werden. Es ist jedoch bevorzugt, flüssige Kulturen anzuwenden.
Das in der Erfindung verwendet Kulturmedium ist derart zusa.It'Jnengesetzt, dass eine oder mehrere Arten von Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt; Mais-Einweichflüssigkeit oder wässrige Extrakte von Sojabohnen oder Weizenkleie mit einer oder mehreren Arten von anorganischem Salz, wie primärem Kaliumphosphat, sekundärem Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Ferrichlorid, Ferrisulfat oder Mangansulfat und, sofern erforderlich weiter mit einem Zucker, wie Stärke, Vitaminen und dergleichen, in geeigneter Weise eingebracht wird bzw. werden Bei der Erfindung wird der vorstehend erwähnte Stamm in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder einem Gemisch hiervon kultiviert. Die Kultivierung kann beispielsweise durch Inokulierung des Stammes in das vorstehend erwähnte Medium, das zuvor mit Kreatinin, Kreatin oder einem Gemisch hiervon versetzt worden ist, durchgeführt werden In alternativer Weise kann sie auch durch Zufügung von Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon zu der Kultur innerhalb von 5 Stunden,nachdem die Kultivierung begonnen worden ist, nämlich nachdem der Stamm in das Medium inokuliert worden ist, durchgeführt werden.
Die Menge an Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon, die zu dem vorstehend erwähnten Kulturmedium hinzugefügt werden soll, liegt im Bereich von o,ol bis 5,0 % (Gewicht/VolumenlG/V1), vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1,o t (G/V), bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums.
Es ist wünschenswert, den anfänglichen pH-Wert des Mediums auf 7 bis 9 einzustellen. Die Kultivierung wird in einem aeroben Zustand mittels einer belüfteten, bewegten Eintauchkultur oder mittels einer Schüttelkultur bei einer Temperatur zwischen 25 und 37°C, vorzugsweise etwa 30 C, während eines Zeitraumes von 10 bis 48 Stunden, vorzugsweise 15 bis 36 Stunden, durchgeführt. Durch die vorstehend erwähnten Stämme kann die Erzeugung und Ansammlung einer grossen Menge an Kreatininamidohydrolase und Kreatinamidinohydrolase in der Kulturlösung mit hoher Effizienz durch eine einstufige Kultivierung erreicht werden.
Zur Gewinnung von t-eatinamidino- - -.
hydrolase aus der Kulturbrühe nach der Beendigung der Kultivierung gemäss der Erfindung können herkömmliche Verfahren der Enzymgewinnung herangezogen werden.
Da das in Betracht gezogenen Enzym in freier Form in der Kulturlösung vorliegt, kann eine Rohflüssigkeit, die das Enzym enthält, durch Entfernung der Zellen und unlöslichen Materialien aus der Kultivierungslösung erhalten werden. Die Rohflüssigkeit kann entweder direkt oder nach deren Umwandlung zu einem rohen Enzympulver mit Hilfe der Gefriertrocknung in Gebrauch genommen werden.
Sofern gewünscht ist, die - -Kreatinamidinohydrolase , die in dem Mikroorganismus in einer kleinen Menge noch verbleibt, zu extrahieren, werden diese nach Vermahlung der Zellen in üblicher Weise oder durch enzymatische Aufarbeitung bzw. -verdauung extrahiert. In alternativer Weise werden die Zellen einer Autolyse durch Schüttl'g oder durch Stehenlassen in Gegenwart von Toluol oder dergleichen zur Freisetzung des Enzyms unterworfen, wonach die Lösung von den Feststoffen durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt und, sofern erforderlich, von Nukleinsäuren durch Behandlung mit Streptomycinsulfat, protaminsulfat oder Mangansulfat befreit wird, undçsodann durch Zugabe von Ammoniumsulfat e Alkohol oder Aceton fraktioniert wird, die resultierende Ausfällung gesammelt wird, letztere gegen Wasser dialysiert wird, und schliesslich unter Vakuum unter Erhalt von Rohenzympulver getrocknet wird.
Kreatinamidinohydrolase wird aus der rohen Enzymzubereitung isoliert entweder durch Adsorptions-Elutions-Methodiken mittels Ionenaustauschern, wie Diäthylaminoäthylcellulose, oder durch geeignete Kombination einiger der Gelfiltrationsmethodiken, der Adsorptions-Elutions-Methodik mittels Hydroxylapatit, und Elektrophorese-Methodik mittels Polyacrylamidgel und dergleichen. Dabei erhält man das hoch gereinigte Enzym.
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der reinen Kreatinamidinohydrolase, die durch die vorstehend erwähnten Reinigungsverfahren erhalten wurden, sind nachstehend aufgeführt: (1) Aktions- und Substratsspezifität Dieses Enzym besitzt eine Fähigkeit, Kreatin zu Harnstoff und Sarkosin zu hydrolisieren. Der Km-Wert (Michaelis-Konstante) beträgt für Kreatin 4,o x 10 Mol (370C, pH 7,7).
Gegenüber Kreatinin übt es keine Wirkung aus.
(2) Optimaler ph- und stabiler pH-Bereich der otpimale pH-Wert beträgt 7,7 und der stabile pH-Bereich beträgt 5,0 bis 9,6.
(3) Verfahren der Messung der enzymatischen Aktivität Zu 0,8 ml 0,1 m Kreatinlösung werden 0,1 ml o,3 m Phosphat-Puffer (pH 7,7) und 0,1 ml einer Lösung dieses Enzyms, die eine geeignete Konzentration aufweist, hinzugegeben und das resultierende Gemisch wird bei 370C während lo Minuten umgesetzt. Sodann werden 2 ml einer 2 %-igen (G/V) p-Dimethylaminobenzaldehydlösung (hergestellt durch Auflösung von 2 g p-Dimethyiaminobenzaldehyd in loo ml 99,5 %-igem äthanol, Zugabe von 15 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und Verdünnung des Gemisches mit destilliertem Wasser auf eine zweifach grössere Menge) hinzugefügt und das resultierende Gemisch wird bei 250C während 30 Minuten stehen gelassen.
Sodann wird seIne Aksorptnor. (O.D.-Wert) bei 435mµ mittels eines fotoelektrischen Colorimeters gemessen. Die Menge des gebildeten Harnstoffes wird durch Vergleich mit einer Kalibrierungskurve für Harnstoff, die zuvor ermittelt wurde, abgeschätzt. Die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 Mikromol Harnstoff pro Minute bei 370C zu erzeugen, wird als Einheit herangezogen.
(4) Bereich der optimalen Temperatur Er liegt im Bereich von 20 bis 450C. Eine Temperatur von etwa ° 37 C ist besonders bevorzugt.
(5) Thermische und pH-Stabilität Es verliert die Aktivität bei einem pH-Wert oberhalb to.
Es verliert seine Aktivität vollständig bei SoOC in lo Minuten.
(6) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung Es wird durch p-C.NS und Quecksilberchlorid inhibiert. Es wird durch Glutathion (reduzierte Form), L-Cysteinhydrochlorid und 2-Mercaptoäthanol stabilisiert.
(7) Reinigungsmethodik Nucleinsäure und Bakterien werden aus der Kulturflüssigkeit durch Zufügung von Mangansulfat und Hyflow-Super-Cel und Filtration des resultierenden Gemisches eliminiert. Das Filtrat wird gegenüber Puffer A dialysiert, wonach die dialysierte Lösung auf eine Säule aufgebracht wird, die mit DEAE-Cellulose gehüllt ist, welches zuvor mit t Puffer A equlllbrlert worden war. Das unadsorbierte Enzym, das eine Kreatinamidinohydrolase-Aktivität aufweist, wird an DEAE-Sephadex A-50 adsorbiertp welches zuvor mittels des vorstehend erwähnten Puffers A equilibriert worden ist und sodann unter Ausnutzung eines linearen NaCl-Gradienten von o bis 0,5 m eluiert, wobei das Enzym bei einer NaCl-Konzentraktion von 0,1 bis 0,3 m eluiert wird. Sodann wird das Eluat konzentriert, durch eine- Sepharose 6B-Säure geführt und mit Puffer A unter Gewinnung der Fraktion eluiert, die die Enzymaktivität aufweist Die Fraktion wird konzentriert und lyophilisiert, wobei ein gereinigtes Enzympulver erhalten wird.
(8) Molekulargewicht Das Molekulargewicht dieses Enzymes wird durch Gelfiltration an Sephadex G-2oo (hergestellt durch Pharmacia Co., Schweden, nach der Andrew's Methodik (P.Andrews, Biochem.J., 96, 595 (1965)) bestimmt. Es wird zu etwa 60.ooo ermittelt. Die Säule wird mit o,o5 m Phosphatpuffer (pH 8,o) equilibriert, welcher 0,1 m NaCl und 1 Millimol 2-Mercaptoäthanol enthält und die Elution wird bei SOC vorgenommen.
Im Gegensatz hierzu weisen Kreatinamidinohydrolasen, die bereits früher beschrieben worden sind, beispielsweise in (i) Journal of Genral Microbiology, Band 14, S. 351 bis 365 (1956) und (ii) US-Patentschriften 3 806 416 und 3 806 420, die vorstehend erwähnt worden sind, die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften auf: Xm-Wert für Kreatin:(i) 2,3 x 10-2m (30°C, pH 7,8) C, pH 7,8) (ii) 5,o x 10 2m (250c, pH 7,6) relative Aktivität für Kreatin (i) etwa 0,1 Einheiten/mg-Proteinoptimale Temperatur: (i) 30 C optimaler pH (i) 7,8 (ii) 7,6 Darüber hinaus erden die Inhibitoreneffekte für Kreatinamidinohydrolase, die durch den Stand der Technik beschrieben worden sind, mit denen der vorliegenden Erfindung nachstehend verglichen: Prozentuale Inhibition der Kreatinentfernung (% Endkonzentration Inhibitor an Inhibitor gemäss d. Stand der (m) Errindung Technik (i) Borat (pH 9,1) 5 x 10-2 40 80 Azid 2 x 10-2 0 18 Jodoacetat io o 20 Wie vorstehend erwähnt wurde, wird dieses Enzym angesichts seiner enzymologischen und --physiko-chemischen Eigenschaften als neue Kreatinamidinohydrolase angesehen, die sich von jeder der bekannten Rreatinamidinohydrolasen unterscheidet.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter, ohne diese einzuschränken. Die Einheit der Enzymaktivität, auf die in den Beispielen Bezug genommen worden ist, ist jene, die die Normalreaktion in Gegenwart von Kreatinin oder Kreatin als Substrat betrifft.
Beispiel 1 1 1 eines Nährmediums (pH 7,6), welches o5 % (G/V) Kreatinin, o,5 % (GV) Hefeextrakt, o36 % (G/V) sekundäres Kaliumphosphat, o,o4 % (G/V) primäres Kaliumphdsphat, 0,02 % (G/V) Magnesiumsulfat, o,ool e (G/V) Mangansulfat und o,ool % (G/V) Eisensulfat enthielt, wurde in eine Kulturvorrichtung geringer Grösse- eingebracht, die mit einem Rührer (hergestellt durch Iwashiya Co., Japan) ausgestattet war, und bei hohem Druck sterilisiert. Sodann wurde das Medium mit 20 ml einer bakteriellen Samenlösung inokuliert, die durch Vorkultivierung von Flavobacterium U-188 (ATCC 31200, FERM-P Nr. 2922)in einem Nährmedium, das die gleiche Zusammensetzung, wie sie vorstehend angegeben worden ist, aufwies, hergestellt worden war, und einer belüfteten-bewegten Eintauchkultur bei 30°C unterworfen.
Nach Kultivierung während 24 Stunden- wurde eine Kulturlösung erhalten, -2,2 Einheiten / ml Kreatinamidinohydrolase enthielt.
Die Kulturlösung wurde von Bakterien durch Zugabe von 15 ml einer 23,6 %-igen (G/V) Mangansulfatlösung unter Rühren, weiterer Zugabe von 15 g Hyflow Super Cel und Filtration des resultierenden Gemisches befreit. Somit wurden 970 ml einer rohen Enzymlösung erhalten, die 2,1 Einheiten/ml Kreatinamidinohydrolase enthielt.
Die hierdurch erhaltene rohe Enzymlösung wurde auf ein Volumen von 95 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde gegenüber 5 1 o,o5 m Phosphat-Puffer (pH 8,0) welcher ein Millimol 2-Mercapto-äthanol (nachstehend als Puvver A bezeichnet) aufwies während 24 Stunden dialysiert und sodann auf eine Säule (2 x 30cm) mit DEAE-Cellulose aufgebracht, welche zuvor mit Puffer A equilibriert worden war. Der nicht adsorbierte Teil wies eine Kreatinamidinohydrolase-Aktivität auf.
Kreatinamidinohydrolase wird dadurch erhalten, dass man den unadsorbierten Teil, der in der vorstehend angeführten DEAE-Cellulose-Säülenchromatografie erhalten worden war, an einer DEAE-Sephadex A-5o-Säule, die zuvor mit dem gleichen erwähnten Puffer epilibriert worden war, absorbiert, und mit einem linearen NaCl-Gradienten von o bis o,5 m eluiert. Kreatinamidinohydrolase wurde bei einer NaCl-Konzentration von o,1 bis o,3 m eluiert. Die aktive Fraktion des Eluates besass eine spezifische Aktivität von 8,5 Einheiten/ng-Protein und eine Gesamtaktivität von 1530 Einheiten.
Nachfolgend wurde die vorstehend erwähnte aktive Fraktion auf ein Volumen von 2,o ml mittels eines Collodiumsackes konzentriert und das Konzentrat durch eine Sepharose 6B-Säule (2 x 108 cm) gefährt, welche zuvor mit dem gleichen Puffer A equilibriert worden war. Sodann wurde mit dem gleichen Puffer eluiert und die Fraktionen, die die Kreatinamidinohydrolase-Aktivität aufwiesen, wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden unter Erhalt eines gereinigten Kreatinamidinohydrolasepulvers konzentriert und lyopholisiert. Die hierdurch erhaltene gereinigte Kreatinamidinohydrolase besass eine spezifische Aktivität von 11,3 Einheiten/mg-Protein und eine Gesamtaktivität von 1.o50 Einheiten. Die Ausbeute betrug 51,6 %.
Die Einheit der Kreatinamidinohydrolase-Aktivität, auf die hier Bezug genommen ist, wurde derart definiert, dass die Enzymmenge, die für die Zersetzung von 1 Mikromol Kreatin zu Harnstoff pro Minute in einem Phosphat-Puffer (pH 7,7) bei 370C erforderlich war, als eine Einheit herangezogen wurde.
Beispiel 2 1 1 eines Nährmediums (pH 7,6), welches o,5 % (G/V) Polypepton, o,5 % (G/V) Hefeextrakt, o,36 % (G/V sekundäres Kaliumphosphat, o,o4 % (G/V) primäres Kaliumphosphat, o,o2 % (G/V) Magnesiumsulfat, o,ool % (G/V) Mangansulfat und o,ool % (G/V) Eisensulfat enthielt, wurde in einen Kutivierungskolben einer Kapazität von 5 1 eingebracht und bei hohem Druck sterilisiert, wobei der Kolben mitBaumwolle zugestopft war. Das Medium wurde mit io ml einer Kulturlösung inokuliert, die durch Vorkultivierung von Corynebacterium U-41 (ATCC 31201, FERM-P No. 2923) während 24 Stunden in einem Nährmedium erhalten worden war, welches die~gleiche Zusammensetzung, wie sie vorstehend angegeben ist, aufweis. Das inokulierte Medium wurde bei 30°C unter Schüttlung kultiviert. Nach 5-stündiger Kultivierung wurden 100 ml sterilisierter, 5%-iger (G/V) Kreatinlösung zu dem Medium hinzugegeben und die Kultivierung wurde währenlweiterer 24 Stunden fortgesetzt, wodurch eine Rohenzymlösung erhalten wurde, die Kreatinamidinohydrolase (o,5 Einheiten/ 1 ml Kulturlösung aufwies.
Die Rohenzymlösung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 unter Erhalt von reiner Kreatinamidinohydrolase behandelt.

Claims

Patentansprüche 01. Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass man einen Bakterienstamm der Gattung Flavobacterium U-188 (ATCC 21200, FERM-P No. 2922) oder Corynebacterium U-41 (ATCC 31201, FERM-P No. 2923), der die Fähigkeit zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolase aufweist, in einem Nährmedium in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder einer Mischung daraus kultiviert und Kreatinamidinohydrolase aus der Kulturflüssigkeit gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass das Nährmedium zumindest eine der Substanzen Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Mais-Weichflüssigkeit und wässriges Sojabohnen- und Weizenkleieextrakt als Stickstoffquelle und zumindest eine Substanz, die unter primärem Kaliumphosphat, sekundärem Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Ferrichlorid, Ferrisulfat und Mangansulfat als anorganisches Salz ausgewählt ist, enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass ein Zuckermaterial oder Vitamin in das Nährmedium eingebracht wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass die Menge an Kreatinin,Kreatin oder eines Gemisches hier von i Bereich von G,G1 bis 5, t (G/V), Yezogen auf das gesamte Nährmedium beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass der Ausgangs-pH-Wert des Nährmediums 7 bis 9 beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man die Kultivierung bei einer ° Temperatur von 25 bis 37 C durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man die Kultivierung während lo bis 48 Stunden durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man die Kultivierung unter Belüftung durch eine Belüftungs-Bewegungs-Eintauchkultur oder -schüttelkultur durchführt.
9. , Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t ,dass man-*die Kultivierung durch Inokulierung eines Bakterienstammes in ein Nährmedium durchführt, welches uvor mit Kreatinin, Kreatincder einem Gemisch hiervon versetzt worden ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man Kreatinin, Kreatin oderein Gemisch hiervon zu dem Nährmedium zu einer Zeit zugibt, die nicht später als 5 Stunden nach Beginn der Kultivierung durch Inokulierung eines Bakterienstammes in das Närhmedium liegt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man Kreatinamidinohydrolase in Form einer Rohenzymiösung durch Abtrennung und Entfernung der Zellen und unlöslichen Materialien aus der Kultivierungslösung oder in Form eines rohen Enzympulvers durch weitere Lyophilisierung der Rohenzymlösung gewinnt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man die Rohenzymlösung oder das Rohenzympulver zu reiner Kreatinamidinohydrolase reinigt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man die Reinigung durch die Adsorptions-Elutionsmethodik unter Verwendung eines Ionenaustauschermaterials durchführt.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , dass man die Reinigung durch Kombination der Gelfiltrationsmethodik, der Adsorptions-Elutions-Methodik und der Elektrophorese-Methodik durchführt.
15. Kreatinamidinohydrolase mit einem Km-Wert (Michaelis-Konstante) für Kreatin von 4,o x lo Mol t37 C, pH 7,7), stabilem-pH-Bereich von 5,9 bis 9,o, optimalem pH-Bereich von 7,7, Aktionstemperaturbereich von 20 bis 450C, optimaler ° Aktionstemperatur von 37 C und einem Molekulargewicht von 60.ooo, erhältlich nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.